Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

redox-hiljainen E-vitamiinin analogi α-tokoferyylihapon sukkinaatti (α-TOS) havaittiin synergistisesti yhteistyötä vitamiinia K3 (VK3) plus askorbiinihapon (AA) induktioon syöpäsolu-selektiivisen apoptoosin kautta kaspaasi-riippumaton reitti. Täällä tutkimme molekyylimekanismin (t) taustalla solukuolema eturauhasen syöpäsoluissa α-TOS, VK3 ja AA, ja mahdollinen käyttö kohdistuva lääkkeiden yhdistelmän eturauhassyövän hoitoon.

Menetelmät /Principal havainnot

sukupolven ROS, soluvastetta oksidatiivista stressiä, ja autophagy tutkittiin PC3 eturauhasen syöpäsolujen käyttämällä huumeita alemmilla toksisilla annoksilla. Arvioimme onko PARP1 välittämää apoptoosia indusoivan tekijän (AIF) julkaisu on rooli apoptoosin aiheuttama yhdistelmä tekijöille. Seuraavaksi vaikutus yhdistelmän α-TOS, VK3 ja AA kasvaimen kasvuun tutkittiin nude-hiirissä. VK3 plus AA indusoi aikaista ROS muodostuminen liittyy induktioon autophagy vasteena oksidatiivisen stressin, mikä väheni α-TOS, muodostumisen estämiseksi autophagosomes. α-TOS aiheuttamaa mitokondrioiden epävakauden johtaa vapauttamista AIF. Translokaatio AIF mitokondrioista tumaan, tuloksena kombinatorisista hoidon välitti PARP1 aktivointi. Estyminen AIF sekä PARP1 vaimentaa tehokkaasti apoptoosia laukaisi lääkeyhdistelmän. Käyttäen hiirimallissa eturauhassyövän, yhdistelmä α-TOS, VK3 ja AA oli tehokkaampi tuumorisuppressiogeeneksi kuin, kun lääkkeet annettiin erikseen, ilman haitallisia sivuvaikutuksia.

Johtopäätökset /merkitys

α-TOS, joka on mitokondrion kohdistaminen apoptoottisia agentti, kytkimet alemmilla apoptoottiset annokset autophagy riippuvan selviytymisen syöpäsolujen hajosi edistämällä apoptoosin. Koska synkkä ennuste syöpäpotilaille, tämä havainto on mahdollisesti on kliinistä merkitystä.

Citation: Tomasetti M, Nocchi L, Neuzil J, Goodwin J, Nguyen M, Dong L, et al. (2012) Alpha-Tocopheryl Succinate Antimikrobiainetta Autophagic Survival eturauhassyöpäsolujen aiheuttama Vitamin K3 ja askorbaatti laukaista solukuolema. PLoS ONE 7 (12): e52263. doi: 10,1371 /journal.pone.0052263

Editor: Kamyar Afarinkia, Univ of Bradford, Iso-Britannia

vastaanotettu: 26 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 12 marraskuu 2012; Julkaistu: 18 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Tomasetti et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustusta Eturauhassyöpä säätiön Australian JN, ja ylimääräiset osittain Research rahoitusta ammattikorkeakoulu Marche. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta varten. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mitochondria äskettäin tullut kiehtova tavoitteet syöpälääkkeet [1] – [3]. K3-vitamiinia (VK3), synteettinen versio K-vitamiinia, osoittaa sytotoksista aktiivisuutta syöpäsoluissa aiheuttamalla mitokondrioita riippuva vahingon Poiketen redox pyöräily sekä selektiivisesti DNA-polymeraasi-γ, avain entsyymi mtDNA lisääntymään [3], [4]. Vahvistavan sen syövän vaikutusta, VK3 on yhdistetty redox-aktiivisen askorbiinihapon (AA). Vetyperoksidi syntyy VK3-AA yhdistelmä on raportoitu aiheuttavan solukuolemaa eri syöpätyyppien [5], [6].

VK3-AA aiheuttama oksidatiivinen stressi voi olla erilainen kasvainsolun ja normaali solujen aineenvaihduntaa, ja voi mahdollistaa manipuloinnin suunniteltu parantamaan syövän hoidossa. Kuitenkin vastauksena oksidatiivista stressiä solujen aktivoida väyliä, jotka edistävät niiden selviytymistä ja sopeutumista [7]. Yksi tällainen stressi-vastaus-mekanismia on autophagy [8], [9]. ROS voi aiheuttaa autophagy, jotka voivat edistää kaspaasi riippumattomia solukuoleman tai, päinvastoin, autophagy voi edistää suojaava tehtävä vastaan ​​ROS-välitteisen kuoleman [10], [11]. Näin ollen löytö molekyylejä, jotka säätelevät autophagy voi olla suuri merkitys kehittämään lääkkeitä syövän hoitoon.

