Krooninen sairaus

tiivistelmä

askorbiinihappoa (AA) osoittaa merkittävää syövän vastaista aktiivisuutta farmakologisen annoksilla saavutettavissa parenteraalisesti, jotka ovat vähäinen vaikutus normaaleihin soluihin. Näin ollen AA on mahdollisia käyttötarkoituksia, kuten kemoterapeuttinen aine yksin tai yhdessä muiden terapeuttisten jotka on kohdistettu erityisesti syövän solujen aineenvaihduntaa. Vertasimme AA: n vaikutuksia ja yhdistelmiä AA glykolyysijärjestelmän inhibiittorin 3- (3-pyridinyyli) -1- (4-pyridinyyli) -2-propen-1-oni (3-PO) elinkelpoisuudesta kolmen ei-pienisoluisen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinjojen vaikutukset kuolemattomaksi keuhkojen epiteelisolujen linja. AA pitoisuudet 0,5 5 mM aiheutti täydellinen menetys kannattavuus kaikissa NSCLC linjat verrattuna 10% menetys elinkelpoisuuden keuhkoissa epiteelisolujen linja. Yhdistelmät AA ja 3-PO synergistisesti solukuoleman kaikissa NSCLC solulinjoissa pitoisuuksina huomattavasti alle IC

50 pitoisuuksia kunkin yhdisteen yksinään. Synergistinen vuorovaikutus ei havaittu yhdistelmähoidot keuhkojen epiteelisolujen ja yhdistelmä hoitoja, jotka aiheuttivat täydellisen menetyksen elinkelpoisuuden NSCLC soluissa oli vähäinen vaikutus normaali keuhkojen solujen elinkelpoisuuden ja reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) tasot. Yhdistelmä hoidot indusoi merkittävästi suurempi ROS tasoilla verrattuna hoitoon AA ja 3-PO yksin NSCLC soluissa ja yhdistelmä-solukuolema estyi lisäämällä katalaasia väliaineen. Analyysit DNA-fragmentaation, poly (ADP-riboosi) polymeraasin pilkkominen, anneksiini V-sitovia, ja kaspaasiaktiivisuus osoittivat, että AA-solukuolema johtuu aktivaation kautta apoptoosin ja että yhdistelmähoidot aiheuttama synergistinen apoptoosin induktiota. Nämä tulokset osoittavat tehokkuutta AA vastaan ​​NSCLC-soluja, ja että yhdistelmät AA 3-PO synergistisesti indusoida apoptoosia kautta ROS-riippuvaisen mekanismin. Nämä tulokset tukevat edelleen arviointia farmakologisen pitoisuuksien AA adjuvanttina hoito NSCLC ja että yhdistelmä AA Glykolyysivaiheen inhibiittorit saattavat olla lupaava hoito hoitoon NSCLC.

Citation: Vuyyuri SB, Rinkinen J, Worden E, Shim H, Lee S, Davis KR (2013) askorbiinihappo ja Sytostaattiset estäjä Glykolyysi synergistisesti apoptoosin indusoimiseksi ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 8 (6): e67081. doi: 10,1371 /journal.pone.0067081

Editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 marraskuu 2012; Hyväksytty: 15 toukokuu 2013; Julkaistu: 11 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Vuyyuri et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoittajat: Osia tämän projektin olivat mahdollisia sopimus, joka tehtiin ja hallinnoi Yhdysvaltain armeijan Medical Research Materiaalilaitoksen (USAMRMC) ja Telelääketiede Advanced Technology Research Center (TATRC), alle Sopimuksen numero: W81XWH-09-2-0022. Näkemykset, mielipiteitä ja /tai havainnot sisältyvät tähän tutkimukseen ovat kirjoittajien omia eivätkä välttämättä edusta puolustusministeriön ja ei pidä tulkita viralliseksi DoD /armeijan asema, politiikka tai päätöstä, ellei tätä tarkoittava muut dokumentointi. Ei virallinen hyväksyntä olisi. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tähän tutkimukseen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ainutlaatuinen piirre monissa kasvainsoluissa on lisääntynyt glukoosin oton ja koholla aerobinen Glykolyysivaiheen kanssa kaventumiseen oksidatiivisen fosforylaation kautta trikarboksyylihappo (TCA) kierto. Tämä merkittävä metabolinen uudelleenohjelmointia, joka tunnetaan nimellä Warburg vaikutus [1], on potentiaalinen kohde estämään kontrolloimaton solujen lisääntymisen, joka on tunnusomaista syöpään. Alkuperäinen selityksiä riippuvuus syöpäsolujen aerobista Glykolyysivaiheen ehdotti, että syöpäsolut sisälsivät vialliset mitokondrioita ja siten, parannettu Glykolyysivaiheen vaadittiin tuottamaan ATP ajaa solujen lisääntymistä. Kuitenkin nyt tiedetään, että suurin syöpäsolut ovat toiminnallisia mitokondrioita, ja että aineenvaihdunnan muutoksiin liittyy Warburg vaikutus on suunnattu tarjoamaan biosynteettisiä prekursoreita aminohappoja, nukleotideja ja lipidejä [1], [2]. Lisäksi ajo lisääntynyt glykolyysin, parannettu glukoosin ominaista monien syöpäsolujen tukee lisääntynyt vuon kautta Pentoosi fosfaatin shuntti ja tuotanto riboosi-5-fosfaattia nukleotidibiosynteesiin. Ehkä vielä tärkeämpää, lisäsi vuon kautta Pentoosi fosfaatin shuntti voi lisätä määrää NADPH tukemiseen käytettävissä aineenvaihdunnan aktiivisuutta ja suojaavat oksidatiivisen stressin. Muita NADPH ja biosynteettisten esiasteita valmistetaan katabolian glutamiini [3]. Siten Warburg vaikutus edellyttää erittäin koordinoitua valvontaa Glykolyysivaiheen, Pentoosifos- fosfaatti shuntti, glutaminolysis ja mitokondrioiden TCA sykli.

Ainutlaatuinen riippuvuus syöpäsoluja on Glykolyysivaiheen tekee niistä haavoittuvia hoitointerventio erityisiä Glykolyysivaiheen estäjiä. Useat glykolyyttiset entsyymit, kuten heksokinaasi II, laktaattidehydrogenaasin A, ja glukoosi-6-fosfaatti-isomeraasi, on yli ilmaistaan ​​kasvainsoluissa ja toimia sekä edistäjinä ja säätelijöinä syövän etenemisessä [4], [5]. Eri osien glykolyyttisellä reitin on suunnattu hoitojen kehittäminen vaikka hyvin harvat on arvioitu kliinisissä tutkimuksissa. 2-deoksi-D-glukoosi (2-DG), 3-bromipyruvaattia ja lonidamiini on raportoitu olevan käyttökelpoisia glykolyyttisissä estäjiä kohdistaminen heksokinaasilla, merkintä pisteen entsyymin Glykolyysivaiheen [5], [6]. 3-bromipyruvaattia estää myös glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) [6] ja tuoreessa tutkimuksessa todettiin, että 3-bromipyruvaattia propyyliesteri oli tehokkaampi inhibiittori GAPDH verrattuna heksokinaasin kolorektaalikarsinoomasta soluissa [7]. Toinen keskeinen glykolyyttisissä entsyymi ilmentyy runsaasti kasvainsoluissa on 6-phosphofructo-2-kinaasi /fruktoosi-2,6-bisphosphatase isotsyymi 3 (PFKFB3), joka generoi fruktoosi-2,6-bisfosfaatin (Fru-2,6-BP). Fru-2,6-BP vapauttaa tukahduttamisesta avaimen nopeutta rajoittava entsyymi 6-phosphofructo-1-kinaasin ATP, mikä mahdollistaa korkeat Glykolyysivaiheen läsnäollessa korkeita ATP-tasot [8]. Pienmolekyylisalpaajilla PFKFB3 on tunnistettu ja osoitettu estävän kasvainsolujen kasvua [9], [10]. Nämä uudet inhibiittorit edustavat uutta luokkaa Glykolyysivaiheen estäjien ja edelleen vahvistaa glykolyysiin estäjien mahdollisina syöpähoitojen, [4], [11].

Huolimatta riippuvuutta syöpäsolujen on Glykolyysivaiheen ATP sukupolvi, estämällä Glykolyysivaiheen käyttäen glykolyyttisissä estäjiä ei useinkaan osoittautuvat tappaa tehokkaasti tuumorisoluja esimerkkeinä useita

in vivo

kokeissa [4], [5], [12] – [18]. Tämä viittaa siihen, että strategiat, joilla pyritään estämällä Glykolyysivaiheen saattaa edellyttää useita ATP heikentäviä aineita, joilla on erilaiset vaikutusmekanismit [16] tai että Glykolyysivaiheen estäjiä tulee pariksi muiden kasvaimeen erityisiä aineenvaihdunnan estäjiä. Tämä lähestymistapa on osoittautunut onnistuneeksi useissa tapauksissa [12] – [15], [17], [18], mikä viittaa siihen, että yhdistelmä hoitoja glykolyyttisissä estäjiä pariksi muiden syöpälääkkeiden voisi olla erittäin voimakas klinikalla.

