Krooninen sairaus

tiivistelmä

RASSF1C on merkittävä isoformi RASSF1 geenin, ja on nousemassa onkogeeni. Tämä on päinvastoin kuin RASSF1A isoformia, joka on perustettu tuumorisuppressorigeenin. Olemme aiemmin osoittaneet, että RASSF1C edistää keuhkosyövän solujen lisääntymistä ja ovat tunnistaneet RASSF1C kohdegeenien kanssa kasvua edistäviä toimintoja. Täällä lisäksi kertoa, että RASSF1C edistää keuhkosyövän solujen vaeltamiseen ja parantaa keuhkosyövän kasvain pallo muodostumista. Osoitamme myös, että RASSF1C yli-ilmentyminen vähentää inhiboivia vaikutuksia syövän vastaisen aineen, betuliinihappo (BA), keuhkosyöpään solujen lisääntymisen. Aikaisemmissa tutkimuksissa osoitimme, että RASSF1C ajan säätelee

piwil1

geenin ilmentyminen, mikä on kantasolujen itseuudistumista geeni, joka yli-ilmentyy useissa ihmisen syövissä, mukaan lukien keuhkosyöpä. Täällä raportoimme vaikutuksista BA

piwil1

geeniekspressiota. Solut käsiteltiin BA määrä aleni

piwil1

ilme. Myös vuorovaikutus IGFBP-5 RASSF1C näyttää estävän RASSF1C jopa säätelevä PIWIL1 proteiinin tasoja. Nämä havainnot viittaavat siihen, että IGFBP-5 voi olla negatiivinen modulaattori RASSF1C /PIWIL1 kasvua edistävää toimintaa. Lisäksi olemme havainneet, että esto ATM-AMPK polku up-regulation RASSF1C geeniekspressiota.

Citation: Reeves ME, Firek M, Chen ST, Amaar YG (2014) näyttö siitä RASSF1C stimulointi Lung Cancer Cell Leviämisen Riippuu IGFBP-5 ja PIWIL1 eksressoitumistasojen. PLoS ONE 9 (7): e101679. doi: 10,1371 /journal.pone.0101679

Editor: Pierlorenzo Pallante, Institute of Experimental Endocrinology ja Oncology ”G. Salvatore ”(IEOS), Italia

vastaanotettu: 10 kesäkuu 2013; Hyväksytty: 11 Kesäkuu 2014; Julkaistu: 09 heinäkuu 2014

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Työtä rahoittavat Loma Linda Cancer Center. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

RASSF1 geeni on tärkeä rooli ihmisen syöpäsolujen kasvua ja etenemistä. Se koodaa useita isomuotoja, suurimpien jotka ovat RASSF1A ja RASSF1C. RASSF1A on useimmin inaktivoitu tuumorisuppressorigeeni ihmisen syövissä ensi sijassa promoottorin metylaation. Se estää solujen kasvua ja muuttoliike sekä edistää apoptoosia. Sitä vastoin RASSF1C isoformia ilmaistaan ​​hyvin useimmissa ihmisen syövissä, ja näyttää toimivan onkogeenin. Toisin kuin RASSF1A, se edistää syöpäsolujen lisääntymistä ja muuttoliike, ja vaimentaa apoptoosin [1] – [13]. Siten RASSF1 geeni näyttää olevan tärkeä kaksoisrooli syövässä, toimiva vaihtoehtoisesti tuumorisuppressorina ja onkogeenin [1] – [15]. Tämän mukaisesti käsite, viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että ilmaus RASSF1C on säädelty ihmisen keuhkokarsinooma kudosta verrattuna vastaaviin normaaleihin kudoksiin, ja liittyy syövän etenemisessä ja huonon ennusteen [13]. Lisäksi RASSF1C yli-ilmentyminen (mutta ei RASSF1A yli-ilmentyminen) ihmisen syöpäsoluissa parantaa kertyminen β-kateniinin onkogeeni, keskeinen toimija Wnt-signalointireitin, mikä lisää transkription aktivaation ja solujen lisääntymistä [16].

