Krooninen sairaus

tiivistelmä

mekanismit epänormaalin proteiinin fosforylaation, jotka säätelevät solujen invaasiota ja etäpesäkkeiden haimasyövän epäselvät. Tässä tutkimuksessa käytimme suurikapasiteettisten fosforylaation array testata kaksi haimasyövän solulinjoissa (PC-1-solut, joissa on pieni, ja PC-1,0-solut, joilla on korkea potentiaali invaasiota ja etäpesäkkeiden). Totesimme, että yhteensä 57 proteiinien paljasti differentiaalikaavojen (fold muutos ≥ 2,0). Kuusi ehdokasta proteiinit vielä vahvistanut western blotilla osumaa olevan mukaisesti jono. 57 proteiineja, 32 säädelty proteiinit (esim CaMK1-α ja P90RSK) olivat pääasiassa mukana ErB ja neurotrofiinireseptoreiden signalointireitteihin määritettynä käyttäen DAVID ohjelmistoa, kun taas 25 alassäädetty proteiineja (esim BID ja BRCA1) on kiinteästi mukana apoptoosin ja p53 signalointireitteihin. Lisäksi neljä proteiineja (AKT1, Chk2, p53 ja p70S6K) eri fosforylaatiopaikkaa todettiin, ei ainoastaan ​​säädellään ylöspäin, mutta myös yksi alassäädetty proteiineja. Tärkeää on, erityisiä fosforylaatiopaikat voi vaikuttaa solujen biologisia toimintoja. CentiScaPe ohjelmisto laskettu topologinen ominaisuuksia kunkin solmun proteiini-proteiini vuorovaikutus (PPI) verkko: huomasimme, että AKT1 omistaa suurimman solmu astetta ja betweenness että ylössäätöä proteiini PPI-verkon (26 solmua, keskimääräinen polun pituus: 1,89, solmu astetta : 6,62 ± 4,18, betweenness: 22,23 ± 35,72), ja p53 on alassäätöä proteiini PPI-verkon (17 solmua, keskimääräinen polun pituus: 2,04, solmu astetta: 3,65 ± 2,47, betweenness: 16,59 ± 29,58). Lopuksi tunnistaminen epänormaalin proteiinin fosforylaation liittyvät invaasiota ja etäpesäkkeiden voivat antaa meille mahdollisuuden tunnistaa uusia biomarkkereita, jolla pyritään kehittämään uusia terapeuttisia lääkekohteita haimasyövän hoitoon.

Citation: Tan X, Liu P, Huang Y, Zhou L, Yang Y, Wang H, et al. (2016) Phosphoproteome analyysi ja metastaasit liittyviä tekijöitä haimasyöpäsoluissa. PLoS ONE 11 (3): e0152280. doi: 10,1371 /journal.pone.0152280

Editor: Dong Wang, Harbin Medical University, Kiina

vastaanotettu: 14 marraskuu 2015; Hyväksytty: 12 maaliskuu 2016; Julkaistu 25 maaliskuuta 2016

Copyright: © 2016 Tan et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Liaoningin Natural Science Foundation of China (nro 2014021006).

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet että ei kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

Haimasyöpä on erittäin pahanlaatuinen sairaus, jossa on hyvin huono ennuste. Huolimatta huomattavasti edistysaskeleet radiologisten ja endoskooppinen ultraääni tekniikoita, se usein esittelee paikallisesti edenneen tai metastaattisen sairauden useimmilla potilailla, ja vain noin 10-20% potilaista katsotaan ehdokkaita leikkausta [1, 2]. Sen lisäksi leikkauksesta, muita tehokkaita hoitomenetelmiä ei ole olemassa, ja eloonjäämisaste resektoidun potilaille on myös erittäin alhainen. Suurin syy huonoon ennusteeseen on paikallinen uusiutumista ja /tai kaukana etäpesäke leikkauksen jälkeen. Tämä viittaa siihen, että ymmärtäminen solu- ja molekyylitason mekanismeja ja metastaasit haimasyövän on tärkeää ja vaatii lisätutkimusta.