Äskettäin subletaali pitoisuudet VK3 ja AA, yhdessä ala-apoptoottisen annos α-tokoferoli-sukkinaatti (α-TOS), on osoitettu tehokkaasti aiheuttaa eturauhasen syöpäsolun kuoleman joka karakterisoitiin DNA pirstoutuminen, lysosomaalisen /mitokondrion häiritseekin, sytokromi

c

julkaisu, kun taas puuttuu kaspaasin aktivaatio [12]. Lisääntyvä todistusaineisto viittaa siihen, että kaspaasi-riippumaton reittejä on tärkeä rooli syövän kuolemaan ja apoptoosin indusoiva tekijä (AIF) on nousemassa keskeinen välittäjänä tässä prosessissa [13] – [16]. Merkitystä tämän lähtökohta, aktivoitumista DNA korjaus entsyymi poly (ADP-riboosi) polymeraasi-1 (PARP1) on raportoitu välttämätöntä AIF vapautumisen mekanismilla, johon liittyy Ca

2+ virtaa sytosoliin [17] – [20].

Käyttämällä osa-myrkyllisiä annoksia α-TOS sub-myrkyllisiä pitoisuuksia VK3 + AA aiemmin tunnistettu [12], arvioimme vaikutus α-TOS on ROS-välitteisen autophagy laukaisee VK3 ja AA. Mekanismi (t) mukana solukuoleman aiheuttama aineen yhdistelmä tutkittiin myös. Me raportoimme että VK3 plus AA aiheuttama varhainen ROS muodostuminen liittyy induktioon autophagy vastauksena oksidatiivista stressiä. Esto autophagy paljastui suojaava rooli VK3 + AA aiheuttama autophagy PC3-soluissa. α-TOS havaittiin vähentävän VK3 + AA-indusoidun ROS muodostumista kumoamisesta ROS laukaisee autophagosomes muodostumista. Kuitenkin ROS tuotettu oli riittävä indusoimaan PARP1 aktivaatio, mikä johtaa vapautumisen pro-apoptoottisen tekijän AIF, edistää solukuolemaa ilmenee apoptoosin tuntomerkkejä, kuten kromatiinin kondensaatio. Kliinistä merkitystä Tämän tutkimuksen tarjoaa huomattavia tukahduttaminen syövän hiirillä hoitaa kolmen yhdistelmää tekijöille.

Tulokset

α-TOS estää autophagy laukaisi ROS syntyy vastauksena VK3 ja AA hoito

on raportoitu, että osa-toksisten annosten yhdistelmän VK3 (3 uM), jossa AA (0,4 mM) johti solunsisäisen sukupolven ROS, mutta solut kuolivat vain, kun läsnä on α Tos (30 uM) [12]. Valaistaan ​​roolin oksidatiivista stressiä yhdistelmähoitoa, ROS muodostumista ja soluvasteiden oksidatiivista stressiä (autophagy) arvioitiin ajan. Hoito PC3-solujen VK3 ja AA johti muodostumista peroksidia liittyvien molekyylien 30 min, jonka jälkeen ROS-liittyvä fluoresoiva signaali palautetaan sen perustasolle. Kun α-TOS yksin indusoi myöhäinen muodostuminen peroksidia liittyviä molekyylejä, jotka havaittiin sen jälkeen, kun 120 minuutin inkuboinnin, se vähensi alussa lisätä niiden tasot vasteena hoitoon soluja VK3 ja AA yksinään (Fig. 1A, vasen paneeli). Tutkia, mitokondriot ovat merkittävä lähde ROS sukupolvi, tasot superoksidi arvioitiin käyttäen dihydroetidium (DHE). Kun vuorovaikutus superoksidi, DHE tuottaa etidiumbromidia (EtBr), joka kerääntyy tumaan ja tuottaa punaisen fluoresenssin [21]. Kuva. 1A (oikea paneeli) asiakirjat lisätä superoksidi tasoille 20-60 min hoidon Solujen VK3 ja AA jota pienennettiin läsnäollessa α-TOS. DHE johdettu EtBr tumavärjäystä havaittiin ajan fluoresenssimikroskopiaa käyttäen, ja osoittaa, että käsittelemällä VK3 ja AA, apoptoottinen blebs sisältävät ydin- komponentteja muodostettu solun pinnalla sen jälkeen, kun 60-120 min; 36-46% soluista oli EtBr-negatiivinen (kalpea solut) seurauksena kromatiinin menetys. Vähentynyt määrä soluja Ydinvoimalla rakkuloita (18% vaalean soluja) havaittiin pitkäaikainen inkubointi. Solut otetaan talteen sen jälkeen, kun 180 minuutin inkuboinnin, mikä osoittaa palautuva prosessi. Läsnäolo α-TOS merkittävästi esti ”hyödyntämisen” ja blebs osoituksena kasvu vaalean soluja (66%), edistää solujen kuolemaa (Fig. 1 B).

