Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Rapid luotettava diagnostiikka DNA mutaatiot ovat erittäin toivottavia tutkimus- ja kliinisissä testeissä . Nykyinen kehitys tällä alalla menee samanaikaisesti kahteen suuntaan: 1) suurikapasiteettisten menetelmiä, ja 2) kannettava määritykset. Ei-entsymaattiset lähestymistavat ovat houkuttelevia sekä erilaisia ​​menetelmiä, koska ne mahdollistavat nopean ja suhteellisen edullinen nukleiinihappojen havaitsemisen. Modern fluoresenssimikroskopiaa on ottaa valtava vaikutus havaitsemiseen biomolekyylien at aiemmin saavuttamaton resoluutio. Ei kuitenkaan ole yksinkertaista menetelmiä DNA: n detektoimiseksi ei-entsymaattisesti käyttäen fluoresenssimikroskopiaa ja nukleiinihappoanalogeilla on ehdotettu tähän mennessä.

Menetelmät ja tulokset

Kirjoittajat raportoivat uuden entsyymi-free lähestyä tehokkaasti havaita syövän mutaatioita. Tämä määritys sisältää geenispesifiseen tavoite rikastamiseen seurasi hehkutus oligonukleotideihin sisältävä lukittu nukleiinihapot (LNA) ja lopuksi, havaitsemiseen fluoresenssimikroskopialla. LNA sisältävät koettimia näyttää suuri sitoutumisaffiniteetti ja spesifisyys DNA, joka sisältää mutaatioita, joka mahdollistaa havaita mutaation runsaasti kanssa tunkeutuvan EvaGreen väriainetta. Käytimme toinen koetin, joka lisää koko määrä emäspareja, jotta saadaan suurempi fluoresenssin signaalia sisällyttämällä enemmän värimolekyylejä. Itse asiassa me osoitamme tässä, että käyttämällä EvaGreen väriainetta ja LNA-koettimien, genomisen DNA: n, joka sisältää

BRAF

V600E mutaatio voitiin havaita fluoresenssimikroskoopilla alhaisilla femtomolaarinen pitoisuuksina. Erityisesti tämä oli vähintään 1000-kertaisesti yli potentiaalia toteamisraja.

Johtopäätös

Kaiken kaikkiaan uusi määritys kuvaamme voisi tulla uutta lähestymistapaa nopeaa, luotettavaa ja entsyymi-ilmaiseksi diagnostiikka syöpä tai muut siihen liittyvät DNA-kohteisiin. Tärkeää on, stoikiometria villityypin ja mutantti tavoitteet on konservoitunut myös määrityksessä joka mahdollistaa tarkan arvion mutantti runsaasti, kun detektioraja täyttyy. Fluoresenssimikroskopiaa käyttäen, tämä lähestymistapa tarjoavat tilaisuuden havaita DNA yhden molekyylin resoluutio ja sitä biologisessa näytteessä valinta.

Citation: Miotke L, maity A, Ji H, Brewer J, Astakhova K (2015 ) Entsyymi-Free havaitseminen Mutaatiot Cancer DNA käyttäminen Synteettiset Oligonukleotidikoetinten ja fluoresenssimikroskopiaan. PLoS ONE 10 (8): e0136720. doi: 10,1371 /journal.pone.0136720

Editor: Thomas Abraham, Pennsylvania State Hershey College of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: toukokuu 19, 2015; Hyväksytty: 07 elokuu 2015; Julkaistu: 27 elokuu 2015

Copyright: © 2015 Miotke et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

rahoitus: Augustinus Foundation (Grant. nro 95 305 73949, https://www.augustinusfonden.dk/) mainitaan rahoitusta AM ja KA (reagenssit että LNA koetinsynteesimenetelmiä ja fluoresenssimikroskopian, määritys kehittäminen ja tietojen analysointi). Kirjoittajat myös, että HJ ja LM siivitti Research Scholar Grant, RSG-13-297-01-TBG American Cancer Society (https://www.cancer.org/). HJ sai lisätukea Doris Duke Clinical Foundation Clinical Scientist Development Award (https://www.ddcf.org/programs/medical-research/goals-and-strategies/build-the-clinical-research-career-ladder/clinical-scientist-development-award/) ja Howard Hughes Medical Institute Varhainen ura Grant (https://www.hhmi.org/). Kirjoittajat myöntävät myös tukea National Institutes of Health P01 HG000205 (HJ; https://www.nih.gov/). Avustukset American Cancer Society ja National Institutes of Health tukevat suunnittelun antureista, genomista esirikastus, syöpäsolun ratatyöt ja tietojen analysointi.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

