Krooninen sairaus

tiivistelmä

RGS10 säätelee munasarjasyövän solujen kasvua ja selviytymistä, ja RGS10 ilmentyminen vaimennetaan solumalleissa munasarjasyövän chemoresistance. Kuitenkin mekanismit RGS10 ilmentymistä munasarjasyövän tunnetaan huonosti. Kirjoittajat raportoivat RGS10 tukahduttaminen perusterveydenhuollossa munasarjasyöpä ja CAOV-3 munasarjasyöpäsoluja verrattuna kuolemattomaksi munasarjojen pinnan epiteelisolujen (menettää tavallisesti) soluja ja A2780-AD solunsalpaajaresistentti solujen verrattuna vanhempien A2780 soluihin. RGS10-1 ja RGS10-2 selostukset ilmaistu munasarjasyöpäsoluja, mutta vain RGS10-1 vaimennetaan A2780-AD ja CAOV-3-soluissa, ja RGS10-1 promoottori on ainutlaatuinen rikastettu CpG dinukleotideissä. Farmakologinen estämällä DNA metyyli-transferaasit (DNMTs) lisääntynyt RGS10 ilmaisua, mikä viittaa mahdollisten sääntelyn DNA: n metylaatio. Bisulfiitti Sekvensointianalyysin tunnisti alueen RGS10-1 promoottorin kanssa tehostaa merkittävästi DNA-metylaation solunsalpaajaresistentti A2780-AD solujen suhteessa vanhempien A2780 soluihin. DNA: n metylaatio in CAOV-3 ja menettää tavallisesti soluissa oli samanlainen A2780 soluihin. Selvempi eroja havaittiin histoni asetylaatio RGS10-1 promoottori. Asetyloitu histoni H3 liittyvä RGS10-1 promoottori oli merkitsevästi pienempi A2780-AD solujen verrattuna vanhempien soluihin, joissa on vastaava lisäys histonideasetylaasi (HDAC) entsyymi -alueella. Samoin asetyloitu histoni tasoilta RGS10-1 promoottori oli selvästi pienempi CAOV-3-soluissa verrattuna menettää tavallisesti soluihin, ja HDAC1 sitoutuminen kaksinkertaistui CAOV-3-soluissa. Lopuksi osoitamme, että farmakologinen esto DNMT tai HDAC-entsyymien solunsalpaajaresistentti A2780-AD soluissa lisää RGS10 ilme ja parantaa sisplatiinin toksisuutta. Nämä tiedot viittaavat siihen, että histoni de-asetylointi ja DNA: n metylaation korreloivat RGS10 tukahduttaminen ja chemoresistance munasarjasyövän. Merkkiaineita menetys RGS10 ilmentyminen voi tunnistaa syöpäsoluja ainutlaatuisia vastauksena terapeuttisia.

Citation: Ali MW, Cacan E, Liu Y, Pierce JY, Creasman WT, Murph MM, et al. (2013) Transkription Suppression DNA Metylointi ja Histone deasetylointi Regulator G-Protein signalointi 10 (RGS10) Gene in munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 8 (3): e60185. doi: 10,1371 /journal.pone.0060185

Academic Editor: James Porter, University of North Dakota, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 marraskuu 2012; Hyväksytty: 22 helmikuu 2013; Julkaistu: 22 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Ali et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitusta tämä työ saatiin avustusta National Institutes of Health (NIH) (CA151006 kohteeseen SBH ja MM, CA131200 Ste), American Cancer Society (ja SFG) ja Marsha Rivkin Center for Munasarjojen Cancer Research (ja SBH). (Www.nih.gov/, www.cancer.org/, www.marsharivkin.org/) Rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpäsolut hyödyntää useita reseptorivälitteisen kasvua ja selviytymistä signalointireittejä kiertää normaalin liikkumattomuus ja solukuolemaa vasteita. Monistaminen näistä reiteistä on yleinen mekanismi syövän etenemiseen. Activation of G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien ligandit lysofosfatidihappo (LPA), endoteliini, strooman kasvutekijä-1 (SDF1), prostaglandiinit, ja trombiini edistää etenemistä useiden syöpien, ja lääkkeet, jotka estävät näitä reseptoreita ovat tällä hetkellä eri vaiheissa kliinisissä tutkimuksissa syöpähoitojen [1]. Nämä GPCR: t aloittaa kasvua ja selviytymistä signa- aktivoimalla solun G-proteiineja. G-proteiinin aktiivisuutta lopetetaan säädin G-proteiinin signalointi (RGS-proteiinit) voidaan nopeasti poistaa G-proteiineja ja ohjata voimakkuus ja kesto GPCR-vireille reittejä [2]. RGS proteiineja, jotka tukahduttaa onkogeeniset signaalit välittävät GPCR ligandit ovat valmiita estämään syövän kasvua. Itse asiassa, tietyn RGS-proteiinit on osoitettu tukahduttaa reseptoriin stimuloiman kasvun ja eloonjäämisen signalointia rinta-, eturauhas-, ja munasarjasyöpä [3] – [5].