Olemme aiemmin osoittaneet, että yli-ilmentyminen RASSF1C up-regulation (ja vaiennettu RASSF1C alasajaa) ilmentymistä PIWIL1, kantasolun itseuudistumisen geeni [12]. Piwil geeniperheen on alaryhmään argonaute proteiineja, jolla on keskeinen rooli kantasolujen itseuudistumisen, gametogeneesiin ja transkription geenien monenlaisia ​​lajeja. Argonaute proteiinit sitovat pieniä RNA: t ja niille on ominaista aminoterminaalisen (N), PAZ (Piwil-Argonaute-Zwille), MID (keskimmäinen), ja PIWI verkkotunnuksia [17]. Ihmisissä kolme Piwil (Piwil 1 (kutsutaan myös Hiwi), Piwil2, ja Piwil3) geenejä on tunnistettu. Piwi proteiinin ilmentyminen profiilit ovat viime aikoina saaneet paljon huomiota niiden mahdollisten toiminnallisten osallistumisesta oncogenesis erilaisissa ihmisen syövissä ja Piwil1 ja Piwil 2 on osoitettu olevan riippumattomia ennustetekijöiden mahasyövän [17] – [19]. PIWIL proteiinit ja niiden vuorovaikutuksessa pieniä RNA: t (piRNAs) saattaa olla merkitystä kasvainten synnyssä lisäämällä geenin metylaatio ja hiljentäminen sykliiniriippuvaisten estäjät ja tuumorisuppressoreilla. PIWIL proteiinit ja niiden vuorovaikutuksessa pieniä RNA: t (piRNAs) saattaa olla merkitystä kasvainten synnyssä lisäämällä geenin metylaatio ja hiljentäminen sykliiniriippuvaisten estäjät ja tuumorisuppressoreita [17] – [19]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että yli-ilmentyminen PIWIL1 edistää sarcomagenesis ja alas-säätelee useita tuumorisuppressorien, mukaan lukien insuliinin kaltaista kasvutekijää sitova proteiini 5 (IGFBP-5) [20]. IGFBP-5 on jäsenenä IGF sitovan proteiinin perheen mukana sääntelyn mitogeeneja IGF I ja II. IGFBP-5 on ratkaisevan tärkeää ihmisen syövän etenemisessä [21]; ja olemme aiemmin osoittaneet, että RASSF1C on sitova kumppani IGFBP-5 [20].

Niinpä halusimme onko RASSF1C välittää sen vaikutuksista syöpäsoluihin vuorovaikutusten kautta IGFBP-5 ja PIWIL1. Voidakseen tehdä tämän, suunnittelimme kokeita määrittämään vaikutukset RASSF1C keuhkosyöpään solujen lisääntymisen, migraation ja kasvaimen pallo muodostumista. Koska syövän vastaisen aineen, betuliinihappo (BA), on osoitettu alas-säädellä PIWIL1 geenin ilmentymistä [22], tutkittiin vaikutuksia BA ja RASSF1C /IGFBP-5 vuorovaikutuksen PIWIL1 geenien ilmentymistä ja β-kateniinin proteiinin tasot . Huomasimme, että RASSF1C edistää syöpäsolujen maahanmuutto- ja kasvainten pallo muodostumista ja vähentää proliferaation esto BA. Lisäksi vuorovaikutus IGFBP-5 kanssa RASSF1C esti RASSF1C välittämä lisäävä säätely PIWIL1. Lopuksi vaimentaminen PIWIL1 geenin ilmentymisen pienentynyt β-kateniinin proteiinin tasoja, mikä osoittaa, että PIWIL1 voidaan edistää Wnt signalointia. Siten RASSF1C, IGFBP-5, PIWIL1 ja Wnt polku voisi toimia yhdessä uutena akseli, joka vaikuttaa keuhkojen syöpäsolujen kasvua ja etenemistä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

ihmisen keuhkosyöpää solulinjoja NCI-H1299 ja A549 saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). A549 on RASSF1A negatiivinen, p16 negatiivinen, ja p53 positiivinen vaikka NCI-H1299 on RASSF1A negatiivinen, p16 negatiivinen, ja p53 negatiivinen. Soluviljely suoritettiin kuten suositellaan ATCC.

Gene ekspressiovektorit

RASSF1C, IGFBP-5, ja RASSF1A oli yli-ilmentynyt ihmisen keuhkosyövän soluista käyttäen indusoituvia hiiren leukemiavirus (MLV) -pohjainen retrovirusvektorit, kuten aikaisemmin on kuvattu [12].

Cell lukumäärä count

NCI-H1299-soluissa stabiilisti transdusoitu MLV-runkoverkon (BB) ja MLV-HA-RASSF1C (1C) käsiteltiin 1 ug /ml doksisykliiniä 72 tuntia, ja sitten solut laskettiin hemosytometrillä. Kokeet toistettiin vähintään 3 kertaa.

Alamar Blue määrityksessä

Solujen lisääntyminen /elinkelpoisuus mitattiin Alamar Blue määrityksessä, kuten aiemmin on kuvattu [11], [12]. Kokeet toistettiin ainakin 3 kertaa ja analysoitiin käyttäen t-testiä.

In vitro

solussa invaasiomääritys

BD BioCoat Matrigel Invasion jaosto (BD Biosciences, Bedford, MA) käytettiin suorittamaan keuhkosyöpä soluinvaasion määrityksissä. NCI-H1299-BB (kontrolli) tai NCI-H1299-1C (yli-ilmentävät RASSF1C) soluja ympättiin tiheydellä 25000 solua Matrigel kammioissa ja kasvatettiin seerumivapaassa RPMI-1640: ssa 24 tuntia. Kammiot sisältävät NCI-H1299-BB ja NCI-H1299-1C solut siirrettiin sitten hyvin sisältävällä alustalla, jota oli täydennetty 10% vasikan seerumia 24 tunnin ajan. Solut alemmalla pinnalla kalvon kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin 1% toluidiinisinisellä. Värjätyt kalvot valokuvattiin mikroskoopilla ja tunkeutuvat solut laskettiin. Kokeet toistettiin ainakin 3 kertaa.