askorbiinihappoa (AA) on osoitettu olevan syöpää terapeuttista potentiaalia; Tähän mennessä sen terapeuttista arvoa edelleen kiistanalainen [19] – [23]. Pienemmillä pitoisuuksilla, AA toimii pääasiassa antioksidanttina ja voi suojata soluja oksidatiivista stressiä kun taas korkeammilla pitoisuuksilla AA toimii pro-hapetin, joka asettaa oksidatiivista stressiä ja indusoi solukuoleman [20], [23] – [27]. On todennäköistä, että tämä pitoisuus riippuvainen dual luonne AA on perustana ristiriidassa tehoa AA syövän hoidossa, sillä ainoastaan ​​farmakologisen pitoisuudet AA korkeampia kuin ne, jotka voidaan saada suun kautta todennäköisesti aiheuttavat syöpää ehkäisevistä vaikutuksista [28]. AA on osoitettu olevan selektiivisesti lisää myrkyllisiä syöpäsoluja verrattuna vastaaviin normaaleihin soluihin [29] – [32]. Merkittävä osa tästä selektiivinen sytotoksisuus on kyky farmakologisen pitoisuuksien AA asettaa oksidatiivista stressiä syöpäsolujen kautta sukupolven ROS ja vetyperoksidia [33] – [35]. Koska syöpäsolut yleensä korkeampi reaktiivisen hapen, näyttää siltä, ​​että lisäksi oksidatiivisen stressin asettamat AA ei voida lievittää solujen antioksidantti vastauksista ja solukuolemaa laukeaa [36]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että yhdistelmät AA muiden syöpälääkkeiden esiintyy usein tehostetun sytotoksisuuden [34], [37] – [40].

Tässä tutkimuksessa totesimme, että AA on selektiivisesti myrkyllinen useita ei-pieni keuhkosyöpä (NSCLC) solulinjoja, ja että yhdistelmä AA ja 3- (3-pyridinyyli) -1- (4-pyridinyyli) -2-propen-1-oni (3-PO), uusi estäjä PFKFB3 merkittäviä syövän vastaista aktiivisuutta [9], synergistisesti indusoi apoptoosia NSCLC soluissa.

tulokset

AA ja 3-PO synergistisesti kasvun eston NSCLC solulinjojen mutta ei keuhkoputken epiteelisolujen

Edellinen tutkimukset osoittivat, että AA-selektiivisesti vähentää solujen lisääntymistä joissain syöpäsolulinjoissa vaikuttamatta normaaleihin soluihin [29] – [32]. Käynnistimme tutkimuksia onko tämä todellakin koskee NSCLC-solujen ja onko yhdistelmät AA kanssa glykolyyttisissä estäjä 3-PO olivat tehokkaampia kuin AA yksin. Alustavat tutkimukset saatiin päätökseen määrittämään IC

50 AA ja 3-PO kolmessa NSCLC solulinjoissa (H1299, H661, ja A549) ja kuolemattomaksi keuhkojen epiteelisolujen linja (BEAS-2B) käyttämällä trypaanisinieksluusiolla solujen elävyyden määritys. 24 h IC

50 pitoisuudet AA kolmessa NSCLC riviä vaihteli 0,57 to1.71 mM, kanssa H1299 on kaikkein herkin (Fig. 1A). Beas-2B solut olivat paljon suvaitsevainen AA hoitoa, jossa IC

50 pitoisuus 20 mM (Fig. 1 C). Nämä tulokset osoittivat, että NSCLC-solut ovat huomattavasti herkempiä AA verrattuna BEAS-2B keuhkon epiteelisolujen. 24 h IC

50 pitoisuudet 3-PO kolmessa NSCLC riviä vaihteli 25-67 uM, jossa H1299 jälleen on kaikkein herkin (Fig. 1 B). IC

50 pitoisuuden BEAS-2B-soluissa oli 105 uM, mikä osoittaa, että kuolemattomaksi keuhkojen epiteelisolujen oli 1,5-4,2 kertaa enemmän resistenttejä 3-PO verrattuna NSCLC soluihin.