Munasarjasyöpä on johtava kuolinsyy gynekologisista syövistä ja viidenneksi yleisin syy syövän naisten yleisin kuolinsyy. Alle 50% munasarjasyöpä potilaiden hengissä viiden vuoden kuluttua niiden diagnosointi [6]. Vaikka munasarjasyövän on ominaista suuri vastausprosentti kemoterapiaa, sen korkea kuolleisuus on suurelta osin resistenssin kehittyminen ensilinjan kemoterapia-aineiden [7]. Suurin osa potilaista, jotka alunperin reagoivat kemoterapiaa uusiutumisen kanssa solunsalpaajaresistentti tauti kahden vuoden kuluessa [8]. Ymmärtäminen molekyyli- ja geneettisiä muutoksia, jotka ajavat munasarjasyöpä etenemistä ja kehittymistä hankittujen chemoresistance voi johtaa strategioita ennakoida ja estää esiintyminen tulenkestävä tauti.

Olemme osoittaneet, että endogeeniset RGS proteiinit tukahduttaa munasarjasyövän solujen kasvua, muuttoliike, ja MAP-kinaasin aktivaation vastauksena LPA, merkittävä autokriinikasvutekijänä munasarjasyövän [3], [9]. Viime aikoina olemme tunnistaneet RGS10 tärkeä säätelijä solujen eloonjäämistä ja chemoresistance. RGS10 transkriptio ilmentyminen säädeltiin vähentävästi useita malleja hankittujen chemoresistance munasarjasyövän, ja RGS10 ekspressiotasot muuttaa munasarjasyöpäsolu herkkyyttä sisplatiinin ja taksaania sytotoksisuus [10]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että suppressio RGS10 ilmentyminen voi myötävaikuttaa munasarjasyöpä etenemistä ja kehittymistä chemoresistance monistamalla GPCR-välitteistä kasvun ja eloonjäämisen signalointireitteihin. Kuitenkin mekanismi tukahduttaminen RGS10 ilmentymisen munasarjasyövän ei ole osoitettu.

RGS proteiinin ilmentymistä dynaamisesti säännelty hermo ja verenkiertoelimistöön [11] ja syövän etenemistä [12], mikä mahdollistaa monimutkaisten hallita GPCR signalointireittejä. Transkription ja translaation jälkeistä valvovat RGS ilmaisun ovat hyvin määriteltyjä [13] – [16], kun taas epigeneettiset valvonta RGS ilmaisun kovalenttisella muutoksia DNA: n tai histonien on ollut paljolti hyödyntämättä. Geenien DNA metylaatio ja histoni deasetylaatiolla on vakiintunut mekanismi etenemisessä moniin syöpiin [17], kuten munasarjasyöpä [18] – [20]. Lisäys metyyliryhmiä CpG dinukleotideissä DNA metyylitransferaasin (DNMT) entsyymejä ja poistaminen asetyyli- ryhmien lysiinijäämien histoniproteiineista mukaan histonideasetylaasi- (HDAC) entsyymit koordinoidusti tukahduttaa transkriptioaktiviteettia [21]. DNA: n metylaatio ja DNMT ilmaisun kasvu munasarjasyövän etenemisessä [22], ja histonideasetylaaseja (HDAC) on myös yli-ilmentyy munasarjasyövän kudoksissa [23]. Tämä viittaa siihen, että epigeneettisellä sääntely RGS geenit saattavat myös edistää niiden dynaamista ilmaisun syövän etenemiseen.

Nykyisessä tutkimuksessa tutkimme epigeneettiset sääntelyn RGS10 ilmentymisen munasarjasyöpäsoluja. Keskitymme kaksi mallia RGS10 tukahduttaminen – CAOV-3 munasarjasyöpäsoluja verrattuna hyvänlaatuinen munasarjaepiteelisoluilla, ja solunsalpaajaresistentti A2780-AD solut ja niiden chemosensitive vanhempien soluja. Tunnistamme merkittäviä lisäyksiä DNA-metylaation solunsalpaajaresistentti soluissa, ja huomattavaa laskua histoni asetylaatio ja korotukset HDAC1 assosiaatio RGS10 promoottori sekä CAOV-3 ja A2780-AD soluissa. Tuloksemme viittaavat siihen, että epigeneettisiä histonimodifikaation voivat edistää menetys RGS10 ilmentymisen munasarjasyöpäsoluja, ja että DNA: n metylaatio saattaa osaltaan menetysten ilmaisu aikana hankittujen chemoresistance.

