Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Signaalin muuntimet ja Activator of Transcription 3 (STST3) on onkogeeni, joka edistää solujen eloonjäämistä, lisääntymistä, liikkuvuutta ja etenemistä syöpäsoluissa. Kohdistaminen STAT3 signalointi voi johtaa kehitystä uusien hoitomuotojen ihmisten syöpiin. Täällä, tutkimme vaikutuksia epigallocathechin gallate (EGCG) on STST3 signalointi haiman syöpäsoluissa, ja arvioidaan terapeuttista potentiaalia EGCG gemsitabiinihoito tai JAK3 estäjän CP690550 (Tasocitinib) hoitoon ja /tai ehkäisyyn haimasyövän.

Menetelmät /Principal havainnot

Solun elinkelpoisuus ja apoptoosin mitattiin XTT-määritys ja TUNEL värjäys, vastaavasti. -Geenin ja -proteiinin ilmaisuja mitattiin qRT-PCR: llä ja Western blot -analyysillä, vastaavasti. Tulokset paljastivat, että EGCG esti ilmaus fosfo ja koko JAK3 ja STAT3, STAT3 transkription ja aktivointia, sekä ilmentymistä STAT3 geenien, jolloin eston solun liikkuvuus, muuttoliike ja invaasio, ja induktio kaspaasi 3 ja PARP pilkkominen. Estyminen STAT3 tehosti estäviä vaikutuksia EGCG solujen liikkuvuutta ja elinkelpoisuutta. Lisäksi gemsitabiini ja CP690550 yksin esti STST3 kohdegeenien ja synergized kanssa EGCG estävän solujen elinkelpoisuuden ja aiheuttavat apoptoosia haiman syöpäsoluja.

Johtopäätökset /merkitys

Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, että EGCG vaimentaa kasvu, invaasio ja migraatio haimasyöpäsoluissa, ja indusoi apoptoosia häiritsemällä STST3 signalointireitille. Lisäksi EGCG entisestään terapeuttista potentiaalia gemsitabiinin ja CP690550 vastaan ​​haimasyöpä.

Citation: Tang SN, Fu J, Shankar S, Srivastava RK (2012) EGCG Parantaa terapeuttinen potentiaali Gemsitabiini ja CP690550 estämällä STAT3 signalointireitin Human Haimasyöpä. PLoS ONE 7 (2): e31067. doi: 10,1371 /journal.pone.0031067

Editor: Hana Algul, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: toukokuu 11, 2011; Hyväksytty: 01 tammikuu 2012; Julkaistu: 13 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Tang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustusta National Institutes of Health (R01CA125262, RO1CA114469 ja RO1CA125262-02S1) ja Kansas Bioscience Authority. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Signaalitransduktiota ja aktivaattorien transkription (STAT) proteiinit on perhe sytoplasman transkriptiotekijöitä, jotka ovat alunperin läsnä aktiivinen muodoissa [1], [2]. Ne stimuloidaan sitovat signaloinnin peptidejä, kuten sytokiinien, kasvutekijöiden ja hormonien, joka johtaa dime- niiden reseptoreihinsa ja aktivointi tyrosiinikinaasien, kuten Janus-kinaasi (JAK). Aktivoitu tyrosiinikinaasit voivat myöhemmin fosforyloivat sytoplasmadomeeneista reseptorien tarjota tunnistus- kohtien ei-fosforyloitua STAT monomeerit. Kun STAT fosforyloituu aktivoidaan tyrosiinikinaaseja sitoutumisen jälkeen, ne muodostavat homo- tai hetero-dimeerit kautta Src-homologia 2 (SH2) domain ja nopeasti siirtyä tumaan, jossa dimeerit sitoutuvat DNA-sekvenssit aktiiviseen geenistä transkription [1] , [2].

Lukuisat kokeet ovat osoittaneet, että normaali fyysinen toiminnot tilastot kriittisiä säätelyssä moniin solun lisääntymistä, erilaistumista, muuttoliike, ja selviytymistä. Kaikista STAT perheenjäsenten STAT3 on kaikkein liittyy kiinteästi solujen eloonjäämistä ja lisääntymistä ja kasvaimen kehittymisen [3], [4]. Se ilmentyy laajalti useimmissa kudoksissa ja sitä pidetään mahdollisena onkogeeni. STAT3 on usein konstitutiivisesti aktiivinen monissa ihmisen syöpäsoluissa, mukaan lukien multippeli myelooma, glioblastooma, leukemia, lymfooma, rintasyöpä, eturauhassyöpä, keuhkosyöpä, ja kaulan alueen syöpä [5], [6], [7]. STAT3 voidaan aktivoida useita sytokiineja, mukaan lukien IL-6, IL-11, siliaarinen neurotrofinen tekijä, ja leukemiaa estävä tekijä, joka kaikki käyttävät gp130-tyypin reseptoreihin. Mielenkiintoista, STAT3 voi edistää joko apoptoosin tai selviytymistä eri elimissä ja solutyyppejä. Se voi edistää leviämistä hepatosyyteissä [8], hermosolujen [9], ja T-solujen [10], mutta on välttämätöntä, että apoptoosin maitorauhasen [11] ja ydinsoluissa [12].