(A) solujen elinkelpoisuus NSCLC H1299, H661 ja A549-solut funktiona AA pitoisuus. (B) Solujen elinkelpoisuus NSCLC H1299, H661 ja A549-solut funktiona 3-PO pitoisuus. (C) Cell elinkelpoisuus NSCLC H1299 solujen ja BEAS-2B keuhkon epiteelisolujen hoidon jälkeen AA yksin ja yhdistelmät AA 10pM 3-PO. Soluja käsiteltiin 24 tuntia ja arvosteltiin sitten käyttäen trypaanisiniekskluusiolla elinkyvyn ja normalisoitiin sopiva apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään. Tiedot edustavat keskiarvo ± keskiarvon määrätietoisesti kolmesta yksittäisestä kokeesta. IC

50 arvot laskettiin käyttäen GraphPad Prism-ohjelmiston.

vieressä tutkineet vaikutuksia yhdistelmiä AA ja 3-PO elinkelpoisuudesta herkimpiä solulinjaa H1299 verrattuna BEAS- 2B. Näitä kokeita varten, soluja käsiteltiin 10 uM 3-PO, ja pitoisuudet AA vaihtelevat 0,1-20 mM. Yhdistelmä hoidot AA ja 3-PO ei ollut merkittävää vaikutusta elinkelpoisuudesta BEAS-2B-soluista pitoisuusalueilla testataan suurin väheneminen elinkelpoisuutta 18% ± 1,3 havaittiin 20 mM AA /10 uM 3- PO hoitoon (Fig. 1 C). Drewinko Index (DI) arvot kaikille AA ja 3-PO yhdistelmiä testattiin BEAS-2B vaihteli 1,0-1,1, mikä osoittaa, että vaatimaton kannattavuus havaitut muutokset johtuivat lisäaineen vaikutuksia 3-PO ja AA. Sen sijaan yhdistelmä hoidot olivat merkittävästi tehokkaampia tappaa H1299 soluissa verrattuna AA yksin (Fig. 1 C). Hoito 300 uM tai 500 uM AA yksin laski solujen elinkelpoisuuden 15,3% ja 26,3%, tässä järjestyksessä, kun taas läsnä ollessa 10 uM 3-PO, 300 uM ja 500 uM AA vähennetään elinkelpoisuutta 84% ja 96%, vastaavasti. Yhdistelmä hoito IC

50 oli 3 kertaa pienempi kuin IC

50 AA yksin H1299. DI arvot varten yhdistelmähoidot sisälsi 300 uM ja 500 uM AA olivat 4,9 ja 18,7, vastaavasti, ja osoittamaan vahvaa synergistisen vuorovaikutuksen AA ja 3-PO.

Voit selvittää, samanlainen synergistinen vuorovaikutus AA ja 3-PO esiintynyt muissa NSCLC linjat, solujen elinkelpoisuuden verrattiin BEAS-2B, H1299, H661 ja A549-soluja käsiteltiin 300 uM AA, 10 uM (BEAS-2B, H1299) tai 30pM 3-PO (H661, A549) tai yhdistelmä AA 3-PO yli 72 tunnin ajan käsittelyn jälkeen. Kuten aiemmin havaittu, nämä hoidot olivat vaatimattomia vaikutuksia elinkelpoisuudesta BEAS-2B-soluja (kuvio. 2A). Suurin menetys elinkelpoisuuden BEAS-2B tapahtui 72 tunnin ja oli 30% yhdistelmällä hoitoa. DI arvot yhdistelmähoito hoitojakson aikana vaihteli 1,0-1,1, joka vahvistaa, että ei ole olemassa synergistinen vuorovaikutus AA ja 3-PO in BEAS-2B-soluja. Sen sijaan yhdistelmiä AA ja 3-PO synergistisesti tappoi kaikki kolme NSCLC riviä, jolla on huomattava (

P

0,05) synergistinen (DI 1) vaikutukset selvästi nähtävissä yli 72 tunnin hoitojakson aikana (Fig. 2B-D). Vaikutukset yhdistelmän hoidon H1299 ja H661 olivat samanlaisia, ja että lähes täydellinen menetys elinkelpoisuuden 72 tuntia. A549-solut olivat herkempiä yhdistelmähoidon, jossa on lähes täydellinen menetys elinkelpoisuutta 48 tuntia. DI arvot yhdistelmähoito 72 tunnin vaihteli 22,2-62,6 kolmelle NSCLC riviä, mikä osoittaa vahvan synergistinen vuorovaikutus. Nämä tulokset osoittavat, että yhdistelmä AA ja 3-PO synergistisesti indusoi solukuolemaa useissa NSCLC linjat ja vahvistaa, että samanlaista vuorovaikutus ei esiinny keuhkoissa epiteelisolulinja BEAS-2B.

