Krooninen sairaus

tiivistelmä

kasvaimensisäisenä epäyhtenäisyys asettaa kyseenalaiseksi nykyiset paradigmoja syövän hoitoon. Olemme aiemmin osoittaneet, että ihmisalkion kantasoluja (hESC) -peräisen solujen microenvironment immuunipuutteisilla hiirillä, mahdollistaa toiminnallinen ero heterogeeninen kasvainsolujen, mukaan lukien solut, jotka eivät kasvaa kasvain tavanomaisessa suoraan -tuumoriksenografti alustalla. Olemme tunnistaneet ja tunnettu siitä, kuusi syövän solualapopulaatioiden kunkin kloonaamalla laajentunut yhdestä solusta, joka on johdettu ihmisen munasarjan selvää cell carcinoma yhden kasvaimen, osoittaa silmiinpistävää kasvaimeen fenotyyppinen heterogeenisyys, joka on dynaamisesti riippuvainen kasvaimen kasvuun mikroympäristössä. Nämä syövän solualapopulaatioiden luonnehdittu syövän kantasoluja alapopulaatioiden, uskollisesti kerrata koko kirjon histologisten fenotyyppisten heterogeenisyys tunnettu ihmisen munasarja- selkeä cell carcinoma. Jokainen kuudesta alapopulaatioiden näyttää eritasoista morfologisia ja kasvaimia aiheuttavasta erilaistumista jossa kasvua hESC johdettu microenvironment suosii kasvua CD44 + /aldehydidehydrogenaasille positiivinen taskuihin itseuudistuvien soluja, jotka ylläpitävät kasvaimen kasvua prosessin kautta kasvaimia aiheuttavasta erilaistumista CD44- /aldehydidehydrogenaasille negatiivinen johdannaisia. Silmiinpistävän, nämä johdannainen solut näyttää mikroympäristölle riippuvaa plastisuus, jolla on kyky palauttaa itseuudistumiseen markkereita ja CD44 ilme. Nykyisessä tutkimuksessa olemme rajata erillistä geenien ilmentymistä ja epigeneettiset profiilit kaksi tällaista alapopulaatioiden, jotka edustavat ääripäitä fenotyyppisten heterogeenisemmiksi kapealla riippuvaisen itseuudistumiseen ja tuumorigeenisiä erilaistumista. Yhdistämällä Gene Set rikastus, Gene ontologia ja Pathway-fokusoitu array analyysit metylaatiostatuksen ehdotamme sarja vankka eroista kasvain itseuudistumiseen ja erilaistumista polkuja, jotka ovat Euroopan silmiinpistävää kasvaimensisäisenä fenotyyppinen heterogeenisyys jotka kuvaavat tätä ja muita kiinteitä kasvain syöpäsairauksia.

Citation: Abelson S, Shamai Y, Berger L, Skorecki K, Tzukerman M (2013) Niche-Dependent geeniekspressioprofiili of kasvaimensisäisenä heterogeeninen munasarjasyövän kantasolukkoa. PLoS ONE 8 (12): e83651. doi: 10,1371 /journal.pone.0083651

Editor: Anita B. Hjelmeland, Cleveland Clinic, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 21, 2013; Hyväksytty 6 marraskuuta 2013. Julkaistu: 17 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Abelson et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Finnancial tuki tähän tutkimukseen tarjosi Daniel M. Soref hyväntekeväisyysjärjestönä Skirball Foundation ja tutkimus avustusta Israel Science Foundation (avustus nro 453 /06MT ja avustus nro 62/10 MT) kantavassa rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

se on nyt laajalti arvostettu että yksittäinen kasvain koostuu heterogeeninen solupopulaatioiden, joista kukin näyttää monipuolinen solun morfologiassa, ilmiasuilmeneminen, kasvain aloittamista kapasiteettia ja luontainen tai hankittu resistenssi syöpälääkkeet. Hiljattain julkaistu tutkimus kuvaavat kasvaimensisäisenä heterogeenisyys paksusuolisyövän solu- ja funktionaalisen käyttäytymisen, jotka näkyvät laaja vaihtelu kasvudynamiikkaa, pysyvyys sarjasiirrostuksilla ksenografti kohtia ja hoitovaste korostetaan edelleen monimutkaisuutta ihmisen kasvaimista [1].

