Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viime aikoina olemme osoittaneet, että trikosantiini (TCS), lupaava aine hoitoon kohdunkaulan adenokarsinooma, esti HeLa solujen lisääntymistä kautta PKC /MAPK /CREB signaalireitin. Lisäksi TCS alassäädetty Bcl-2: n ilmentymisen kumottiin syötti oligonukleotidi (OGN) ja syklisen AMP-reagoivan elementin (CRE). Syötti OGN esti sitoutumisen CRE-sitovan proteiinin (CREB) ja Bcl-2. Nämä tulokset viittaavat siihen, CRE-välitteinen geenin ilmentyminen voi olla keskeinen rooli HeLa solujen lisääntymisen. Kuitenkin tiedetään vähän vaikutusta TCS solusyklin pidätyksistä, erityisesti, onko geenit osallistuvat solukierron säädeltiin CRE. Nykyinen tutkimus osoittaa, että pidätykset S, G1 ja G2 /M faasit mukana merkittäviä alas-säätely sykliini A, D1 ja CDK 2, 4 HeLa-soluissa, sykliini D1, E ja CDK 2, 4 CaSki ja C33A soluja, ja sykliini A, B1, E ja CDK 2 SW1990-soluissa. Kuitenkin solusyklin pidätykset päinvastainen kautta merkittävä ylössäätöä sykliini A ja D1, jota yhdistelmähoito TCS ja CRE. Yhteenvetona nämä tiedot osoittavat ensimmäistä kertaa, että tietyt solusyklin pidätyksen syövän solut voidaan indusoida TCS mukaan inhiboimaan CREB CRE liittyvistä geeneistä solujen lisääntymisen.

Citation: Wang P, Huang S, Wang F, Ren Y, Hehir M, Wang X, et ai. (2013) Cyclic AMP-Response Element säädelty Cell Cycle Pidätykset syöpäsoluissa. PLoS ONE 8 (6): e65661. doi: 10,1371 /journal.pone.0065661

Editor: Hong Wanjin, Institute of Molecular and Cell Biology, Biopol’ia®, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 marraskuu 2012; Hyväksytty: 25 huhtikuu 2013; Julkaistu: 28 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (81071653), Natural Science Foundation of Zhejiang (Y2111136), Advanced Key tieteellistä ja teknologista ohjelmat Ningbo (2011C51005), Natural Science Foundation of Ningbo (2011A610050) ja KC Wong Magna Fund Ningbo University. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Trichosanthin (TCS), aktiivisen komponentin eristetty juuresta mukulat Kiinan lääkeyrtti

Trichosanthes kirilowii

[1], on lupaava aine syövän hoitoon [2]. Aikaisemmat raportit osoittivat, että TCS esti kohdunkaulan adenokarsinooma HeLa solujen lisääntymistä [3] kautta PKC /MAPK /CREB signaalireitin [4]. Lisäksi TCS alassäädetty Bcl-2: n ilmentymisen [5], joka kumottiin syklinen AMP-reagoivan elementin (CRE, TGACGTCA) houkutuslintuna oligonukleotidi (OGN), estää CRE-sitovan proteiinin (CREB) sitoutumiskohdan Bcl-2 [6]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että CRE-välitteinen geenin ilmentyminen voi olla keskeinen rooli HeLa solujen lisääntymisen.

Kuitenkin tiedetään vähän vaikutusta TCS solusyklin pidättäminen HeLasoluista, kohdunkaulan levyepiteelikarsinooma syöpä (CaSki ja C33A solu), ja ihmisen haiman karsinooma (SW1990 solu), erityisesti, onko geenit liittyvät solusyklin säädeltiin CRE houkutuslintuna OGN.

Tässä tutkimuksessa olemme edelleen tutkitaan vaikutuksia TCS proliferaatioon syöpäsolut, solukierron pidätyksiä edistymistä solujen lisääntymistä ja rooli CRE solukierron säätelyssä.

tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia vaikutukset TCS syövän solujen lisääntymistä ja vaikutus CRE on TCS aiheuttama solukierron pidätyksiä. Tärkeä kysymys oli, CRE-yhdistetty Sykliineiksi ollut keskeinen rooli säätelyssä solukierron pysähtymisen näissä syöpäsoluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja kulttuuri

kohdunkaulan soluissa (HeLa, CaSki, C33A) ja SW1990-solut saatiin American Type Culture Collection (ATCC, USA). HeLa, CaSki, C33A [7] ja SW1990 solujen [8] kasvatettiin kerroksena RPMI 1640 väliaineessa (Gibco, NY, USA) ja Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM), joka sisälsi 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (BioWhittaker, Inc., Walkersville, MD, USA), joka CO

2-inkubaattorissa (Forma Scientific, USA). Elatusaine korvattiin kahdesti viikossa, ja solut siirrostettiin joka 4-5 päivä suhteessa 01:03.