Kokeelliset menetelmät

Solut ja reagenssit

CAOV-3 ja SKOV-3-soluja hankittiin American Type Culture Collection (ATCC) ja pidettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa (ATCC) ja McCoyn 5A-alustassa (Mediatech, Inc.), tässä järjestyksessä, täydennettynä 10% FBS: ää (PAA Laboratories, Inc.). Chemosensitive A2780 emosolulinjassa ja sen monilääkeresistentin tytär vastine A2780-AD soluja (saatu kuten on kuvattu [24]) on jalomielinen lahjoitus tohtori Bob Brown, Imperial College London. Nämä solut pidettiin RPMI 1640-alustassa (ATCC), jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 5 mM L-glutamiinia. Solunsalpaajaresistentti soluja totesi edelleen 1,5 uM sisplatiinia. Immortalized munasarjojen pinnan epiteelisolujen (menettää tavallisesti-80, [25]) on jalomielinen lahjoitus tohtori Nelly Auersperg (University of British Columbia) ja ylläpidetään Media 199: MCDB 105 (01:01) täydennettynä 15% FBS. Kaikki solut kasvatettiin 5 mM penisilliiniä-streptomysiiniä, 37 ° C: ssa 5% hiilidioksidia.

5-atsa-2′-deoksisytidiinin ja sisplatiinin ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Tunnistavien vasta-aineiden histoni H3 ja asetyloidut histoni H3 olivat Milliporesta (Lake Placid, NY). Tunnistavaa vasta-ainetta histoni H3 (asetyyli K18) oli peräisin Abcam (Cambridge, MA). Vasta-aineet tunnustaa RGS10 ja HDAC1 saatiin Santa Cruz (Santa Cruz, CA).

Cellular Elinkykymääritykset

1 x 10

4 A2780 tai A2780-AD-soluja ympättiin kolmena rinnakkaisena 96-kuoppalevyille ja annettiin kiinnittyä 24 tunnin ajan ennen käsittelyä osoitettuihin konsentraatioihin sisplatiinia 48 tunnin ajan. Solunelinkykyisyysmäärityksen suoritettiin seerumittomassa väliaineessa, joka sisälsi CellTiter-Blue®-reagenssia (Promega Corporation), kuten aiemmin on kuvattu [10].

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-

mRNA eristettiin käyttäen Trizol-reagenssia ( Invitrogen) ja cDNA syntetisoitiin 2 ug kokonais-RNA käyttäen High Capacity käänteistranskriptaasia cDNA kit (Applied Biosystems /Life Technologies). Kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio suoritettiin käyttäen Superscript III sarja RT-PCR: llä (Invitrogen) ja Power SYBR Green reagenssia (Applied Biosystems). Reaktiot normalisoitiin käyttäen taloudenhoito geeni GAPDH ja laskelmia suoritettiin 2

-ddCT menetelmällä. Kertainen muutos ilmentyminen määritettiin kolmena kappaleena kolmessa riippumattomassa kokeessa, ja kokeellinen rinnakkaista testattiin merkittäviä eroja ryhmien välillä käyttäen pariksi T-testejä. Käytetyt alukkeet perustuivat algoritmiin syntyvän sekvenssit Primer Bank (https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/). RGS10 Forward: GAC CCA GAA GGC GTG AAA AGA, RGS10 Reverse: GCT GGA CAG AAA GGT CAT GTA GA, RGS10 variantti-1 Forward: CCC GCG GCG ATG TTC AAC C, RGS10-variantti-1 Käänteinen: CTC CAG GGA TGC CGC CCA TT, RGS10-variantti-2 Forward: TGC GTG GAA CTT CTC AGG TGG ACA, RGS10 variantti-2 Käänteinen: CCG CCC ATT TGG CTG TGC TCT, RGS2 Forward: AAG ATT GGA AGA CCC GTT TGA G, RGS2 Reverse: GCA AGA CCA TAT TTG CTG GCT RGS5 Forward: CCC ACT CAT GCC TGG AAA GG RGS5 Reverse: CTT GGC TGG TTT CTC TGG CT, GAPDH Forward: GCC AAG GTC ATC CAT GAC AAC T, GAPDH Reverse: GAG GGG CCA TCC ACA GTC TT.

vaikutuksen määrittämiseksi 5-atsa-2′-deoksisytidiini valotuksen RGS transkriptio ilmaisun, 7 × 10

5 SKOV-3-solut maljattiin 100 mm kudosviljelylevyille ja annettiin kiinnittyä yön yli. Seuraavana päivänä, imettiin ja korvattiin 20 uM 5-atsa-2′-deoksisytidiinin DMSO tai DMSO ajoneuvon hallinnan. Kun 3, 5, 7 ja 9 päivää lääkeaineen inkubaation alusta imettiin pois ja 7 ml Trizol-reagenssia (Invitrogen) lisättiin. RNA: n eristys, DNA-synteesin, ja qRT-PCR suoritettiin kuten edellä.