Kasvain pallo muodostumista

CD133 mikrohelmistandardeilla Kit (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) käytettiin eristämään A549 puolelle väestöstä (SP, CD133

+, syöpä kantasolut) ja ei-SP (CD133

-) solut käyttäen käyttäen virtaussytometria protokollaa toimittajalta. SP solut eristettiin A549 transdusoitu joko ohjattu MLV-runkoverkon (A549-BB) tai MLV-HA-RASSF1C (A549-1C). SP ja ei-SP-soluja inkuboitiin sitten seerumivapaassa täydennetty EFG (20 ng /ml) ja FGF (10 ng /ml) edistää SP-solut muodostavat kasvaimen palloja kolme wk. Kasvaimen aloilla valokuvattiin, kerättiin ja maljattiin johon oli lisätty 10% vasikan seerumia, ja soluja kasvatettiin 70% konfluenssiin. Sitten soluja käytettiin Western blot-analyysi tarkistaa ilmentymisen eksogeenisen HA-RASSF1C.

RNA: n eristys ja RT-PCR-analyysi

Kokonais-RNA ihmisen keuhkosyövän solulinjoja eristettiin viljelmistä ja käänteistranskriptaasi (RT) -PCR tehtiin käyttämällä PIWIL1 geenispesifisiä alukkeita, kuten aikaisemmin on kuvattu [12]. PCR suoritettiin käyttäen HotStart master mix (Qiagen, Valencia, CA), ja PCR-reaktiot ajettiin seuraavissa olosuhteissa: 95 ° C 15 min, 95 ° C 1 min, 60 ° C 30 sekuntia, ja 72 ° C 30 sekuntia 35 syklille. Monistaminen syklofylliinillä käyttämällä geenispesifisiä PCR-alukkeita käytettiin latauskontrollina. RT-PCR-reaktiot suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja kertainen muutos laskettiin käyttäen 2

-ΔΔCT menetelmä [23]. RT-PCR-ajot toistettiin vähintään 3 kertaa.

betuliinihappo (BA) käsittely

BA (Enzo Life Sciences, New York, NY) liuotettiin DMSO: hon 5 mg /ml . A549 ja NCI-H1299-solut maljattiin 5000 solua /kuoppa 96-kuoppaisille levyille. Seuraavana päivänä soluja käsiteltiin 25 ug /ml BA: ssa 24 tuntia. Solujen proliferaatio määritettiin sitten käyttäen Alamar Blue-määritystä. Kokeet toistettiin vähintään 3 kertaa.

hiljentäminen of Piwil1 ilmentymisen keuhkosyöpäsoluissa

Keuhkosyöpä solut (NCI-H1299), maljattiin 5000 /kuoppa 96-kuoppaisille levyille 24 tuntia . ennen infektiota ja solut infektoitiin Mission Non-Target shRNA Ohjaus transduktiopartikkeleilla tai useamman operaation Lentivirusvektorikonstruktit shRNA transduktiopartikkeleilla (NMID: NM_004764) hiljentää RASSF1C (Sigma, St. Louis, MO), kuten aiemmin on kuvattu [14]. Soluja käsiteltiin polybreeniä (Sigma, ST. Louis, MO) kaksi tuntia ennen kuin lisättiin Lentivirusvektorikonstruktit hiukkasen infektiokertoimella (MOI) 5. pudotus validointi

piwil1

ilmentymistä arvioitiin Western blot ja qRT -PCR käyttäen RASSF1C vasta-ainetta ja RASSF1C spesifisiä alukkeita, vastaavasti. Kokeet toistettiin ainakin 3 kertaa.

Western blot-analyysi

Western blot-analyysi suoritettiin käyttäen Odyssey Infrared System (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) ja anti-β- kateniini vasta-ainetta # 9582 (Cell Signaling, Danvers, MA), anti-PIWIL1-vasta-aineen ab12337 (Abcam, Cambridge, MA), anti-HA-vasta-aine klooni 16B12 (Covance, Berkeley, CA), monoklonaalinen beta aktiini-vasta-aineen AC-74 (Sigma, St. Louis, MO), ja fluoresoivasti leimattuja sekundaarisia vasta-aineita IRDye 680RD Infrapuna Dye (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE). Kokeet toistettiin vähintään 3 kertaa. Proteiini tasot normalisoitiin aktiini tasot (lastaus kontrolli) kanssa keskihajonnat.

transcriptome PCR Array näyttö

SureFind transcriptome PCR Array saatiin Qiagen (luettelo nro 336611. Se koostui 90 cDNA näytteet on johdettu rintasyöpä MCF7 käsiteltiin 90 eri kemiallisia inhibiittoreita, jotka säätelevät eri signalointireittejä. PCR-array seulottiin RASSF1C alukkeilla. Data-analyysi suoritettiin tuomalla Ct-arvoja suoraan SureFind transcriptome PCR array Data Analysis Software at https://www.sabiosciences.com/tpadataanalysis.php (Qiagen). kemikaalit tunnistetaan RASSF1C geenin ilmentymisen säätävät käytettiin hoitoon keuhko- syöpäsoluja vahvistamaan niiden vaikutukset RASSF1C geenin ilmentymistä käyttäen RT-PCR: ää.