STAT3 on piilevä transkriptiotekijä, joka sijaitsee sytoplasmassa. Aktivoitaessa tyrosiinifosforylaation, STAT3 dimeroituu, siirtyy tumaan ja sitoutuu tuman DNA moduloimaan kohdegeenien transkription. STAT3 fosforylaatio välittyy pääasiassa aktivoitumisen kautta ei-reseptoriproteiinin tyrosiinikinaasiryh- Jaks, joihin kuuluu useita jäseniä JAK1, JAK2, JAK3 ja tyrosiinikinaasi-2 [13], [14]. Lisäksi STAT3 fosforylaatio voidaan välittämä ylikuulumisen c-Src [13], [14], [15]. Suurimmat fosforylaatio sivustoja STST3 kuuluvat tyrosiini- ja seriini asemissa Tyr

705 ja Ser

727, vastaavasti, joka sijaitsee transaktivaatiodomeenin. Aktivointi STST3 aiheuttaa ilmentymistä monissa kohdegeenien vaaditaan kasvainsolujen eloonjäämisen (esim Bcl-X

L, Mcl-1 ja surviviiniperäisten), lisääntymistä (esim. Sykliini D1 ja c-myc) ja angiogeneesiä [esim. verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF)] sekä etäpesäkkeiden [16]. Siten STAT3-signalointireitistä on ollut suosikki terapeuttinen kohde lääkekehityksen [17], [18].

Gemsitabiini (nukleosidianalogi) osoittivat suurempaa kliinistä hyötyä haimasyövän potilaille verrattuna perinteiseen elämäntapaan [19 ]. Jotkut tehokas ja selektiivinen JAK3 estäjät, esim. CP690550, osoittivat merkittävää kliinistä aktiivisuutta syövän [20], [21]. CP690550 edustaa vain lähtökohta etsittäessä turvallisemman pienimolekyylisiä immunosuppressiiviset, ja että isoentsyymin-selektiivinen JAK3 estäjä tunnistetaan rationaalinen lääkekehityksessä voi mennä huomattavasti turvallisempaa. Viime vuosina monia uusia oivalluksia on saatu osaksi tutkimuksen erilaisten puhdistettu yhdisteiden luonnontuotteista. Esimerkiksi EGCG on tärkeä catechin vihreän teen ja on tunnustettu tärkeäksi chemopreventive aineena ja modulaattorit kasvaimen soluvasteen kemoterapiaa [22], [23], [24]. Sen on osoitettu estävän solujen proliferaatiota [25], apoptoosin [26] tuumorisoluissa, estää angiogeneesiä [27], moduloida invaasion ja migraation syöpien, ja häiritä useita signalointireittien, kuten tumatekijä-KB-signalointireitin [28], epidermaalisen kasvutekijän-välitteisen reitin [29], insuliinin kaltainen kasvutekijä-I-signalointireitin [30], mitogeeni-aktivoitu proteiinikinaasi-riippuvaisen reitin [31], ja proteasomin hajoamisreitit [32].

tässä tutkimuksessa selvitimme vaikutuksia EGCG on STST3 signalointi ihmisen haimasyövän soluja, ja arvioi myös interaktiivinen vaikutuksia EGCG gemsitabiinihoito tai JAK3 estäjän CP690550 niiden terapeuttista potentiaalia. Huomasimme, että EGCG esti ilmaus JAK3 ja STAT3 (fosfo ja yhteensä), STAT transkription ja aktivointia, sekä ilmentymistä STAT3 geenien, jolloin eston solun liikkuvuus, muuttoliike ja invaasio, ja induktio kaspaasi 3 ja PARP cleavages. Esto STAT3 mukaan shRNA haiman syöpäsoluissa parantaa estäviä vaikutuksia EGCG solujen muuttoliikettä ja liikkuvuutta. Tuloksemme osoittavat, että aktivointi STAT3 signalointireitin on kriittinen kasvuun haimasyövän soluja, ja viittaavat siihen, että egcg kohdistaminen STAT3 signalointi voi olla potentiaalisen terapeuttisen intervention haimasyöpä. Lisäksi yhdistelmä EGCG gemsitabiinin kanssa tai CP690550 oli additiivinen /synergistinen vaikutukset solujen elinkelpoisuuteen ja apoptoosin.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

Ihmisen haimasyövän solulinjoja AsPC-1 ja PANC-1 hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA), ja niitä viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Thermo Scientific) ja 1% antibiootti-antimykoottia (Invitrogen) on 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa ja 5% CO

2.