Yhden nukleotidin polymorfismien (SNP: t) ja variantit (SNVs) ovat tärkein lähde geneettistä vaihtelua ihmisen genomin ja muiden lajien [1]. Siksi luotettavasti havaita SNP ja SNVs on tärkeä kliininen ja translaatiotutkimuksen työkalu. Jotkut monia sovelluksia ovat lääkeresistenssideterminantit analyysi virusgenomien ja syöpään liittyvät somaattiset DNA muutoksiin [2]. Yksi ihmisen syövän geeni erityisesti,

BRAF

tai v-Raf hiiren sarkooma viruksen onkogeeni homologin B, koodaa proteiinia B-Raf [3]. Enemmän virallisemmin tunnetaan seriini /treoniini-proteiinikinaasi B-Raf, tämä proteiini vaikuttaa solunsisäinen signalointi ja on mukana ohjaa solujen kasvua [3]. Mutaatiot

BRAF

ovat sekaantuneet joissakin ihmisen syövissä, erityisesti melanooma [4]. Muuten, useita lääkkeitä on kehitetty, että syöpien hoitoon ohjaa

BRAF

, joista kaksi, vemurafenib ja dabrafenib, nyt FDA hyväksytty hoitoon myöhäisen vaiheen melanooma [5,6]. Nykyinen havaitsemismenetelmät mutaatioiden

BRAF

altistaa biopsianäytteissä PCR ja /tai sekvensoinnilla. Vähemmän invasiivisia lähestymistapa tunnistaa

BRAF

mutaatioita suoraan verenkierrossa kasvaimen DNA (ctDNA) saatu potilaan plasmasta [7]. Koska ctDNA ovat läsnä hyvin pieninä pitoisuuksina (100-300 molekyyliä 100 ui analyytin), erittäin herkkä ja spesifinen tunnistus tekniikat ovat sovellettava [8].

Yleensä kehitys alalla SNP /SNV diagnostiikka menee samanaikaisesti kahteen suuntaan: 1) suurikapasiteettisten menetelmiä, ja 2) kannettava, helposti käsiteltävää määritykset [8,9]. Suurikapasiteettinen sekvensointi ja polymeraasi-ketjureaktio (PCR) ovat nykyisten menetelmien valinta tutkimuksen syövän ja tartuntatautien kehittyneissä maissa [9]. Lisää käytettävissä olevia tekniikoita nopeasti point-of-care diagnostiikka puuttuessa sekvensointi ja PCR ovat houkuttelevia. Lisäksi kaikki suurikapasiteettisten tekniikoiden alalla tähän mennessä soveltaa entsyymien saavuttamiseksi vaaditun herkkyyden ja spesifisyyden havaitseminen [9]. Entsyymit lisäävät virheiden analyysin aikana ja vaikuttaa stoikiometria kohdennetun mutaation suhteen villityypin analoginen [10]. Näin ollen kaikki menetelmät nukleiinihappojen havaitsemiseen ja kvantifiointiin hyötyisivät vaihtoehtoisten entsyymi-vapaa strategioita [9,10].

Ihanteellinen, helppo käsitellä diagnostinen SNP /SNV on yksinkertainen vankka määritys vähällä vaiheet, korkea herkkyys ja toistettavuus edullisia [9]. Näiden tavoitteiden mielessä, kiinteän kantajan tai liuoksena järjestelmässä käytetään optisia ja sähkökemiallisia menetelmiä sopii [11]. Fluoresenssi on kätevä optinen havaitsemismenetelmä, jota laajasti sovelletaan sekä modernia state-of-the-art ja kannettava diagnostisia määrityksiä [9]. Erityisesti viimeaikainen kehitys fluoresenssimikroskopialla on ottaa valtava vaikutus havaitsemiseen biomolekyylien

in vitro

ja

in vivo

[12,13]. Mikroskoopin tekniikat ovat tehneet aikaisemmin saavuttamaton yhden molekyylin havaitseminen käytettävissä. Tämä antaa mahdollisuuden välttää entsyymejä havaitessaan biomolekyylien

in vitro

ja mahdollisuus seurata tavoitteiden

in vivo

[9-13].