(A) PC3-soluja käsiteltiin A-TOS (30 uM), VK3 ja AA (3 uM VK3, 0,4 mM AA) ja arvioitiin ROS sukupolvi DCF (indikaattori vetyperoksidia) tai DHE (indikaattori superoksidi) ilmaistuna fluoresenssin intensiteettiä. Solut arvioitiin lisääntyneeseen fluoresenssiin käyttäen virtaussytometrialla. (B) mikroskooppinen visualisointi DHE-värjättyä PC3-soluissa lääkehoitoon ajan. Kun vuorovaikutus superoksidi, DHE (pilkukas sininen) tuottaa etidiumbromidia (EtBr), joka kerääntyy tumaan ja antaa punaisen fluoresenssin (ylempi paneeli). Ydin- blebs sisältävä vaurioitunut chromatin vähentää ydinaseiden EtBr värjäytymistä (kalpea solut). Virtaussytometria kvantifiointi vaalean soluja (EtBr-negatiivisia soluja, alapaneeli) suoritettiin PC3-soluissa, joita käsiteltiin, kuten on ilmoitettu. Tiedot ovat keskiarvoja ± S.D. (N = 3), mikroskoopin kuvat edustavat kolmen erillisen kokeen. Suurennus 600 ×, asteikko bar = 10 pm.

Koska dokumentoitu, että lääkehoidon aiheuttama sukupolven ROS, tutkimme seuraavaksi niiden vaikutus autophagy PC3 soluissa arviointia ekspressiokuviota mikrotubulusverkon -associated proteiini-1 (LC3), transmissioelektronimikroskopialla (TEM), ja muodostuksen kautta happaman vakuolaarisen soluelimiin [22]. LC3 esiintyy kahdessa muodossa, LC3-I (18-kDa) ja LC3-II (16-kDa), joista jälkimmäinen kalvoon sitoutuneen ja kasvoivat autophagy muuttamalla entisen [23]. PC3-soluja käsiteltiin VK3 ja AA-menetelmää osoitti korkeamman tason LC3-II proteiinin 60-120 min hoidon jälkeen, joka estyi, kun läsnä on α-TOS (Fig. 2A). TEM suoritettiin PC3-soluissa eri hoitoyhdistelmissä. Ohjaus ja α-TOS-käsitellyt solut varustellun mitokondrioita kanssa hyvin määritelty kristat, ehjä kaksinkertainen kalvo, homogeeninen tiheys ja lieriön muotoinen. Ulkonäkö suuri määrä autophagosomes jossa on kaksinkertainen kalvo rakenne sytoplasmassa havaittiin TEM jälkeen 120 min hoidon VK3 + AA, joilla on vain vähän vaikutusta mitokondrioiden morfologiaan. Sen sijaan, kun VK3 ja AA yhdistettiin α-TOS, näkyvä epänormaali mitokondrioita kanssa sekavaa kristat laski elektronitiheys ja kasvu pienempi akseli vastaa mitokondrioiden turvotusta havaittiin, kun taas muodostuminen autophagosomes ei havaittu (kuvio. 2B). Otto punainen fluoresoiva AO edelleen tukee estävää vaikutusta α-TOS on VK3 + AA aiheuttama autophagy (Fig. 2C).

(A) PC3-soluja käsiteltiin huumeiden kuten ja taso LC3-II proteiinin normalisoidaan-aktiini ilmaistiin keskiarvona ± SD n LC3-II /LC3-I densitometrian suhde. (B) PC3-soluja käsiteltiin huumeiden kuten 2 tuntia ja arvioitu morfologia TEM. Suurennus 4000 ×, asteikko bar = 0,5 pm (ylempi kuvia), suurennus 9000 ×, bar = 0,5 pm; N = tuma, m = mitokondriot, a = autophagosomes. (C) PC3-solut käsiteltiin kuten, ja muodostuminen AO-kertyy hapan vesicular organelles (oranssi-punainen fluoresenssi) havaittiin käyttäen virtaussytometria. (D) PC3-solut käsiteltiin kuten on esitetty läsnä ollessa tai ilman autophagy estäjien (3mA ja CQ), ja solujen elinkykyisyys assed jälkeen 24 h inkubaation jälkeen. (E) muodostuminen autophagosomes kontrollisoluissa (1) ja kun läsnä 3mA (2) ja CQ (3) arvioitiin western-blottauksella, kuten ilmentymistä LC3-II 2 tunnin kuluttua lääkkeen hoitoja. Tiedot ilmaistaan ​​eroavat käsittelemätön kontrolli, ja ovat keskiarvoja ± S.D. (N = 3), kuvat edustavat kolmen erillisen kokeen. * P 0,05 verrattuna kontrolleihin.

