Krooninen sairaus

tiivistelmä

CC kemokiinireseptori 7 (CCR7-) edistää selviytymistä tiettyjen syöpäsolujen linjat, mutta sen rooli leviämisen ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin on epämääräinen. Proliferaatiomääritykset suoritettiin A549 ja H460 NSCLC-soluihin käyttäen Cell Counting Kit-8 osoitti, että aktivoituminen CCR7- sen ligandin, eksogeeninen kemokiini ligandin 21 (CCL21), liittyi merkittävästi lineaarinen kasvu solujen lisääntymisen kanssa altistumisen kestoa CCL21. CCL21 /CCR7 vuorovaikutus huomattavasti osa solujen G

2 /M vaiheen solusyklin mitattuna virtaussytometrialla. Sen sijaan, CCL21 /CCR7- ollut merkittävää vaikutusta G

0 /G

1 ja S vaiheissa. Western blot ja reaaliaikaisella PCR: llä osoitti, että CCL21 /CCR7 merkittävästi voimistunut ilmentyminen sykliini A, sykliini B1, ja sykliini-riippuvaisen kinaasin 1 (CDK1), jotka liittyvät G

2 /M faasimuutoksen. Ilmaus sykliini D1 ja sykliini E, jotka liittyvät G

0 /G

1 ja G

1 /S siirtymiä, ei muutettu. CCL21 /CCR7- vuorovaikutus huomattavasti korkeampia fosforylaation ekstrasellulaarisen signaalin säännelty kinaasi (P-ERK), mutta ei Akt, mitattuna Western blot. LY294002, selektiivinen estäjä PI3K joka estää aktivoinnin loppupään Akt, ei heikentää vaikutusta CCL21 /CCR7- P-ERK. Coimmunoprecipitation edelleen vahvisti, että oli olemassa vuorovaikutusta P-ERK ja sykliini A, sykliini B1, tai CDK1, erityisesti kun läsnä on CCL21. CCR7- Sirna tai PD98059, selektiivinen estäjä MEK joka häiritsee aktivointi loppupään ERK merkittävästi poisti ulkosyntyisten CCL21. Nämä tulokset viittaavat siihen, että CCL21 /CCR7- edistää ajasta riippuva leviämisen ihmisen NSCLC-solujen säätelemällä sykliini A, sykliini B1, ja CDK1 mahdollisesti kautta ERK-reitin.

Citation: Xu Y, Liu L, Qiu X Jiang L, Huang B, Li H, et al. (2011) CCL21 /CCR7- Edistää G

2 /M-vaiheen eteneminen kautta ERK Pathway in Human ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 6 (6): e21119. doi: 10,1371 /journal.pone.0021119

Editor: Lin Zhang, University of Pennsylvania, Yhdysvallat

vastaanotettu: 7. 2011; Hyväksytty: 19. toukokuuta 2011; Julkaistu: 16 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Xu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (nro 30972967) ja Research Fund tohtorikoulutuskeskukseen of Higher Education of China (nro 20092104110018). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

CC-kemokiinireseptori 7 (CCR7) ilmentyy kaikissa naiiveja T-soluja ja joitakin muisti-T-solujen, B-solujen ja kypsien dendriittisolujen [1]. Kun vuorovaikutus sen ligandien, kemokiini ligandin 19 (CCL19) tai kemokiinin ligandin 21 (CCL21) [2], CCR7- edistää lymfosyyttiliikennettä ja itseohjautuva imusolmukkeisiin aikana immuunijärjestelmän ja tulehdusreaktioita [3] – [5]. CCR7- ilmentyy erittäin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), rintasyöpä, ja okasolusyöpä pään ja kaulan sekä vastaa välittävä etäpesäke tietyissä syöpäsoluissa linjat [6] – [15]. Tähän mennessä roolia CCR7- lisääntymisessä ihmisen NSCLC-solujen ei ole selvitetty.