aggressiivisuus ja nerokkuus ihmisen syövissä lähtöisin lähinnä monimutkaisten kasvaimensisäisiä heterogeenisyys, mikä puolestaan ​​on katsottu johtuvan geneettisten ja epigeneettiset muutokset yhdistettynä sopeutumisreaktiot kasvaimeen microenvironment. Kertyvät todisteet osoittavat, että malli ”syövän kantasolujen” (CSC) ja klonaalisen evoluutiomalli toisiaan edistää kasvaimensisäisiä heterogeenisyys, koska CSC itse läpi klonaalinen kehitys [2-7]. Jatkuva mutaatioiden synnyttää epäyhtenäisyyttä solujen kiinteän kasvaimen ja sen etäpesäkkeitä, ja saattaa kuvastaa prosessia, jossa tietyt alaryhmiä syöpäsolujen tulevat aggressiivisempia prosessissa syövän etenemisen. Tärkeä oivallus liittyy käsitys, että kyky uusiutua syövän kantasoluja ei ole kestävä tila, vaan dynaaminen ja niche-riippuvainen. Kasvain strooman vuorovaikutus signaaleja myös säädellä epiteelin syöpäsolujen plastisuus kautta epiteelin ja mesenkymaalitransitioon ohjelmat (EMT), joka lisäksi helpottaa ja metastaasit syöpäsolujen, mahdollistaa uusiin kuin CSCS osaksi CSCS ja vaikuttaa muutos kasvaimen microenvironment muuntamalla syöpäsolut osaksi kasvain tukevaa strooman [8-11]. Sellaisenaan, monimutkaisuus ja plastisuus kiinteitä kasvaimia lähtöisin vaatimuksesta tukevan mikroympäristön joka tarjoaa yhteensopiva verkko vuorovaikutuksesta heterogeeninen syöpäsolujen ja erilaisten kasvaimeen tukisolukkoa [12-16]. Rekrytointi kasvain tukemaan multipotentteihin mesenkyymikantasoluista yhdistettynä laajaa uudistumista viereisten kudosten on olennainen prosessi tarjoaa mikroympäristön joka tukee syöpäsolujen proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota [17,18]. Erityisiä prosesseja, jotka ovat laajimmin tutkittuja ovat neoangiogeneesiä [19], vetovoima tulehdussolujen [20] ja syöpä liittyy fibroblastien [21-23], joka yhdessä solunulkoisen matriisin (ECM) luo monimutkaisuus kasvaimen massa [24] .

Ksenotransplantaatio mallien synnyttämiseksi ihmisen kasvaimista immuunivajaissa hiiret rajoittavat eroja hiiren ja ihmisen microenvironment, erityisesti suhteessa kapealla riippuvia ominaisuuksia CSC itseuudistumisen [25,26]. Monissa tapauksissa tämä rajoitus johtaa eri lukea läpikotaisin erillisiä kasvaimen Subkloonien on ksenotransplantaatio määrityksissä [5,21,27,28]. Niinpä olemme laatineet ja validoitu kasvaimen mikroympäris- mallia, joka perustuu potentiaalia ihmisalkion kantasoluja (hESC) tuottaa teratomas immuunipuutteisilla hiirillä. Tämä malli on helppo standardin ksenograftimalleissa, mutta etuna on, että kasvaimen mikroympäris- käsittää monenlaisia ​​ei-transformoitujen eriytetty kudoksissa, jotka ovat peräisin kaikista kolmesta alkio kerrosten ja rakenteiden ihmisperäisten [29,30]. Olemme aiemmin osoittaneet, että tämä

in vivo

malli tarjoaa etuoikeutettu kasvaimien synnyn mikroympäristön seuraavat ominaisuudet: a) tehostettu kasvain solujen elävyyden; b) näkyvä kasvainsolun invaasiota; c) kasvaimen aiheuttama vaskulogeneesiksi; ja d) suhteellinen suojan immunotoksiinille aiheuttama regressio [29,30].

Munasarjojen kirkas cell carcinoma (OCCC), on ominaista iskemällä kasvaimensisäisiä morfologisia heterogeenisyys, mukaan lukien solut ominaisuuksia kehittyneen munasarjasyövän rakenteellinen vaihtelu toisaalta, ja solujen ominaisuuksia kasvaimia aiheuttavasta erilaistumisen (esim invaasio, proliferaatio) ja vastaavan solun pinnan ja solunsisäinen merkki heterogeenisyys [31-35]. Olemme eristettiin ja karakterisoitiin kuusi eri syövän solualapopulaatioiden (CCSPs) kasvaimesta yhden potilaan, ja osoitti kapealla riippuvainen tuumorigeenisemmiksi valmiuksia ja histologiset fenotyyppien kun kasvanut sisällä hESC johdettuja teratoma kudosta, joka kumulatiivisesti kerrata koko kirjon kasvain heterogeenisyys [ ,,,0],36]. Kuusi CCSPs luonnehdittiin munasarjojen CSC nojalla toiminnallisten ja ilmiasuilmeneminen CD44 + CD24 + EpCAM + ja ALDH1 aktiivisuus [5,36]. Lisäksi nämä kuusi erillistä kannan osiin on toiminnallisesti luonnehdittu näyttämällä avaimen kantasolujen ominaisuuksia sekä itseuudistumisen ja tuumorigeenisia erilaistumista kapasiteetin kapealla riippuvaisella tavalla. Vuonna hiiren markkinarako, on rajoitettu tuki itseuudistumisen CSC yhdessä korkea kasvaimia aiheuttavasta eriyttäminen, kun taas hESC johdettu niche näkyvämmin ylläpitää CSC itseuudistumisen vastakohtana erilaistumista. Siten hESC perustuva malli tarjoaa ratkaiseva

in vivo

alustan ottaen huomioon keskeinen rooli CSC itseuudistumisen vastuksessa syöpälääkkeiden ja teurasjätteiden kasvaimensisäisenä heterogeenisyys myöntyväinen biologiseen analyysiin sekä syöpähoidolla testaus [5]. Lisäksi se oli viime aikoina osoittaneet, että hESC perustuva malli ilmaista

