Krooninen sairaus

tiivistelmä

saavuttaminen tehokasta hoitoa syövän on vaikeaa, varsinkin kun vastustuskyky tavanomainen kemoterapia kehitetään. P-glykoproteiinin (P-gp) toimintaa säätelevän monilääkeaineresistenssi (MDR) kehittäminen eri syöpäsolutyyppien. Tunnistaminen syöpälääkkeet, joilla on potentiaalia tappaa syöpäsoluja ja samalla estävät MDR on tärkeää tehostaa etsiä uusia terapeuttisia lähestymistapoja. Tutkimme vaikutukset sulfmosiini (SF), joka on melko tutkimaton puriininukleosidin analoginen, vuonna MDR (P-gp yli-ilmentävät) ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja glioblastoomasolulinjoissa (NCI-H460 /R ja U87-TXR , vastaavasti). SF osoitti saman tehon vastaan ​​MDR syöpäsolun linjat ja niiden herkkä kollegansa. Kuitenkin se oli myrkytön normaalin ihmisen keratinosyyttejä (HaCaT). SF aiheuttama kaspaasiriippuvaisen apoptoottisen solukuoleman ja autophagy MDR syöpäsoluja. Sen jälkeen SF sovellus, reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) tuli ja glutationia (GSH) pitoisuus pieneni. Ilmaisu keskeisten entsyymin GSH synteesiä, gammaglutamyylitranspeptidaasi-kysteiini-syntetaasin (γGCS) väheni sekä ilmaus

gst-π

mRNA. Näin ollen SF merkittävästi vähentynyt ilmentyminen

HIF-1α

,

MDR1

ja

VEGF

mRNA: t jopa hypoksinen olosuhteissa. SF aiheutti eston P-gp (koodattu

MDR1

) ilmaisun ja toimintaa. Kertyminen standardi kemoterapeuttisen aineen – doksorubisiini (DOX) indusoitiin SF pitoisuudesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Paras vaikutus SF saatiin 72 tunnin kuluttua, kun se saavuttaa vaikutus tunnetaan P-gp: n estäjien (Dex-verapamiili ja tariquidar). Vastaavasti SF herkistynyt resistentit syöpäsolut DOX jatkokäsittelyä. Lisäksi SF vähensi Ilmeeni verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF), mRNA: n ja proteiinin tason ja moduloidaan sen eritystä. Lopuksi vaikutukset P-gp (sekaantunut farmakokinetiikkaa ja MDR), GSH (sekaantunut vieroitus) ja VEGF (osallistuvat kasvaimen angiogeneesiä ja eteneminen) luokitella SF multi-voimakas syövän vastaisen aineen, joka käyttö on pidettävä erityisesti kestävä syöpäsairauksia.

Citation: Dačević M, Isaković A, Podolski-Renić A, Isaković AM, Stanković T, Milošević Z, et al. (2013) puriininukleosidia Analog – sulfmosiini moduloi Erilaiset mekanismit Cancer Progression in monilääkeresistenteiksi Cancer Cell Lines. PLoS ONE 8 (1): e54044. doi: 10,1371 /journal.pone.0054044

Editor: Michihiko Kuwano, Kyushu University, Japani

vastaanotettu: 26 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 05 joulukuu 2012; Julkaistu: 11 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Dačević et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoittajat: Ministry of Opetus-, tiede- ja teknologian kehittämisen Serbian (lupanumeroita III 41031 ja III 41025) tuki tätä tutkimusta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

sulfmosiini tai SF (kuvio 1, [R, S] -2-amino-9-β-D-ribofuranosylpurine-6-sulfiiniamidia) on hapettunut muoto 6-thioguanosine [1]. Se on melko tutkimaton syöpälääkkeen verrattuna muihin tiopuriinit (6-tioguaniini ja 6-merkaptopuriini). SF estää syöpäsolujen kasvua, ainakin osittain, sisällyttämällä sen fosforyloidun johdannaisen DNA: han. Metabolinen muuntaminen SF vastaaviin 5′-monofosfaattijohdannainen on monimutkaisempi kuin muiden tiopuriinit [2].