aktivointi CCR7- voi lisätä fosforylaation ekstrasellulaarisen signaalin säännelty kinaasi (P-ERK) tai Akt (P-Akt) kautta Gi-proteiinien parantaa solujen lisääntymisen tai eloonjäämistä [16] – [20]. ERK kuuluu mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) perhe, joka sisältää myös c-Jun-N-terminaalisen kinaasin (JNK) ja p38. ERK cascade, aktivoidaan mitogeenisesta ärsykkeitä, on kriittinen leviämisen ja säilymisen [21], [22] ja tarvitaan tavallisen mitoosiin [23], [24]. JNK ja p38 aktivoituvat vastauksena kemikaalien ja ympäristön rasitusta [25] – [27]. Akt (tunnetaan myös Akt1), välittäjänä kasvutekijän aiheuttaman solujen eloonjäämistä [28] – [30], voivat edistää soluproliferaatiota kautta fosforylaation [31].

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää vaikutus ja sääntelyn mekanismi CCL21 /CCR7- vuorovaikutuksen leviämisen A549 ja NCI-H460 (H460) ihmisen NSCLC-soluja. Tässä me osoitimme, että CCL21 /CCR7 osaltaan ajasta riippuva proliferaatiota ihmisen NSCLC-solujen säätelemällä ilmentymistä sykliini A, sykliini B1, ja CDK1 kautta ERK-reitin. Saadut kokemukset tämän tutkimuksen lainaa käsityksen mekanismeja selviytymisen CCR7- välittämän syöpäsolujen ja vaikuttaa hoidon tavoitteita NSCLC.

Tulokset

CCL21 /CCR7- edistää leviämisen A549 ja H460-solujen . Aikaisemmassa tutkimuksessa, tunnistimme korkeamman CCR7- ekspressiotaso A549 ja H460 ihmisen NSCLC solulinjoissa verrattuna muihin solulinjoihin [32]. Roolin tutkimiseksi CCR7- toiminnassa A549 ja H460-soluissa, CCR7- aktivaatio ja inhibitio indusoitiin eksogeenisen CCL21 ja CCR7 Sirna (siRNA), tässä järjestyksessä. Transfektion jälkeen CCR7 siRNA (siCCR7) tai kontrolli-siRNA: n ilmentyminen CCR7 arvioitiin käyttäen Western blot ja käänteistranskriptaasin (RT) -PCR. Olemme havainneet, että siCCR7 merkittävästi vaimentua proteiini- ja mRNA-tasojen CCR7, verrattuna ohjaus siRNA (kuvio 1).

A549 (A) ja H460 (B) transfektoitiin kontrolli-siRNA tai CCR7 siRNA (siCCR7) . Transfektion jälkeen ilmentymistä CCR7-proteiinin (a) ja mRNA: n (b) arvioitiin käyttämällä Western blot (a) ja RT-PCR: llä (b) ja verrattuna transfektoimattomiin A549 tai H460-solut. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, verrattuna kontrollisoluihin.

vaikutuksen määrittämiseksi CCL21 /CCR7 soluproliferaatioon, CCK-8-määritys suoritettiin A549 ja H460-soluja. Mukaan julkaistuihin tietoihin [33], [34] ja tulokset meidän alustavassa kokeessa, 100 ng /ml pitoisuuksina CCL21 edistänyt merkittävästi solujen proliferaatiota, verrattuna 50 ng /ml pitoisuuksia, kun taas ei ollut merkittävää eroa 100 ng /ml ja 200 ng /ml pitoisuuksina (kuvio 2). Näin ollen, 100 ng /ml pitoisuuksia CCL21 käytettiin seuraavassa kokeessa. CCL21 /CCR7- vuorovaikutus merkittävästi edistänyt solujen lisääntymistä, kun taas siCCR7 merkittävästi kumosi toiminta CCL21 (kuva 3). siCCR7 yksinään ei ollut merkittävää vaikutusta soluproliferaatioon verrattuna kontrolli soluihin. Merkittäviä eroja havaittiin kaikkien ajankohtana tutkittiin (kaikki p 0,01), mikä osoittaa lineaarista kasvua leviämisen altistumisen lisääntyessä kertaa CCL21 (kaikki p 0,01).