Seuraavaksi kysyimme autophagy vaikuttaa solukuolemaan. Käsitellä tätä kysymystä, autophagy suppressoitiin farmakologisen estäjän 3mA (varhainen vaihe esto) ja CQ (myöhäinen vaihe esto). PC3-soluja käsiteltiin sitten α-TOS tai VK3 + AA ja α-TOS + VK3 + AA. Kuten on esitetty kuviossa. 2D, esto alussa autophagic prosessi vähentää solujen elinkelpoisuutta VK3 + AA-käsiteltyjen solujen määrin verrattavissa siihen, mitä havaittiin, kun α-TOS yhdistettiin VK3 + AA. Tätä vaikutusta ei ole havaittu, kun estää viimeinen vaihe autophagic kautta. Muodostumista autophagosomes puuttuessa tai läsnä ollessa autophagic estäjien 3mA ja CQ arvioitiin ilmentyminen LC3-II jälkeen lääkehoitoon (2 h). VK3 + AA seoksen aiheuttama LC3-II ilmaisu, joka estyi läsnäollessa 3mA muttei CQ (Fig. 2E). Tämä osoittaa, että autophagy on suojaava vaste VK3 + AA-solukuolema, ja inhibitio autophagy varhaisessa vaiheessa on strategia indusoi solukuoleman.

Mechanism of α-TOS, VK3 ja AA- solukuolema

tutkimiseksi mekanismi (t) mukana solukuoleman aiheuttama yhdistelmä α-TOS kanssa VK3 + AA, arvioimme rooli AIF. Subsellulaarinen fraktiointi osoitti, että vain silloin, kun a-TOS (30 uM) yhdistettiin VK3 (3 uM) ja AA (0,4 mM), AIF uudelleen jaellaan mitokondrioita sytoplasmaan ja tumaan (Fig. 3A). Sen testaamiseksi, AIF uudelleenjako on mukana solukuoleman aiheuttama yhdistelmä kolmesta aineesta, proteiini hiljennettiin ja solujen elinkelpoisuus arvioitiin. Kuten on esitetty kuviossa. 3B, siRNA kohdistaminen AIF tehokkaasti tukkinut AIF lauseke puolestaan ​​heikennetty solukuoleman aiheuttama yhdistelmä α-TOS, VK3 ja AA. Teho AIF siRNA on dokumentoitu kuvassa. 3C.

Panel (A) esittää fluoresenssimikroskooppiin kuvia AIF translokaation tumaan jälkeen 180 minuutin käsittelemällä-TOS (30 uM), VK3 ja AA (3 uM VK3, 0,4 mM AA) yksin tai yhdistelmä (vasen paneeli). Ydin- translokaatio AIF osoittaa samanlainen jakauma punaisen (AIF-TRITC) ja sinisen signaalin (nucleus); suurennus 600 ×, asteikko bar = 10 um. Oikeassa paneelissa näkyy western blot-analyysi AIF translokaatiota solufraktiossa. Organelle (org), solulimassa (cyto) ja ydin- (Nucl) fraktiot saatiin PC3 soluista käsitelty lääkkeillä kuten edellä ja tason AIF arvioitu. PC3-solut transfektoitiin NS siRNA tai AIF siRNA, ja arvioitiin AIF proteiini taso (C). Transfektoidut solut käsiteltiin kuten edellä 24 tunnin inkuboinnin ja arvioitu elinkelpoisuus käyttäen MTT-määritystä (B). Tiedot ovat keskiarvoja ± S.D. (N = 3), kuvat edustavat kolmen erillisen kokeen. Symboli ”*” osoittaa tilastollisesti erilaisia ​​tuloksia AIF siRNA- ja NS siRNA-transfektoitujen solujen p 0,05.

Voit selvittää suora suhde kasvoi solunsisäisten ROS tasoilla ja AIF-välitteisen solukuoleman aiheuttama kombinatorinen hoitoon, PC3-soluja esikäsiteltiin antioksidantti NAC, joka tehokkaasti estää sytoplasminen ja tumaansiirtymiseen AIF indusoi kolmen aineita, mikä osoittaa roolin ROS (Fig. 4A, B). Estyminen AIF tumaansiirtymiseen liittyi kumoamisen huumeiden aiheuttama solukuolema (Fig. 4 C, D). Lisäksi testata, onko uudelleen jakautuminen AIF tapahtuu on kaspaasi-riippumattomalla tavalla, solut altistettiin kolmelle aineiden läsnäollessa yleiseurooppalaisen kaspaasiestäjä z-VAD-fmk joka ei estänyt AIF translokaatio eikä kohdistu mitään suojaava vaikutus vastaan ​​kombinatorisista hoitoa (Fig. 4 A-D).