Koska SF käytetään eri metaboliareittiä sen solunsisäisen aktivointia, SF hoito ei indusoi resistanssin syöpäsoluissa. Sen sijaan, että poistetaan yksi entsyymi, joka vastaa metabolista aktivaatiota muiden puriininukleosidianalogien riittää resistenssin kehittyminen. SF paremmin läpäisee keskushermoston (CNS) kuin sen lähtöaineena molekyyli – 6-thioguanosine ja on tehokkaampi syövän hoidossa. SF on käyttökelpoinen pahanlaatuisten kasvainten vastustuskykyisiä muille tiopuriinit [3]. Vaikka rajoitukset niiden käyttöä, jotkut puriinianalogeja läheisesti SF osoitti huomattavaa antiangiogeenisestä toimintoja, jotka ansaitsevat tieteelliset huomiota [4].

metabolia SF liittyy solujen glutationi järjestelmään. SF helposti addukteja sulfhydryyliyhdisteet (glutationi ja kysteiini) ja tukahduttamalla glutationi vieroitus järjestelmä ja kohottaa pitoisuutta reaktiivisia happiradikaaleja (ROS), SF voi aiheuttaa kuoleman syöpäsolujen [2].

Ottaen sen huomattavan tehoa syövän hoidossa ja kohtalainen myrkyllisyys normaaleille soluille [2], SF soveltuu yhdistettäväksi muiden kemoterapia-aineiden. SF vaikuttaa synergistisesti doksorubisiinin (DOX), curcumine (CUR) ja verapamiili (VER) ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinjat [5] – [7]. Tehokkuus yhdistetyn hakemuksen SF sallittua käyttää näitä lääkkeitä pienemmillä pitoisuuksilla, jotka ovat vähemmän myrkyllisiä vähemmillä haittavaikutuksia. Oletimme, että kaikki mainitut syöpälääkkeen vaikutuksia SF voisi olla hyötyä reversiossa vastustuskyky kemoterapeuttisia.

Multi-lääkeresistenssin (MDR) on tärkein rajoitus suorittamisessa onnistuneen syövän hoitoon. MDR-fenotyyppi liittyy usein yli-ilmentäminen P-glykoproteiinin (P-gp), kalvo kuljettaja, joka tehokkaasti ekstrudoi sytotoksiset lääkkeet syövän solujen ja muuttaa niiden farmakokinetiikkaan. P-gp toimii effluksipumpun eri hydrofobisten syöpälääkkeet kuten antrasykliinit, vinka-alkaloidit, taksaanit, epipodofyllotoksiinit, ja jotkut uudet lääkkeet (esim imatinibi nilotinibi, everolimuusi). P-gp yli-ilmentyminen on yleinen kokeellinen syövän malleissa sekä syöpäkudokset potilailta [8]. Siksi P-gp on tullut tärkein terapeuttinen kohde voittamiseksi MDR.

Joukossa monia vaihtoehtoja palataan MDR, agentit jossa syövän vastaista aktiivisuutta oman voitiin tarkastella mahdollisina MDR modulaattorit. Olemme arvelleet aikaisemmin, että lisäksi synergiaa SF ja DOX kuin syöpälääkkeet kautta toimivien erillistä reittiä, muutokset MDR liittyvien geenien ilmentymisen ja vähentäminen P-gp toiminta voisi edistää Chemo-herkistymistä vaikutus SF [5], [6].

Siksi teimme lisätutkimukset mekanismeja SF toimia resistenttien ja parantumaton syövät. Tätä varten käytimme kahta eri MDR syöpäsolulinjoissa kanssa yli-ilmentyminen P-gp (NCI-H460 /R ja U87-TXR) [9], [10]. Olemme tutkineet mahdollisuuksia SF tappaa resistenttejä syöpäsoluja ja aiheuttaa autophagy sekä modulointiin liittyviä mekanismeja syövän etenemisessä, kuten glutationia (GSH) vieroitus järjestelmä, P-gp: n välittämää lääkkeen kuljetusta, verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF) ilmaisu and.secretion. Huomasimme, että muutos redox aseman SF johti laskuun ilmaisun hypoksian indusoima tekijä-1α (HIF-1α), joka säätelee ilmentymistä P-gp: n ja VEGF. Siten modulaatio MDR SF on seurausta GSH vieroitus järjestelmän tukahduttaminen.