Cell transfektio

STAT3 shRNAs suunniteltiin käyttäen BLOCK-iT ™ RNAi Designer (Invitrogen) kantavassa hakunumero saatiin Gene pankki. Sekvenssit STAT3 shRNAs (hakunumero: NM_139276) on vastaavat koodaavat alueet 398-416 (5′-CCA CTT TGG TGT TTC ATA A-3 ’), 1070-1088 (5′-CCCGTCAACAAATTAAGAA-3′), 1448 -1466 (5’-GCC TCT CTG CAG AAT TCA A-3 ’) ja 1935-1953 (5′-GGA CAA TAT CAT TGA CCT T-3’) nukleotidin. AsPC-1 ja PANC-1-solut transfektoitiin seoksella shRNAs käyttäen Lipofetamine 2000 (Invitrogen). Kun oli kulunut 24 h transfektion jälkeen solut käsiteltiin EGCG. Soluja käytettiin solujen elinkelpoisuuden havaitsemiseen, naarmu määritys, qRT-PCR ja western-blottauksella.

XTT-määritys

Solut (1 x 10

4 200 ul viljelyalustassa per kolo) ympättiin 96-kuoppalevylle (tasapohja), käsiteltiin tai ilman lääkkeitä ja inkuboitiin eri ajankohtina 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Ennen kokeen lopussa, 50 ui XTT merkintöjä seosta (lopullinen konsentraatio 125 uM XTT (natrium-2,3-bis (2-metoksi-4-nitro-5-sulfofenyyli) -2H-tetratsolium-5-karboksanilidi sisäinen suola) ja 25 uM PMS (fenatsiini- metosulfaatti) per kuoppa lisättiin ja levyjä inkuboitiin vielä 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. spektrofotometrinen absorbanssi näytteestä mitattiin käyttäen mikrotiitterilevyn (ELISA-lukijassa). aallonpituus mitataan absorbanssi formazon tuote oli 450 nm, ja viittaus aallonpituus oli 650 nm.

kaspaasi-3/7 Pitoisuus

Solut (3 x 10

4 kuoppaa kohti ) ympättiin 96-kuoppalevylle 200 ul: lla elatusaineesta. Noin 16 tuntia myöhemmin soluja käsiteltiin eri annoksilla egcg. Casapse-3/7 aktiivisuus mitattiin kuten valmistajan ohjeiden mukaisesti (Invitrogen).

Scratch määritys

AsPC-1 salattuja ja STAT3 shRNA soluja siirrostettiin 6 kuopan astioihin. Kun kaikki viljelmät olivat 50% konfluentteja, risti oli merkitty kunkin maljan keskellä käyttäen 10 ui kärkeä. Solut pestiin PBS: llä ja viljeltiin tuoreessa väliaineessa. Naarmu kuvat otettiin fluoresenssimikroskoopilla 0, 24 ja 48 h samoihin asemiin, kun solut käsiteltiin EGCG.

TranswellTM migraatiokokeessa

vaikutuksen määrittämiseksi EGCG on solujen vaeltamiseen, AsPC-1 ja PANC-1-solut maljattiin yläosassa kammion päälle noncoated kalvo (24-kuoppaiset insertin, huokoskoko, 8 um; Corning Costar) tiheydellä 1 x 10

4 solua /hyvin RPMI, joka sisälsi 1% FBS: ää, ja annettiin siirtyä kohti RPMI, joka sisälsi 10% FBS: ää alemmassa kammiossa. Egcg lisättiin sekä kammioihin saavuttaa pitoisuus 0, 20, 40, 60 uM, vastaavasti. 24 tunnin inkubaation jälkeen solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja värjättiin kristallivioletilla. Siirrettyjä solut laskettiin valomikroskoopilla (neljä random kentät per kuoppa).

TranswellTM invaasiomääritys

vaikutuksen määrittämiseksi EGCG solujen invaasio, AsPC-1 ja PANC-1-soluissa maljattiin yläosassa kammion päälle Matrigel päällystetyn kalvon (24-kuoppaisilla insertin, huokoskoko, 8 um, Corning Costar) tiheydellä 1 x 10

4 solua /kuoppa RPMI-väliaineessa, joka sisälsi 1% FBS: ää, ja saa hyökätä kohti RPMI, joka sisälsi 10% FBS alemmassa kammiossa. Egcg lisättiin sekä kammioihin saavuttaa pitoisuus 0, 20, 40, 60 uM, vastaavasti. 48 tunnin kuluttua inkubaation kuin hyökkäsi solut poistettiin pumpulipuikolla, ja hyökkäsi solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja värjättiin kristallivioletilla. Tunkeutuneet solut laskettiin valomikroskoopilla (neljä random kentät per kuoppa).

Transient transfektion ja STAT3 toimittaja

AsPC-1 ja PANC-1-soluja viljeltiin 100 mm ruokia ja transfektoidaan 70% konfluentteja kanssa pGreenfire1-STAT3 reportteriplasmidilla käyttäen Lipofetamine 2000 (Invitrogen). 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin EGCG (0-80 uM). Sen jälkeen kun on inkuboitu 24 tuntia, lusiferaasin aktiivisuus määritettiin käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega), mukaan valmistajan ohjeiden on Multilabel levylukijalla (Wallac Victor, Perkin-Elmer).