Dorsomorphin ja Trichostatin hoidon

H1299 keuhkosyövän soluja käsiteltiin Dorsomorphin, joka tunnetaan myös nimellä yhdiste C (10 uM) tai trikostatiini A (10 uM) in seerumivapaassa 24 tuntia, ennen kuin soluihin kerättiin RNA: n eristämistä. Kontrollisoluja käsiteltiin dimetyylisulfoksidi (DMSO). RT-PCR-analyysi käyttäen RASSF1C, PIWIL1, ja syklofylliinillä alukkeilla suoritettiin kuten edellä on mainittu. Dorsomorphin saatiin Phoenix Pharmaceutical, Inc. (Burlingame, CA) ja trikostatiini A saatu Reagenssit Direct (Encinitas, CA). Kokeet toistettiin ainakin 3 kertaa.

Tilastollinen analyysi

t-testiä käytettiin laskettaessa merkitystä tietojen.

Tulokset

RASSF1C yli-ilmentyminen lisää keuhkosyövän solujen vaeltamiseen

keuhkosyövän solulinjaa NCI-H1299 oli transdusoidaan retrovirusvektorilla aikaisemmin kuvatulla [12], [13] luoda vakaa solulinja, joka yli-ilmentää RASSF1C. Olemme havainneet, että stabiileja RASSF1C yli-ilmentyminen ei ainoastaan ​​lisätä keuhkosyövän soluproliferaatiota (kuvio 1), mikä on yhdenmukaista niiden aiempien havaintojen käyttäen ohimenevä yli-ilmentyminen RASSF1C [11], mutta myös edistää solujen vaeltamiseen (kuvio 2).

NCI-H1299-soluissa stabiilisti transdusoitu MLV-runkoverkon (BB) tai MLV-HA-RASSF1C (1C), käsiteltiin 1 ug /ml doksisykliiniä 72 tuntia, ja sitten solut laskettiin. RASSF1C yliekspressio (1C) lisääntyi soluproliferaatiota 2,5 kertaiseksi kontrolliin verrattuna (BB). Data edustaa vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen, ja arvot edustavat keskiarvoja ± SEM. * P 0,05.

. RASSF1C edistää keuhkosyövän solujen vaeltamiseen. (EN) BD BioCoat Matrigel Invasion jaosto käytettiin arvioimaan soluinvaasiota /kulkeutuminen NCI-H1299-soluissa stabiilisti transdusoitu tyhjä MLV-selkäranka (BB) tai MLV-HA-RASSF1C (1C). Solut, doksisykliinillä on 1 ug /ml co-inkuboitiin seerumia sisältävässä väliaineessa. 24 tunnin jälkeen alempi puolin suodattimet fiksattiin ja värjättiin, ja solujen neljä mikroskooppikentästä laskettiin. Keskimääräinen solumäärä määrä piirrettiin. (B) NCI-H1299-soluista ilmentävän RASSF1C oli suurempi määrä soluja valtaavat Matrigel kammion ja vaeltavat toiselle puolelle suodattimen verrattuna kontrolliin NCI-H1299-BB-soluja. Data edustaa vähintään 3 riippumattomasta kokeesta ja arvot edustavat keskimääräistä solun pesäkeluvut. * P 0,05 määritettynä t-testiä.

RASSF1C parantaa keuhkojen kasvain pallo muodostumista

On osoitettu, että CD133-positiiviset solut A549-solulinja voi aiheuttaa kasvain aloilla ja ne voivat toimia kasvaimen aloittamista soluihin [24], [25]. Niinpä halusimme arvioida vaikutusta RASSF1C yli-ilmentyminen on keuhkosyöpä kasvain pallo muodostumista. Me eristetty A549 puolella väestöstä (SP, CD133

+ solut), joka näyttää kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia, ja ei-SP CD133

– soluihin käyttäen CD133 virtaussytometria [24], [25]. SP solut eristettiin A549 transdusoitu joko MLV-runkoverkon (A549-BB) tai MLV-HA-RASSF1C (A549-1C). Soluja kasvatettiin seerumivapaassa täydennetty EFG ja FGF aiheuttaa SP-solut muodostavat kasvaimen palloja (kuvio 3A). RASSF1C-SP-CD133

+ solut muodostivat yhä enemmän ja suurempia kasvaimen aloilla verrattuna kontrolliin BB-SP-CD133

+ soluissa (kuvio 3A). Sen osoittamiseksi, että kasvain pallo jälkeläisiä edelleen yli-ilmaisivat RASSF1C, kasvain palloja eristettiin, kasvatettiin ja käytettiin Western blot-analyysi. SP-soluissa tosiaan over-express RASSF1C (kuvio 3B). Kaikki tämä viittaa siihen, että RASSF1C voi parantaa keuhkosyöpää kantasolujen lisääntymistä, ja on mahdollista, että tämä tapahtuu avulla säätely ylöspäin PIWIL1 geenin, kantasolun itseuudistumisen geeni [12].