Isolation Of munasarjasyöpäsoluja peritoneaalisista Askitesta

Peritoneaalidialyysi vesivatsoja munasarjasyöpä potilaiden lääketieteellisessä University of South Carolina (MUSC ) saatiin alla MUSC Institutional Review Board (IRB) protokolla # 18983, joka sisältyi katsaus etiikan tutkimuksen ja erikseen hyväksynyt tutkimuksen. Tämä protokolla liittyy käytön de-tunnistettu ihmisen näytteitä tutkimusta ilmaisun ja muuttaminen proteiinien osallistuvat solujen signalointi ja lääkeresistenssin ensisijainen munasarjasyöpäsoluja. Poistaminen vatsakalvon Askites on hoidon taso munasarjasyöpä potilaille ja askites heitetään tavallisesti pois. Kaikki näytteet saivat poistui tunnistamattomiksi ennen toimitusta laboratorion henkilökunta. Potilaat ilmoitettiin mahdollisuus osallistua tutkimukseen ja sanallinen suostumus saatiin lääkäri. Kirjallinen suostumus katsottiin riskin potilaan luottamuksellisuuden jonka IRB koska allekirjoittamalla suostumuslomake lupaa käyttää de-tunnistettu näyte olisi ainoa kirjaa potilaan identiteetti ja osallistuminen, ja näin ollen ainoa kohdistuva riski potilaan luottamuksellisuuden. Kirjaa näytteiden Laboratorioon oli kirjautuneena vain keruupäivää. Poistaminen vatsakalvon Askites on hoidon taso munasarjasyöpä potilaille. Yksikään potilas ei tunnistetietoja saatiin tutkijoiden laboratoriossa. Vatsakalvon askites sentrifugoitiin 1000 rpm: ssä 10 minuuttia huoneen lämpötilassa, ja solupelletit pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS). Punaiset verisolut lyysattiin RBC hajotuspuskuria (eBioscience, San Diego, CA) 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Hajotuspuskuria laimennettiin PBS: llä, solut sentrifugoitiin kuten edellä ja suspendoitiin uudelleen RPMI 10% FBS: ää. Soluja inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa 5% CO2 annettiin kiinnittyä fibroblastit ja makrofagit. Irrallinen epiteelisolujen poistettiin ja inkuboitiin erikseen täydellistä RPMI-väliainetta, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia.

Rgs10 Immunoblotit

arvioimiseksi RGS10 ilmentymisen ensisijaisen askitesta ja menettää tavallisesti soluja, solulysaatit syntyy RIPA -puskuria (50 mM Tris, pH 7,4, 10% glyserolia, 150 mM NaCl, 1% Triton X100, 0,5% SDS, 0,5 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 5 mM Na4P2O7, 40 mM β-glyserofosfaatti, 50 mM NaF, 2 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia fluoria ja aprotiniini). Sonikoinnin jälkeen ja sentrifugoinnin, yhtä suuret määrät liukoista proteiinia ajettiin 10-12% SDS-PAGE-geelissä, siirrettiin nitroselluloosalle, ja immunoblotattiin RGS10 vasta-aineella. Arvioida RGS10 ilmentyminen solulinjoissa, 10

5 solut hajotettiin SDS-PAGE-näytepuskuria. Lysaatit keitettiin viisi minuuttia ja analysoitiin SDS-PAGE: lla. Membraanit inkuboitiin RGS10 primaarisilla vasta-aineilla (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) ja HRP-konjugoidulla kaniini-vasta-aineilla (Pierce) ja visualisoitiin käyttämällä ECL-reagensseilla (Pierce). Kalvot myöhemmin blotattiin GAPDH vasta-aineita (Life Technologies) latauskontrollina.

bisulfiittimodifiointi Sequencing

Methprimer verkkosivuilla [26] (https://www.urogene.org/methprimer/index1 .html) käytettiin analysoimaan CpG sisällön RGS promoottorien ja suunnittelemaan alukkeita kohdistaminen eri alueiden RGS10-1 promoottori. Neljä erilaista alukeparia suunniteltiin, RGS10-BS1, RGS10-BS2, RGS10-BS3 ja RGS10-BS4: RGS10-BS1forward: AAG AAA ATG GGG GTT AAT GAT ATT T, RGS10-BS1reverse: TAC CTC TAA CAA AAC CTT CAA ACT C , RGS10-BS1 vahvistus alue: -121.303.236–121.303.086. RGS10-BS2forward: TGT TTT TAA AGT TAG AGA AGT GTT T, RGS10-BS2reverse: CAC AAA CTA AAA AAC CTA AAC CTC, RGS10-BS2 vahvistus alue: -121.303.076–121.302.726. RGS10-BS3forward: GAG GAG GTA AAG GTT ATA GGT TGG, RGS10-BS3reverse: AAA TAC ACT AAC CCA AAA AAA ACC CC, RGS10-BS3 vahvistus alue: -121.302.800–121.302.514. RGS10-BS4forward: GTT TGG TTA GGA GGA GG, RGS10-BS4reverse: CTC CAA TCT AAA AAA TAC CAC, RGS10-BS4 vahvistus alue: -121.302.327–121.301.988.