bona fide

ihmisen kasvaimen verisuonten ja parantaa kasvaimen siirteen korkoaan ensisijainen ihmisen munasarjasyöpä kantasoluja kaltaisia ​​soluja (CSC) [37]. Näin ollen, pyrittiin tutkimaan vastaavien geenien ilmentyminen kahdella eri OCCC johdettu CCSPs edustavat äärimmäisen ääripään suhteen kapealla riippuvainen itseuudistumisen versus tuumorigeenisiä erilaistumista. Saadut tulokset highlight reittejä koskevat kasvaimensisäisenä heterogeenisyys geenin ilmentymisen ja epigeneettiset tasolla, ja sen tärkeän panoksen kasvaimen mikroympäristön tähän heterogeenisuus.

Materiaalit ja menetelmät

johtaminen munasarjasyövän solualapopulaatioiden

kokoelma askitesnesteen suoritettiin kirjallinen tietoinen suostumus 64-vuotiaan potilaan diagnosoitu vaiheen IV Munasarjojen Clear cell carcinoma ja protokolla hyväksyi institutionaalisten eettinen Review komitean Rambam Medical Center. Kuusi eri syöpä solualapopulaatioiden, kloonaamalla laajentunut yhdestä solusta, kuten CCSP C12 ja C13, olivat peräisin pahanlaatuiset munasarjojen vatsaonteloon sekä kasvatetaan viljelmässä aikaisemmin kuvatulla [5,36]. Klonaalisuuden määrityksiä käyttäen Humara menetelmällä [38] ja oikeushammaslääketieteen STR-analyysi osoitti monoklonaalinen peräisin kaikkien kuuden CCSPs tutkittiin (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin, karyotyyppi analyysi metafaasikromosomeissa kustakin uutettiin syöpäsolujen alaryhmästä, levitetään objektilaseille ja analysoitiin Spectral-Karyotyping (SKY), osoitti korkeaa kromosomaalisten muutosten ja variaatioita joukossa CCSPs (tuloksia ei ole esitetty). On huomattava, että vaikka pidettiin viljelmässä yli 6 vuotta, soluviljelmissä toistuvasti aloitetaan jäädytetty varastot 3-4 kuukauden välein, ja CCSPs kestävästi ja johdonmukaisesti ylläpitää ”

bona fide

” munasarjasyöpä ominaisuudet CSC ominaisuudet ja ksenosiirrettyjä kasvaimen histologinen fenotyyppi [5,36].

Eläimet, teratooma, kasvaimen muodostumisen ja kudoksen käsittely

SCID /beige hiiret hankittiin Harlan Laboratories Ltd., Jerusalem, Israel. Hiiret majoitettiin ja ylläpidettiin spesifisissä patogeenivapaissa olosuhteissa ohjeiden mukaan komitea Valvonta eläinkokeiden klo Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel. Tämä hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitea Technion (Protocol # IL-026-02-12). Hiiriä tarkkailtiin teratoma ja kasvainten muodostumisen kerran viikossa ja lopetettiin käyttämällä CO

2 hengitettynä. Sillä teratoma muodostumista, erilaistumaton hESC kloonista H9.1 (46XX), injektoitiin hiiriin takaraajan lihaksisto (~ 5×10

6 solua per injektio) [29]. 7-8 viikkoa alkuperäisen injektion kantasoluja, 4X10

6 syöpäsolujen injisoitiin teratoma (i.t kasvaimet) ja annettiin kasvaa vielä 20-60 päivää. Kontrollituumorit johdettu suoraruiskutus (im kasvaimia) on 4×10

6 solua osaksi takaraajassa lihaksiston kerättiin 20-60 päivää injektion jälkeen.

Geenien ilmentyminen tutkimukset

Ilmaisu tutkimukset olivat suoritettiin kolme itsenäistä näytteen sarjaa käyttäen Illumina HumanWG-6 V3.0 ilme BeadChip Array. Skannatut kuvat analysoitiin Illumina n GenomeStudio V.2009.1 ohjelmisto (Illumina Inc. San Diego, CA, USA) louhinta ja laadunvalvonta. Raakadata on saatu kolmesta riippumatonta microarray kokeiluja tuotiin genomiikan ohjelmisto (Genomics Suite, Partek Inc., St. Louis, MO), normalisoitu, ja poistamalla ei-biologinen, ”erä vaikutuksia”, jotka voivat häiritä tulokset suoritettu. Geeni ilmentymissignaaleja muuttuivat laskemalla pohjan kaksi logaritmi. Geenit että heidän annetaan transkripti ei ilmaissut yli taustan määritelty negatiivinen kontrolli koettimet Illumina BeadChip kaikissa näytteet suodatetaan pois. Tiedot on talletettu National Center for Biotechnology Information GEO7, ja pääsee läpi GEO Sarja liittymisen GSE43208.