Kuitenkin, proteiinia translaation jälkeiset muutokset haimasyövän solulinjoissa, mikä voi olla välttämätöntä rooleja sääntely soluvasteiden, joita ei ole selvästi osoitettu. Sen vuoksi on tärkeää tunnistaa kaikki fosforylaatiotapahtumien ja määrittää koko proteiinin fosforylaation profiilit syöpäsoluja. Äskettäin vertaamalla phosphoproteomes eri kehitysvaiheissa ihosyövän hiirillä, liittyvien proteiinien varhainen ja myöhäinen soluvasteita havaittiin, tarjoaa uusia oivalluksia taudin etenemistä [3]. Batchu et ai. havaitsivat, että miR-26a hoito voisi palauttaa villityypin toimintojen mutantin p53 kautta fosforylaation sen Ser9 ja Ser392 jäämät, mikä johtaa solujen kasvun esto [4]. Siksi paikkasidonnainen proteiinien fosforylaatio on tärkeä rooli säätelyssä solussa prosesseissa.

Kuitenkin, sikäli kuin tiedämme, tutkimuksia ei ole analysoitu phosphoproteome profiilit kahden homogeenisen solulinjoista (PC-1, jossa on alhainen, ja PC-1,0, joilla on korkea potentiaali ja metastaasit) [5, 6] haimasyövän tutkimukseen. Tavoitteena on vertailla muutoksia 582 fosforylaatiopaikat 452 proteiinien välillä PC-1 ja PC-1.0 solujen hyödyntäen Fosfospesifiset Explorer Vasta Array tekniikkaa. Lisäksi reittejä ja verkkoja, jotka liittyvät fosfopro- tunnistettu tutkimuksessamme osoittavat vaihtelevat suuresti niiden osia.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja soluviljelmä

Kaksi hamsteri haimasyöpä solulinjoja käytettiin: heikosti invasiivinen ja metastaattinen soluja (PC-1), ja erittäin invasiivinen ja metastaattinen soluja (PC-1,0). PC-1 solulinja perustetaan haimatiehyen adenokarsinooman aiheuttama BOP vuonna Syyrian kultahamsteri. PC-1.0 solulinja perustettiin subkutaanista kasvain jälkeen tuotettua siirrostus hamsterin PC-1-soluissa [5,6].

In vitro

, PC-1,0-solut ovat pääasiassa yksittäisiä soluja, kun taas PC-1-solut kasvavat saarimaiset solujen pesäkkeitä.

In vivo

, paikallista invaasiota PC-1,0-solujen ja paikallisen laajenemisen PC-1-soluissa ei havaittu [7].

PC-1,0 ja PC-1-soluja inkuboitiin RPMI-1640 (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Bioserum, Canterbury, Victoria, Australia), 100 U /ml penisilliini G ja 100 ug /ml streptomysiiniä 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, 5% CO

2/95% ilmaa.

Phospho-proteiinin profilointi Phospho Explorer Vasta Array

Solulysaatit saatu PC-1 ja PC-1,0-soluja levitettiin phospho Explorer Vasta Array (Full Moon Biosystems, Sunnyvale, CA, USA). Array sisälsi 1318 vasta-aineita. Jokainen vasta on kaksi rinnakkaista, jotka painetaan päällystetylle mikroskoopin dia yhdessä useita positiivisia ja negatiivisia kontrolleja. Lyhyesti, solulysaatteja uutettiin Vasta-Array Assay Kit, joka sisälsi proteaasi-inhibiittori cocktail ja fosfataasi-inhibiittori, ja ne suoritettiin valmistajan protokollan. 25 ug solulysaateista leimattiin 3 ui biotiiniin. Vasta-aine microarray liukuu ensin estetty blokkausliuosta 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, huuhdeltiin Milli-Q-laatua olevaa vettä, ja kuivattiin pakattu typellä. Ja sitten inkuboitiin biotiini-leimattu solulysaateista kytkentään liuokseen huoneen lämpötilassa 2 tuntia. Array levyjä pestiin neljä kertaa 60 ml 1 x Wash Solution ja huuhdeltiin perusteellisesti Milli-Q-laatua olevaa vettä ennen ilmaisua sitoutuneen biotinyloidun proteiinin välillä käyttäen Cy3-konjugoitu streptavidiini. Levyt skannattiin GenePix 4000 skanneri ja kuvat analysoitiin GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

fosforylaation suhteen muutos laskettiin perustuen seuraavan yhtälön jossa ilmaus fosforyloidun proteiinit oli normalisoitu vastaaviin fosforyloimattoman proteiinin ilmentyminen sekä kokeellisen (PC-1,0) ja vertailutiedot (PC-1). Fosforyloituu proteiinit katsottiin ekspressoitua eri kun kasvu (≥ 2,0) tai vähennys (≤ 0,5) esiintyi suhdetta ekspressiotasoja välillä PC-1.0 ja PC-1-soluissa. Proteiinifosforylaation tiedot vahvistettiin Western blot.