Perimän DNA kerättiin soluista ja bisulfite- muunnetaan EZ DNA metylointi-Direct Kit (Zymo Research Corp). ZymoTaq ™ DNA-polymeraasia (Zymo Research Corp) käytettiin monistamaan eri alueiden RGS10 promoottori bisulfiitin käsitellyn genomi-DNA: ta ja PCR-tuotteet analysoitiin 2,5% DNA-agaroosigeeleillä ja puhdistettiin käyttäen PureLink Nopea Gel Extraction ja PCR Purification Combo Kit (Invitrogen ). Puhdistettua tuotteet ligatoitiin plasmideihin käyttäen StrataClone PCR Cloning Kit (Agilent Technologies), joka sitten transformoitiin kompetentteihin bakteereihin. 20 yksittäistä pesäkettä eristettiin Carbenicilliniä LB-agarmaljoille ja laajennettu. Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen Sample Assay Technologies) käytettiin puhdistamaan plasmidit kustakin pesäke, joka sitten lähetetään sekvensointiin käyttämällä T7 ja /tai T3-promoottori sekvensointialukkeita on UGA Genomics Facility. Klooni sekvenssit alistettiin näytöt laadun ja täydellinen muuntuminen, ja linjattu genomista RGS10 promoottori-DNA käyttäen BiQ Analyzer ohjelmisto [27].

Kromatiini Immunosaostaminen (chip) Pitoisuus

Solut maljattiin tiheys 2,5 x 10

6 15 cm kudosviljelylevyihin ja silloitettu 1% formaldehydiä 8 minuuttia huoneenlämpötilassa. Silloitusreaktio Reaktio pysäytettiin lisäämällä 0,125 M glysiiniä viisi minuuttia huoneen lämpötilassa. Solujen tumat eristettiin ja väkevöitiin hajottamalla tuoreeseen SDS lyysipuskuria (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8,0, dH

2O) plus proteaasinestäjät 25 minuuttia jäissä, minkä jälkeen flash jäädyttäminen nestetypessä. Tumat sonikoitiin käyttäen Bioruptor vettä haudesonikaattorissa 30 sec ”On”, 30 sec ”Off” 3X tuottaa keskimäärin 500 emäsparia leikattua DNA. DNA leikkaus varmistettiin suorittamalla lysaatit 1% agaroosigeelielektroforeesilla ja visualisointi SYBR turvallinen värjäys. Sonikoitiin lysaatit sitten esikirkastettiin lohen sperman /agaroosi-helmiä (Upstate) ja 5% koko lysaattia tallennetaan tulo normalisointia. Puolet jäljellä lysaattia immunosaostettiin 5 ug osoitetun vasta-aineen yli yön 4 ° C: ssa ja toinen puoli immunosaostettiin kontrollivasta-aineella. Seuraavat vielä kahden tunnin immunosaostuksella 60 ui lohen sperma päällystettyjä agaroosihelmiä, kaikki näytteet pestiin kutakin seuraavista puskureista: alhainen puskuria (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, dH2O), korkean suolapitoisuuden puskuria (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, dH2O), LiCI: n (0,25 M LiCI: a, 1% NP40, 1% DOC, 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8,0, dH2O), ja 1xTE. DNA eluoitiin SDS-eluutiopuskuria (1% SDS, 0,1 M NaHCO 3, dH2O). Eluoinnin jälkeen, ristisidosten purettu yön yli 5 M NaCl: a 65 ° C: ssa ja immunosaostettiin DNA eristettiin käyttäen fenoli: kloroformi: isopropanoli-seosta (Invitrogen) kohti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Eristetty DNA kvantifioitiin reaaliaikaista PCR ABI prism 7900 (Applied Biosystems, Foster City, CA) käyttäen seuraavia alukkeita ja koetin RGS10: eteenpäin, 5′-GGA ACC GCG AGT CCT CAC-3 ’, kääntää, 5’ -CCC GGA GCT CTA GGT CCC-3 ’ja koetin, 5′-TGG CTA GGA GGA GGG CGG CG-3′; ja GAPDH: eteenpäin, 5’-AAT GAA TGG GCA GCC GTT A-3 ’, kääntää, 5′-TAG CCT CGC TCC ACC TGA CT-3′ ja koetin, 5’-CCT GCC GGT GAC TAA CCC TGC GCT CCT -3 ’. Arvot syntyvät Reaaliaikainen PCR-reaktiot laskeminen perustuu standardin käyrät syntyvät, ajettiin kolmena kappaleena reaktioita, ja analysoitiin käyttäen SDS 2.0 ohjelman.