(A) Non -SP-1C CD133

-, SP-BB CD133

+, ja SP-1C CD133

+ -solut eristettiin A549-keuhkosyövän solulinjaa kasvatettiin seerumittomassa väliaineessa, jota oli täydennetty 10 ng /ml EGF: ää ja 20 ng /ml FGF edistää kasvainten pallo muodostumista kolme vk. (B) A549-solut uusitun kasvaimeen aloilla tarkastettiin HA-RASSF1C ilmentymisen käyttäen HA-vasta-ainetta. Kuten odotettua, SP-1C CD133- ja CD133 + ilmaisi HA-RASSF1C, kun taas SP-BB solut eivät. Data edustaa vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen.

RASSF1C vähentää herkkyyttä keuhkosyöpään solujen syöpälääkkeen betuliinihappo

betuliinihappo (BA) on anti-inflammatorinen ja syövän vastaisen aineen, joka on osoitettu edistää apoptoosia ja estävät solujen proliferaatio ja migraatio. Se tekee tämän, ainakin osittain alaspäin säätäminen PIWILI, sykliini B1, sykliini D1, Bcl2 ja ylös säätelevä Bax-geenin ilmentyminen useissa syöpäsolujen, kuten A549 [22], [26], [27]. Olemme aiemmin osoittaneet, että RASSF1C yli-ilmentyminen ajan säätelee PIWIL1 geenin ilmentymisen ja siten haluamme määrittää, onko RASSF1C yli-ilmentyminen vähentäisi antiproliferatiivisia vaikutuksia BA keuhkosyövän soluja. Kokeemme osoittivat, että A549 ja NCI-H1299-soluista-ilmentävät RASSF1C olivat vähemmän herkkiä BA antiproliferatiivisia vaikutuksia kontrolliin verrattuna soluihin (kuvio 4), mikä edelleen tukee kasvua edistetään rooli RASSF1C keuhkojen syöpäsoluja.

A549 (A) ja NCI-H1299 (B) keuhkosyöpä solut yli-ilmentävät RASSF1C käsiteltiin betuliinihappo (BA) 24 tuntia. Sitten solut määritettiin solujen elinkelpoisuus /lisääntymiseen. RASSF1C yli-ilmentyminen vähensi merkittävästi solujen herkkyys BA. Data edustaa vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen, ja arvot edustavat keskiarvoja ± SEM. * P 0,05: 1C verrattuna BB.

Effects of BA PIWIL1 ilmentyminen keuhkosyöpäsoluissa

On raportoitu, että BA hoito ihmisen mahalaukun adenokarsinooman AGS solut alas -regulates PIWIL1 geenin ilmentymistä [26]. Siksi halusimme arvioida vaikutusta BA PIWIL1 geenien ilmentyminen keuhkosyövässä soluissa. RT-PCR data (kuva 5) osoittavat, että

piwil1

mRNA-tasot laskivat A549 ja H1299 solujen päälle BA hoitoa. Alas säätelevä vaikutus BA

piwil1

mRNA keuhkojen syöpäsoluja on sopusoinnussa tämän havaittu mahalaukun adenokarsinooman AGS soluihin [26].

Piwil1

mRNA ilmaisun arvioitiin läsnä ollessa ja puuttuessa seerumin ja Ba keuhkosyöpä solulinjat A549 (A) ja NCI-H1299 (B). RT-PCR tiedot osoittavat, että

piwil1

ilmentyminen alassäädetty BA puuttuessa ja läsnä seerumin. PCR-reaktiot asetettu kolmena rinnakkaisena ja syklofilliini käytettiin sisäisenä kuormaus- ohjaus ja käytetään normalisoimaan suhteelliset ekspressiotasot käyttäen 2

-ΔΔ menetelmä (26). RT-PCR-reaktio ajettiin kolme riippumatonta kertaa.

PIWIL1 knock-down johtaa vähentämiseen β-kateniinin ilmentymistä

RASSF1C on aiemmin liitetty Wnt-signalointireitin aktivaatio, kuten RASSF1C yli-ilmentyminen lisääntyy ja hiljentäminen tai RASSF1C vähentää β-kateniinin kerääntyminen keuhkojen syöpäsoluja [16]. Olemme aiemmin osoittaneet, että knock-alas RASSF1C ilmaisun tuloksia alas-säätely PIWIL1 geenin ilmentymisen [12]. Niinpä halusimme onko PIWIL1 geenin knock-down vaikuttaa β-kateniinin ilme. Knock-alas PIWIL1 geenin ilmentymistä käyttäen shRNA-lentivirusvektorilla johti alhaisempi β-kateniinin mRNA: ta ja proteiinia (kuvio 6). Tulosten perusteella näyttää, että PIWIL1 voivat moduloida β-kateniinin tasoilla ja että RASSF1C ja PIWIL1 voi olla keskeinen rooli Wnt koulutusjakson signalointi edistää kasvaimien syntyyn.