Panel (A) Asiakirjat AIF-TRITC visualisoitu fluoresenssin mikroskoopilla, suurennus 600 ×, asteikko bar = 10 um. (Vasen paneeli), ja western blot kuvia (oikea paneeli) AIF translokaation sytosoliin ja tumassa after180 min käsittelemällä-TOS (30 uM), VK3 ja AA (3 uM VK3, 0,4 mM AA) puuttuessa tai läsnä ollessa NAC (10 mM) tai z-VAD-fmk (10 gM). AIF juovan tiheyden normalisoitiin käyttäen-aktiini tai Lamin, ja ilmaistaan ​​keskiarvo ± S.D. AIF

cyto-AIF

Nucl /AIF

org densitometrian suhde. (B). Sytotoksinen vaikutus kombinatoristen hoidon PC3-solujen läsnä ollessa tai ilman NAC (10 mM) ja z-VAD-fmk (10 gM) arvioitiin solujen elinkelpoisuuden 24 h kuluttua altistumisen solujen lääkkeet (C), ja vaihe kontrasti micrographs solun käsiteltiin vastaavasti on kuvattu (D); suurennus 200 ×, asteikko bar = 100 pm. Tiedot ovat keskiarvoja ± S.D. (N = 3), kuvat edustavat kolmen erillisen kokeen. Symboli ”*” osoittaa tilastollisesti erilaisia ​​tuloksia käsittelemättömän

vs

käsitellään PC3-solujen puuttuessa tai läsnä NAC tai zVAD-fmk kanssa p 0,05.

Aiemmin on kertoi, että ROS-välitteinen DNA-vaurion laukaisee aktivoituminen PARP1 ja johtaa solukuolemaan [24]. PARP1 aktivointi tuottaa PAR polymeeri tumassa ja sen translokoituvat että mitokondriot välittäjäksi AIF julkaisu [20]. Täsmennetään suhdetta AIF ja PARP1, arvioimme AIF vapautumista ja PARP1 aktiivisuutta PC3-soluissa altistumisen jälkeen a-TOS, VK3 ja AA eri ajankohtina. AIF translokaatio solulimaan oli havaittavissa sisällä 5-60 min yhdistelmämuta- solujen käsittelyä, ja sytoplasmista vapautuminen AIF oli samanaikainen PARP1 aktivointi. Sen sijaan, translokaatio vaihtoehtoisten tuma viivästyvät ainakin 60 min (Fig. 5A, B). Esto PARP1 mukaan 3ABA vaimennetaan sekä AIF tumaansiirtymiseen (Fig. 5C, D) ja solukuoleman induktioon (Fig. 6 E, F).

Paneeli A esittää kinetiikkaa AIF vapautumisen ja paneeli B aktiivisuutta PARP1 vuonna PC3-solut altistettiin a-TOS (30 uM), VK3 (3 uM) ja AA (0,4 mM). Paneelissa C esitetään fluoresenssi micrographs käyttäen PARP1-FITC ja AIF-TRITC (suurennus 600 ×, asteikko bar = 10 pm) (vasen paneeli), ja western blot kuvia (oikea paneeli) ja PARP1 ja AIF translokaation tumaan jälkeen 180 min hoidon A-TOS + VK3 + AA puuttuessa tai 3ABA: n (2 mM). (D) AIF juovan tiheyden normalisoidaan-aktiini tai Lamin ja esitetään keskiarvo ± S.D. että AIF

cyto-AIF

Nucl /AIF

org densitometrian suhde. (E) Sytotoksinen vaikutus kombinatoristen hoidon PC3-solujen läsnä ollessa tai ilman 3ABA arvioitiin solujen elinkelpoisuuden 24 h kuluttua altistumisen solujen huumeita. Paneelissa F esitetään vaihe kontrastia micrographs solujen käsitelty kolmen lääkeaineen kanssa tai ilman 3ABA; suurennus 200 ×, asteikko bar = 100 pm. Tiedot ovat keskiarvoja ± S.D. (N = 3), kuvat edustavat kolmen erillisen kokeen. Symboli ”*” osoittaa tilastollisesti erilaisia ​​tuloksia käsittelemättömän vs käsiteltyjen PC3-solujen läsnä ollessa tai ilman 3-ABA kanssa p 0,05.

Hoito α-TOS + VK3 + AA tukahduttaa syövän etenemiseen

jotta voidaan arvioida syövän vastaisen vaikutuksen kolmen lääkeaineen, Balb-c-nude-hiiret, joilla PC3 ksenografteja käsiteltiin oraalisesti toksista annosta VK3 (3 mg /kg), AA (400 mg /kg), ja jossa on α-TOS (15 mg /kg) intraperitoneaalisesti annettuna, ja yhdistelmät VK3 + AA, tai α-TOS + VK3 + AA. Merkittävä kasvaimen kasvun inhibitio havaittiin VK3 ja AA-hoitoryhmässä; Tätä vaikutusta huomattavasti parannettu klo pitkäaikainen aikoina hoidon, kun molemmat aineet yhdistettiin α-TOS (Fig. 6A). Yhdistelmähoidossa kanssa kolmen lääkeaineen aiheuttama DNA lohkon murtuma muodostumiseen (TUNEL positiivisuus), joka vastaa apoptoottisen prosessin, joka liittyi ydin- AIF translokaatio (Fig. 6B). Suurempi kasvainsolukuoleman alueilla havaittiin hiirillä alttiina tri-yhdistelmähoidossa suhteessa käsittelemättömien hiirien (85 ± 16 x 10

3 um

2

vs

238 ± 45 x 10

3 pm

2: lla,

p

0,05). Tämä käsittely näytti aiheuttavan mitään havaittavaa puolella toksisuutta, sillä hiiret eivät osoittaneet mitään laihtuminen sekä mitään merkkejä sytotoksisuuden munuaisissa ja maksassa, kuten havaitaan histologista arviointia varten ja biokemiallisia analyysejä (tietoja ei esitetty).