Tulokset

tukahduttaminen Rgs10 kaavaan munasarjasyöpä solut

aikaisemmat tiedot osoittivat downregulation RGS10 transkriptien munasarjasyövän solulinjoissa hankittu chemoresistance [10]. Sen määrittämiseksi, RGS10 myös vaimentua primaarisissa munasarjasyöpäsoluja, me immunoblotattiin lysaatit hyvänlaatuinen, kuolemattomaksi menettää tavallisesti solu- ja kuudesta ensisijainen epiteelin munasarjasyövän solujen näytteitä eristetään potilaasta askites (kuvio 1A). RGS10 proteiinin ilmentyminen oli selvästi pienempi soluja kullekin potilaalle, mikä viittaa siihen, että RGS10 ilmentyminen vaimennetaan kliinisessä munasarjasyöpä. Koska potilas näytteet ovat heterogeenisiä ja uusiutumattomien, niiden käyttöä määriteltäessä mekanismeihin tukahduttaminen on rajallinen. Perustaa uusiutuva, homogeeninen solumallin menetyksen RGS10 ilmaisun munasarjasyövän, vertasimme RGS10 ilmentymistä menettää tavallisesti soluihin ja serous epiteelin munasarjasyövän solulinja CAOV-3 (kuvio 1 B, C). RGS10 transkriptio ja proteiini oli merkitsevästi pienempi CAOV-3-soluissa verrattuna menettää tavallisesti kontrollisoluihin.

. Munasarjasyöpä solut eristettiin potilaan pahanlaatuisen askiteksen ja RGS10 ekspressiotasoja verrattiin menettää tavallisesti soluihin western blottauksella. B.-C. RGS10 transkripti (B) ja proteiini (C) ekspressiotasoja verrattiin CAOV-3 munasarjasyövän solulinjoissa ja menettää tavallisesti hyvänlaatuisia munasarjaepiteelisoluilla käyttäen qRT-PCR: ää ja western-blottauksella. D. Sisplatiini annos-vaste-käyrät määritettiin käyttämällä CellTiter-Blue luelinkykymäärityksillä A2780 ja A2780-AD-soluja. E.-F. RGS10 transkripti (E) ja proteiini (F) tasot verrattiin solunsalpaajaresistentti A2780-AD solujen suhteessa niiden vanhempien chemosensitive A2780. **: P 0,01, ***: p 0,0001.

edellinen havainto, että RGS10 vaimennetaan solunsalpaajaresistentti soluissa tehtiin julkaistiin transkriptioekspressiokuvio aineistoja päässä chemosensitive ja solunsalpaajaresistentti munasarjasyöpäsolu paria [ ,,,0],10]. Jotta nykyinen tutkimuksessa olemme saatu A2780 munasarjasyöpäsoluja ja niiden monilääkeresistentin johdannainen A2780-AD. A2780-AD-solut olivat peräisin vanhempien A2780 soluihin krooninen altistuminen pieniannoksisen sytotoksinen lääke, ja edustavat siten mallina hankittu chemoresistance [28], [29]. Olemme vahvistaneet menetys herkkyys sisplatiinin aiheuttamaa sytotoksisuutta A2780-AD soluja, ja osoitti, että RGS10 otteen ja proteiinin ilmentymistä vähennetään A2780-AD solujen verrattuna vanhempien A2780 soluihin (kuvio 1 D-F). Yhdessä RGS10 transkriptio ja proteiini ilmentymistä vähennetään ensisijaisesti munasarjasyöpäsoluja ja CAOV-3 tasyöpäsolulinja suhteessa kuolemattomaksi munasarjaepiteelisoluilla ja A2780 soluissa suhteessa vanhempien soluihin. Olemme keskittyneet seuraaviin tutkimuksia näistä kaksi vertailua.

Rgs10 Promoottorit

Ihmisen RGS10 geeni sijaitsee negatiivisessa juosteessa kromosomin 10 ja sisältää kaksi transkription aloituspaikat, synnyttää kaksi eri selostukset ja geenituotteiden (kuvio 2A, B). Muunnokset ovat ainutlaatuinen ensimmäisen eksonia, ja jakaa neljä yhteistä eksonia. Pidemmällä transkripti RGS10-1 synnyttää 21 kDa: n proteiini RGS10a sisältävät 181 aminohappoa. Lyhyempi transkripti variantti RGS10-2 synnyttää 19,5 kDa: n proteiinin RGS10b koostuu 167 aminohaposta. Vain yksi RGS10 immunoreaktiivisia bändi on havaittavissa munasarjan soluissa ja on yhdenmukainen ennustettu molekyylipaino RGS10a (kuvio 1). Sen määrittämiseksi, molemmat kopiot ovat havaittavissa ja samalla vaimentaa munasarjasyövän, suoritimme qRT-PCR käyttäen variantti-alukkeita. Sekä pitkät ja lyhyet selostukset havaittiin kaikissa solulinjoissa qRT-PCR, mutta RGS10-2 ilmaistiin paljon alemmilla tasoilla kuin RGS10-1. RGS10-1 transkripti ilmentyminen CAOV-3 munasarjasyöpäsoluja on noin 20% ilmentymistason nähdään menettää tavallisesti soluihin, verrattavissa kertainen pieneneminen havaittiin yhteensä RGS10 transkriptio. Kuitenkin lyhyempi transkriptio, RGS10-2, ei ole merkittävästi erilainen kahden solulinjoista (kuvio 2C). Edelleen RGS10-1 transkripti ilmentyminen säädeltiin vähentävästi vuonna solunsalpaajaresistentti A2780-AD johdannainen solulinjassa, kun taas RGS10-2 kohoamiseen (kuvio 2D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että suppressio RGS10 transkriptin CAOV-3 ja A2780-AD munasarjasyöpäsoluja on ainutlaatuinen RGS10-1, ja viittaa siihen, että mekanismi voidaan kohdistaa ainutlaatuinen promoottorialueen.