Cell hoidon

Solut maljattiin 2 x 10

6 solua /astia 100 mm ruokia Peruselatusaineen. Konfluentteina ne pestiin lyhyesti PBS: llä ja sitten käsiteltiin TCS (Jinshanin apteekkiyhtiön, Shanghai, Kiina). Ohjaus soluja inkuboitiin TCS-väliaineessa.

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elinkelpoisuus arvioitiin kanssa Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japani) käyttämällä aikaisemmin kuvattuja menetelmiä [3 ], [4], [9].

solujen käsittely CRE-OGNs

CRE houkutuslintuna OGN (5′-TGACGTCAGAGAGCGCTCTCTGACGTCA-3 ’) ja ohjaus OGN (5’TGACGTCATGACGTCATGACGTCA- 3 ’) muutettiin fosforotioaattideoksioligonukleotideihin OGNs (Invitrogen Carlsbad, CA, USA) edellinen on kuvattu [5], [6], [10].

valmistelu sytosolin ja tumaproteiinit

valmisteet sytosolin ja tumaproteiinit suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [6], [11], [12]. Lyhyesti, lopussa kunkin nimetyn hoidon, solut pestiin lyhyesti kylmällä PBS: llä ja hajotettiin romuttamalla niitä 0,5 ml kylmää hypotonisessa puskurissa (10 mM HEPES, 40 mM KCI, 3 mM MgCI

2, 1 mM ditiotreitoli, 0,2 % NP-40, 1 ug /ml aprotiniinia, 2 uM leupeptiiniä, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 40 mM p-nitrofenyylifosfaattia, 1 mM natriumortovanadaattia ja 50% glyserolia). Lysaatit kerättiin talteen ja niitä inkuboitiin jäällä 5 minuutin ajan, sitten sentrifugoitiin 15000 x g 20 s. Supernatantti kerättiin ja tallennetaan sytosolin jakeet. Pelletti (eli solujen tumat) suspendoitiin uudelleen hypertoninen puskuriin (20 mM HEPES, 420 mM KCI, 1,5 mM MgCl

2, 0,2 mM EDTA: ta, 0,5 mM ditiotreitolia, 0,2% NP-40, 1 ug /ml aprotiniinia, 2 uM leupeptiiniä, 0,5 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 40 mM p-nitrofenyylifosfaattia, 1 mM natriumortovanadaattia ja 25% glyserolia). Kun oli inkuboitu jäissä 60 minuutin ajan, näytteet sentrifugoitiin 15000 x g 20 minuuttia ja supernatantit otettiin talteen ja tallennetaan tumauutteet. Sytosolin fraktiot ja tumauutteet keitettiin 10 min ja liuotettiin 8% SDS-PAGE.

Solusyklianalyysiä

virtaussytometria-analyysi solusyklin, 1 x 10

6 solua kerättiin sentrifugoimalla, pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin jääkylmällä 70% etanolilla yön yli. Kiinteä-soluja käsiteltiin 25 ug /ml RNaasi A: ta 37 ° C: ssa 30 min ja värjätään propidiumjodidilla (PI) (50 ug /ml, Sigma) liuosta 30 minuutin ajan pimeässä. Fluoresenssin intensiteetin yksittäisten solujen mitattiin virtaussytometrillä (Beckman Coulter, Inc., Miami, FL, USA). Vähintään 10000 solut laskettiin [13].