RNA: n eristys ja todellisen -aika RT-PCR

Kokonais-RNA eristettiin AsPC-1 ja PANC-1-soluihin käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen). RNA-pitoisuus määritettiin käyttäen Nano Drop 2000 Spektrofotometri. cDNA syntetisoitiin ja RT-PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen SuperScript II (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Reaaliaikainen PCR suoritettiin Applied Biosystems 7300 real-time PCR System, käyttäen seuraavaa ohjelmaa: 50 ° C 2 min, 95 ° C: ssa 10 min, ja sitten 40 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C 1 min. PCR-alukkeet ostettiin Realtimeprimers.com. Kaikki reaktiot suoritettiin kolmena kappaleena, ja suhteellinen ilmentyminen kohde-mRNA kussakin näytteessä oli normalisoitu että keskimääräisen GAPDH.

PCR-alukkeita sekvenssit: GAPDH, eteenpäin aluke 5′- GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT – 3 ’; reverse-aluke 5’- TTG ATT TTG GAG GGA TCT CG -3 ’; STAT3, eteenpäin suuntautuvaa aluketta 5’- CCT TTG ACA TGG AGT TGA CC -3 ’; reverse-aluke 5’- TAA AAG TGC CCA GAT TGC TC -3 ’; Sykliini D1, aluketta 5’TTC AAA TGT GTG CAG AAG GA -3 ’, käänteinen aluke 5′-GGG ATG GTC TCC TTC ATC TT -3′; c-Myc, aluketta 5’- CGA CGA GAC CTT CAT CAA AA -3 ’, reverse-aluke 5′- TGC TGT CGT TGA GAG GGT AG -3’; Surviviinia eteenpäin aluke 5’TCC CTG GCT CCT CTA CTG TT -3 ’, käänteinen aluke 5′- TGT CTC CTC ATC CAC CTG AA -3′; VEGF, eteenpäin suuntautuvaa aluketta 5’- AGA CAC ACC CAC CCA CAT AC -3 ’, käänteinen aluke 5’TGC CAG AGT CTC TCA TCT CC -3’; BclX

L alukkeesta 5′- GCT CTC ACT CCC AGT CCA AA -3 ’, käänteinen aluke 5′-GCT GAG GCC ATA AAC AGC TC -3’.

immunofluoresenssivärjäyksellä

AsPC-1 ja PANC-1-soluja viljeltiin RPMI-väliaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää, ja sitä käsiteltiin EGCG (0, 40, 60 uM) 24 tunnin ajan. Sitten solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja värjättiin vasta-aineiden STAT3 (hiiren monoklonaalinen IgG1, Cell Signaling), 4 ° C: ssa yön yli. Solut pestiin ja inkuboitiin uudelleen anti-hiiri-FITC sekundaarista vasta-ainetta (Sigma) yhdessä DAPI (0,5 ug /ml). Stained Objektilasit asentaa kiinnitysväliaine ja visualisoitu fluoresenssimikroskoopilla. Paremman visuaalisuus, väri DAPI muutettiin punaisiksi. Vihreä väri edustaa ilmaus STAT3.

Western blotting-analyysi

havaitsemiseksi eri proteiineja, AsPC-1 ja PANC-1-solut käsiteltiin EGCG (0-60 uM) pestiin PBS: llä ja lyysattiin RIPA-puskuriin, joka sisälsi 1 x proteaasiestäjäseostabletit. Lysaatit sentrifugoitiin ja supernatantti otettiin talteen. Proteiinikonsentraatiot määritettiin käyttäen Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad). Proteiini uutteet (40 ug) erotettiin 12,5% SDS-PAGE. Siirretään membraanit blokattiin käyttämällä 5% rasvatonta kuivamaitoa, ja inkuboitiin yön yli primaarisilla vasta-aineilla on 1:1,000 laimennoksia TBS, minkä jälkeen sekundaarisia vasta-aineita, jotka on konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin on 1:5,000 laimennoksia TBS-Tween 20: ssa 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Kalvot kehitettiin käyttämällä ECL Alustan. Proteiinivyöhykkeet näkyviksi röntgenfilmille käytetään parannettua kemiluminesenssin järjestelmä.

Tilastollinen

Keskimääräinen ja SD laskettiin kunkin koeryhmän. Erot ryhmien välillä analysoitiin yksi tai kaksisuuntainen ANOVA käyttäen PRISM tilastollista analyysiä ohjelmisto (GrafPad Software, Inc., San Diego, CA). Merkittäviä eroja ryhmien laskettiin P 0,05.