havaitsemiseksi SNP /SNVs at hyvin pieninä pitoisuuksina, hyvin spesifisiä ja herkkiä koettimet on sovellettava. Yksi lähestymistapa on sijoittaa lukittu nukleiinihapot (LNA) kanssa suoraan kiinnitetty fluoroforeilla lyhyiksi oligonukleotidit [14]. Tämäntyyppiset LNA /DNA sieppauskoettimien nykyisin sovelletaan entsymaattisessa genotyypitys of SNP microarray muodossa ja PCR-pohjaiset tekniikat [15]. Viime aikoina olemme esitteli fluoresoivasti leimattu LNA johdannaisia ​​lupaava väline kehittyneissä genotyypitys, esimerkiksi huumeiden resistenssitestausta erittäin polymorfisia HIV-1-proteaasin [16]. Kuitenkin synteesi fluoresoivasti leimattujen koettimien on kalliimpaa ja työvoimaa kuin on tarpeen point-of-care sovelluksia. Entistä suoraviivainen sondirakenne voisivat soveltaa erittäin tehokas hybridisaatio ominaisuuksia LNA /DNA-oligonukleotidit yhdessä vankka, fluoresoiva väriaineaine kuten EvaGreen. Viime vuosikymmenen aikana interkalatoivista väriaineet on sovellettu menestyksekkäästi entsymaattiset tekniikoita nukleiinihappojen havaitsemiseen [2-5]. Tässä tutkimuksessa valitsimme EvaGreen väriaineen vuoksi osoitti kontrasti kirkkaan signaalin se antaa pois sitoutuneena kaksijuosteisen DNA ja sammutettiin fluoresenssisignaali yksijuosteisia näytteitä [17].

Tässä kuvaamme uusi määritys nopean entsyymi-vapaa havaitseminen

BRAF

V600E mutaatio (T → A-geenin asemassa 1799) ihmisen DNA (kuvio 1). Alussa rikastuttaa kohde-DNA käyttämällä geeniä erityinen 120mer rikastamiseen koetin, jonka jälkeen loisteputki tunnistus EvaGreen väriainetta ja toinen mutaatio erityinen, lyhyempi LNA /DNA sieppauskoetinta. Käyttämällä laimennussarjoja mutantti /villityypin solulinjan DNA seokset, osoitamme, että tämä uusi määritys on erittäin voimakas, että loisteputki tunnistus kliinisesti merkittävästä SNP alhaisina pitoisuuksina ja korkea näytteen monimutkaisuus. Lisäksi osoitamme, että soveltamalla fluoresenssimikroskopialla voimme erityisesti havaita pieni femtomolaarinen ja attomolar DNA: n pitoisuuksia, jotka sisältävät kohteena mutaation.

päävaiheet LNA /DNA-määritys: 1) sitoutuminen geenispesifistä sieppauskoetinta, 2) pesu- ja lohkaisu tuki, 3) lisätään signaali parantavia LNA /DNA-koetin ja väriaineaine, 4) fluoresenssidetektiojärjestel-. B = biotiini, S = streptavidiini, CPG = huokoskooltaan kontrolloitu lasi, L = LNA.

Materiaalit ja menetelmät

Yleiset

reagenssit saatiin kaupallisilta toimittajilta, käytettiin ohjeiden mukaisesti. LNA Fosforamidiitti reagenssit ja EvaGreen väriainetta (20X vedessä) saatiin Exiqon ja Biotium, vastaavasti. Unmodified ja biotinyloitua DNA-säikeet ostettiin IDT ja käytettiin HPLC-puhdistuksen jälkeen.

Tiedot oligonukleotidisynteesiin, kuvauksesta ja lämpödenaturaatiota tutkimukset esitetään S1 lisäyksessä.

Perimän DNA

Perimän DNA solulinjoista LS411N ja HT29 saatiin suoraan toimittajan (ATCC, luettelo nro. CRL-2159 ja HTB-38, tässä järjestyksessä), ja eristettiin käyttäen Qiagen DNeasy solukkoviljely poistojärjestelmä kohti valmistajan ohjeiden (Qiagen). HMC-1 (ihmisen uros kontrolli) saatiin Promega [18]. Tuote pilkottiin 12 tunnin ajan 37 ° C: ssa käyttäen EcoRI (New England Biolabs), ja saostettiin etanolista. Pituus fragmenttien mitattiin Agilent Bioanalyzer DNA 7500 Kit antaa arvon n. 7000 emäsparin.

Pre-rikastamista

BRAF

geenifragmentti.