Western blot-analyysi

Yhteensä solulysaatteja valmistettiin lysoimalla solut radioimmunosaostuskokeella puskurilla ja proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen proteiinin määrityskittiä (Bio -Rad). Western blot-analyysi, 50 ug kutakin näytettä käsiteltiin, kuten on kuvattu [14]. Seuraavia vasta-aineita käytettiin: anti-sykliini A, B1, D1, E, anti-CDK2, 4 ja anti-aktiini (Cell Signaling Thehnology, Inc., Beverly, MA). Toissijainen vasta-aineet on kytketty piparjuuriperoksidaasiin ja kemiluminesenssilla (Bio-Rad, Hercules, CA). Suhteelliset määrät immunoreaktiivisia proteiinin kullakin kaistalla määritettiin skannaamalla densitometrinen analyysi röntgenfilmit.

Tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa. Tiedot ilmaistiin keskiarvoina ± SD. ANOVA arvioimiseksi käytettiin ryhmien välisten erojen. Tiedot, jotka ilmoitetaan keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Eroja pidettiin merkittävinä, jos

p

0,05.

Tulokset

Effects of TCS proliferaatioon syöpäsolujen

TCS 20-100 ug /ml inhiboivat solujen 3%: sta 70% hoidon jälkeen 24 h (Fig. 1). 50% estävä konsentraatio (IC

50) TCS on CaSki ja C33A-soluja havaittiin olevan 60 ug /ml, pienempi kuin HeLa ja SW1990-soluissa (100 ug /ml) (taulukko 1).

TCS inhiboi solujen proliferaatiota annoksesta riippuvaisella tavalla. Tiedot edustavat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta (*

p

0,05 verrattuna kontrolli).

Effects of TCS solusyklin etenemistä ja solusyklin säätelyproteiineja

TCS-käsiteltyjen syöpäsolujen analysoitiin virtaussytometrialla. Annoksesta riippuva solujen lukumäärän nousua S, G1, G2 /M-faasissa on esitetty HeLa, CaSki, ja SW1990-soluissa, sen jälkeen kun niitä käsiteltiin 24 tunnin ajan, (taulukko 2). Tasot solusyklin liittyviä proteiineja määritettiin Western blot-määrityksellä. TCS väheni runsaasti sykliini A, D1 ja CDK 2, 4, vaikka sillä ei ollut merkittävää vaikutusta ilmaisun sykliini B1 ja E HeLa soluun (Fig. 2). Vuonna CaSki- solu, sykliini D1, E ja CDK 2, 4 oli merkittävästi vähentynyt, kun taas mitään merkittäviä muutoksia näytettiin ilmaisemisessa sykliini A ja B1 (Fig. 3). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin C33A-soluja (tietoja ei esitetty). Vuonna SW1990 solussa, sykliini A, B1, E ja CDK 2 olivat huomattavasti alassäädetty, ei erillisiä vaikutuksia havaittiin ilmaus sykliini D1 ja CDK4 (Fig. 4).

HeLa soluja käsiteltiin ilmoitettu annoksia TCS 24 tuntia. Solujen määrä S-vaiheessa lisääntyi merkittävästi (A) ja ilmauksia sykliini A, D1 ja CDK2, 4 vähensi merkittävästi (B). Tiedot edustavat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta (*

p

0,05 verrattuna kontrolli).

CaSki- soluja käsiteltiin osoitetulla annoksilla TCS 24 tuntia. Cell numerot G1 vaiheessa kasvanut merkittävästi (A) ja ilmauksia sykliini D1, E ja CDK2, 4 vähensi merkittävästi (B). Tulokset edustavat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta (*

p

0,05 verrattuna kontrolli).

SW1990-soluja käsiteltiin osoitetulla annoksella TCS 24 tuntia. Solujen määrä G2 /M vaiheessa kasvanut merkittävästi (A), ilmaisut sykliini A, B1, E ja CDK2 laski merkittävästi (B). Tiedot edustavat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta (*

p

0,05 verrattuna kontrolli).

Effects of CRE-houkutuslintuna on solusyklin etenemistä ja sääntelyn proteiinit

pidätykset S, G1 ja G2 /M vaiheiden aiheuttama TCS HeLa (Fig. 5), CaSki (Fig. 6) ja SW1990 (Fig. 7) soluja, oli merkittävästi vaimennettu yhdistetyn kohtelu TCS ja CRE (A, B). Todettiin, että TCS-indusoidun pienenee sykliini A: n ja D1 ovat merkittävästi päinvastaiseksi lisäämällä CRE, HeLa-soluissa (kuvio. 5, C, D), CaSki-solut (Fig. 6 C, D) ja SW1990-soluissa ( Fig. 7 C, D).