Differential ilmentyminen yksittäisten geenien

Geenit, joita säädellään eri tavalla kussakin ryhmässä, olivat valitaan niiden kertaluokkamuutos. Keskiarvo normalisoitu geenien signaalit eri ryhmien verrattiin ja Studentin t-testiä käytettiin arvioitaessa tilastollista merkitystä kertainen ero niiden välillä. Geenit valittiin perustuen kertainen muutos ( 2), ja vastaava tilastollinen merkitsevyys p-arvo ( 0,05). Jotta et väärien positiivisten, geenit, jotka eivät noudata 2 kertaiseksi kynnyksen kunkin yksi 3 riippumatonta geenien ilmentymisen paneelit jätettiin pois.

Gene Set Enrichment analyysit (GSEA) B

GSEA suoritettiin käyttäen JAVA-pohjainen ohjelmisto [39]. Etureuna Analysointityökalu (LEA) käytettiin erottamaan ydin geeni jäsenet rikastetun geenin sarjaa, jotta voidaan luoda luetteloita geenejä, jotka edistävät parhaiten vastaavaan rikastamiseen tulokset (ES) saatu joko C12 im, C12 sitä, C13 im, ja C13 se luokkaerot. Konservatiivinen kynnysarvo False Detection Rate (FDR) 0,05 ja p-arvo 0,05 määritettiin jälkeen 1,000 satunnainen permutaatio. Vain etureuna geenit, jotka on jaettu vähintään 5 tilastollisesti rikastettua geenin sarjaa käytettiin myöhemmin varten Gene ontologia analyysit.

Gene ontologia (GO) analyysi

Gorilla web-pohjainen työkalu (http : //cbl-gorilla.cs.technion.ac.il) joka käyttää sijoittui geeni luetteloita käytettiin tunnistamiseksi rikastettua GO merkinnät [40]. Koska tavoite lista tuloa, käytimme ydin geeni jäsenet GSEA LEA työkalun korreloi C12 tai C13 johdettu kasvaimia että kehitetty intramuskulaarisesti (i.m.) tai sisäistä teratoma (i.t). Neljä tavoite luettelot käyttää erikseen, kun taas listan, joka edustaa kaikkia geenit testattiin Illumina geeniekspression alustan toimi taustan kullekin analyysien. Konservatiivinen raja p-arvo 0,005 valittiin seuraavat Bonferroni korjaus monivertailuja.

Rajoittava analyysiperusteiden

1) Geenit, jotka eivät noudata 2 kertaiseksi kynnyksen kunkin yksi 3 riippumatonta geenien ilmentyminen paneelit jätettiin pois (erittäin rajoittavat kriteerit). 2) GSEA, konservatiivinen nimellisarvo p-arvo 0,05 (NOM p) ja FDR Q-arvo 0,05 valittiin 3) LEA käytettiin. 4) Kun GO rikastamiseen analyysi, sulku p-arvo 0,005 valittiin.

Pathway-Kohdennettu Arrays

Ihmisen Wnt, Sonic Hedgehog, ja Notch signalointireitin RT

2 Profiler PCR paneelit (SuperArray Bioscience, Frederick, USA) käytettiin valmistajan ohjeiden 1 ug RNA: ta lähtöaineena kunkin matriisin. Analyysi tiedoista suoritettiin SABiosciences web-pohjainen PCR Array Data Analysis ohjelmisto (https://sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php) ja kekseliäisyyttä Pathway Analysis (IPA) ohjelmisto (Ingenuity Systems, Redwood City, CA).

RNA uuttamalla laser mikro-leikellään kasvain näytteet, ja

vitro

solujen kasvuun qRT-PCR-analyysit ja bisulfiittimodifiointi sekvensointi kuvataan Materiaalit ja menetelmät S1. Geenit spesifisiä alukkeita käytettiin qRT-PCR ja bisulfiitti analyysit annetaan taulukoissa S2 ja S3.

Tulokset

Expression profiilit OCCC johdettujen heterogeeninen syöpäsolujen

in vitro

ja

in vivo

Olemme äskettäin raportoitu havainto, että johdonmukainen heterogeenisuus tuumorigeenisia ominaisuuksien joukossa kuusi erilaista OCCC johdettuja CCSPs oli eniten silmiinpistävän heijastuu niiden kapealla riippuva

in vivo

tuumorigeenisemmiksi valmiuksia ja kasvaimen solujen fenotyyppien [36], ja että hESC johdettu niche edelleen tukee itseuudistuvien CSC ja altistaa niiden täyden valikoiman kasvaimia aiheuttavasta fenotyyppien [5]. Jotta valottaa kasvain mikroympäristön panos tähän heterogeenisuus, keskityimme geenien ilmentymisen microarray analyyseja luonnehtia geeniekspressioprofiilien kahdesta erillisestä syövän solualapopulaatioiden, CCSP C12 ja C13, jotka kasvavat menestyksekkäästi sekä ksenotransplantaatio ja hESC perustuva teratoma malleja, ja joilla on äärimmäiset tuumorigeenisen fenotyyppisten ominaisuuksien ja kapealla riippuva kyky uusiutua [5,36]. C12-johdettuja kasvaimet ominaista runsaasti erittäin pitkälle munasarjojen rakenteita, kun taas C13-johdettu kasvaimia on huono munasarjojen rakenteellinen eriyttäminen [36]. Lisäksi C13 säilyttää kyky itseuudistumisen osoituksena