Pre-rikastamista genomista DNA: ta suoritettiin käyttäen xGen Lockdown Kit (IDT), 120mer

BRAF

erityisiä koetin on leimattu biotiinilla (IDT), ja streptavidiinilla päällystettyjen magneettisten helmien kanssa (Dynabeads-M270, Life Technologies). 120mer koetin suunniteltiin päällekkäin

BRAF

V600E alue (asento V600E mutaatio on underlined):

5’-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACCCACTCCATCGAGATTTCACTGTAGCTAGACCAA

AATCACCTATTTTACTGTGAGGTCTTCATGAAGAAATATATCTGAGGTGTAGTAAGTAAAGG-(biotin-C6)-3’

Pre-digested genomisen DNA: n ja biotinyloitua 120mer koetin inkuboitiin 5 tunnin ajan 60 ° C: ssa ja sen jälkeen kiinnittämällä magneettihelmiin, useita pesuvaiheita ja irtoamista lämmön ehdottivat toimittajan (IDT, kuumentamalla 92 ° C: ssa 10 min). Tämän seurauksena , yksijuosteinen DNA saatiin.

Solid-tuki hybridisaatiomääritysmenetelmän.

DNA: n konsentraatio laskettiin käyttäen molekyylipainoa ja Life Technologies DNA kopioluvun laskin www-sivuillaan. Siten 50 fM ss DNA-fragmenttien (pituus 5000 nt) vastasi 3×10

6 molekyylejä 100 ui, tai 1×10

6 molekyylejä saman DNA-fragmentti on 100 ui näytteen vastasi pitoisuutta 16,6 fM. Kiinteä tuki, joka sisältää vastaavat sieppauskoettimen ja kohde-DNA (1 ekv.) pantiin 1,5 ml Eppendorf-putkeen, joka sisälsi 100 ui 1 x PBS-puskuria. saatua seosta kuumennettiin 10 minuutin ajan 85 ° C: ssa ja sen jälkeen jäähdytettiin huoneenlämpötilaan yli 20 min. tuki sentrifugoitiin 11,000 rpm: llä 10 minuutin ajan, ja sen jälkeen poistamalla supernatantti se pestiin 2 kertaa 100 ul: lla 1 x PBS: ssä 37 ° C: ssa. Jälkeenpäin EvaGreen väriaine (0.06-0.6X) ja vastaava signaali-parantaa koettimen (4 ekv.), Hybridisoitiin tuen (100 ui 1 x PBS, 85 ° C, 10 min, minkä jälkeen jäähdytetty RT: hen yli 20 min). Fluoresenssi signaali oli aluksi analysoitiin käyttämällä standardia laboratorio- UV-vis-lamppu. Analysointia liuoksessa ja mikroskopia, oligonukleotidit pilkottiin kantajasta käyttäen 32% vesipitoista ammoniakkia ja metyyliamiinin 1: 1 (v /v) 4 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, haihdutetaan ja uudelleen hehkutetaan läsnä EvaGreen väriaineen kuten edellä on kuvattu (0.06- 0,6 x).

Fluorometria

DNA määrät (pitoisuudet ja molekyylien lukumäärä) määritettiin käyttäen standardi UV-spektrofotometria ja Life Technologies DNA kopioluvun laskin käytettävissä kuten edellä on kuvattu. Varten hehkutus, koettimet kuumennettiin 10 minuutin ajan 85 ° C: ssa ja sen jälkeen jäähdytettiin huoneenlämpötilaan yli 20 min. Fluorometria tutkimuksissa saadut näytteet tehtiin 19 ° C: ssa 1 x PBS käyttämällä PerkinElmer LS 55 luminesenssin spektrometria varustettuna Peltier Lämpötila ohjelmoija, eksitaatio 500 nm: ssä ja tallennetaan emissio 530 nm: ssä.

Fluoresenssimikroskopia

multiphoton heräte fluoresenssimikroskopiaan mittaukset saatiin päätökseen muokattuihin multiphoton heräte mikroskooppi [19]. Lyhyesti, tavoitteena käytettiin oli 60X vesiupotukseen tavoite NA 1.29. Laser oli Ti: Sa laser (HPeMaiTai DeepSee, Spectra Physics, Mountain View, CA) ja virityksen aallonpituus käytettiin 840 nm. Fluoresenssisignaalien kerättiin kaistanpäästösuotimina Bandpass 525/35 nm (AHF ANALYSENTECHNIK AG, Saksa). Ilmaisimet olivat Hamamatsu H7422P-40 PMT: t.