TCS-indusoidun solujen määrä S-vaiheessa merkittävästi lieventyneet yhdistetty hoito TCS + CRE (A, B). Alas-säänneltyjen ilmentymä sykliini A ja D1 purettiin TCS + CRE. Mitään vaikutusta ei havaittu muita proteiineja (C, D). Tiedot edustavat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta (*

p

0,05 verrattuna ohjaus,

#

p

0,05 verrattuna TCS).

TCS-indusoidun solujen määrä G1 faasi merkittävästi heikennetty TCS + CRE (A, B). Alas-säänneltyjen ilmentymistä sykliini D1 purettiin käsittelemällä TCS + CRE. Mitään vaikutusta ei havaittu muita proteiineja (C, D). Tiedot edustavat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta (*

p

0,05 verrattuna ohjaus,

#

p

0,05 verrattuna TCS).

TCS aiheuttama lisäys solujen määrässä G2 /M vaiheessa merkittävästi heikennetty käsittelemällä TCS + CRE (A, B). Alassäädetty ilmentyminen sykliini A päinvastaiseksi käsittelemällä TCS + CRE. Ei ollut vaikutusta muiden proteiinien (C, D). Tiedot edustavat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta (*

p

0,05 verrattuna ohjaus,

#

p

0,05 verrattuna TCS).

keskustelu

Tämä tutkimus osoitti, ensimmäistä kertaa, että TCS kohdistama sytotoksisia vaikutuksia syöpäsolujen elinkelpoisuuden annosriippuvaisesti (Fig. 1). CaSki ja C33A-solut olivat herkkiä sen inhiboiva vaikutus solujen lisääntymistä (taulukko 1). Tulokset on syövän vastaisen mekanismeja osoittavat selvästi, että kasvu S-vaiheeseen HeLa-soluissa mukana lasku G

1 vaihe solujen, kun taas määrä G

2 vaiheessa solut eivät muutu. Vuonna CaSki- ja C33A solujen merkittävää lisäystä G

1 vaihe ja lasku S ja G

2 vaiheen soluja havaittiin. Vuonna SW1990-soluissa, mikä on G

2 /M vaiheessa olevien solujen liittyi lasku G

1 vaihe solujen muuttamatta löytyy määrä S-vaiheeseen soluja (taulukko 2).

tutkiminen muutoksia useisiin säätelymolekyyleja mukana solusyklin osoitti, että ilmaukset sykliini A, D1 ja CDK 2, 4 HeLa-soluissa (kuvio. 2), sykliini D1, E ja CDK 2, 4 CaSki ja C33A solut (Fig. 3), sykliini A, B1, E ja CDK 2 SW1990-soluissa (kuvio. 4) olivat merkittävästi alassäädetty. Estää sitoutumiskohdan solusyklin geenien CREB jonka OGN, CRE decoy, esti TCS-pidätetty S, G1 ja G2 /M-solun syklin HeLa (Fig. 5 A, B), CaSki (Fig. 6 A, B ) ja SW1990 (Fig. 7 A, B-solut), vastaavasti. TCS välittämä säätely alaspäin sykliini A, D1 HeLa-soluissa (kuvio. 5 C, D), sykliini D1 CaSki- soluissa (Kuva. 6 C, D) ja sykliini A SW1990-soluissa (kuvio. 7 C, D) palautettiin yhdistelmä CRE ja TCS.

Nämä tulokset vahvistivat ja laajentaneet aiemmat raportit osoittavat, että TCS on sytotoksinen vaikutus syöpäsoluihin [3], [4], ja osittain paljasti mekanismeista aktivoinnin CREB-proteiinin [5], [6]. Kuitenkin, se ei ole aikaisemmin raportoitu onko TCS välittämä solukierron pysähtymisen tapahtuu yhdistämällä CRE ja kohdegeenien. Tämä tutkimus osoittaa, että CRE houkutuslintuna OGN heikennetty lasku ilmaisujen sykliini A: n ja D1 johtuvat TCS hoitoa, ja käänteinen solusyklin pidätyksiä.