Tulokset

EGCG estää maahanmuutto- ja invaasion haimasyövän soluja ja indusoi caspase3 aktiviteetti

On osoitettu, että STAT3 on tärkeä rooli säätelyssä solussa liikettä ohjaamalla solun tukirangan uudelleenjärjestelyjä ja soluadheesion ominaisuuksia [33]. Koska korrelaatio STAT3 ja solujen liikkumista, tutkimme vaikutuksia EGCG maahanmuutto- ja hyökkäys AsPC-1 ja PANC-1. Solut levytettiin yläosassa kammion päälle noncoated kalvo ja Matrigel päällystetty kalvo muuttoliikkeen ja invaasion havaitsemiseksi, vastaavasti. Kun hoidot EGCG, siirrettyjä ja hyökkäsi solut värjättiin ja laskettiin. Tulokset osoittavat, että siirretty ja tunkeutuu haiman solujen vähentää annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 1A ja B). Nämä tiedot osoittivat, että EGCG voi estää migraation ja invaasion haiman syöpäsoluja.

(A), TranswellTM migraatiokokeessa. AsPC-1 ja PANC-1-solut levytettiin ylä- kammioon siirtokuoppaan ja käsiteltiin EGCG (0-60 uM) 24 tunnin ajan. Solut siirtyneet alempaan chambered kiinnitettiin metanolilla, värjättiin kristallivioletilla ja laskettiin. Data edustaa keskiarvoa ± SD. * Tai ** = merkitsevä ero verrokkeihin nähden, P 0,05. (B) Matrigel invaasiomääritys. AsPC-1 ja PANC-1-solut maljattiin Matrigel päällystetty kalvo alkuun kammioon siirtokuoppaan ja käsiteltiin EGCG (0-60 uM) 48 tunnin ajan. Solut tunkeutuneet alempaan kammioon kiinnitettiin metanolilla, värjättiin kristallivioletilla ja laskettiin. Data edustaa keskiarvoa ± SD. * Tai ** = merkitsevä ero verrokkeihin nähden, P 0,05. (C), kaspaasi-3: n aktiivisuuden. AsPC-1 ja PANC-1-soluja käsiteltiin EGCG (0-40 uM) 48 tuntia, ja kaspaasi-3-aktiivisuus mitattiin valmistajan ohjeiden mukaisesti (Invitrogen). Data edustaa keskiarvoa ± SD. * = Merkitsevä ero verrokkeihin nähden, P 0,05. (D), AsPC-1 ja PANC-1-soluja käsiteltiin EGCG (0-60 uM) kanssa tai ilman gemsitabiinin (0,5 uM) 48 tuntia. Solut kerättiin, ja Western blot -analyysi suoritettiin ekspression tutkimiseksi PARP ja kaspaasi-3. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. PARP-vasta-aine tunnistaa pilkotun PARP, ja kaspaasi-3-vasta-aine tunnistaa lohkaistaan ​​/aktiivinen kaspaasi-3.

kaspaasi-3 on jäsen kysteiini-asparagiinihapon proteaasi (kaspaasi) -perheen ja aktivoituvat apoptoottisen cell sekä ulkoista (kuolema ligandi) ja sisäinen (mitokondrion) väyliä [34]. Egcg indusoi kaspaasi-3: n aktiivisuuden annoksesta riippuvaisella tavalla sekä AsPC-1 ja PANC-1-soluissa, mitattuna fluorometrisellä määrityksellä (kuvio. 1C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että egcg voi indusoida apoptoosia aktivoimalla kaspaasi-3.

egcg lisää gemsitabiinin aiheuttama lohkaisu caspase3 ja PARP haiman syöpäsoluissa

PARP liittyy normaalisti DNA: n korjaukseen, DNA vakaus , ja muut solujen tapahtumia, ja pilkkoutuu jäsenten kaspaasi perheen alkuvuodesta apoptoosin; Näin ollen, se on substraatti kaspaasi aktiivisuus ja luotettava merkki apoptoosin [35]. Seuraavaksi me tutki EGCG ja gemsitabiinia vuorovaikutuksessa yhdessä pilkkovan kaspaasi-3 ja PARP AsPC-1 ja PANC-1-soluissa. EGCG ja gemsitabiinin yksin indusoi pilkkominen kaspaasi-3 molemmissa solulinjoissa. Lisäksi yhdistelmä EGCG gemsitabiinin kanssa indusoi huomattavasti enemmän kaspaasi-3 pilkkominen kuin ainoana lääkkeenä yksinään (Fig. 1 D). EGCG ja gemsitabiinin yksin osoitti PARP lohkaisu AsPC-1 ja PANC-1-soluissa. Vertailun vuoksi yhdistelmä EGCG gemsitabiinin kanssa johti parannettu PARP pilkkominen. Nämä tiedot viittaavat siihen, että egcg voi indusoida apoptoosia kaspaasi-3-aktivaation ja PARP pilkkominen.

egcg estää JAK3 /STAT3-reaktiotien haimasyövän

vieressä tutkittiin vaikutuksia egcg ekspressioon STAT3, fosforylaatiota STAT3 ja JAK3 ja ydinvoiman ilmentyminen fosfo-STAT3 in AsPC-1 ja PANC-1-soluissa. Vaikutusten tutkimiseksi egcg on STAT3 ilmaisun, suoritimme qRT-PCR-analyysi (Fig. 2A).