Vasta-aineet ja reagenssit

Kanin polyklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​epitooppeja ihmisen Abl1, pAbl1-Tyr204 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), ITGB4 , ITGB4-Tyr1510 (Abcam, Cambridge, MA, USA), Myc, pMyc Ser62, Fos, PFOS-Thr232, IRS-1, Pirs-1-Ser636, Raf1, pRaf1-Tyr341 ja ß-aktiini (Santa Cruz Biotechnology, Dallas , TX, USA) käytettiin ensisijaisena vasta-aineita. Piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineiden tai FITC-fluoresoiva vasta-aineita (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), joita käytetään toissijaisena vasta-aineiden Western blot. FOS ja IRS-1 siRNA ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). RAF1 estäjä (GW5074) hankittiin Selleck Chemicals (Houston, TX).

Western blot

Western-blottaus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [7]. Solut kerättiin jäihin käyttäen RIPA puskuria täydennettynä proteaasiestäjäseostabletit ja fosfataasinestäjällä 30 minuuttia. Lyhyesti, näytteet vastaavat yhteensä proteiinia (20 ug) ajettiin 5% polyakryyliamidilevygeeli ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF) kalvo (Bio-Rad, Anaheim, CA, USA). Membraanit inkuboitiin primaarisen vasta-aineen, laimennettuna 0,1% Tween-20 /PBS: llä, yön yli 4 ° C: ssa. Blotteja inkuboitiin sitten piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (laimennettu 1: 5000) 0,1% Tween-20 /PBS: llä. Proteiinit saatiin näkyviin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssidetektiolla reagenssit (Santa Cruz Biotechnology).

In vitro

hyökkäyksen ja muuttoliike määritykset

PC-1,0-soluja transfektoitiin ohimenevästi eri siRNA: illa käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Grand Island, NY), tai tukahdutettiin käyttäen RAF1 estäjä. Invaasiolle Transwell määrityksiä, transfektoidut solut (5 x 10

4 solua /ml) seerumia lisättiin yläkammiot, joka hankittiin Costar (8 um huokoskoon suodattimien, New York, NY) ja päällystetty matrigeelin (dilution1: 4). Alakammioissa täytettiin RPMI-1640, joka sisälsi 10% seerumia. 24 tunnin inkubaation jälkeen solut jäljellä yläkammiot poistettiin, ja invasiiviset solut alakammioissa kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä (Sigma-Aldrich), värjättiin kristallivioletilla huoneenlämpötilassa, ja laskettiin mikroskoopilla. Haavan paranemista migraatiokokeessa, transfektoidut solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille 24 tuntia. 1mm laajuinen haava tehtiin poikki yksikerroksista kärjellä 200 ui pipetillä. Sitten kuvat otettiin 0, 6 ja 12 h käyttäen mikroskooppia. PC-1,0-soluja suoritettiin kuten edellä on kuvattu kontrollina. Kukin koe suoritettiin kahtena kappaleena ja kolme kertaa. Vahvistamiseksi taso kolme proteiinien pudotus solussa, solut altistettiin reaaliaikaisen PCR: llä ja Western blot -analyysillä käyttämällä spesifisiä alukkeita ja vasta-aineita, vastaavasti. Alukkeita monistamiseen käytettiin FOS ja IRS-1 on lueteltu S1 taulukossa.

Gene ontologia ja Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomit (Kegg) reitin analysoi ja Search Tool haettaessa Vuorovaikutus Genes /Proteiinit

havaitsemista merkittävästi rikastettu Gene ontologia (GO) sanottuna Cytoscape plugin BINGO käytettiin [8,9]; ilmentyvät eri fosforyloitu proteiinit automaattisesti koottu tiettyihin biologisen prosessin, molekyyli- toiminto tai solukomponentista. GO ryhmiin, joilla on korjattu

P

-arvo 0,01 oli merkitty eri merkitys tasoilla. Pathway analyysit differentiaalisesti ilmaisi fosforyloidun proteiinit tehtiin käyttäen DAVID (Database varten Annotation, visualisointi ja Integration Discovery) bioinformatiikan resurssit (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) [10] bioinformatiikan ja merkittävästi muuttunut signalointireitteihin oli valittu on

P

-arvo 0,01, ja FDR (False Discovery Rate) 10%. Perääntymisen vuoksi kvantitatiivisesti mitata käyttäen modifioitua Fisherin testiä. Käyttää Search Tool haettaessa Vuorovaikutus Genes /Proteiinit (STRING) (https://www.string-db.org/) tietokanta, saimme proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen (PPI) verkko [11]. PPI verkko rakennettiin kun luottamus pisteet yli 0,9 osoitti, että vain vuorovaikutuksia korkean luottamuksen pidettiin voimassa linkkien PPI verkossa.