Tulokset ja keskustelu

Aluksi suunnittelimme sieppauskoettimien eripituisia (9, 11 ja 18mers), joka sisältää kolme LNA Keski tehtävissä sekvenssit ( Pöytä 1). Mukaan meidän suunnittelu, yksi LNA yksiköiden oli ilmainen mahdolliseen

BRAF

V600E mutaatio (T → A) kohteena [16]. Tutkimme yksilöllisesti kumpaankin sieppauskoetinta CP1-CP3 hybridisaation kohdealueeseen verrattuna koko 3 miljardia emäsparia ihmisen genomi käyttämällä talon tietokoneohjelmiin Stanfordin yliopiston (S1 taulukko) [20]. Siten 9mer ja 11-meeristä koettimet oli useita sitoutumiskohtia genomissa, jolloin nolla, yksi tai useampia yhteensopimattomuuksia, kun taas 18-meeri-koettimia (CP3) olivat täysin spesifinen kohde. Negatiivisena kontrollina, käytimme vastaava 9mer DNA-sekvenssi soveltaa edellisessä määrityksissä, joka ei ollut ilmainen, että

BRAF

kohde (sieppauskoetinta CP4) [14].

Seuraava , CP1-CP4 valmistettiin automatisoidulla kiinteän faasin oligonukleotidisynteesiin on säädellysti huokoiseen lasiin (CPG, taulukko 1). CP1-CP3 syntetisoitiin sekä villityypin (w) ja mutantin (m) varianttien

BRAF

1790-1800 alueella (eli jotka sisältävät nukleotidit A ja T asemassa vastapäätä pohja 1799, vastaavasti). Capture koettimet joko irrotettiin CPG pidetään tai kiinteällä kantajalla synteesin jälkeen (Tukevaa tietoa). Näin saatoimme analysoivat sekä liuoksessa ja kiinteälle alustalle kuten alla on kuvattu.

Analysoimme sitomisaffiniteettien CP1-CP3 täysin toisiaan täydentäviä ja yhteensopimattomien 63 nt BRAF fragmentit liuoksessa (

T

m arvot, taulukko 1). Kuten odotettua, sisäisesti sijoitettu LNA lisäsi sulamislämpötilat kaikkien koettimien 3,0-4,5 ° C per yksi LNA sisällyttämistä. Samanaikaisesti kohdistaa spesifisyys nostettiin, koska Tm laski 10,0-11,0 ° C: ssa, kun läsnä on yhteensopimattomuus. Ei duplexes muodostettiin lämpötiloissa yli 22 ° C: n 9mer sieppauskoettimien CP1W, m. Tämä viittaa siihen, että CP1W, m antureista on suurin potentiaali syrjiä paritonta vs. täysin yhteensopivat tavoitteet. Kuitenkin tämä saattaa olla mukana spesifisyyden puute ihmisgenomiin ehdottamaa meidän koetin ainutlaatuisuus analyysi (Tukevaa tietoa). Puolestaan ​​18-meeri sieppauskoettimien osoitti korkea

T

m-arvot sekä täysin yhteensopiviin ja yhteensopimattomiin duplexes sekä 11-meeristä CP2w ja CP2m oli jokseenkin väliarvot (33,5 ° C-34,5 ° C, kun läsnä virhepariutumista). Lopuksi negatiivinen kontrolli CP4 ei osoittanut sitoutumista kohdesekvenssien.

ottaa tutkittu hybridisaatio ominaisuuksia LNA /DNA sieppauskoettimien, haimme heidät havaitsemiseen

BRAF

V600E mutaatio ihmisen genomista DNA (kuviot 2 ja 3, taulukko 2). Me määritetty, käyttämällä digitaalista PCR (tietoja ei esitetty), että ihmisen solulinjat HT29 ja LS411N oli 25,0% ja 66,7% runsaasti tavoite mutaation, vastaavasti [18]. HMC-1 DNA: ta käytettiin 100% villityypin valvonnan sillä oli mutaatio ei. Ensin ennalta rikastettua DNA käyttäen 120mer

BRAF

erityinen koetin on leimattu streptavidiini, jotka eivät ole päällekkäisiä alueella sieppauskoetinta ja siten sen universaali sekä paino- ja mut tavoitteet (kuvio 1 ja materiaalit sekä Methods;). Tämä vaihe lisääntynyt keskittyminen kohde genomin fragmentti ja samanaikaisesti parantaa spesifisyys meidän määritys samalla tavalla kuin silloin, kun sovelletaan ennen seuraavan sukupolven sekvensointi [7-8]. Toistuvassa pesuvaiheet ja irrottautuminen biotinyloidun magneettiset helmet, yksijuosteisia

BRAF

fragmentteja (7000 nt) otettiin talteen liuokseen.

Target sitoutumisspesifisyys johtuu ero sulamislämpötila (

T

m) välillä täysin yhteensopiviin ja yhteensopimattomiin sieppauskoetinta: kohde komplekseja. CPG = säädellysti huokoiseen lasiin.