(A) Balb-c-nude-hiiret, joilla ksenografteja peräisin PC3-soluja käsiteltiin antamalla suun kautta VK3 (3 mg /kg) andAA (400 mg /kg), ja vatsaonteloon A-TOS (15 mg /kg) yksinään tai yhdistelmä, kuten, 5-kertaa viikossa, ja kasvaimen tilavuus (mm

3) kvantifioitiin jarrusatulat. (B) Formaliinifiksoidusta, parafinoidut tuumorisektioiden (5 pm) tarkastettiin TUNEL positiivisuus (vihreä rytmittävät solut) (suurennos 200 x, asteikko bar = 100 um) ja oli immunologiseen värjättiin anti-AIF IgG (valkoiset nuolet osoitti tumaansiirtymiseen AIF-TRITC ja pycnotic ytimet havaittiin käyttäen DAPI); suurennus 400 ×, asteikko bar = 50 pm. Tiedot kasvaimen tilavuuden ovat keskiarvo ± SEM (n = 8), ei havaittu merkittäviä eroja välillä ohjaus hiirillä ja yhden lääkeaineella hoidettuja hiiriä, kun taas havaittu merkitseviä eroja välillä ohjaus hiirillä ja VK3 + AA-hoidetuista eläimistä päivinä 22-31 ( p = 0,034) ja α-TOS + VK3 + AA-hoidetuista eläimistä päivinä 43-49 (p = 0,043).

keskustelu

anto suun AA ja VK3 käytettiin että eturauhassyövän hoitoon potilailla, [25]. Tämä lähestymistapa oli hyödyllistä, kun lääke yhdistelmä oli yhteistyössä hallinnoitava tunnettujen kemoterapeuttisten aineiden [26]. Niinpä samanaikainen antaminen subletaalisia annokset AA + VK3 (redox-aktiivinen järjestelmä) kanssa redox-hiljainen α-TOS johti tehokkaaseen

in vitro

solukuolemaan. Yhdistelmä VK3 + AA osoitettu synergistisesti edistää tuotannon vetyperoksidin solunulkoiseen ympäristöön [12], [27].

Yhdenmukaisesti aiempien havaintojen huomasimme, että yhdistelmä VK3 + AA aiheutti nopean sukupolvi sekä vetyperoksidin (DCF fluoresenssi) ja superoksidi (dhe fluoresenssi), suurimmillaan 10-20 min ja 30-60 min altistumisen solujen kahden lääkkeen (

cf

Fig. 1A). Vastauksena tähän oksidatiivisen stressin, solut aktivoitu autophagic kautta. Tämän osoituksena olivat muodostumista ydin- blebs ja autophagic rakkulat (hapan vakuolaarisen soluelimiin), sekä lisääntynyt tasoja LC3-II-proteiinia (

cf

Fig. 2A-C). Kuitenkin, kun 180 min tämän hoidon, solut täysin toipunut. Tämä näkyy DHE hapettumisen aiheuttama EtBr tumavärjäystä, joka dokumentoi että lisääntynyt indeksi vaalean solujen havaittiin 60 minuutin kuluttua hoidon VK3 + AA merkittävästi vähentynyt pitkiä ajanjaksoja (

cf

Fig. 1 B). Autophagy estäjä 3mA (varhainen autophagic prosessi) laukaisee VK3 + AA-solukuolema osoittaa, että autophagy on suojaava mekanismi yhteydessä PC3-solujen (

cf

Fig. 2D). Nämä havainnot viittaavat siihen, että varhain oksidatiivista stressiä johtaa adaptiivisen vasteen syöpäsoluja, joka mahdollistaa niiden toipuminen loukkaus. Toisaalta, osa-apoptoottiset annokset α-TOS indusoi väheneminen ROS muodostumisen laukaisee VK3 + AA (

cf

Fig. 1A). Voimme hypothesize että hydrolyysi α-TOS esteraasit soluissa johtaa sukupolven α-tokoferoli (α-TOH), joka toimii ROS scavenger [28]. Kuten aikaisemmin on havaittu [29], havaitsimme, että ROS syntyy vasteena a-TOS koostuvat pääasiassa peroksidia liittyvien lajien, mutta ei superoksidin. Sen sijaan, α-TOS: n raportoitiin indusoivan superoksidin kanssa tapahtuvan vuorovaikutuksen välityksellä kompleksin II mitokondrion hengitysketjun [30]. Emme voi sulkea pois, että meidän koeolosuhteissa, osa-toksisilla annoksilla ofα-TOS johtaa sukupolven pieniä määriä superoksidi, jotka voidaan nopeasti dismutatoitu ja paeta havaitsemiseen.