Knock-down on

piwil1

ilmaus johti väheneminen β-kateniinin mRNA ja proteiini tasoilla. (A) Western blot-analyysi H1299 keuhkosyöpään solut infektoitu Mission Lentivirusvektorikonstruktit-shRNA-ohjaus hiukkasten (shRNA-jatk) ja Mission Lentivirusvektorikonstruktit-shRNA-

piwil1

(shRNA-

piwil1

) ja hiljaisuus endogeeninen

piwil1

ilme. Western blot-analyysi käyttämällä anti-PIWIL1-vasta-aine osoittaa vähentää PIWIL1 proteiinin tasot shRNA-PIWIL1 soluja verrattuna shRNA-jatkuu soluja. Hiljentäminen

piwil1

geeniekspression johti vähenemiseen β-kateniinin proteiinin tasot määritetään käyttäen β-kateniinin vasta-aine. Normalisoitu PIWIL1 proteiinin tasot aktiini (lastaus valvonta) esitetään myös, data edustaa kolme riippumatonta blotteja. (B)

Piwil1

ja

β-kateniinin

mRNA arvioitiin myös shRNA-jatk ja shRNA-

piwil1

soluja ja RT-PCR-tiedot osoittavat alassäätöä molempien

piwil1

ja

β-kateniinin

mRNA-tasot, jotka on sopusoinnussa Western blot-analyysi. RT-PCR-kokeet suoritettiin vähintään 3 riippumatonta kertaa.

Solunsisäinen IGFBP-5 näyttää moduloida RASSF1C toiminnon keuhkosyöpäsoluissa

Viimeaikaiset työ osoittaa, että PIWIL1 yliekspressio alas -regulates useita tuumorisuppressorigeeneille, mukaan lukien IGFBP-5, ihmisen mesenkymaaliset kantasolut [18]. Edellinen työ laboratoriossamme ovat osoittaneet, että RASSF1C sitoutuu IGFBP-5 ja voi säädellä luusarkoomasolulin- lisääntymistä ja apoptoosin [20]. Siten halusimme tutkia vaikutusta RASSF1C /IGFBP-5 vuorovaikutuksen PIWIL1 geenien ilmentyminen keuhkosyövässä soluissa. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että koekspressio RASSF1C ja IGFBP-5 alennetaan PIWIL1 mRNA: ta ja proteiinia tasot keuhkosyöpää solulinjoissa, kun taas koekspressio RASSF1A-RASSF1C ei ollut suurta vaikutusta PIWIL1 mRNA-tasot verrattuna soluihin, yli-ilmentävät RASSF1C (kuvio 7). PIWIL1 proteiinin tasot vähensi myös keuhkosyövässä soluissa, jotka ilmensivät samanaikaisesti RASSF1C-IGFBP-5 verrattuna soluihin, yli-ilmentävät RASSF1C (kuvio 8). Lisäksi olemme havainneet, että keuhkosyövän solut koekspressoivat RASSF1C ja IGFBP-5, mutta ei soluja, jotka koekspressoivat RASSF1A ja RASSF1C, olivat herkistyneet BA eston kontrollisoluihin (kuva 9). Meidän ei pitäisi, että RASSF1A yli-ilmentyminen yksin ei tehostanut kasvua estäviä vaikutuksia BA (tuloksia ei ole esitetty). Nämä havainnot viittaavat siihen, että solunsisäiset IGFBP-5, mutta ei RASSF1A, vaikuttaa negatiivisesti RASSF1C toimintoja. Linkittäminen RASSF1C /IGFBP-5 vuorovaikutusta modulaatioon PIWIL1 geenien ilmentyminen ja soluproliferaatiota on uusi havainto, joka vaatii lisätutkimuksia.

Piwil1

mRNA ilmentyminen arvioitiin H1299-soluissa stabiilisti transdusoitu MLV -HA-back bone (BB), MLV-HA-RASSF1C (1C), MLV-HA-RASSF1A ja 1C (1A-1C) ja MLV-HA-1C ja IGFBP-5 (1C-BP5). RT-PCR-tiedot osoittavat, että

piwil1

mRNA: n ekspressio soluissa, jotka koekspressoivat 1C ja BP5 väheni verrattuna soluihin, yli-ilmentävät 1C ja 1A and1C. Data edustaa vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen, ja arvot edustavat keskiarvoja ± SEM. * P 0,05: 1C verrattuna BB.

(A) Western blot-analyysi NCI-H1299 ja A549-soluja pysyvästi transdusoitu MLV-runkoverkon (BB), MLV-HA-RASSF1C (1C ), MLV-HA-IGFBP-5 (BP5), ja yhteistyö transdusoitiin sekä MLV-HA-RASSF1C ja -IGFBP-5 (1C-BP5) ja käsiteltiin 1 ug /ml doksisykliiniä 48 tuntia. Anti-HA-tag-vasta-aine havaitsi HA-RASSF1C ja HA-IGFBP-5 fuusioproteiini soluihin, jotka yli-ilmentynyt kumpikin yksin ja ne, jotka koekspressoitu molemmat. Fuusioproteiini visualisoitiin käyttäen fluoresoivasti leimattuja sekundaarisia vasta-aineita. (B) Western blot-analyysi A549 ja H1299 keuhkosyöpään solujen vakaasti transdusoitu MLV-runkoverkon (A549-BB ja H1299-BB), MLV-HA-RASSF1C (A549-1C ja H1299-1C), MLV-HA-IGFBP- 5 (A549-BP5 ja H1299-BP5), ja MLV-HA-RASSF1C /MLV-HA-IGFBP-5 A549-1C-BP5 ja H1299-1C-BP5). Anti-PIWIL1-vasta-ainetta käytettiin koettimena Western blot. PIWIL1 on säädelty A549 ja NCI-H1299-solujen yliekspressoivissa RASSF1C, mutta ei soluissa, jotka ilmentävät IGFBP-5 tai co-express sekä IGFBP-5 ja RASSF1C. (C) Näyttää normalisoidut PIWIL1 proteiinin tasot aktiini (lastaus kontrolli) kanssa keskihajonnat, data edustaa kolme riippumatonta blots.