. RGS10 geeni (geneID: 6001) sijaitsee negatiivisessa juosteessa kromosomin 10 (NCBI: NC_000010.10) asemassa -121.302.222–121.259.339. Kaksi transkriptio variantteja RGS10-1 (liittymistä: NM_001005339) ja RGS10-2 (liittymistä: NM_002925) on raportoitu RGS10 perustuu vaihtoehtoinen aloituspaikat, jotka johtavat erilliset ensimmäisessä eksonia. B. Tuloksena isomuotoja RGS10a (liittymistä: NP_001005339) ja RGS10b (liittymistä: NP_002916) vaihtelevat vain ensimmäinen 18 tai kolme aminohappoa. Konservoituneiden RGS domain on alleviivattu. CD. Ilmaus yhteensä RGS10 transkriptin (RGStot), RGS10-1, ja RGS10-2 määritettiin menettää tavallisesti ja CAOV-3-solut (C) ja vanhempien A2780 soluissa ja solunsalpaajaresistentti A2780-AD-soluja (D). **: P 0,01, ***: p 0,0001.

Dna metyloinnin Rgs10 promoottorit munasarjasyöpäsoluja

Promoottorit sisältävän G-C rikas ”CpG-saarekkeiden” tyypillisesti on alhainen metylaation normaaleissa kudoksissa, mutta tullut hypermetyloitunut aikana syövän etenemisen [30], [31], mikä viittaa siihen, että geenit CpG saaria niiden promoottorit ovat potentiaalisia kohteita transkription hiljentämiseltä promoottori DNA: n metylaation syöpäsoluissa. Analyysi alueella 1 kiloemäksen vastavirtaan transkription aloituspaikat ja 0,5 kiloemästä myötävirtaan alusta sivustoja RGS10-1 ja RGS10-2 transkriptien paljastaa silmiinpistävä ero CG sisällön ja useita CpG-dinukleotidien välillä RGS10 promoottorialueilla ( Kuva 3A). Promoottorialueen RGS10-1 sisältää 60-80% CG sisältöä, ja se sisältää noin 120 CpG-dinukleotidejä, kun taas RGS10-2 promoottori sisältää vähemmän kuin 30. Vertailun analyysi RGS2 promoottorin on CpG sisältöä samanlainen RGS10-1, kun taas promoottori RGS5 sisältää vähän CpG dinukleotideissä.

. Promoottorialueiden RGS10-1, RGS10-2, RGS2, ja RGS5 analysoitiin CpG sisällön käyttämällä sivuston Methprimer. Kunkin promoottori, alueen genomisen DNA: n 1000 emäsparin 5 ’transkription aloituskohdasta ja 500 emäsparia 3’ aloituskohdan arvioitiin prosenttia GC-pitoisuuden ja yksittäisten CpG-dinukleotidejä. Nukleotidin asema on osoitettu x-akselilla ja GC-pitoisuus piirretään y-akselin suuntaan; CpG-saarekkeiden on merkitty varjostus. Jokainen CpG osoitetaan hash merkki alapuolella nukleotidin numerointia, ja transkription aloituspaikan on osoitettu nuolella. Amplification alueita neljälle bisulfiitti Sekvenointialuke pareja on merkitty vaakapalkeilla (BS10-1, BS10-2, BS10-3, BS10-4). B. SKOV-3-soluja käsiteltiin vehikkelillä tai DNMT inhibiittorin 5-atsa yhdeksän päivän ajan, ja transkripti tasot ilmoitetaan RGS ja GAPDH valvontaa mitattiin 3, 5, 7, ja 9 päivää hoidon jälkeen. RGS-transkripti normalisoitiin GAPDH, ja piirretään suhteessa ilmentämiseen ajoneuvon hoidettuihin kontrolleihin kussakin aikapisteessä.