Materiaalit ja menetelmät

Drugs

SF ([R, S] -2-amino -9-β-D-ribofuranosylpurine-6-sulfiiniamidia) syntetisoitiin 6-thioguanosine mukaisesti julkaistun menettelyn [1]. DOX liuos saatiin ebewe Arzneimittel GmbH, Wien, Itävalta. R ± Verapamiili (Dex-VER) ostettiin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Saksa. Tariquidar (TK) luovutti ystävällisesti Dr. Sven Rottenberg Alankomaista Cancer Institute, Amsterdam. CoCl

2 saatiin Fisher Scientific, USA. SF pidettiin -20 ° C: ssa. Ennen hoitoa, SF ja CoCl

2 tuoreeltaan laimennetaan vedellä, kun taas erät DOX sulatettiin -20 ° C. Dex-VER säilytettiin 1 mM varastoliuosta, huoneenlämpötilassa. TQ laimennettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) ja 10 uM alikvootteja pidettiin -20 ° C: ssa.

Chemicals

RPMI 1640-väliaine, Minimum Essential Medium (MEM), penisilliini-streptomysiiniä ratkaisu, antibiootti-antimykoottiliuoksella, L-glutamiinia ja trypsiini /EDTA ostettiin PAA, Wien, Itävalta. Naudan sikiön seerumia (FBS), sulforodamiini B (SRB) ja akridiini oranssi saatiin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Saksa. Matrigel luovutti ystävällisesti Dr. Sanja Mijatovic Institute for Biological Research ”Sinisa Stankovic”, University of Belgradissa, Serbia. Propidiumjodidia (PI) ostettiin Roche Applied Science, Basel, Sveitsi ja anneksiini-V-FITC (AV) alkaen Abcam, Cambridge, Iso-Britannia. FITC-konjugoitu anti-P-gp-vasta-aine saatiin BD Biosciences, Iso-Britannia, kun taas PE-konjugoitu anti-VEGF-vasta-aine saatiin R R 0,05 (*), p 0,01 (**), p 0,001 (***).

Tulokset ja keskustelu

SF estää niiden kasvun MDR syöpäsolut

Olemme perustettu NSCLC ja glioblastooma P-gp yli-ilmentäviä solulinjoja (NCI-H460 /R ja U87-TXR) kanssa MDR fenotyyppi selvittääkseen mahdollisia syöpälääkkeitä [9], [10 ]. NCI-H460 /R ja U87-TXR ovat MDR syöpä solulinjoja, jotka ovat peräisin NCI-H460 (NSCLC solulinja) ja U87 (glioblastoomasolulinjan). Kantasolulinjoista katsottiin herkkä, koska solut, jotka ovat peräisin potilaista, jotka eivät olleet saaneet kemoterapiaa. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme yrittäneet selvittää toiminnan sulfmosiini (SF), synteettinen puriini nukleosidianalogia, näissä kahdessa MDR syöpäsolulinjoilla. Meidän valita SF koska todisteita, jotka sen terapeuttisesti tehokas pitoisuudet voinut aiheuttaa vastarintaa. SF myös tehokkaasti tunkeutuu CNS [2]. Lisäksi viimeaikaiset Kliininen tutkimus osoitti, että yhdistelmähoito mukaan lukien 6-tioguaniini (läheisesti liittyvät molekyylin SF) on lupaava potilaille, joilla on toistuvia korkealaatuisesta anaplastinen gliooma [19].

Vaikutukset SF syöpäsolukasvua 72 tunnin kuluttua hoidon arvioitiin kemiallis-herkkyyden määritys – sulforodamiini B (SRB). SF inhiboi kasvua herkkä ja MDR syöpäsolulinjoja annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 2A, C). Koska soveltaminen syöpälääkkeet rajoittaa niiden toksisuus normaaleille soluille, testasimme vaikutus SF HaCaT-soluja (ihmisen normaaleja keratinosyyttejä). Vaikutukset kasvuun HaCaT jälkeen jatkuvaa hoitoa 72 h arvioitiin myös SRB-määritystä. SF ei vähentänyt merkittävästi määrää normaalien solujen jopa korkein pitoisuus (100 uM) (kuvio 2C). Olemme osoittaneet, että SF estää niiden kasvun herkkä sekä kestävä NSCLC ja glioblastoomasolut mikro-molaarinen Pitoisuusalueen ja että sen teho ei vaikuttanut läsnäolo MDR fenotyypin. Lisäksi SF oli myrkyttömiä normaaleille soluille (HaCaT) on konsentraatioalueella, joka tarvitaan estämään syöpäsolujen kasvua.