. H1299-BB, H1299-1C, H1299-1A-1C, ja H1299-1C-BP5 soluja käsiteltiin betuliinihappo (BA) 24 tuntia. Sitten solut määritettiin solujen elinkelpoisuus /lisääntymiseen. Solut ilmensivät RASSF1C-IGFBP-5 olivat herkempiä BA verrattuna soluihin, yli-ilmentävät RASSF1C tai koekspressoivat RASSF1A-RASSF1C. Data edustaa vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen, ja arvot edustavat keskiarvoja ± SEM. * P 0,05: 1C verrattuna BB.

esto ATM-AMPK reitin indusoi RASSF1C geeniekspressiota

Tällä hetkellä ei ole tietoa ylävirran signalointikaskadien mukana säännellä RASSF1C geenissä ilmaisu. Siksi teimme transcriptome PCR array tutkimuksen tunnistaa kemiallisen estäjien ja niihin liittyvät signalointireitin (t), jotka moduloivat RASSF1C ilmaisua. PCR joukko koostui cDNA rintasyöpä MCF7 käsiteltiin 90 eri kemiallisia inhibiittoreita, jotka säätelevät eri signalointireittejä. Array seulottiin RASSF1C alukkeilla ja useita kemiallisia estäjiä, jotka näyttävät ajan säädellä ja alas-säädellä RASSF1C ilmentyminen ≥ 1,5 kertaiseksi tunnistettiin. Merkittävimpiä reagenssit ovat Dorsopmorphin (AMPK estäjä) ja KU60019 (ATM-estäjä), joka säätää ylös RASSF1C ilmentymistä 2,8 ja 2,4-kertaiseksi; ja Trichostatin A (HDAC estäjä ja AMPK aktivaattori) alas säätelee RASSF1C ilmentymisen 2 kertaiseksi (taulukko 1). Olemme vahvistettiin myöhemmin vaikutus Dorsomorphin ja Trichostatin on RASSF1C ilmentyminen H1299 keuhkosyövän soluja (kuvio 10). Nämä havainnot ovat uusia, ja viittaavat siihen, että ATM-AMPK reitti voi moduloida RASSF1C ekspressiota /toiminto keuhkosyövän soluja.

H1299 keuhkosyövän soluja käsiteltiin Dorsomorphin ja Trichostatin A: n konsentraatio on 10 uM vahvistaa PCR- array data. RT-PCR-analyysi osoittaa, että Dorsomorphin merkittävästi sääteli RASSF1C geeniekspressiota taas hieman ylöspäin säätelevä PIWIL1 geenin ilmentymistä. Trikostatiini Hoito merkitsevästi alassäädetty RASSF1C ja PIWIL1 mRNA-tasoja. Esitetyt tiedot on keskimäärin kolme itsenäistä RT-PCR kokeet tehdään kolmena kappaleena, * = P 0,05.

Keskustelu

RASSF1 näyttää olevan geenin dual toiminnallisuutta, sekä kuten tuumorisuppressoriproteiinia (RASSF1A isoformin), ja kuin onkoproteiini (RASSF1C isoformin) [11] – [16]. Tässä artikkelissa, me raportoimme että yli-ilmentyminen RASSF1C parantaa paitsi keuhkosyöpää soluproliferaatiota, mutta myös edistää solujen vaeltamiseen. Tämä on yhdenmukaista aiempien havaintojen rintasyöpäsoluissa [13]. Lisäksi, RASSF1C yli-ilmentyminen on myös vähentää vaikutuksia syövän vastaisen aineen, betuliinihappo, jonka tiedetään laskevan keuhkosyövän soluproliferaatiota [22]. Tämä tukee edelleen kasvua edistävää ja apoptoosin lieventävien toimien RASSF1C.