Topological analyysi PPI verkon

jotta ymmärrettäisiin paremmin PPI-verkkoon, CentiScaPe ohjelmisto [12], käytettiin analysoimaan topologinen verkon ominaisuuksista ja laskea solmun asteen jakauma, keskimääräinen polun pituus, topologinen kerroin ja betweenness. Voisimme suoraan analysoida molekyylien vuorovaikutus verkkojen avulla visualisoida työkaluja, ja saatu mielenkiintoisia avain proteiineja. Lisäksi GeneMANIA (https://www.genemania.org/) www-palvelin käytettiin ennustamaan verkkoihin. Tällainen web-palvelin työkalu tehty tehokas geenien toiminnan ennusteita, mukaan lukien yhteistoiminta ilme, fyysinen vuorovaikutus, polkuja ja ennusti verkkoja, jotka perustuvat aiemmin raportoitu kokeellista tietoa [13]. Tässä raportissa, käytimme automaattisesti valitun painotuksen menetelmällä ja käytetään ihmisen lähteenä laji ennustaa verkkoihin.

Tilastot Analysis

Tilastollinen analyysi ja grafiikkaa tehtiin käyttäen GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, San Diego CA). Tulokset esitetään keskiarvona ± keskivirhettä (SEM). Vertailut määrällisten analysoitiin Studentin

t

testiä tai ANOVA kahden ryhmän välillä (kaksisuuntainen;

P

-arvot 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä).

tulokset

Differentially ekspressoidun proteiinin fosforylaatio tunnistaa PEX100 erittäin (PC-1,0) ja heikosti (PC-1) invasiivisia ja metastaattinen haiman soluja

tunnistaa ilmentyvät eri signalointi liittyvien fosforyloitujen proteiineja välillä erittäin (PC-1,0) ja heikosti (PC-1) invasiivisen ja metastaattisen syöpäsolujen ekspressiotasot fosfo-spesifistä vasta-ainetta proteiinien kaksi haimasyövän solulinjoissa verrattiin. Niistä 1318 vasta analysoitiin microarray kokeiluja, yhteensä 57 proteiinien osoitti differentiaalikaavojen käyttämällä kertainen suhdetta ≥ 2 cutoff kriteerinä. Näiden 57-proteiinien ekspressiotasot 32 proteiineja merkittävästi lisääntynyt PC-1,0 verrattuna PC-1-soluissa (taulukko 1 esittää kymmenen eniten voimistunut proteiinit). Sitä vastoin ilmaus tasot 25-proteiinit ovat pienentyneet merkittävästi PC-1,0 verrattuna PC-1-soluja (taulukko 2 esittää kymmenen vaimentua proteiinit). Suhteet esitetään edustavat ekspressiotasot PC-1,0-soluissa verrattuna ekspressiotasot PC-1-soluissa. CaMK1-α oli yli-ilmentynyt korkeilla tasoilla PC-1.0 soluissa, kun taas Smad1 oli alassäädetty, paljastaen pieni joukko intensiteetin. Lisäksi neljä proteiineja (AKT1, Chk2, p53 ja p70S6K) eri fosforylaatiopaikkaa todettiin, ei ainoastaan ​​säädellään ylöspäin, mutta myös yksi alassäädetty proteiineja. Varsinainen array siru kuvia näytettiin S2 taulukossa ja ilmaus kaikkien proteiinien lueteltiin S3 taulukossa.