(A) visualisointi

BRAF

V600E mutaatiosta kiinteään alustaan, joka sisältää sieppauskoetinta CP2m: CP2m: HT29 (14:05, putki 1), CP2m : LS411N (14:05, putki 6). Signaali saadaan laboratorio UV-vis-lamppu (viritys 365 nm) 19 ° C: ssa käyttämällä kaksikymmentäkaksi signaali parantavia koetin ja 0,6 x EvaGreen väriainetta. (B) kvantifiointi genomista

BRAF

tavoitteita fluorometrialla liuoksessa. Target titrauskäyrät saatiin täysin toisiaan ja yhteensopimattomien komplekseja (sininen ja punaiset viivat, vastaavasti) LNA /DNA sieppauskoettimien CP2w ja CP2m vastaaviin tavoitteisiin ja signaali tehostavia koetin P1: 5′- GCT A + GA CCA + AAA TCA CCT A + TT TTT ACT GTG AG + G TCT TCA TGA AGA + AAT AT-3 ’. LNA nukleotidit on merkitty plus ennen vastaavaa kirjeen.

Jälkeenpäin pre-rikastettu

BRAF

tavoitteet hybridisoitiin sieppauskoettimien CP1-CP4 suoraan kiinteään alustaan ​​[ ,,,0],11]. Sitten käytetään EvaGreen havaitsemiseen ja kvantifioimiseen kaksijuosteista DNA: ta. EvaGreen signaali kasvaa suhteellisesti määrä emäsparin muodostettu duplex [17]. Tästä huolimatta sieppauskoetinta: tavoite monimutkainen oli melko lyhyt (9-18 emäsparia). Jotta vältettäisiin heikon signaalin me ylimääräisen LNA /DNA signaali parantavia koetin ovat komplementaarisia aivan vieressä sieppauskoetinta (P1; 50 nt). Tämä koetin ei osoittanut itsensä laskostumisominaisuuksia ja sitoutunut sekä villin tyypin ja mutantti tavoitteet yleisesti (kuvio 2 ja S1 liite). Pidemmät signaali parantavia anturi johtaisi vielä suurempaa signaalin lisääntyisi kohdetta sitova. Kuitenkin LNA /DNA koettimien pituus 50 nt ovat haastavia syntetisoimiseksi ja puhdistamiseksi. Lisäksi niiden tavoite sitovia ominaisuuksia täytyy olla lisäksi arvioitava välttää vääriä positiivisia signaali johtuu esimerkiksi self-taitto (paperi valmisteilla).

Lisäksi kiinteän tukijärjestelmä pystyimme hyödyntämään

T

m ero täysin yhteensopiviin ja yhteensopimattomiin tavoite: koetinparien (taulukko 1). Yksinkertainen pesuvaihe

T

m on sopimattomasta monimutkainen antoi meille mahdollisuuden poistaa sitoutumisen paritonta järjestyksessä. Lopuksi näyte uudelleen hehkutettu läsnä ollessa signaalin parantaa koettimen P1 ja EvaGreen väriainetta (kuviot 1 ja 2).

Kiinteä tuki, joka sisältää syöpä-DNA: koetin kompleksi visualisoitiin käyttämällä tavanomaista laboratorion UV-lamppu (kuva 3 ja S2 taulukko). Kun mutantti-spesifinen sieppauskoetinta on sovellettu, läsnäolo mutantti tavoite voitiin selvästi havaita paljaalla silmällä. Tarkempia kvantifiointiin, näyte irrotettiin CPG, uudelleen lämpökäsitelty ja joutuvat analyysiin fluorometrialla (kuva 3). Arvioimme pitoisuudet villityypin ja mutantti tavoitteet syövän DNA käyttäen titrauskäyrä. Tämä on mahdollista tuottaa fluorometriaa määritys liuoksessa käyttämällä tunnettua alkuperäisestä määrästä genomista DNA: ta analyytin (mol ja molekyylien lukumäärä), ja sama reagenssien konsentraatiot, kuten kokeellisessa määrityksessä (katso materiaalit ja menetelmät). Toteamisraja (LOD) on laskettu alin kohteena pitoisuus, joka voitaisiin havaita signaali-kohinasuhteen yli 3 [14]. Niinpä loimme LOD-arvo 50 FM-genomista DNA käyttäen tavanomaisia ​​fluorometriassa (taulukko 2; katso materiaalit ja menetelmät lisätietoja laskentaan).