kasvua inhiboivia vaikutuksia SF on NCI-H460 ja NCI-H460 /R ( A), U87, U87-TXR ja HaCaT (C) soluja kasvatettiin muovi 72 tunnin kuluttua hoidon arvioitiin SRB-määritystä. Keskimääräinen ± S.D. arvot laskettiin viidestä itsenäisestä kokeesta (n = 5). NCI-H460 ja NCI-H460 /R (B), U87 ja U87-TXR (D) solut värjättiin CFSE ja inkuboitiin 72 tuntia 10 uM SF. Nopeus leviämisen (CFSE eranto) määritettiin virtaussytometrialla kanavalla FL1. Valomikroskoopilla NCI-H460 ja NCI-H460 /R (E), U87 ja U87-TXR (F) solujen kasvua muovi (2-D kulttuuri) ja matrigeelin kasvu (3-D kulttuuri) jälkeen 72 h 10 uM SF hoitoon.

Seuraavaksi arvioitiin sytostaattinen vaikutus 10 uM SF kussakin solulinjassa CFSE värjäytymistä (kuvio 2B, D). CFSE on vitaaliväri vakaa sytoplasmassa noin 7-8 sukupolvea, mutta intensiteetti CFSE fluoresenssin laskee johtuen sen asteittaista puolitus kuluessa tytärsoluksi jokaisen solunjakautumisen. Tällä tavoin, CFSE jakauma solut voidaan arvioida määrä solujen lisääntymisen. CFSE jakautuminen ohjaus ja SF käsiteltyjen näytteiden kuvataan flow-sytometria profiloitu histogrammien (kuvio 2B, D). Inhibitio leviämisen havaittu, kun läsnä on SF oli kaikkein pronunced NCI-H460 /R-soluissa. Nämä tulokset osoittivat, että proliferaation esto on osittain vastuussa syövän vastaista aktiivisuutta SF.

Koska NSCLC ja glioblastoomasolulinjoissa on korkea metastaattinen potentiaali, vertasimme vaikutuksia SF estävän solun kasvua jälkeen 72 h muovi (2-D kulttuuri) ja saatettua tyvikalvon – matrigeelin (3-D kulttuuri) (kuvio 2E, F). Huomasimme, että SF esti kasvua 3-D kulttuuri samalla teho havaitaan 2-D kulttuuri. Se, että solut irrotettiin toisistaan ​​sen jälkeen, kun SF hoidon matrigeeliä, erityisesti glioblastooma-solut, viittaa muutos niiden adheesio-ominaisuudet. Siksi me spekuloida, että SF voivat vaikuttaa affiniteetti syöpäsolujen hyökätä verisuonia, indusoida kasvaimen angiogeneesiä ja etäpesäkkeiden.

SF indusoi kaspaasiriippuvaisen apoptoosi MDR Syöpäsolut

Seuraavaksi jatkoimme tutkia, apoptoosin induktioon edistää syövän toiminnan SF MDR syöpäsolulinjoissa. Arvioida indusoiman apoptoosin SF 72 tunnin jälkeen solut ympättiin optimaalinen tiheys niiden kasvava ominaisuuksia. Tällä tavoin, käsittelemättömien kontrollien ei saavutettu yhtymäkohdassa lopussa itämisaika. Anneksiini V-FITC /propidiumjodidivärjäys paljasti, että SF kasvattaa osuutta apoptoottisten solujen (AV + PI) molemmissa MDR syöpäsolun linjat. Tulokset on esitetty yhteenvetona (kuvio 3A, B, C, D): elossa solut ovat negatiivisia molemmille, anneksiini-V: n ja propidiumjodidia (AV-PI);