A549 (A) ja H460 (B) soluja käsiteltiin CCL21 (50, 100 tai 200 ng /ml) 24, 48 tai 72 h, ja solujen elinvoimaisuus arvioitiin käyttäen CCK-8-määrityksessä. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. ** P 0,01, verrattuna soluihin käsiteltiin CCL21 (50 ng /ml).

A549 (A) ja H460 (B) Soluja käsiteltiin CCL21 (100 ng /ml) 24 , 48 tai 72 tuntia, ja solujen elinvoimaisuus arvioitiin käyttäen CCK-8 määrityksessä. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. ** P 0,01 verrattuna kontrolli soluihin.

CCL21 /CCR7- täydentää osuus solujen G

2 /M. Voit tarkistaa, onko toiminta CCL21 /CCR7- proliferaatioon A549 ja H460-soluissa liittyy muutokseen solusyklin jakeluun, solusyklin analyysi tehtiin käyttämällä virtaussytometria. CCL21 /CCR7- vuorovaikutus merkittävästi parannettu osuus solujen G

2 /M vaiheessa, kun taas ei ollut merkittävää vaikutusta tämän vuorovaikutuksen osuus solujen G

0 /G

1 tai S-vaiheessa, kun kontrollisoluja (taulukko 1). siCCR7 merkittävästi poisti tämän vaikutuksen CCL21, kun taas siCCR7 yksinään ei ollut merkittävää vaikutusta solusyklin jakeluun.

CCL21 /CCR7- ylössäätelee ilmaisun sykliini A, sykliini B1, ja CDK1. Voit selvittää mahdollinen mekanismi, jolla CCL21 /CCR7- vaikuttaa G

2 /M vaihejakauman A549 ja H460-soluissa, ilmaisu Sykliinien ja sykliiniriippuvaisen kinaasi 1 (CDK1) arvioitiin käyttäen Western blot ja reaaliaikaisen PCR . Verrattuna kontrolli solujen CCL21 /CCR7 vuorovaikutus merkittävästi voimistunut proteiinin ja mRNA-tasoja sykliini A, sykliini B1, ja CDK1, jotka liittyvät G

2 /M vaiheen etenemisen (kuvio 4). siCCR7 merkittävästi kumosi vaikutukset CCL21, kun taas siCCR7 yksinään ei ollut merkittävää vaikutusta sykliini tai CDK1 ilme. CCL21 ei ollut merkittävää vaikutusta tasoilla sykliini D1 tai sykliini E, jotka liittyvät G

0 /G

1 ja G

1 /S siirtyminen.

A549 (A ) ja H460 (b) soluja käsiteltiin CCL21 (100 ng /ml) 24 tuntia, ja proteiini (a) ja mRNA: n (b) taso sykliinien A, B1, D1 ja E ja CDK1 arvioitiin käyttäen Western blot (a) ja reaaliaikainen PCR (b). Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05 tai ** p 0,01 verrattuna kontrolli soluihin.

CCL21 /CCR7- ylössäätelee ilmaus P-ERK mutta ei P-Akt. Muut ovat raportoineet, että CCR7 voi lisätä fosforylaatiota ERK, JNK, tai Akt, jotka liittyvät solun eloonjäämisen [16] – [20], [33], [35] – [42]. Voit tarkistaa, onko CCL21 /CCR7- vuorovaikutus voi myös parantaa ilmaus MAPK perheenjäsenten ja Akt A549 ja H460-soluissa, ilmentyminen näiden komponenttien arvioitiin käyttäen Western blot. CCL21 /CCR7- vuorovaikutus merkittävästi voimistunut ilmentyminen P-ERK 24 tunnin ja 48 tunnin kuluttua taas ei ollut merkittävää vaikutusta ilmaisun ERK (kuva 5). CCL21 /CCR7- ollut merkittävää vaikutusta ilmentymiseen tai fosforylaation JNK, p38 tai Akt. Koska Akt on mahdollisesti ylävirtaan ERK [43], A549 ja H460-soluja käsiteltiin CCL21 24 h sen jälkeen, kun 1-h altistuminen LY294002, selektiivinen estäjä PI3K joka estää aktivointi alavirran Akt-reitillä. Tämän käsittelyn jälkeen, CCL21 /CCR7 edelleen merkittävästi voimistunut ilmentyminen P-ERK (kuvio 6).