in vivo

jatkumiseen kasvaimia aiheuttavasta syöpäsolujen sekä hiiren ja hESC johdettuja solu kudosta samalla C12 ei pysy hengissä tuumorigeenisiä soluja hiiren kudoksessa, mutta tuottaa erittäin aggressiivinen ja invasiivisia kasvaimia hESC johdettuja solu kudosta [5]. Ottaen huomioon tämän silmiinpistävä vaikutus, pyrimme rajaamiseksi geeniekspressioprofiili of CCSP C12 ja C13 johdettu kasvaimia osoituksena välisen vuorovaikutuksen kasvainsolujen ja kasvaimen microenvironment. RNA-näytteet uutetaan C12- ja C13 kasvatettu soluviljelmässä, ja kasvaimia syntyy i.m. ja i.t (kukin näyte kolmena kappaleena) ja hybridisoitiin päälle koko genomin ilmaisun pakat (katso materiaalit ja menetelmät). Kaaviokuva analyysin menetelmä on kuvattu kuviossa 1. array analyysit suoritettiin seuraavilla tasoilla: C12 versus C13

in vitro

kasvaneet solut, C12 versus C13 im kasvaimia ja C12 versus C13 se kasvaimia (kuvio 1A , B). Pääkomponenttianalyysi (PCA) varten saadut tiedot arvioimiseksi suoritettiin suhteellisen hierarkkinen osuus eroja geenien ilmentyminen joukossa näytteistä (kuvio 2A). Distinct klusterointi C12

in vitro

kasvaneet solut näytteitä ja C13

in vitro

kasvaneet solut näytteitä havaittiin kuitenkin ilmeinen suhde osoittaa välillä C12 im ja se näytteiden välillä C13 im ja se näytteiden, joka osoittaa huomattavia eroja geeniekspressioprofiilien välillä CCSPs C12 ja C13. Hierarkkinen klusterianalyysillä (HCA) kunkin näytteen kolmena kappaleena edelleen vahvistaa nämä tulokset (kuvio 2B). Ilmentyvät eri geenit (DEG) välillä C12 ja C13

in vitro

kasvaneet solut ja välillä kasvaimia syntyy im ja se tunnistettiin perustuen kertainen muutos ( 2) ja vastaava tilastollinen merkitsevyys p-arvot ( 0,05) . Päällekkäisyys DEG kaikissa tutkituissa näytteissä paljastui 47 päällekkäisiä geenejä, joita on huomattavasti muuttunut (kuvio 1A), jotka käsittävät ytimen väliset erot C12 ja C13 syöpä solualapopulaatioiden, joista 26 ja 21 geenit osoittivat kohonnut ilmentyminen C12 ja C13 vastaavasti (taulukot 1 ja 2).

, työnkulku suorituspäivämäärät varten geeniekspressioprofilointi syöpä solualapopulaatioiden (CCSPs) C12 ja C13

vitro

ja

vivo

.

B

, tunnistaminen differentiaalisesti ilmentyvien geenien välillä C12 ja C13

vitro

kasvaneet solut ja välillä kasvaimia syntyy lihakseen (im) ja intrateratoma (se), ja Gene ontologia merkinnät, jotka korreloivat kasvaimia syntyy im ja se

, PCA Tulokset esitetään kaksiulotteisena esityksiä perustuu panos pisteet kahdesta ensimmäisestä osa. Syrjiä syövän solualapopulaatioiden (CCSPs) C12 ja C13 näytteitä näkyy ilmoitettu väri kaapata.

B

, hierarkkinen klusterointi näytteistä käyttäen kaikkia 48803 koetin elementit Illumina helmi siru osoittivat vaihtelua välillä CCSPs C12 ja C13 näytteitä.