Validation fosforylaation proteiinien Western blot, ja differentiaalisesti proteiinit on merkittävä rooli solujen migraation ja invaasion PC-1.0 Metastaattinen

validoida proteiinifosforylaation tietojen ekspressiotasot kuuden satunnaisesti valitun proteiineja vertailuja PC-1.0 ja PC-1-soluja uudelleen tutkittiin western blot (kuvio 1). Western blotit paljasti, että kaikki kuusi proteiinit osoittivat lisääntynyttä fosforylaatiota PC-1,0-solujen vastaa meidän array data, mikä vahvistaa jälkimmäisen luotettavuudesta. Ymmärtää toiminnallinen suhteita ero muutoksen proteiinin fosforylaatio erittäin metastaattinen PC-1,0-soluissa, invaasio ja muuttoliike määritykset suoritettiin. Western blot ja reaaliaikaisen PCR-analyysit tehtiin vahvistaa tehokkuutta siRNA tai inhibiittoripastojen alassäätöä (Kuten on esitetty S3 taulukko). Vahva inhibitio muuttoliikkeen havaittiin FOS, IRS-1 ja RAF1 käyttämällä siRNA tai vasta esto (kuvio 2A), ja koskien invaasio, FOS, IRS-1 ja RAF1 aiheuttivat myös merkittävä väheneminen hyökkäys kyky (kuvio 2B).

Kuten on esitetty, koko ilmaisua kunkin proteiinin oli sama molemmissa solulinjoissa, kun taas fosforylaation tasolla, ilmaisu kuuden proteiinien oli vahvempi PC-1,0-soluissa kuin PC-1-soluissa. Molekyylimarkkereina osoitetaan.

(A) vaikutus kolme proteiinien siirtymistä käytön jälkeen siRNA tai vasta esto erittäin metastaattinen PC-1.0 soluissa. Soluja inkuboitiin 24 tuntia. Prosenttiosuus muuttoliike laskettiin ja piirretään. * Verrattuna PC-1,0,

P

-arvo 0,01. (N = 3) (B) kvantifiointi siirtokuoppaan määrityksen käsitellyn ryhmän ja kontrolliryhmän. Solut laskettiin kolmesta kaivosta ja kolme samansisältöistä kokeissa * Verrattuna PC-1,0,

P

-arvo 0,01. (N = 3)

Toiminnallinen luokittelu, verkko ja polku analyysi

Ymmärtääksemme samanlainen biologisista prosesseista, jotka korreloivat invaasio ja etäpesäkkeiden haiman syöpäsoluja, selvitimme nämä uudelleen käyttämällä verkossa toiminnallinen käsinkirjoitustyökalun, DAVID, ja myös Kegg sellaisia ​​keinoja analyysi. GO aikavälin analyysi osoitti, että tavoitteet rikastettu monissa prosesseissa (taulukot 3-5), mukaan lukien aminohappo fosforylaatiota ja translaation jälkeiset proteiinin muutos. Pathway analyysit paljastivat tällaista sääteli tavoitteet rikastuneet 27 Kegg väyliä (kuvio 3A), jotka olivat välttämättömiä aineenvaihduntaa (insuliinin signalointireitin ja solusyklin), immuniteetti (T-solureseptorin signalointireitin) ja kehitys (ErB signalointireittiin). Proteiinit muodostavat PPI-verkkoon ja ovat sekaantuneet muuttamisessa ja valvontaan solujen invaasio erilaisissa biologisissa järjestelmissä. Tiedot on esitetty kuviossa 3B ja 3C. Kuvio 4A ja 4D esittävät vuorovaikutusverkosto rakennettu STRING jälkeen kyselemällä 32 säädelty ja 25 alassäädetty proteiineja löytyy PC-1.0 soluissa. Lisäksi kun luottamus pistemäärä oli 0,900, CAMK1-α, PIM-1and MKK7 /MAP2K7 ei enää sisälly up-säännelty verkkoon, sekä MAPKAPK2, sytokeratiinista 8, GATA1, GRK1, ACC1, PDGFRA ja Smad1 on alassäädetty verkkoon. Markov (MCL) ja K-Means klusterin algoritmeja käytettiin sitten analysoida edelleen PPI verkoissa. Vertailun saimme noin seuraus klusterin jossa MCL sulku oli 2 ja K-Mean sulku oli 4 sekä säädellään ylöspäin (kuva 4B ja 4C) ja alassäädetty (kuvio 4E ja 4F) PPI verkoissa. Proteiinit, joilla on vähemmän tai ei lainkaan vuorovaikutusta havaittiin enemmän kehää kohti verkkoon. Edelleen kokeellinen tutkimus vaaditaan näiden etuyhteydettömien proteiinien jotta voidaan ymmärtää niiden todellinen funktio on PPI-verkossa.