A549 (A) ja H460 (B) Soluja käsiteltiin CCL21 (100 ng /ml) 12, 24 tai 48 h, ja normaali ja fosforyloidun (P-) ekspressiotasot arvioitiin Western blot. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05 tai ** p 0,01, verrattuna kontrollisoluihin.

A549 (A) ja H460 (B) Soluja käsiteltiin CCL21 (100 ng /ml) 24 tuntia sen jälkeen, kun LY294002 , selektiivinen estäjä PI3K että näin ollen estää aktivoinnin loppupään Akt, levitettiin 1 h. Ilmaisu P-ERK arvioitiin käyttäen Western blot. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. ** P 0,01 verrattuna kontrolli soluihin.

esto P-ERK poistetaan moottorien vaikutukset CCL21 /CCR7- proliferaatioon ja G

2 /M vaiheessa etenemistä. Voit tarkistaa onko PD98059, selektiivinen estäjä MEK joka häiritsee aktivointi loppupään ERK, voi poistaa vaikutukset CCL21 /CCR7- proliferaatioon ja G

2 /M vaiheessa etenemistä A549 ja H460-solujen, solujen elinkelpoisuuden ja solusyklin jakelu analyysit suoritettiin käyttäen CCK-8 ja virtaussytometria, vastaavasti. PD98059 merkittävästi kumosi vaikutukset CCL21 /CCR7- soluproliferaatioon ja G

2 /M vaiheessa etenemisen (kuvio 7 ja taulukko 2, tässä järjestyksessä). PD98059 myös poisti vaikutuksen CCL21 /CCR7- ilmentymistä koskevat P-ERK, sykliini A, sykliini B1, ja CDK1 (kuvio 8). Lisäksi, PD98059 yksinään oli merkittävä inhiboiva vaikutus solujen proliferaatioon, G

2 /M vaiheen etenemistä ja ilmentymistä P-ERK, sykliini A: n ja sykliini B1 (kuvio 7, taulukko 2 ja kuvio 8, vastaavasti).

A549 (A) ja H460 (B) soluja käsiteltiin CCL21 (100 ng /ml) 24, 48 tai 72 h kuluttua PD98059, selektiivinen estäjä MEK joka häiritsee aktivointi loppupään ERK, levitettiin 1 h. Solujen elinvoimaisuus arvioitiin käyttäen CCK-8 määrityksessä. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05 tai ** p 0,01, verrattuna kontrollisoluihin.

A549 (A) ja H460 (B) Soluja käsiteltiin CCL21 (100 ng /ml) 24 tuntia sen jälkeen, kun PD98059 , selektiivinen estäjä MEK joka häiritsee aktivointi loppupään ERK, sovellettiin 1 h. Ilmentymistasojen näiden komponenttien arvioitiin käyttäen Western blot. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05 tai ** p 0,01 verrattuna kontrolli soluihin.

P-ERK, aiheuttama CCL21 /CCR7-, vuorovaikutuksessa sykliini A, sykliini B1, ja CDK1. Jotta edelleen tunnistaa, onko vuorovaikutus P-ERK ja sykliini A, sykliini B1 tai CDK1, coimmunoprecipitation suoritettiin. A549 ja H460-solujen läsnä ollessa tai ilman CCL21 24 tuntia alistettiin immunosaostukselle vasta-aineita P-ERK tai IgG, jota seurasi Western-blottaus ja sykliini A, sykliini B1, ja CDK1. Korostunut, välistä spesifistä vuorovaikutusta P-ERK ja sykliini A, sykliini B1, tai CDK1 havaittiin, erityisesti silloin, kun soluja käsiteltiin CCL21 24 h (kuvio 9a). Vastavuoroisesti immunosaostuksella vasta-aineita sykliini A, sykliini B1, CDK1, tai IgG arvioitiin Western-blottauksella P-ERK, ja jälleen, vuorovaikutus P-ERK ja sykliini A, sykliini B1 tai CDK1 oli merkittävä, etenkin kun läsnä ja CCL21 (kuva 9b). A549 ja H460-solujen läsnä ollessa tai ilman PD98059 1 h alistettiin immunosaostukselle vasta-aineita P-ERK tai IgG, jota seurasi Western-blottaus ja sykliini A, sykliini B1, ja CDK1. Vuorovaikutus P-ERK ja sykliini A, sykliini B1 tai CDK1 heikensivät vastauksena PD98059 altistuminen (kuva 9c).