Koholla CCSP C12

C12 vs C13 solut

C12 vs C13 im

C12 vs C13 se

Illumina probe_ID

Gene Symbol

Gene Nimi

kertainen muutos

p-arvo

kertainen muutos

p-arvo

kertainen muutos

p-arvo

ILMN_1677814ABCC3ATP sitova kasetti, alaryhmä C (CFTR /MRP), jäsen 310.030.00212.40010.400.003ILMN_2081070BTCbetacellulin6.380.0012.7103.290ILMN_1677108CAPN13calpain 135.800.01211.070.0015.930.005ILMN_1777190CFDcomplement tekijä D (adipsin) 4.370.0013.6803.140.001ILMN_1656560DKFZP564O0823prostate androgeenisäädellyn musiini-kaltaisen proteiinin 15.2503.780.0013.830.004ILMN_1815673DKK3dickkopf WNT signalointireitin estäjä 32.630.0256.380.0036.270.004ILMN_2398159DKK3dickkopf WNT signalointireitin estäjä 33.210.0098.700.0018.490.001ILMN_1729455EML1echinoderm mikrotubuluksiin liittyvä proteiini, kuten 13,150. 0105.680.0035.680ILMN_1743445FAM107Aamily kanssa sekvenssin samankaltaisuus 107, jäsen A29.680.00917.21016.300ILMN_1715748FLNCfilamin C, gamma10.7003.750.0064.380.001ILMN_1799744GALCgalactosylceramidase9.140.00112.380.00113.480ILMN_1726666GPX3glutathione peroksidaasi 3 (plasma) 169.140409.810368.950ILMN_1696183HBQ1hemoglobin, theta 17.6802.9903.020ILMN_2217329IAH1isoamyl asetaatti-hydrolysoidaan esteraasin 1-homologi (S. cerevisiae) 13.4309.4506.930ILMN_1673521KISS1RKISS1 receptor5.6204.1403.970ILMN_1662358MX1myxovirus (influenssaviruksen) vastus 1, interferoni-indusoituva proteiini P78 (hiiri) 17.36039.970.00127.660ILMN_1709814NMRAL1NmrA kaltainen perhe domeenin, joka sisältää 18.7409.41010.100ILMN_1680339PDGFRLplatelet-derived growth factor receptor-like2.950.0035.200.0015.310.001ILMN_1792506PLA1Aphospholipase A1 jäsen A4.8402.4902.840.003ILMN_1736533RND2Rho perheen GTPaasi 26.800.0017.360.0016.500.002ILMN_1726928TCEA3transcription elongaatiotekijä A (SII ), 312.4903.970.0015.620ILMN_1760245TMEM42transmembrane proteiini 426.780.0015.260.0015.190ILMN_1713990TRIP6thyroid hormonireseptoripositiivinen Interactor 63.370.0016.210.0015.120.004ILMN_1670377ZNF20zinc sormi proteiini 203.950.0016.4905.680ILMN_1798533ZNF22zinc sormi proteiini 227.7206.7206.570ILMN_2117904ZNF22zinc sormi proteiini 227.6906.5107.660ILMN_1728710ZNF816Azinc sormi proteiini 8166.510.0017.040.0017.220 ILMN_1802053ZNF91zinc sormi proteiini 914.180.0063.9003.770.001Table 1. Differentially ilmentyvien geenien välillä syövän solualapopulaatioiden (CCSPs) C12 ja C13

vitro

kasvaneet solut ja välillä kasvaimia syntyy lihakseen (im) ja intrateratoma (se).

arvot nolla (0) = alle 0,001 CSV Lataa CSV koholla CCSP C13

C13 vs C12 solut

C13 vs C12 im

C13 vs C12 se

NAME

Gene Symbol

Gene Nimi

kertainen muutos

p-arvo

kertainen muutos

p-arvo

kertainen muutos

p-arvo

ILMN_1802167ALDH1L1aldehyde dehydrogenaasi 1 perhe, jäsen L15.1103.870.0016.570.001ILMN_1805410C15orf48chromosome 15 avoimen lukukehyksen 488.380.0073.060.0092.830.002ILMN_1774287CFBcomplement tekijä B4.450.0013.500.0015.350ILMN_1810942CYP3A5cytochrome P450, perhe 3, subfamily A, polypeptidi 54.870.0115.760.0179.230.007ILMN_1725597FXYD4FXYD verkkotunnuksen sisältäviä ioninkuljetuksen säädin 44,570. 0056.080.0056.800.004ILMN_1660973GAD1glutamate dekarboksylaasin 15.440.0012.520.0022.550.001ILMN_1712082GCNT3glucosaminyl (N-asetyyli) transferaasi 3, musiini type5.900.0093.6504.190.002ILMN_1739813HYAL1hyaluronoglucosaminidase 14.030.00815.84014.140ILMN_2314417HYAL1hyaluronoglucosaminidase 12.430.0046.050.0025.650.001ILMN_1778010IL32interleukin 322.870.0096.450.0015.180ILMN_1705814KRT80keratin 803.990.0153.840 .0023.570ILMN_1692223LCN2lipocalin 220.320.0052.500.0023.820.006ILMN_1814270LY6Dlymphocyte antigeeni 6 monimutkainen, locus D10.2909.520.00212.990ILMN_1802780M160CD163 molekyyli kaltainen 13.290.0015.320.0044.830.001ILMN_1651568MUC13mucin 13, solun pinnan associated4.570.0053.980.0027.130ILMN_1709809NHP2L1NHP2 ei-histoni kromosomin proteiini 2 kaltainen 1 (S. cerevisiae) 11.1407.9505.260.001ILMN_1773389PLTPphospholipid siirto protein6.3803.280.0034.610.006ILMN_1713829PTGESprostaglandin E synthase5.9108.5309.180ILMN_1651429SELMselenoprotein M2.530.0013.510.0023.800.001ILMN_1683670SLC10A2solute kantaja perheen 10 (natrium /sappihappo kotransportteri), jäsen 25.650.00115.1105.140.006ILMN_1739001TACSTD2tumor liittyvä kalsium signaalinmuuntajana 276.1505.310.0125.460.004ILMN_1725387TMEM200Atransmembrane proteiini 200A4.540.0047.310.0047.950.003Table 2. Differentially ilmentyvien geenien välillä syövän solualapopulaatioiden (CCSPs) C13 ja C12

vitro

kasvaneet solut ja välillä kasvaimia syntyy lihakseen (im) ja intrateratoma (se).