Ei muodostumista autophagosomes tai muuttanut morfologia soluelimiin havaittiin α-TOS- ja VK3 + AA käsiteltyjen solujen (

cf

Fig. 2A-C). Tämä linkittää vähentäminen ”mukautuva” aikaisin oksidatiivista stressiä kanssa estämisestä autophagic prosessin aiheuttama yhdistelmä VK3 + AA yksin, ja on edelleen tukee TEM, paljastaen puuttuminen autophagosomes soluissa hoitaa kolmen yhdistelmää lääkkeet (

cf

Fig. 2B). Esto autophagy aiheuttama byα-TOS edistänyt ulkonäkö lisääntynyt alaryhmä kalpea solujen muodostumista ydin- blebs ja mitokondrioiden turvotus sekavaa kristat ja laski elektronitiheys, kaikki ominaisuudet solukuoleman. Näin ollen, sisällyttäminen α-TOS yhdistelmähoidossa hoidossa PC3-solujen estää Adaptaatiomekanismit ja selviytymistä, jotka johtavat induktio niiden kuoleman.

induktio autophagy on raportoitu edistää eloonjäämistä kasvainsolujen siten neutraloimaan tai rajoittamalla tehoa solukuoleman induktion kemoterapeuttiset aineet, vaarantaa tulos syöpähoidon [31]. Suostumuksella tätä käsitystä, tuloksemme osoittavat, suojaava rooli autophagy altistettaessa PC3 solujen VK3 ja AA. Olemme havainneet, että käsiteltyjen solujen, jotka osoittivat morfologia muistuttaa (autophagic) solukuolemaa, suurelta osin talteen, ja vain pieni osa soluja hajotettiin mitokondriaalisen transmembraaninen potentiaali oli yli pelastus- ja kuoli näissä olosuhteissa.

todettiin aiemmin, että apoptoosin viivästyy soluissa, joilta puuttuu Bax ja Bak proteiineja, joita tarvitaan mitokondrion ulkokalvon läpäiseväksi (MOMP), joka on tunnusmerkki apoptoottisen solukuoleman ja edellytys solun ylittämään ”point of no paluu ”[32]. Todettiin, että α-TOS indusoi translokaatiota Bax osaksi mitokondrioita rintasyöpäsoluissa [33] – [36]. Toinen raportti dokumentoitu α-TOS aiheuttavan mitokondrioiden apoptoosin joihin FoxO1-Noxa-Bak akselilla [37], [38]. AIF-välitteisen kaspaasi-riippumaton sisäisen reaktiotien kautta Bak on aiemmin kuvattu [39]. AIF liukoista fragmenttia vapautuu mitokondrioiden upon ulkokalvon läpäiseväksi kautta Bax /Bak huokoset [40]. Osoitamme, että AIF vapautumista mitokondrioita on tarpeen solukuolema kombinatorisella eturauhassyövän solujen α-TOS + VK3 + AA on osa-myrkyllisiä annoksia yksilöllisiä aineita. Hiljentäminen AIF proteiinin siRNA merkittävästi heikennetty kuoleman PC3-solujen aiheuttama yhdistelmämuta- hoito (

cf

Fig. 3).

ROS tuotanto on avainasemassa vapautumiseen AIF ja myöhempi edistäminen solukuoleman. Me dokumentoida että tämä lähtökohta pätee järjestelmämme, joka osoittaa, että ROS scavenger NAC kumosi kokonaan kuoleman PC3-solujen altistuvat yhdistelmä α-TOS + VK3 + AA (

cf

Fig. 4). Olemme edelleen osoittamiseksi, että ROS-riippuvaisen PARP1 aktivaatio liittyy julkaisun vaihtoehtoisen sijoitusrahaston mitokondrioiden tumaan (

cf

Fig. 5). Vastauksena DNA-vaurioita, PARP1 katalysoi synteesiä ja siirto PAR yksiköiden vastaanottajan proteiineja, jolloin moduloiva niiden toimintaa ja säätelemällä DNA korjaukseen [41], [42]. Kuitenkin liiallinen DNA-vaurioita aktivoi ainutlaatuinen PARP1 riippuva solukuolemaohjelma, joka on kaspaasin riippumaton mutta riippuvaisia ​​AIF [43]. Vaikka vähäisemmässä määrin suhteessa VK3 + AA, The α-TOS + VK3 + AA yhdistelmä indusoi aikaista ROS muodostumista, joka aiemmin oli aiheuttaa varhaisen DNA-vaurioiden [12]. ROS-indusoidun DNA-vaurion laukaisi vahva kasvu PARP1 aktiivisuus, mikä johti vapautumisen AIF mitokondrioista sytoplasmaan, ja edelleen tumaan. Siten sa seurauksena PARP1 aktivointi, vaihtoehtoisen proteiinin translokaatio sytoplasmasta tumaan, jolloin induktion kromatiinin kondensaatio seurannut solukuolemaa (

cf

Fig. 5).