A549 (A) ja H460 (B) solujen puuttuessa tai läsnä CCL21 (100 ng /ml) 24 tuntia alistettiin immunosaostukselle vasta-aineita P-ERK tai IgG, jota seurasi Western-blottaus ja sykliini A, sykliini B1, ja CDK1 (a). Vastavuoroinen immunosaostuksella vasta-aineita sykliini A, sykliini B1, CDK1, tai IgG analysoitiin Western-blottauksella P-ERK (b). A549 ja H460-solujen läsnä ollessa tai ilman PD98059 1 h saatettiin immunosaostus P-ERK tai IgG-vasta-aineiden ja sen jälkeen Western blottauksella sykliini A, sykliini B1, ja CDK1 (c).

keskustelu

Useat tutkimukset ovat dokumentoitu, että aktivointi CCR7- vastaa välittävä selviytymisen tiettyjen syöpäsolujen linjojen edistämällä muuttoliikettä ja leviämiseen tai estämällä apoptoosin [33], [35] – [42]. Kuitenkin rooli CCR7- lisääntymisessä ihmisen NSCLC-solujen ei ole hyvin dokumentoitu. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme vahvistaneet, että CCL21 /CCR7 vuorovaikutus voi merkittävästi parantaa ihmisen NSCLC-solujen lisääntymisen in ajasta riippuvalla tavalla, johon säätelyä sykliini A, sykliini B1, ja CDK1, mahdollisesti kautta ERK, mutta ei Akt, polku.

yhdenmukainen aiempien tutkimusten eri solumalleja [16], [37], [40], aktivointi CCR7- kanssa CCL21 edistetään solujen lisääntymistä. Toisin kuin nykyinen havaintojen etukäteen tutkimuksessa todettiin, että hiiren CCL21 ollut merkittävää toimintaa proliferaatioon A549-solujen [44]. Mahdollinen selitys ristiriitaa olisi, että hiiri CCL21 voi olla vuorovaikutuksessa CXCR3 muttei CCR7-, kun taas ihmisen CCL21 voi sitoa CCR7- muttei CXCR3 [45]. Tämä viittaa siihen, että aktivaatio CXCR3 ei vaikuta lisääntymistä A549-solut.

Perinteisesti solusyklin on erillisiä neljään vaiheeseen: DNA: n replikaatio tapahtuu S-vaiheessa, ja kromosomi erottelu tapahtuu M vaiheessa. S ja M faasit erotetaan ns aukko vaiheet, G1 (ennen DNA-replikaation) ja G2 (ennen mitoosi). Olemme osoittaneet, että CCL21 /CCR7- merkittävästi muuttunut solusyklin jakelu niin, että enemmän soluja asutuilla G

2 /M vaiheessa. Merkittäviä eroja ei havaittu koskien jakautuminen solujen G

0 /G

1 ja S vaiheissa.

Solusykli säädellään sykliinien ja CDK. D-tyypin sykliinien pidetään keskeinen säätelijöinä G

1 etenemistä [46]. Sykliini E tarvitaan G

1 /S siirtyminen [47], [48] ja sykliini A on välttämätön etenemisensä S-vaiheeseen [49], [50]. Sekä sykliini A: n ja B-tyypin sykliinien liittävät CDK1 edistää pääsyä mitoosiin [51], [52]. Tässä tutkimuksessa sekä proteiini- että mRNA-tasot sykliini A, sykliini B1, ja CDK1 merkittävästi voimistunut, kun soluja käsiteltiin CCL21 24 tuntia. Tämä osoittaa, että CCL21 /CCR7- kiihdyttää G

2 /M vaiheessa etenemisen edistämiseksi soluproliferaatiota. Mitään merkittäviä eroja sykliini D1 tai sykliini E ekspressiotasoja mitattiin, mikä osoittaa, että CCL21 /CCR7- ei ole merkittävää vaikutusta G

0 /G

1 vaihe tai G

1 /S siirtyminen. Tämä havainto osoittaa ensimmäistä kertaa, että CCL21 /CCR7- on moottorien vaikuttaa solusyklin etenemistä, joihin G

2 /M vaiheessa.