Kun verrataan tuloksia välillä sieppauskoettimien CP1-CP3, The 11-meeristä CP2 osoitti korkein erottelukyky yhteensopimattomien kohteiden säilyttäen hyvä sitoutumisspesifisyys (kuvio 3). Sen sijaan enää CP3 koettimet osoitti samanlaista signaalin täysin yhteensopiviin ja yhteensopimattomiin komplekseja, koska dupleksi on vielä muodostettu lämpötilan määrityksen (taulukko 1 ja S1 kuviossa). Käyttämällä CP2m olemme myös saavuttaneet korkean tarkkuuden runsaudesta kvantifiointiin solulinjan LS411N (67,2% -67,7%, kun meidän määrityksessä vs. 66,7%, kun digitaalinen PCR). Kuitenkin alempi mutantti runsautta HT29 DNA havaittiin meidän kokeessa on suurempi virheiden tasolla kuin LS411N (poikkeama ~ 8% vs. ≤ 1%, vastaavasti). Todennäköisesti tämä johtui päästöjen signaali mutantin tavoite HT29 on alle meidän luotettava LOD.

spesifisyys tunnistus varmistettiin puuttuminen fluoresenssisignaalin käytettäessä CP2m ja villin tyypin kontrolli-DNA, HMC-1 (taulukko 2). Varsinkin esirikastus- vaiheessa kasvanut dramaattisesti pitoisuus

BRAF

fragmentti näytteessä. Tämä vahvistettiin jopa 10 kertaa kohonnut ei-spesifisen signaalin, kun havaitaan ei-rikastetun HMC-1 DNA kanssa CP2m koettimen (tuloksia ei ole esitetty). Sen vuoksi päättelimme, että molemmat esirikastus- askel ja suunnittelu mutaatiokoettimen olivat välttämättömiä määritystä varten. Arvioimme tarkkuutta kohdistaminen tiettyyn

BRAF

alue on ± 1%. Ottaen huomioon suuri sekvenssikompleksisuus ihmisen genomista DNA: ta, päättelimme, että tarkkuus meidän

BRAF

geenikohdistus käyttämällä LNA /DNA-koettimia oli erittäin hyvä [10,21].

Koska lopullinen näkökulma, meillä alistetaan joukon erittäin laimeita HT29 mutantti-DNA-molekyylien havaitsemiseen fluoresenssimikroskopialla (kuvio 4). Ennen analyysiä varten ennalta rikastettu kohde-DNA, lämpökäsitelty sen CP2m kiinteälle alustalle (CPG) ja sen jälkeen lohkaistaan ​​sen CPG kuten edellä on kuvattu. Tällä menetelmällä kompleksi

BRAF

tavoite, CP2m, P1 ja EvaGreen väriaine voidaan helposti havaita ~ 1,5 fM pitoisuus mutantti-DNA, joka vastaa noin 1 x 10

5-molekyylejä 100 ui analyytin (for lisätietoja laskelma, katso materiaalit ja menetelmät). DNA: EvaGreen kompleksi nähtiin muodostavat pieniä aggregaatteja kannessa lasin pinnan noin. 1 um halkaisijaltaan. Puuttuessa P1, fluoresenssisignaali oli neljä kertaa himmennin ja ei-fluoresenssi havaittiin EvaGreen väriaine ohjaus (kuvio 4 ja S2 kuviossa). Lisäksi ei signaalia havaittu käyttäen 100% villin tyypin kontrolli DNA HMC-1 on sama asetus. Parhaan tietomme mukaan nämä LOD arvot ovat vain aiemmin raportoitu PCR-perustaiset määritykset, mutta ei mitään vahvistusta-vapaita menetelmiä. Lisäksi havaittiin signaali voitiin havaita 1000-kertaa pienempi DNA: n pitoisuuksia kuin jopa 1,5 Fm vastaten vain 100 molekyyliä 100 ui pitoisuudesta. Spekuloida, että soveltamalla tätä tekniikkaa ja lisäämällä signaalin pituutta lisäävä koetin, kuten edellä mainittiin, LOD-arvo syövän DNA voi olla paljon alle 1 aM.

(A) Complex DNA CP2m, signaalin tehostuvien koetin P1 ja EvaGreen väriaine, kirkkaita pisteitä intensiteetit yli 80 nähdään. (B) Kohde-DNA uudelleen pariutua CP2m ja EvaGreen väriaine ilman P1, tummempi pisteitä nähneet laskee jopa noin 20 (C) EvaGreen väriaineen 1XX PBS (0.06X liuos), signaalia ei havaita. Kuvat saatiin käyttäen kahta fotonin laser skannaus mikroskooppi (ex 535 + 35nm; laser @ 840); 19 ° C: ssa käyttäen 1,5 Fm syöpä DNA ja uudelleen hehkutus kanssa kaksikymmentäkaksi signaali parantavia koetin ja 0.06X EvaGreen väriainetta. Kuvat otettiin käyttäen samoja laiteasetuksia ja säätää samalla intensiteetillä kynnystä. Alla oleva kaavio kuvien näyttää viivadiagrammina linjan kuvan.