toiset ovat havainneet, että suuret annokset AA aiheuttama autophagy eturauhassyöpäsoluissa, joka ei toipunut ja sidottiin kuolla [10], [44]. Eri annoksia lääkkeet kohdistavat eri vaikutuksia soluihin valmistamalla vaihtelevia määriä ROS. Perustuen ROS loukkaus, solut eri vastata induktio niiden selviytyminen tai kuolema ohjelmaa. Tässä ala-myrkyllisiä annoksia VK3 + AA indusoi ROS loukkaus ei voi laukaista solukuolema, mutta aiheuttaa vahinkoa soluelinten ja sitä seuraava aktivointi selviytymisen autophagic prosessi. Läsnäolo α-TOS vähensi VK3 + AA-indusoidun oksidatiivisen loukkaus, estäen siten solujen selviytymisen vasteen. Kuitenkin ROS muodostunut oli riittävä indusoimaan PARP1 aktivaatio johtaa AIF vapautumisen ja johtaa solukuolemaan.

Koska mahdollisia syövän vastaista aktiivisuutta kolmen aineiden vaikutus yhdistelmän α-TOS + VK3 + AA kasvaimen kasvuun tutkittiin nude-hiirissä. Suun kautta seoksesta VK3 + AA vähensi kasvaimen kasvua päivinä 22-31 (p = 0,034). Ei TUNEL positiivisuus havaittiin kohdissa VK3 + AA-käsitellyt tuumorit, mikä viittaa siihen, että kasvaimen koon pienentyminen aiheuttama VK3 + AA johtui tuumorin kasvun estäminen sijaan solukuolemaa (

cf

kuvio 6A). Tätä tukee se, että pidemmän aikaa lääkealtistuksen (päivinä 35-49) kasvaimet uudelleen alkoi kasvaa. Hoito α-TOS + VK3 + AA merkitsevästi esti kasvaimen kasvua (päivinä 43-49, p = 0,04), joka indusoi laajoilla alueilla solukuoleman liittyy AIF tumaansiirtymiseen verrattuna kontrollieläimiin ja ne hoidettiin yksittäisten lääkkeiden (

cf

Fig. 6A, B). On huomattava, että anti-kasvain vaikutus α-TOS + VK3 + AA yhdistelmä ei liittynyt mitään merkkejä toissijaisia ​​haitallisia vaikutuksia. Nämä havainnot tukevat

in vitro

tietoja, jotka osoittavat, että α-TOS estää syöpäsolun talteenotto ja selviytymisen jälkeen VK3 + AA hoidon indusoimalla tehokas solukuolemaa klo pitkäaikainen aikoina altistumisen yhdistelmä kolmesta aineesta.

Johtopäätökset

Monet tekijät, kuten kasvain vascularization ja syöpäsolun otto vaikuttaa lääkeainepitoisuudet sisällä kasvain massa. Siksi on kasvain tasolla syöpälääkkeet voisi olla ei tällä tappaminen tasolla, vaikka ylläpitäjä suurilla pitoisuuksilla. Näin ollen, sen sijaan aiheuttaa solukuoleman, alhainen syöpälääkkeet saattavat aiheuttaa sopeutumisreaktio johtaa syöpäsolujen lisääntyä. Täällä, huomasimme, että mukautuva soluvasteen oksidatiivisen stressin aiheuttama redox-aktiivisen järjestelmän VK3 + AA voitettava yhdessä redox-hiljainen agentti α-TOS, joka aiheutti siirtyminen autophagic selviytymisen solukuolemaa (kuvio . 7). Koska seerumissa syöpälääkkeiden olivat alle määritysrajan, niiden farmakokinetiikkaa ei arvioitu, joten tehokas konsentraatio aineita, jotka voisivat kliinistä asetukset eivät ole tarkasti tiedossa. Kliinisessä käytössä pieniä annoksia AA ja VK3 voidaan helposti saavuttaa antamalla suun kautta. Koska α-TOS kokonaan muuntaa tehottomaan α-tokoferoli on annosteltu suun kautta, laskimoon tai ihon läpi edustaa uskottava tapa saavuttaa sen farmakologisen tason ja syövän vaikutusta. Huolimatta kliinisiä keinoja hallinnon, joka on vielä testattu, tämä raportti osoittaa mahdolliseen käyttöön kohdistuva lääkkeiden yhdistelmän eturauhassyövän hoitoon.

VK3 + AA yhdistelmä indusoi ROS muodostuminen (i), ja