Useat tutkimukset käyttävät muita solutyyppejä ovat osoittaneet, että aktivointi CCR7- liittyy tiiviimmän solujen selviytymistä kasvattamalla fosforylaatioon ERK, JNK tai Akt [16] – [20], [33], [35] – [42]. Tutkimme, onko CCL21 /CCR7- voi parantaa ilmentymistä MAPK komponenttien ja Akt A549 ja H460-soluissa. Meidän tulokset viittasivat siihen, että CCL21 /CCR7 parannettu fosforylaation ERK mutta ei JNK, p38, tai Akt. Nämä havainnot ovat ristiriidassa aiemmin julkaistu raportteja, että ehdotettu helpottavia vaikutus CCR7- on Akt, mutta ei Erk, polku [16], [19]. Erillinen tutkimus osoitti, että Akt on mahdollisesti ylävirtaan ERK [43]. Olemme havainneet, että CCL21 /CCR7 vielä voisi merkittävästi upregulate ilmentymisen P-ERK jälkeen soluja käsiteltiin LY294002 1 h. Koska LY294002 estää selektiivisesti PI3K estämiseksi alavirtaan aktivoitumista Akt tuloksemme viittaavat vahvasti siihen, että Akt ei olla kriittinen rooli vuorovaikutusta CCL21 /CCR7- ja ERK. Tämä on yhdenmukaiset aiemman raportin kanssa [53]. Syynä näihin eroihin jää epäselväksi.

Koska CCL21 /CCR7- kykeni lisäämään ilmentymistä P-ERK, pyrimme määrittämään onko vuorovaikutusta P-ERK ja sykliini A, sykliini B1, tai CDK1. Coimmunoprecipitation ja vastavuoroinen immunosaostus tulokset viittaavat voimakkaasti vuorovaikutusta P-ERK ja sykliini A, sykliini B1 tai CDK1, varsinkin läsnäollessa CCL21. Tämä vuorovaikutus voi heikentää ERK kanssa PD98059. Lisäksi PD98059 poisti vaikutus CCL21 /CCR7- A549 ja H460- solujen lisääntymisen ja G

2 /M vaiheessa etenemistä sekä vähen- tämisessä ilmaus P-ERK, sykliini A, sykliini B1, ja CDK1. Nämä tulokset osoittavat, että vaikutus CCL21 /CCR7- soluproliferaatioon ja säätelyä sykliini A, sykliini B1, ja CDK1 voi tapahtua ERK-reitin ihmisen NSCLC soluissa.

Tämä tutkimus viittaa siihen, että aktivaatio CCR7- kanssa CCL21 voi merkittävästi edistää lisääntymistä NSCLC solujen ajasta riippuva tavalla mukana sykliini A, sykliini B1, ja CDK1, mahdollisesti kautta ERK, mutta ei Akt, polku. Tämä tieto voi auttaa selventämään mekanismeja syöpäsolun selviytymisen ja tunnistaa potentiaalisia hoitoon NSCLC.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

A549 ja H460-solulinjoja aikaisemmista julkaistu paperi [32] viljeltiin RPMI-1640 tai DMEM-F12 lisätty 10% HyClone naudan sikiön seerumia (FBS) (ThermoFisher Scientific, Fremont, CA, USA) atmosfäärissä 5% CO

2 37 ° C: ssa. Soluja kasvatettiin 75 cm

2 viljelypulloissa ja kerätyistä trypsiinin liuos-EDTA: logaritmisen kasvun vaiheessa.