arvot nolla (0) = alle 0,001 CSV Lataa CSV

mikroympäristölle – kasvain geeniekspressioprofiili

tarkastella geeniekspressioprofiili of CCSP C12 ja C13 – johdettu kasvaimia osoituksena välisen vuorovaikutuksen kasvainsolujen ja kasvaimen microenvironment (kuvio 1 B), haimme geeniperimä rikastus analyysi (GSEA) [39] arvioida, erillisiä geenin sarjaa olivat tilastollisesti merkitseviä. Tätä varten käytimme yhteensä 3279 geenin sarjaa, jotka julkaistaan ​​Molecular allekirjoitukset Tietokanta GSEA virallisilla verkkosivuilla (https://broadinstitute.org/gsea). GSEA havaitsee rikastuminen koko sarjaa toiminnallisesti liittyvien ryhmien geenien vertaamalla ilmaisu dataa valitun geenin settejä saatavilla geeniperimä tietokantoja. Geeni, joissa on nimellinen p-arvo 0,05 (NOM p) ja FDR Q-arvo 0,05 käytettiin minimoimaan tunnistamiseen vääriä positiivisia että GSEA analyysiin. Niistä 3279 geenin sarjaa, jotka testattiin C12 i.m. versus i.t vertailun, 401 geenin sarjaa rikastuneet C12 i.t, ja 43 geeniä sarjaa rikastunut C12 i.m. Lisäksi C13 i.m. versus i.t vertailun, 120 kappaletta rikastuneet C13 i.t luokassa, ja 43 geeniä sarjaa korreloivat C13 i.m. luokan (taulukko 3). Jotta tulkita tämän suuren tietomäärän tehokkaasti, käytimme LEA väline GSEA ohjelmiston talteen ydin geeni jäsenet rikastettua geenin sarjaa, jotka vaikuttavat eniten vastaavaan ES arvoja. Ottamalla huomioon vain etureunan geenejä, me syntyy 4-geenin luettelot edustavat merkittävimmät osajoukot varten C12 i.m., C12 i.t, C13 i.m. ja C13 i.t. Kuvassa 3 100 eniten differentiaalisesti ilmentyvien geenien paremmuusjärjestykseen GSEA varten C12 ja C13

in vitro

kasvaneet solut (kuvio 3A) ja C12 i.m. ja i.t (kuvio 3B) ja C13 i.m. ja i.t. (Kuvio 3C).

Rikastettu geeni sarjaa

Gene Set Name Ver.2.5

Gene Set Size

ES

NES

NOM p

FDR q

C12 i.m. DAC_IFN_BLADDER_UP17-0.755-2.27700GNF2_IGF125-0.667-2.18200.002GNF2_LYN26-0.630-2.15000.003MODULE_345114-0.495-2.22300.003MODULE_436124-0.449-2.08200.006MODULE_7121-0.633-2.01400.01IFN_BETA_UP65-0.477-1.96700.011MODULE_171128-0.428-1.97900.014PROTEASOME17-0.588-1.7620.0060.045ANDROGEN_AND_ESTROGEN_METABOLISM23-0.552-1.7910.010.038 C12 i.tHSA04512_ECM_RECEPTOR_INTERACTION850.7942.65200HSA01430_CELL_COMMUNICATION1350.7082.51600DNA_REPLICATION_REACTOME440.6912.10400.002CANCER_UNDIFFERENTIATED_META_UP680.6412.08300.003HSA04350_TGF_BETA_SIGNALING_PATHWAY880.5721.94500.012CELL_ADHESION1710.5181.86700.022HSA04310_WNT_SIGNALING_PATHWAY1470.5151.82700.03CELL_CYCLE770.5651.8520.0010.024HSA05217_BASAL_CELL_CARCINOMA550.6171.9400.0010.013SRC_ONCOGENIC_SIGNATURE580.5621.7530.0060.044 C13 i.m. BECKER_TAMOXIFEN_RESISTANT_UP38-0.487-3.12600DSRNA_UP36-0.436-2.13200CMV_8HRS_UP32-0.451-2.08800MODULE_35528-0.416-2.10900DAC_IFN_BLADDER_UP17-0.535-2.21300.001HPV31_DN48-0.379-2.16700.002CMV_24HRS_UP72-0.263-1.26100.007NF90_UP24-0.487-1.92600.008RIBAVIRIN_RSV_UP22-0.409-1.79800.016ET743_RESIST_UP17-0.385-1.68900.036C13 se HSA01032_GLYCAN_STRUCTURES_DEGRADATION300.5931.59000.002MYC_ONCOGENIC_SIGNATURE1900.4941.52100.006RAS_ONCOGENIC_SIGNATURE2490.4491.39600.029HSA04910_INSULIN_SIGNALING_PATHWAY1350.4541.3860.0010.032HSA04012_ERBB_SIGNALING_PATHWAY870.4851.4330.0020.019HSA04370_VEGF_SIGNALING_PATHWAY700.4821.4150.0040.023HSA04150_MTOR_SIGNALING_PATHWAY480.5201.4770.0050.011HSA04512_ECM_RECEPTOR_INTERACTION850.4541.3350.0120.052HSA04330_NOTCH_SIGNALING_PATHWAY460.4881.3810.020.033HSA00100_BIOSYNTHESIS_OF_STEROIDS240.5421.4180.0310.022Table 3. Edustavia rikastettu geenin sarjat CCSPs C12 ja C13 -peräisen kasvaimia syntyy lihakseen (im) ja intrateratoma (se).