(A), AsPC-1 ja PANC-1-soluja käsiteltiin EGCG (0-60 uM) 48 tuntia, ja ilmentyminen STAT3 mitattiin q-RT-PCR: llä. Data edustaa keskiarvoa ± SD. * Tai ** = merkitsevä ero verrokkeihin nähden, P 0,05. (B), AsPC-1 ja PANC-1-soluja käsiteltiin EGCG (0-60 uM) 48 tuntia. Ilmentymisen STAT3, p-STAT3, JAK3 ja p-JAK3 mitattiin Western blot-analyysi. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (C), Expression of STAT3: in AsPC-1 ja PANC-1-soluissa. Soluja käsiteltiin EGCG (0-60 uM) 48 tuntia. Inkuboinnin jälkeen ilmentyminen STAT3 mitattiin immunoflurescence. DAPI käytettiin tahraa ytimiä. Paremman visuaalisuus, väri DAPI muutettiin punaisiksi. Vihreä väri edustaa ilmaus STAT3. Punainen väri = ytimeksi.

EGCG esti ilmentymistä STAT3 mRNA sekä AsPC-1 ja PANC-1-soluissa. Me seuraavaksi mitataan ilmentyminen koko ja fosforyloidun JAK3 ja STAT3, jonka Western blot -analyysissä (kuvio. 2B). Egcg inhiboi fosforylaatiota sekä JAK3 ja STAT3 annoksesta riippuvalla tavalla AsPC-1 ja PANC-1-soluissa. Yllättäen ilmentyminen sekä JAK3 ja STAT3 myös inhiboi egcg. Nämä tiedot viittaavat siihen, että EGCG voi estää ilmentymisen JAK3 ja STAT3, sekä niiden jälkeistä käännös muutos.

Koska STST3 on konstitutiivisesti aktiivinen haiman syöpäsoluissa, me seuraavaksi tutkinut, mitä vaikutuksia EGCG on STST3 ilmaisu immunofluoresenssilla . Kuten on esitetty kuviossa. 2C, egcg esti ilmentymisen STAT3 (läsnäolo vihreä väri) annoksesta riippuvalla tavalla sekä solulinjoissa. Nämä tiedot viittaavat siihen, että apoptoosin inhibitio, jonka EGCG liittyy tukahduttaminen JAK3 /STAT3: n kautta.

egcg estää STAT3 transkriptiota ja ilmentymistä STAT3-geenien

STAT3 pidetään onkogeeni, koska se korreloi kasvaimen kehittymisen [7]. Siksi on tarpeen määrittää vaikutuksen EGCG on STAT transkriptioaktiivisuuden. Haimasyövän soluja transfektoitiin pGreen fire1-STAT3 reportteriplasmidilla ja käsiteltiin EGCG (0-80 uM). Sen jälkeen kun on inkuboitu 24 tuntia, lusiferaasin aktiivisuus määritettiin reportterimääritys. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, egcg esti STAT3 transkriptionaalista aktiivisuutta annoksesta riippuvalla tavalla haimasyövän AsPC-1 ja PANC-1-soluissa.

(A), STAT3 aktiivisuus. AsPC-1 ja PANC-1-solut transfektoitiin pGreenfire1-STAT3 reportteriplasmidilla. Soluja käsiteltiin EGCG (0-80 uM). Inkuboinnin jälkeen 24 tuntia, lusiferaasin aktiivisuus määritettiin käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay System, mukaan valmistajan ohjeiden on Multilabel levylukijalla. Data edustaa keskiarvoa ± SD. * = Merkitsevä ero verrokkeihin nähden, P 0,05. (B), VEGF, Bcl-X

L, c-Myc, surviviinia ja sykliini D1 havaittiin qRT-PCR: llä. Data edustaa keskiarvoa ± SD. * = Merkitsevä ero verrokkeihin nähden, P 0,05.

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että STAT3 voi säätelemään monien geenituotteiden mukana proliferaatiota ja elossa pysymistä, angiogeneesiä ja anti-apoptoosin [7] . Esimerkiksi VEGF, Bcl-X

L, c-Myc, Surviviinispesifisiä ja sykliini D1 säätelee STAT3 aktivointi [17], [36]. Kuten kuviossa. 3B, STAT3 geenien, c-Myc, Surviviinispesifisiä ja sykliini D1 inhiboi EGCG AsPC-1 ja PANC-1-soluissa. Egcg myös vähensi VEGF: n ilmentyminen in AsPC-1-soluissa, ja Bcl-X

L PANC-1-soluissa. Nämä tiedot osoittavat, että egcg voi estää ilmentymisen STAT3-geenien haiman syöpäsoluissa. Nämä STAT-3 kohdegeenien on osoitettu säätelevän solujen proliferaatiota ja ajan, apoptoosia ja angiogeneesiä.