sykliini A, sykliini B1, sykliini D1, sykliini E, CDK1, P-ERK , ERK, P-JNK, JNK, P-p38, p38, P-Akt, Akt, IgG, ja β-aktiini hiiren tai kanin monoklonaalisia vasta-aineita ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Rekombinantti ihmisen CCL21 ostettiin Pepro Tech (Rocky Hill, NJ, USA). siCCR7 ja Lipofectamine 2000 ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Cell Counting Kit-8 (CCK-8) hankittiin Dojindo Laboratories (Peking, Kiina). PD98059 ja LY294002 saatiin Sigma (St. Louis, MO, USA) ja käytettiin 50 uM tai 100 uM (lopulliset pitoisuudet), vastaavasti, mukaisesti aikaisempien raporttien [40], [54]. Proteiini A /G-helmiä saatiin Beyotime (Haimen, Kiina).

siRNA solujen käsittely

A549 ja H460-solut maljattiin 6 cm:

2 soluviljelymaljoille ja kasvatettiin 30-50% konfluenssiin ennen transfektiota Lipofectamine 2000 aikaisemmin kuvatulla [55]. Transfektion tehokkuus arvioitiin virtaussytometrialla. Hyötysuhteet siCCR7 ja ei-hiljentäminen ohjaus siRNA testattiin Western blot ja RT-PCR. Sekvenssit siCCR7 ja ohjaus siRNA olivat: CCR7, 5′-GCGUCAACCCUUUCUUGUATT-3 ’ja 3′-UACAAGAAAGGGUUGACGCAG-5′; ohjaus, 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ’ja 3′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-5’.

Soluproliferaatiomääritys

Soluproliferaatioon toimintaa tutkittiin käyttäen CCK-8. A549 ja H460-solut ympättiin 96-kuoppalevyille (1000 solua /kuoppa), ja sitä käsiteltiin CCL21 0, 24, 48, tai 72 tuntia. Hoidon jälkeen, CCK-8, lisättiin kuhunkin kuoppaan mukaisesti valmistajan ohjeiden ja inkuboitiin 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Optinen tiheys (OD) arvo kussakin kuopassa mitattiin käyttäen mikrolevyn lukijaa (Spectra Thermo, Männedorf, Sveitsi), jossa testi aallonpituudella 450 nm.

Solusyklianalyysiä

käsittelyn jälkeen CCL21 24 tuntia, solut kerättiin ja pestiin kahdesti kylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kiinnitettiin 75% etanolissa 2 tuntia 4 ° C: ssa. Kiinnitetyt solut pestiin kaksi kertaa 500 ul: lla kylmää PBS: ää. Sitten solut värjättiin 500 ui propidiumjodidia (PI) värjäysliuosta (50 ug /ml PI, 0,1% Triton X-100, 200 ug /ml DNaasi-vapaata RNaasi PBS: ssä) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä. Kymmenentuhatta tapahtumaa per näyte hankittiin käyttäen FACS-scan virtaussytometrillä (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA), ja prosenttiosuus solujen G

0 /G

1, S ja G

2 /M vaiheiden solusyklin määritettiin käyttäen Modfit LT 3,0 (Becton-Dickinson).

Western blot-analyysi

käsittelyn jälkeen CCL21: ssa 24 tuntia, solut uutettiin lysis -puskuria (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 2 ug /ml aprotiniini ja 1 mM PMSF) 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Uutteet sentrifugoitiin 12000 x

g

15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantit sisältävä kokonaisproteiinista sitten korjattu. Alikvootit, joista jokainen sisältää 50 ug proteiinia, erotettiin 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-kalvoille 55 V (sykliini A, sykliini B1, P-Akt, Akt) tai 40 V (muut) 2,5 tuntia alhaisessa lämpötilassa . Membraanit blokattiin kuoritun maidon 5% 2 h, ja proteiinit havaittiin käyttäen monoklonaalisia vasta-aineita 1:1000 (P-JNK, JNK, P-p38, p38 ja β-aktiini) tai 1:200 (muut) laimennus yön yli 4 ° C: ssa. Proteiinit saatiin näkyviin käyttäen anti-hiiri- tai anti-kani-IgG: llä konjugoituna piparjuuriperoksidaasiin (HRP) on 1:6000 tai 1:8000 laimennoksella 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, vastaavasti. Bändit oli kuvattu kanssa EC3 Imaging System (UVP LLC, Upland, CA, USA), ja OD mitattiin ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA). OD ero testattiin proteiinien ja β-aktiini, että samasta näytteestä laskettiin suhteellinen pitoisuus ja ilmaistiin graafisesti.