Arvot nolla (0) = alle 0.001MSigDB Ver.2.5ES = rikastus Score NES = Normalisoitu Enrichment Pisteet FDR = False Discovery Hinta CSV Lataa CSV

100 eniten ilmentyvät eri geenien välillä syövän solualapopulaatioiden (CCSPs) C12 ja C13

vitro

kasvaneet solut (

), CCSP C12-johdettu kasvaimia syntyy lihakseen (im) ja intrateratoma (se) (

B

) ja CCSP C13-johdettu kasvaimia syntyy im ja se (

C

). Differentiaalinen geenien ilmentymistä laskettiin mukaan Signaali-kohina mittareita. Top 50 symbolia edustavat geenejä, jotka kohosivat kasvaimia kehittyi i.t. Seuraavan 50 symbolia edustavat geenejä, jotka koholla kasvaimia kehittyi i.m. Geenit, jotka sijaitsevat korkeammalla kussakin kaksi 50-geenin ryhmää osoittaa suurempaa eroa tasolla kuin geenit sijaitsevat alemmassa asemassa. Expression arvot esitetään alla olevan värin kuvatekstin.

Gene ontologia (GO) rikastamiseen analyysi

Tuloksena geeni luettelot alistettiin GO rikastamiseen analyysi [40], käyttäen Gorilla web-pohjainen ohjelmisto. Panos tähän analyysiin koostui luetteloita etureunan geenien ja taustan luettelo, joka edustaa kaikkia geenit testattiin Illumina geeniekspression alustalla. Konservatiivinen kriteeri Bonferronin oikaistu p-arvo 0,005, saimme kaksi luetteloa rikastettua GO termejä per CCSP, joka edustaa sen vuorovaikutusta kahden eri mikroympäristöihin. Tärkeää on, että hiiren kapealla, vain rajoitettu määrä erot kahden CCSPs havaittiin (kuvio 4A, C). 10 ja 7 GO termejä rikastuneet CCSP C12 ja C13 vastaavasti. Kaikki 7 GO termejä rikastuneet CCSP C13 i.m. myös rikastuneet CCSP C12 i.m. samanlaisia ​​rikastamiseen tulokset (ES) arvot. Kaikki tällaiset nimetyt GO termejä liittyvät immuunivastejärjestelmään ja mukana ”soluvasteen ärsyke tuottama elävä organismi”. Rikastamista Näiden GO termejä osoittaa tilan muutos tai aktiivisuuden CCPSs seurauksena vuorovaikutus heterologisten ulkoisen ympäristön, kuten oli odotettavissakin. Toisaalta, kun hESC johdettu mikroympäristön paljon suurempia eroja kahden CCSPs havaittiin (kuvio 4B, D). CCSP C12 näytteillä rikastamista useiden GO liittyviä termejä solusykliä, mikä saattaa heijastaa vaikutusta kantasoluja johdetun mikroympäristölle kuin enemmän tukea kapealla toisin kuin hiiren microenvironment. Lisäksi GO liittyvistä ehdoista prosessin epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) on myös rikastunut C12 johdettu kasvaimia hESC johdettu microenvironment. Suhteessa C12, CCSP C13 johdettu kasvaimia hESC johdettu mikroympäristölle näytteille vain muutama, matala ES arvo rikastettu GO termejä, liittyvät enimmäkseen aineenvaihduntaan. Luettelot rikastettua GO termejä C12 ja C13 – johdettu kasvaimia syntyy i.m. ja i.t on esitetty taulukossa S1.

Tilastollisesti merkitsevä GSEA geenin sarjaa tehtiin etureuna analyysi (LEA) ja tuloksena geenit ryhmiteltiin ontologisia merkinnät biologisen prosessin luokkiin. Kakku kaavioita esittää rikastettu GO merkinnät ja niiden vastaavat rikastus tulokset (ES) varten:

, GO merkinnät yläreguloituja C12 kasvaimissa syntyy i.m. verrattuna C12 kasvaimia syntyy i.t.

B

, GO merkinnät yläreguloituja C12 kasvaimissa syntyy i.t verrattuna C12 kasvaimia syntyy i.m. (20 GO merkinnät, joilla on korkein rikastamiseen pisteet näkyvät).

C

, GO merkinnät ylös säännelty C13 kasvaimissa syntyy i.m. verrattuna C13 kasvaimia syntyy i.t.

D

, GO merkinnät yläreguloituja C13 kasvaimissa syntyy sitä verrataan C13 kasvaimia syntyy im

Yhdessä tämä analyysi osoittaa erilaisia ​​reittejä vuorovaikutuksen CCSPs C12 ja C13 kanssa microenvironment prosessin aikana syövän etenemisen. Toisin kuin tavanomaisen hiiren malli, hESC perustuva malli osoittaa monimutkaisempi syöpäsolu-mikroympäristössä vuorovaikutus, joka voi tarjota entistä aito heijastus kirjeenvaihtaja suhde kasvainsolujen potilaan ja kompleksi ihmisen ympäröiviin kudoksiin kasvaimen.