inhibitio STAT3 parantaa estäviä vaikutuksia egcg solun motiliteettia ja elinkelpoisuuden haiman syöpäsoluissa

tässä työssä STST3 shRNA käytettiin hiljentää STST3 geeniekspression AsPC-1 ja PANC-1-soluissa. STAT3 shRNA inhiboi ilmentymistä STAT3 sekä AsPC-1 ja PANC-1-soluja, kuten osoittaa Western blot -analyysillä (kuvio. 4A). Vaikutusten tutkimiseksi egcg haiman syöpäsoluissa, tyhjästä ja solujen elinkelpoisuuden määritykset suoritettiin käyttäen sekä salattu ja STAT3 shRNA soluja. Scratch määrityksessä inhiboivia vaikutuksia EGCG siirtyvien AsPC-1-solut parantaa estämällä STAT3 geeniekspressiota (Fig. 4B). Egcg ja STAT3 shRNA yksinään vähensi prosenttia elinkelpoisten AsPC-1 ja PANC-1-solujen annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 4C). Mielenkiintoista on, että inhiboivia vaikutuksia egcg solujen elinkelpoisuus edelleen parantaa STAT3 shRNA sekä solulinjoissa.

(A), AsPC-1 ja PANC-1 transfektoitiin STAT3 shRNA. Ilmentyminen STAT3 suoritettiin Western blotting. (B), AsPC-1 naarmu määrityksessä. AsPC-1 salattuja ja STAT3 shRNA soluja viljeltiin 6 hyvin ruokia. Scratch leimasi kun astiat olivat 50% konfluentteja. Kuvat on otettu sen jälkeen, kun soluja käsiteltiin egcg ja inkuboitiin 0, 24 ja 48 tuntia. (C), Cell elinkyvyn. AsPC-1 ja PANC-1 (salattu ja STAT3 shRNA) soluja ympättiin ja sitä käsiteltiin EGCG (0, 20, 40, 60 uM). 72 tunnin kuluttua hoidon, solujen elinkelpoisuus suoritettiin XTT-määritys. Data edustaa keskiarvoa ± SD. * Tai ** = merkitsevä ero verrokkeihin nähden, P 0,05.

vieressä tutkinut, mitä vaikutuksia STAT3 shRNA sääntelystä STAT3-kohdegeenien by EGCG. Egcg esti ilmentymistä STAT3-säädellään geenin sykliini D1 sekä AsPC-1 /salattuja ja PANC-1 /salattu solut (Fig. 5 ja B). STAT3 shRNA esti täydellisesti ekspression sykliini D1 sekä haimasyövän solulinjoissa läsnä ollessa tai poissa ollessa egcg. EGCG esti myös hän ilmaus Bcl-X

L ja c-Myc in PANC-1 /salattu soluja. Bcl-X

L ja c-Myc myös esti in PANC-1 /STAT3 shRNA soluja verrattuna PANC-1 /salatut soluja. Kuitenkin egcg voinut edelleen estää Bcl-X

L ja c-Myc in PANC-1 /STAT3 shRNA soluja. Nämä tiedot viittaavat siihen, että egcg voi säädellä haimasyöpä solun liikkuvuus ja elinkelpoisuus, jotka liittyvät STAT3 kautta.

(A), AsPC-1 /salattuja ja AsPC-1 /STAT3 shRNA soluja käsiteltiin kanssa tai ilman EGCG ( 60 uM) 48 tunnin ajan. Ilmaisu sykliini D1 mitattiin q-RT-PCR: llä. Data edustaa keskiarvoa ± SD. * = Merkitsevä ero verrokkeihin nähden, P 0,05. (B), PANC-1 /salattuja ja PANC-1 /STAT3 shRNA soluja käsiteltiin kanssa tai ilman EGCG (60 uM) 48 tunnin ajan. Ilmaisu sykliini D1 mitattiin q-RT-PCR: llä. Data edustaa keskiarvoa ± SD. * = Merkitsevä ero verrokkeihin nähden, P 0,05. (C), PANC-1 /salattu ja PANC 1 /STAT3 shRNA soluja käsiteltiin kanssa tai ilman EGCG (60 uM) 48 tunnin ajan. Ilmaisu Bcl-X

L mitattiin qRT-PCR. Data edustaa keskiarvoa ± SD. * = Merkitsevä ero verrokkeihin nähden, P 0,05. (D), PANC-1 /salattuja ja PANC-1 /STAT3 shRNA soluja käsiteltiin kanssa tai ilman EGCG (60 uM) 48 tunnin ajan. Ilmaisua c-Myc mitattiin q-RT-PCR: llä. Data edustaa keskiarvoa ± SD. * = Merkitsevä ero verrokkeihin nähden, P 0,05.

Gemsitabiini synergoi EGCG estävän solujen elinkelpoisuuden ja aiheuttaa apoptoosin haimasyöpäsoluissa

Gemsitabiini on tullut suosittu kemoterapeuttinen aine hoidettaessa kehittyneiden ja metastasoituneen haimasyövän, ja hyötyä tästä single-aine on pieni mutta merkittävä parantamiseen kokonaiselinajan mediaani [19]. Vaikutusten testaamiseksi gemsitabiinin kanssa EGCG solujen elinkelpoisuuden haimasyövän soluja käsiteltiin gemsitabiinin (0,5 uM) tai ilman kasvavia konsentraatioita EGCG (0-60 uM) 72 tunnin ajan. Kuten on esitetty kuviossa. 5A, solujen elinkelpoisuus estyi egcg ja gemsitabiini yksin, ja estäviä vaikutuksia gemsitabiinin solujen elinkelpoisuus edelleen parantaa egcg näissä kahdessa solulinjassa (kuvio. 6A).