Kegg ja BioCarta polku toiminnallinen merkinnät erilaisesti ilmaistu sääteli (A, C) ja alassäädetty (B ) proteiinit (

P

-arvot 0,01, Benjamin 0,05). Rikastamiseen tulokset vastaavat kutakin polku toimittamat DAVID käsinkirjoitustyökalun näkyvät -log

P

-arvot. Alassäädetty proteiineja, jotka olivat BioCarta polku toiminnallinen merkinnät vain rikastuneet apoptoottisen signalointi vastauksena DNA vaurioita.

(A) PPI-verkkoon, kuten on esitetty vuorovaikutteinen mielestä tuottaman STRING tietokanta paljastaa toiminnallisia vuorovaikutuksia sääteli proteiineja. Kukin solmu edustaa proteiinia, ja kukin reuna edustaa vuorovaikutusta (

P

-arvot = 6.06E-12); (B) Up-säänneltyjen proteiinien MCL klusterin algoritmit johdetaan STRING. MCL = 2; (C) ylöspäin säädelty proteiinit ”K-Means klusteri algoritmeja. K-Means = 4; likimääräinen samoja seurauksia kahdella klusterien (D) PPI-verkko paljastaa toiminnallisia vuorovaikutuksia alassäädetty proteiineja (

P

-arvo = 1.47E-6); (E) alassäädetty proteins’MCL klusteri algoritmeja. MCL = 2; (F) alassäädetty proteiinit ”K-Means klusteri algoritmeja. K-Means = 4.

Lisäksi CentiScaPe ohjelmistot, jotka laskevat topologinen ominaisuuksia kunkin solmun, käytettiin saada syvällistä tietoa biologisista ominaisuuksista PPI-verkon, mutta ei etuyhteydettömille proteiineja. Ylös-asetus PPI verkosto koostui 26 solmujen joiden keskimääräinen reitin pituus 1,89. Solmun aste oli 6,62 ± 4,18, ja betweenness oli 22,23 ± 35,72 (taulukko 6). Samalla menetelmällä, meidän alassäätöä PPI verkon näytetään 17 solmut, joiden keskimääräinen reitin pituus 2,04. Solmun aste oli 3,65 ± 2,47, ja betweenness oli 16,59 ± 29,58 (taulukko 7). Proteiinit, joilla on suuri arvo olivat tärkeämpiä verkossa ja tämä ehdotti keskeinen rooli ylläpitää toimintoja ja johdonmukaisuuden viestinvälitystekniikoita. Meidän sääteli PPI-verkkoon, keskitin proteiineja korkea solmun aste ja betweenness ( Means) olivat AKT1, CTNNB1, FOS, NFKB-p65, SYK, TP53 ja MYC. Toisaalta, alas-säädellä verkon mukana BRCA1, LCK, AKT1, ja TP53 (kuvio 5). Erityisesti AKT1 ja TP53 näkyvät korkeimman pistemäärän kaikkien laskettu centralities, mikä viittaa sen keskeinen säätelevä rooli säädelty proteiineja ja on alassäädetty verkkoon.

Kaikki solmut, joilla on keskeistä arvoa suurempi tai yhtä suuri kuin kynnys on korostettu vaaleanharmaata verkossa mieltä. (A) sääteli proteiinit; (B) alassäädetty proteiineja.

Seuraavaksi ilmentyvät eri fosfopro- ladattiin päälle GeneMANIA työkalu ennustaa koekspressoimalla verkkoon. Tämän seurauksena 20-geenit lisättiin verkkoon (kuvio 6, taulukko 8). Tällainen yhteistyö ilmaus verkon selittää erillistä prosessia löytyy haimasyövän solulinjoissa. Yleensä tällaiset topologinen ominaisuudet verkko voi paremmin ymmärtää keskeisten liittyvien geenien hyökkäystä.

verkosto ero geenien luotiin käyttäen GeneMANIA. Vasemmanpuoleinen verkko edustaa jopa geenien ja oikea verkko edustaa alas geenien. Lisäksi viisi geenejä esiintyy sekä ylä- ja alassäädetty verkot (TP53, CHEK2, AKT1, RPS6KB1, RAF1). Kyselyn geenit on merkitty mustalla pisteellä ja koekspressoimalla on osoitettu vaaleanpunainen linjat. Gray solmut osoittavat ennustetun geenejä.