Vertaamalla meidän tapa aiemmin raportoitu genotyypitysmenetelmiä varten

BRAF

mutaatio ja toisen sekvenssin muunnelmia, kehittyneissä määritys on edullisesti alhainen hinta, aika (12 tuntia vs. enintään 1 viikko) ja kestävyyttä [9,14]. Tärkeää on, ei entsyymit, paitsi restriktioentsyymejä varten pirstoutuminen genomista DNA: ta, tarvitaan havaitsemiseen kohde-mutaation [22-24]. Tämä estää virheet, jotka tapahtuvat usein PCR tai yhdenmukaistaminen sekvenointitulosten [3,11]. Stökiömetria villityypin ja mutantti tavoitteita on myös säilynyt meidän määrityksessä, joka mahdollistaa tarkan arvion mutantti runsaus, koska raja kohteiden etsiminen vaatimus täyttyy. Aiemmin raportoitiin määrityksissä tämä voitaisiin saavuttaa käyttämällä kultananopartikkeleilla, DNAzymes tai sähköinen tunnistus [25-27]. Tässä työssä me parannella herkkyyttä kohteen havaitsemisen soveltamalla signaali parantavia antureista ja laser mikroskoopilla, joka esittelee mahdollisuuden havaita järjestyksessä vaihtelut kohde-DNA pieninä pitoisuuksina suoraan ihmisen seerumissa [28].

yhteenveto kuvaamme uusi määritys, joka mahdollistaa nopean analyysin syövän mutaatioita. Saavuttamiseksi tarvittavat spesifisyys ja herkkyys kohteen havaitsemisen, määritys yhdistää useita periaatteita: 1) kohdistaa esirikastusta käytetään pitkää, geeni-spesifinen koetin (120mer); 2) suuri sitoutumisaffiniteetti ja spesifisyys lyhyitä LNA antureista, ja 3) DNA havaitseminen korkean erotuskyvyn fluoresenssimikroskopialla. Kuten todistaa tässä työssä, yhdistelmä näiden tekniikoiden avulla analysoida nopeasti mutaatioiden syövän DNA ilman vahvistusta tai muita entsymaattisia reaktioita. Menestyksekkäästi osoittanut kuin proof-of-periaate on V600E mutaatio

BRAF

onkogeeni, tätä menetelmää voidaan soveltaa havaita muiden mutaatioiden kliinistä merkitystä (esim kodonit 12 ja 13

KRAS

geeni [29]) ja toimii yksinkertainen, luotettava menetelmä tutkimukseen, ennustetekijöitä tai terapian seurantaa kliinisissä näytteissä.

tukeminen Information

S1 Liite. Oligonukleotidisynteesiin, kuvauksesta ja lämpödenaturaatiota tutkimuksia.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0136720.s001

(DOCX) B S1 Kuva. Visualisointi syövän DNA kiinteään alustaan, joka sisältää sieppauskoetinta CP3m.

(Vasemmalta oikealle) putkiin 1-3: CP3m: HT29 (10,0, 5,0 ja 14:05), putket 3-6: CP3m: LS411N (10,0, 5,0 ja 14:05). Signaali saadaan laboratorio UV-vis-lamppu (viritys 365 nm), 19 ° C: ssa käyttämällä kaksikymmentäkaksi signaali parantavia koetin ja 0,6 x EvaGreen väriainetta.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0136720.s002

(TIF)

S2 Kuva. Fluoresenssi kuvia

BRAF

DNA-osia solulinjasta HT29.

(A) Complex DNA kanssa CP2m, signaali parantavia koetin P1 ja EvaGreen väriaine, kirkkaita pisteitä intensiteetit yli 80 nähdään. (B) Kohde-DNA uudelleen pariutua CP2m ja EvaGreen väriaine ilman P1, tummempi pisteitä nähneet laskee jopa noin 20 (C) EvaGreen väriaine 1X PBS (0.06X liuos), signaalia ei havaita. (D) Villityypin ohjaus DNA HMC-1, signaalia ei havaita.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0136720.s003

(TIF) B S1 Taulukko. Ainutlaatuisuus analyysi talteenoton ja signaali tehostavia antureista.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0136720.s004

(PDF)

S2 Taulukko. Kolorimetrinen mallin tavoitteet ja genomista DNA kiinteällä kantajalla.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0136720.s005

(PDF) B