(A), AsPC-1 ja PANC-1-soluja käsiteltiin EGCG (0, 20, 40, 60 uM) kanssa tai ilman gemsitabiinin (0,5 uM) 72 tuntia. Solujen elinkelpoisuus mitattiin XTT-määrityksellä. Data edustaa keskiarvoa ± SD. * Tai ** = merkitsevä ero verrokkeihin nähden, P 0,05. (B), AsPC-1 ja PANC-1-soluja käsiteltiin EGCG (0, 20, 40, 60 uM) kanssa tai ilman gemsitabiinin (0,5 uM) 72 tuntia. Apoptoosi mitattiin TUNEL määrityksessä. Data edustaa keskiarvoa ± SD. * Tai ** = merkitsevä ero verrokkeihin nähden, P 0,05. (C), Inhibition of STAT3 kohde- geenien egcg ja gemsitabiinia. AsPC-1 ja PANC-1-soluja käsiteltiin EGCG (20 uM) tai gemsitabiinia (0,5 uM) 48 tuntia. VEGF: n ilmentymistä, c-Myc, surviviini ja sykliini D1was mitattiin qRT-PCR: llä. Data edustaa keskiarvoa ± SD. * = Merkitsevä ero verrokkeihin nähden, P 0,05.

vieressä tutki interaktiivisia vaikutuksia EGCG gemsitabiinihoito on apoptoosia sekä AsPC-1 ja PANC-1 solulinjoissa (Fig. 6B). Egcg aiheutti apoptoosia sekä solulinjoissa annoksesta riippuvalla tavalla. Samoin gemsitabiini aiheutti apoptoosia sekä AsPC-1 ja PANC-1-soluissa. Kaikki annokset EGCG entisestään vaikutuksia gemsitabiinin apoptoosiin. Nämä tiedot viittaavat siihen, että EGCG voidaan yhdistää gemsitabiinin hoitoon haimasyövän potilaille.

vieressä tutki vaikutuksia EGCG ja gemsitabiinin ilmenemistä c-Myc ja sykliini D1 AsPC-1 ja PANC-1-soluissa (Fig. 6C). Egcg ja gemsitabiinin yksin inhiboi VEGF: n ilmentymistä, c-Myc, surviviini ja sykliini D1was sekä solulinjoissa. Yhdistelmä egcg ja gemsitabiinin oli lisäaineen vaikutukset näihin kohdegeenien. Nämä tiedot viittaavat siihen, että egcg voivat parantaa terapeuttista potentiaalia gemsitabiinin haiman syöpäsoluissa estämällä STAT3.

JAK3 estäjä CP690550 inhiboi solujen elävyys haiman syöpäsoluissa

CP690550 on uusi JAK3: n estäjä ja odotettavissa kohdistaa JAK3, joka ilmaistaan ​​yleensä vain immuunisolujen ja on vain sitoo gamma-ketjun kantava sytokiinireseptorit mukana JAK /STAT signalointireitin [37]. Olemme ensi tutkinut, mitä vaikutuksia CP690550 solujen elinkelpoisuutta AsPC-1 ja PANC-1-solut (Fig. 7). CP690550 inhiboi solujen elinkelpoisuus molemmissa solulinjoissa annoksesta riippuvalla tavalla. Nämä tiedot viittaavat siihen, että CP690550 voi olla mahdollinen syöpälääkettä hoitoon haimasyöpä.

(A), AsPC-1-solut ympättiin 96-kuoppalevyille 4 x 10

4 solua kuoppaa kohti ja käsiteltiin CP690550 (0-15 uM) 72 tuntia. Solujen elinkelpoisuus mitattiin XTT-määrityksellä. Data edustaa keskiarvoa ± SD. * = Merkitsevä ero ohjaus, P 0,05. (B), PANC-1-solut ympättiin 96-kuoppalevyille 4 x 10

4 solua per kuoppa ja käsiteltiin CP690550 (0-15 uM) 72 tuntia. Solujen elinkelpoisuus mitattiin XTT-määrityksellä. Data edustaa keskiarvoa ± SD. * = Merkitsevä ero kontrollista, P 0,05.

CP690550 synergistisesti EGCG estää solujen elinkelpoisuuden haiman syöpäsoluissa

Koska CP690550 aiheuttaman apoptoosin haiman syöpäsoluissa, seuraavan kerran pyrittiin tutkia interaktiivinen vaikutuksia CP690550 ja EGCG solun elinkelpoisuuden ja apoptoosin haimasyövän soluja (Fig. 8). Kuten on esitetty kuviossa.