(Weight ≥ 0,04).

Keskustelu

Viime vuosina monet tutkijat ovat käyttäneet endoskooppinen ultraääni-ohjattu hieno neula toive (EUS-STT) kuin ennen leikkausta diagnostinen menetelmä vähentää turhaa kirurgisten toimenpiteiden käytettäessä pyritään saavuttamaan korkeamman eloonjäämisaste [14,15]; kuitenkin, tulokset ovat olleet tyydyttäviä. Kuinka vähentää ja metastaasit haimasyövän on edelleen voimakas tutkimus- ja jatkuva ongelma. Fosforylaatio on tärkein ja on mukana monissa solun toiminnoissa (esim lisääntymistä, erilaistumista, signaalitransduktion, aineenvaihdunta, apoptoosin, solu-signalointi, transkription ja translaation asetus) [16-23].

Kuten kuvattu edellisessä tutkimuksessa olemme perustaneet kaksi haimasyövän solulinjoissa kokeellisesta haimasyöpä malli [5,6]. Jaksottamattomat soluja (PC-1) ja hajotettiin solujen (PC-1,0) osoittavat korkea histologinen yhtäläisyyksiä mutta eroavat invasiivisia ja metastaattinen valmiuksia. Me rationalisoida, että käyttämällä tällaisia ​​solulinjoja minimoisi vaikutus käyttäen soluja eri kudoksista peräisin. Siksi analyysi ilmentyvät eri phosphoproteomes kahdessa solulinjoissa (PC-1,0 ja PC-1) on erityisen tärkeää tutkimuksessa haimasyövän ja metastaasit mekanismeja.

Jotta edelleen ymmärtää erilaisia ​​biologisia toimintoja tuotettu eri fosforylaatio muutoksia saman proteiinin kahdessa solulinjassa (PC-1,0 ja PC-1), suurikapasiteettisten fosforylaatio array tekniikkaa käytettiin analyysimme. Array havaittu fosforylaation tasoja proteiinien tiettyjä aminohappotähteitä (esim. Ser, Thr, Tyr), ja edellyttäen, tarkka ja tehokas phosphoproteome profilointi kunkin haimasyövän solulinja. Sen jälkeen data mining, olemme havainneet, että on 57 allekirjoituksen ero ilmaisun proteiinien, kuusi geeniä koodattu 12 proteiineja, jossa fosforylaatio esiintyvät eri sivustoja (eli NFKB-p65, p70S6K, Smad2, Chk2, p53 ja AKT1). Kaatopaikkakohtaisen proteiinien fosforylaatio normaalisti johtaa eri biologisiin toimintoihin [24]. Mutta roolit useiden fosforylaatiopaikat yhdessä proteiinin molekyylin ei ole selvästi selvitetty. Näin ollen, Guo et ai. käytetyt nanofluidic proteomic immunomääritys (NIA) analysoida ja luonnehtia proteiinifosforylaation useiden eri sivustoja [25]. Verrattuna Guo et ai. Tutkimuksen, tuloksemme osoittavat, että fosforylaation Thr72 ja Ser124 of AKT1 on suurempi merkitys ja niitä voidaan läheisesti haimasyövän invaasiota ja etäpesäkkeiden.

Yleensä kemokiinit ovat pieniä proteiineja, joilla on tärkeä rooli valvoa muuttoa monipuolinen solujen [26]. Tuloksemme osoittavat, että 10-proteiinit, että olemme määritelleet voidaan luokitella kemokiinien (esim ITGB4, PLCG2, IRS-1, FOS, CTNNB1, PLCG1, CD227, PKD1, P53 ja ACTC1), mukaan https://www.phosphosite.org [27]. Muut invaasio liittyvät proteiinin tyypit olivat transkriptiotekijöitä (MYC, Rb, FOS, CTNNB1, NFKB-p65, P53, BRCA1, GATA1, Smad1 ja Smad2) ja solun tukirangan proteiinit (Lamin A, sytokeratiinista 8 ja ACTC1).