korkea pitoisuus CpG-dinukleotidien on RGS10-1 promoottori viittaa siihen, että RGS10 geeni on potentiaalisimmaksi sääntelyn DNMT entsyymien ja voidaan vaimentaa munasarjasyövän etenemisen tehostamalla DNA: n metylaatio. Testata tätä ennustus, määritimme estävä vaikutus DNA: n metylaatio on RGS10 ilme. DNMT inhibiittori 5-atsa 2’deoxycytidine (5-atsa) estää lisäämällä metyyli-ryhmien CpG-dinukleotidejä juuri syntetisoidun DNA: n lisääntyvien solujen [32]. Näin ollen, vaikutukset 5-atsa on DNA: n metylaation ja geeni-ilmentymisen ovat ilmeisiä sen jälkeen, kun useita kierroksia solunjakautumisen. Soluja käsiteltiin ajoneuvon tai 5-atsa yhteensä yhdeksän päivää, ja vaikutus transkriptio tasoilla RGS10-1, RGS2 ja RGS5 määritettiin kahden päivän välein. Yhdenmukainen CpG-saarekkeen ennusteita, RGS5 ilmentyminen ei muutu 5-atsa hoitoa, kun taas RGS10-1 ja RGS2 transkripti pitoisuudet ovat noin 8 kertaa suurempi 5-atsa käsitellyissä soluissa verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin soluihin (kuvio 3B). Tämä tulos viittaa siihen, että DNMT entsyymit todennäköisesti edistää tukahduttaminen RGS10-1 transkriptipitoisuuksissa.

bisulfiittimodifiointi sekvensointi Rgs10-1 Promoottorit

lisäksi ennustaa, että taajuus metylaation RGS10-1 promoottorit olisi olla suurempi munasarjasyöpäsoluja pienemmillä RGS10-1 ekspressiotasoja. Metyloitu ja un-metyloitu sytosiini tähteet ovat erotettavissa käsittelemällä bisulfiitti, joka muuntaa metyloitumattomat, mutta ei metyloidut, sytosiiniemäkset urasiileiksi. Ensin suoritetaan bisulfiitti sekvensoinnin vertaamaan taajuutta DNA metylaatio RGS10-1 promoottorit emo A2780 ja A2780-AD solunsalpaajaresistentti soluissa. Bisulfiitti-käsitelty genomista DNA: ta monistettiin käyttäen neljää päällekkäistä alukepareja suunniteltu täysin kattaa alueen 1000 emäsparia 200 emäsparia alavirtaan RGS10-1 transkription aloitus- päällä. Yksittäisiä klooneja bisulfiitin käsiteltiin genomisen DNA: n sekvensoitiin ja rinnastaa genomi-DNA: sta käyttäen BiQ Analyzer ohjelmisto määrittää metylaatiostatuksen kunkin CpG sivuston RGS10-1 promoottorin vähintään 10 klooneja. Saadut tulokset alukeparilla BS10-2 on esitetty kuviossa 4, ja tulokset saadaan käyttämällä BS10-1, BS10-3, ja BS10-4 on esitetty kuviossa S1.

RGS10 promoottori genomista DNA: ta kohdistettu yksittäisten sekvenssien kloonattujen PCR-tuotteiden alukeparia BS10-2 vahvistus bisulfiitin käsiteltiin genomista DNA: ta osoitetun solulinjat. Sekvenssit alistettiin laadunvalvonta analyysiin ja rinnastettiin käyttämällä BiQ Analyzer ohjelmisto. Tässä tavanomaisessa ”tikkari edustuksen, kukin CpG alueella (-121303076 → -121302726) on merkitty ympyrällä; täytetyt pallot ovat metyloitu, täyttämättömiä ympyrät ovat metyloimaton. Lollipop esityksiä metylaatiostatuksen kunkin CpG sivuston RGS10-1 promoottorialueille monistettiin BS10-1, BS10-3, ja BS10-4 alukesarjoista ovat saatavilla olevat tiedot.

käyttäminen bisulfiitti sekvensointi tietoja, määritimme taajuus metylaation CpG-sivustoja RGS10-1 promoottorin A2780 ja A2780-AD-soluja (kuvio 5, taulukko S1). Taajuus metylaation CpG-sivustoja RGS10-1 promoottori oli alhainen; Suurin osa CpG sivustot olivat täysin metyloimattomia tai metyloitiin 10-20% klooneja. Poikkeuksena oli dinukleotidi asemassa -121030162, joka oli hyvin metyloitu molemmissa solulinjoissa. Koko promoottori, nopeus metylaation oli hieman suurempi A2780-AD soluissa kuin vanhempien A2780 soluissa (kuvio 5A, upotus). Tämä ero oli selvempi useita vierekkäisiä CpG sivustoja alueella -121303155 → -121303007 (katkoviivaprofiileina rekki, kuvio 5A). Kokonaisveroaste metylaation poikki alueella kaksinkertaistui solunsalpaajaresistentti soluissa verrattuna vanhempien soluihin (kuvio 5A, upotus). Nämä tiedot viittaavat siihen, että paikallinen parannettu DNA metylaatio tietyn alueen noin 800 emäsparia ylävirtaan transkription aloituskohdasta korreloi menetys RGS10 ilmaisun hankittu chemoresistance. Me seuraavaksi suoritetaan sama analyysi RGS10-1 edistävinä menettää tavallisesti ja CAOV-3-soluissa. Metylointi hinnat koko RGS10-1 promoottori ja alueen tunnistettu edellä olivat samanlaiset menettää tavallisesti ja CAOV-3-soluissa (kuvio 5B).