Solusykli on tiukasti välittyvät monimutkaisen verkoston positiivisia ja negatiivinen solusyklin säätelymolekyyleja kuten CDK, CKIs ja sykliinejä [15], [16]. On raportoitu, että siitä muodostuisi aktiivisia sykliini D /CDK4 ja sykliini E /CDK2 kompleksit ohjaa etenemisen kautta G1 vaihe (G1 /S: ksi). Lisäksi sykliini A: sitoutuu ja aktivoi CDK2, edistämällä G1 /S ja G2 /M solusyklin siirtymiä. Loppuvuodesta G2, sykliini B /CDK2 aktivoidaan, jolloin merkintä mitoosiin [17]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että vähentynyt ilmaisuja sykliini A, D1 ja CDK2, 4 liittyivät S vaiheen pysähtymisen HeLa-soluissa (kuvio. 2). Vähentynyt-ilmauksia sykliini D, E ja CDK2, 4 liittyivät G1 vaiheeseen CaSki- ja C33A soluja (Fig. 3). Ilmaisut sykliini A, B1 ja CDK2 olivat merkittävästi säädellä vähentävästi SW1990-soluissa, pidätettiin G2 /M vaiheessa (Fig. 4). Olemme myös havainneet, että CDK2 pieneni merkitsevästi solulinjoissa. Tämä tulos on sopusoinnussa ajatus, että CDK2 on erillinen ja olennainen tehtävä nisäkässolun syklin, ja sen mutaatio tai esto aiheuttaa G1-vaiheen block [18].

geenien aktivaation varustettujen CRE raportoidaan tapahtua fosforyloimalla CREB Ser 133 ja sitoutumisen CRE konsensussekvenssien promoottorialueen geenien [19], [20]. CREB huiput aikana G1-S siirtyminen ja sitten vähitellen pienenee S vaiheesta M vaiheeseen [21]. Yhdistettynä aiemmin raportoitujen tulosten [4] – [6], [9], on loogista oletuksen, että solujen lisääntymistä geenit, joissa on CRE sivuston, sitoutuvat CREB ja vaikuttaa sen fosforylaation tasolla ja siten häiritsevän solunjakautumisen.

CRE etsii ylävirtaan mRNA alkaa sivustoja. Sillä on keskeinen rooli sykliini A: [22], [23] ja D1 [24], [25] ilmaisun kautta CREB aktivaation [26] – [28]. Aiemmassa tutkimuksessa on osoitettu, että yhdistys CREB lehmänrokkoyhdistelmä liittyvä kinaasi 1 (VRK1) tapahtui solusyklin riippuva tavalla myöhään G1 S-vaiheessa. Lisäksi VRK1 nimenomaan parantaa aktiivisuutta CRE sykliini D1 promoottori helpottamalla rekrytointia fosforyloidun CREB tähän lokukseen [29]. Giampuzzi ym totesi myös, että merkittävä väheneminen CREB-proteiinin sitoutumisesta sykliini D1 promoottori johti dramaattiseen eston sykliini D1-proteiinin ilmentymistä lysyyli oksidaasi (LOX) up-säännellään solujen [30]. Ilmiö vahvistettiin myös fibroblastisoluissa [31], kohdun limakalvon solujen [32], INS solujen [33], hepatosyyttisolulinjasta [34] ja muut solulinjat [21], [35], [36]. Lisäksi useat havainnot viittaavat sykliini A: lla on keskeinen rooli S ja G2 /M siirtyminen nisäkässoluissa ja tämä rooli on sopusoinnussa sen etuoikeutettu yhdessä CDK2 sijasta cdc2 aikana S-vaiheen [37], [38] . CRE vahvistettiin vaaditaan tehokasta aktivointia sykliini Promoottori aortan sileän lihaksen soluissa [39], fibroblastisolut [40] ja ihmisen alkion karsinoomasoluja [22]. Tämä tutkimus osoittaa selvästi, että yhdistetty hoito TCS ja CRE vaimennetaan kavennukset sykliini A: n ja D1 ilmaisun, mikä kääntää vaikutus TCS solusyklin pidätyksen. Siksi ehdotamme, että transkriptiotekijä CREB on yksi ylävirran sääntelyviranomaisten TCS aiheuttaman solukierron pysähtymisen syöpäsoluissa.

Johtopäätös

Meidän tulokset osoittavat, ensimmäistä kertaa, että TCS indusoi erityisiä solusyklin pidätyksen syöpäsolujen estämällä sitoutumista CREB CRE liittyvistä geeneistä solujen lisääntymistä.