kautta Kegg koulutusjakson analyysit, huomasimme, että nämä differentiaalikaavojen proteiinien olemassa kaksi signalointireitteihin (ErB ja neurotrofiiniryhmän signalointireittejä kuvion 2A). Niistä muuttunut polku, löysimme PI3K ja MAPK olivat pääasiallisia toimijoita prosessissa solun liikkuvuus. Aiemmissa tutkimuksissa havaittiin, että aktivointi EGFR-välitteisen MEK /ERK-signalointireitin indusoi solujen invaasiota PC-1-solut, toisaalta, EGFR-inhibiittorin AG1478 voi estää edellä reitin ja vähentää solujen invaasiota PC-1,0-solujen [28] . Tässä tutkimuksessa havaitsimme hyperfosforylaatiota ErbB3, ErbB4, Raf1, P90RSK, MSK1, MYC ja FOS PC-1.0 soluissa verrattuna PC-1-soluissa, mutta muutokset Grb2, MEK, ERK ja Elk1 ei havaittu. Lisäksi käytimme Raf1 estäjän ja FOS siRNA tutkia suhdetta proteiinin ja invaasio. Tuloksista ilmeni, että knockdovvn FOS tai Raf1 estivät merkittävästi muuttoliikkeen ja hyökkäyksen PC-1.0 soluissa. Tuloksemme, Grb2 /MEK /ERK signalointi ei ole noudatettu, ehkä johtua methodologic rajoituksista. Tuloksemme osoittivat, että P90RSK oli hyperfosforyloi- kuitenkin, Kang et ai. kertoi, että P90RSK2 edistetään invaasio ja etäpesäkkeiden ihmisen pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) [29]. P90RSK voi olla osallisena säätelyssä haiman syöpäsoluinvaasiota ja etäpesäkkeiden.

Toinen signalointireitin (PI3K /AKT) edellyttää yleensä soluproliferaatioon ja solusyklin [30]. Meidän data testasimme useita ylävirtaan säätelijöitä PI3K /AKT kuten VEGFR1 /2/3, ErbB2 /3/4, PDGFRα, MET, EGFR, FLT3, KIT, ja IGF-1 R. Näiden proteiinien joukossa, ErbB3 ja ErbB4 ovat erittäin fosforyloitu vastoin PDGFRα ja KIT on merkittävästi vähentynyt. Samaan aikaan, havaitsimme, että IRS-1 fosforylaation Ser 636 oli merkittävästi lisääntynyt, mutta IGF-1 R ei ole muutettu. Varsinkin IRS-1 fosforylaatiota voidaan säätelee negatiivisesti aktivoituminen p70S6K että PI3K /AKT /mTOR signalointireitille [31]. Tässä tutkimuksessa löysimme lisääntyminen p70S6K fosforylaation Ser371 ja Thr 421, ja lasku on Ser 418 fosforylaatio. Siksi tutkimuksemme ehdotti, että PDGFRα ja KIT downregulation haimasyövän johtaa laski p70S6K fosforylaation Ser 418, ja lisääntynyt IRS-1 fosforylaation Ser 636 kautta lisääntynyt PI3K /AKT mTOR /p70S6K signalointi. Hyperphosphorylation IRS-1 myöhemmin aktivaatio PI3K /AKT-reitin. Havainto voi osoittaa mekanismin resistenssin haimasyövän, minkä seurauksena yhdistelmä kliinisissä tutkimuksissa haimasyövän tulee harkita.

Yhteenvetona tunnistaa eri tavalla ilmaistuna phosphoproteomes, mikä käy ilmi Tutkimuksessamme tulee osoittamaan mekanismit hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden haimasyövän. Tulevaisuudessa tarvitsemme kiinnitettävä enemmän huomiota tunnistaa aktivoitu phosphoproteome, erityisesti tiettyjä aminohappotähteitä. Yhdessä tunnistaminen epänormaalin proteiinin fosforylaation, joka liittyy invaasio ja etäpesäkkeiden, voivat antaa meille mahdollisuuden tunnistaa uusia biomarkkereita varhaiseen toteamiseen haimasyövän.

tukeminen Information

S1 Taulukko. Alukesekvenssit ja inhibiittori, käytetään määrityksessä.

Reaaliaikainen PCR suoritettiin analysoida tason FOS tai IRS-1 mRNA: n pudotus solulinjoissa. Taso Raf1 Knockdown varmistettiin käyttäen Western blot.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0152280.s001

(DOCX)

S2 Taulukko. Fosfo Explorer Vasta Array skannattiin on GenePix 4000 skanneri.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0152280.s002

(DOCX)

S3 Taulukko. Ilmaus kaikkien proteiinien Phospho Explorer Vasta Array esitettiin.

Koordinaatit ja proteiinit taulukon.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0152280.s003

(XLSX)