Olemme aiemmin osoittaneet, että RASSF1C moduloi PIWIL1 geeniekspressiota, kantasolun itseuudistumisen geeni. Näin ollen on mahdollista, että RASSF1C voivat edistää keuhkosyövän kantasolujen kehittymistä ja etenemistä. Tämän mukaisesti olemme havainneet, että CD133

+ keuhkosyöpä solut (jotka osoittavat syövän kantasolun ominaisuuksia [24], [25] yli-ilmentävät RASSF1C näyttävät muodostaa suurempia ja lukuisia kasvaimen aloilla verrattuna kontrolliin CD133

+ solut. PIWIL1 geenin ilmentyminen on kohonnut monissa ihmisen syöpäsoluissa, ja on ehdotettu, että PIWIL1 voi olla osallisena kasvainten synnyssä [17], [18], [26]. Äskettäin sh-RNA

piwil1

geenin knock-down in keuhkosyövän kantasolut (SSCloAldebr) on osoitettu vähentävän merkittävästi kasvaimen kasvua nude-hiirissä, edelleen syyllistämättä roolia PIWIL1 proteiinin ylläpitämisessä syövän kantasolujen lisääntymistä [28].

BA on aiemmin osoitettu vähentävän ihmisen syöpäsolujen lisääntymistä ja alas-säädellä

piwil1

mRNA ilmaisun mahalaukun adenokarsinoomasolua [22], [26]. Olemme arvioineet vaikutuksia BA

piwil1

geeni ilmentyminen keuhkosyöpäsoluissa käyttäen RT-PCR ja Western blot-analyysi. Vaikka hoidossa keuhkosyövän soluja BA johti vähenemiseen soluproliferaatioon (kuva 4) ja alas-säätely

piwil1

mRNA, joka on yhdenmukainen kanssa julkaistuun kirjallisuuteen.

piwil1

geeni yli-ilmentyy useissa ihmisen syövissä, ja knock-down on

piwil1

vähenee (ja yli-ilmentyminen

piwil1

geeni kasvaa) kasvaimen kasvua

in vivo

[18], [19], [28]. Kuitenkin hyvin vähän tiedetään sen roolista keuhkosyövän solujen kasvua ja etenemistä. Me pudotti

piwil1

geenien ilmentymisen edelleen oppia sen toiminnoista keuhkojen syöpäsoluja. Huomasimme, että

piwil1

geenin knock-down pienensi sisäsyntyisen β-kateniinin proteiinin tasot. Olemme osoittaneet, että RASSF1C up-regulation PIWIL1 ilmentymistä [12], ja muut ovat osoittaneet, että RASSF1C parantaa kertyminen β-kateniinin proteiinin tasot A549 keuhkosyövän soluja [15]. Meidän havainnot viittaavat välistä mahdollista yhteyttä RASSF1C ja PIWIL1 ja kanoninen Wnt-signalointireitin, joka on polku, joka on avainasemassa paitsi pitää kantasoluja itsenäisenä uusimisesta ja erilaistumaton valtion, vaan myös edistää kasvainten synnyssä [19], [ ,,,0],28].

PIWIL1 on äskettäin osoitettu estävän erilaistumista sarkooma lähtöaineiden

in vitro

ja aiheuttaa sarkoomat

in vivo

(19). PIWIL1 indusoi sarcomagenesis kautta alas-säätely tuumorisuppressoreilla ja sykliiniriippuvaisen estäjät kautta hypermetylaation [19]. Yksi tuumorisuppressoreilla alas-säädellä PIWIL1 on IGFBP-5, jota on aiemmin osoitettu olevan vuorovaikutuksessa kumppani RASSF1C [19]. Siksi halusimme tutkia vaikutusta RASSF1C /IGFBP-5 vuorovaikutus PIWIL1 geenien ilmentyminen keuhkosyövässä soluissa. Kiehtovan, koekspressio RASSF1C ja IGFBP-5 merkittävästi invertoinnin RASSF1C säätely ylöspäin PIWIL1 geenien ilmentyminen ja tehosti estäviä vaikutuksia BA verrattuna soluihin, jotka joko nimenomainen RASSF1C tai co-express RASSF1A ja RASSF1C (kuvio 9). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että IGFBP-5 voi sitoa ja sitovat RASSF1C, mikä estää ylös-säätely PIWIL1 geenin ilmentymisen RASSF1C. Tämä yhteys on IGFBP-5 /RASSF1C vuorovaikutus modulaatio PIWIL1 ilme on uusi havainto ja ansaitsee lisätutkimuksia ja validointi.

Tällä hetkellä ei ole tietoa miten RASSF1C geenien ilmentyminen säätelee, ja siten teimme transcriptome PCR array näyttö ja tunnistaneet useita kemiallisia estäjiä, jotka näyttävät moduloimaan RASSF1C geeniekspressiota. Näistä kemialliset estäjät, olemme huomanneet, että kemiallisen inhibiittorin Dorsomorphin (tunnetaan myös nimellä yhdiste C) ja KU60019 säätää ylös RASSF1C 2-kertaisesti, kun taas kemialliset Trichostatin Alas-säätelee RASSF1C geeniekspressiota 2 kertaiseksi rinta- ja keuhkosyövän soluja (taulukko 1). Dorsomorphin on osoitettu estävän ionisoivan säteilyn (IR) solusyklin pysähtymisen ja solujen lisääntymistä kautta inaktivoinnin ATM-AMPK-p21

WAF /CIP-reitin [29]. Aktivointi ATM-AMPK-p21

WAF /CIP-reitin metformiinin on hiljattain osoitettu estävän kasvua ja parantaa IR vaikutuksia NSCLC soluihin [30].