RT-PCR ja reaaliaikainen PCR

Kokonais-RNA eristettiin soluista käyttämällä TRIzolia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. p-Actin käytettiin sisäisenä kontrollina. Voit selvittää hyötysuhteet siCCR7 ja hallita siRNA semikvantitatiivisista RT-PCR suoritettiin G-STORM lämpösyklilaitteeseen (GRI Ltd, Byfleet, UK) käyttämällä TAKARA RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 (TaKaRa, Dalian, Kiina). PCR-alukkeet olivat seuraavat: CCR7 F: 5′-GAGGCTATTGTCCCCTAAACC-3 ’, R: 5′-TGGAGGACAGTGAAGAAAACG-3’. CCR7- amplikoni pituus oli 305 emäsparia. β-aktiinin F: 5′-AAATCGTGCGTGACATTAA-3 ’, R: 5′-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3’. Β-aktiini amplikoni pituus oli 513 emäsparia. Lämpö sykliolosuhteet olivat seuraavat: 30 sykliä 40 s kukin, mukaan lukien denaturaatio 95 ° C: ssa, pariuttaminen 53 ° C: ssa, ja pidennys 72 ° C: ssa.

Reaaliaikainen PCR suoritettiin ABI Prism 7900HT Fast System (Applied Biosystems, Foster, CA, USA) käyttäen SYBR Esisekoite Ex Taq II (Takara). Monistukset suoritettiin kokonaistilavuudessa 20 ui ja kierrätettiin 40 kertaa, kun alkudenaturaation (95 ° C, 30 s) ja seuraavia parametrejä: 95 ° C: ssa 5 s ja 60 ° C: ssa 30 s. β-aktiinin F: 5′-AGCACAGAGCCTCGCCTTTG-3 ’, R: 5′-ACATGCCGGAGCCGTTGT-3’. Β-aktiini amplikoni pituus oli 107 emäsparia. Muita alukesekvensseissä on julkaistu toisessa tutkimuksessa [56]. Luotettavuus PCR tulokset tukivat analysoimalla dissosiaatiokäyrä. Reaaliaikainen PCR tiedot laskettiin 2

-ΔΔCT menetelmää SDS 2,4 ohjelmistopaketti (Applied Biosystems) [57].

Coimmunoprecipitation

hoidon jälkeen CCL21 24 tuntia solut uutettiin lyysipuskurilla (10 mM KCI, 1,5 mM MgCl

2, 10 mM HEPES [pH 7,9], 1 mM PMSF, 1 mM DTT) ja homogenoitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Uutteet sentrifugoitiin 12000 x

g

15 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja supernatantit, jotka sisältävät koko proteiinia kerättiin. Yhtä suuret määrät proteiinia, altistettiin vasta-aineita P-ERK, IgG, sykliini A, sykliini B1, tai CDK1, joka immobilisoitiin proteiini A /G-helmiä. Seuraavat 3 tunnin inkuboinnin 4 ° C: ssa varo- vaisesti pyörittäen, helmet pestiin perusteellisesti viisi kertaa hajotuspuskurilla, keitetyt ja mikrosentrifugoitiin. Proteiinit havaittiin vasta-aineita P-ERK, sykliini A, sykliini B1 tai CDK1 Western blotilla.

Tilastollinen

Tiedot analysoitiin SPSS 16.0 ohjelmistolla. Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) käytettiin arvioimaan eroja ryhmien kanssa erilaisia ​​hoitoja, ja vähiten merkitsevä ero (LSD) testi tai Dunnettin T3 testiä käytettiin post hoc alaryhmäanalyysi. Polynomi sijaan käytettiin analyysiä varten. Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tulokset katsottiin tilastollisesti merkittävä p 0,05. N-kertainen arvot geenien ilmentymisen muuttua jopa 0,5 ja alle 2 otettiin nonsignificant mukaisesti arvoja negatiivinen kontrolli geeneistä [57], [58].