Lung epiteelisolujen BEAS- 2B (A) ja NSCLC-soluja H1299 (B), H661 (C), ja A549 (D) käsiteltiin 300 uM AA yksin, 10 uM (BEAS-2B, H1299) tai 30 uM (H661, A549), 3-PO yksin tai yhdistelmänä AA ja 3-PO. Kontrollisoluja käsiteltiin pelkällä vehikkelillä. 24, 48 ja 72 tuntia hoidon jälkeen, solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttämällä trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä. Tiedot edustavat keskiarvo ± keskiarvon määrätietoisesti kolmesta yksittäisestä kokeesta. A; tilastollisesti merkittävää eroa (

P

0,05) ajoneuvon käsitelty kontrolli. b; tilastollisesti merkittävää eroa (

P

0,05) kontrollista ja yksittäisten AA ja 3-PO hoitoja. Drewinko Index (DI) arvot laskettiin käyttäen kaavaa SF1 x SF2 /SF1 + 2 jossa SF1, SF2 ja SF1 + 2 ovat eloonjääntifraktio käsiteltyjen solujen AA yksin, 3-PO yksin, ja yhdistelmä AA ja 3- PO, vastaavasti. DI arvot 1 osoittaa synergististä vaikutusta, DI = 1 osoittaa additiivista vaikutusta; ja DI arvot 1 osoittaa antagonistista vaikutusta.

Todettuaan, että AA ja 3-PO aiheuttaa synergistisen induktion solukuoleman NSCLC solulinjoissa, me tutki tarkemmin vuorovaikutusta eri AA ja 3-PO pitoisuudet H1299-soluissa (kuvio. 3A). Pitoisuudet 1-10 uM 3-PO ei ollut merkittävää vaikutusta kannattavuuteen H1299 soluja, kun taas 30 uM 3-PO aiheutti 60% menetyksen elinkelpoisuutta. Pitoisuudet AA 50-500 uM osoitti annoksesta riippuvaa vähenemistä elinkelpoisuutta, 500 uM aiheuttaa 40% menetys elinkelpoisuutta. Merkittävä synergistinen vaste havaittiin H1299-soluista monilla eri AA ja 3-PO yhdistelmät (Fig. 3B, taulukko 1). Yhdistelmiä 100, 300 ja 500 uM AA pitoisuudet 3-PO ≥ 3 uM aiheuttaman synergistisen induktion solukuoleman [Combination Index (CI) 1]. Yhdistelmä hoito, joka sisältää 50 uM 30 uM 3-PO myös aiheutti merkittävän synergistisen vaikutuksen, joka johti 90% solukuolema (CI = 0,16). Useat yhdistelmähoidot aiheuttivat vain lisäaineen vaikutuksia tai mahdollisesti antagonistiset vuorovaikutukset (CI 1). Kuitenkin nämä tapaukset havaittiin vain yhdistelminä, jotka sisältävät alimman AA ja 3-PO testikonsentraatioiden; nämä pitoisuudet 3-PO ja AA yksin aiheutti alle 5% menetys elinkelpoisuutta. Nämä tulokset osoittavat yhdistelmät AA ja 3-PO pitoisuuksina yli 20-kertaa pienempi kuin niiden IC

50 johti synergistinen solukuoleman induktioon ja lähes täydellinen menetys NSCLC H1299 solujen elinkelpoisuuden.

(A) Solujen elinkelpoisuus funktiona 3-PO-pitoisuus yhdessä AA pitoisuuksina 50-500 uM. (B) Normalized isobologrammia kunkin 3-PO: n ja AA yhdistelmät testattu. H1299-soluja käsiteltiin 3-PO (1, 3, 10, 30 uM) yksin tai yhdessä eri pitoisuuksien kanssa AA (25, 50, 100, 300 tai 500 uM). Solujen elinkelpoisuus arvioitiin 24 h käsittelyn jälkeen käyttäen trypaanisinieksluusiolla elinkelpoisuuden määrityksessä. Tiedot edustavat keskiarvo ± keskiarvon määrätietoisesti kolmesta yksittäisestä kokeesta. Isobologram- data kertyi CalcuSyn- ohjelmiston ei-vakio suhde menetelmällä ja tiedot on esitetty (A). Symbolit osoittavat saadut arvot yhdistelmähoitojen sisältävä osoitettu pitoisuus AA.

panos ROS ja H

2O

2 mekanismin solukuoleman induktio yhdistelmillä AA 3-PO

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ROS ja H

2O

2 tuotetaan hapettumista AA on ratkaiseva välittäjäaine AA aiheuttaman sytotoksisuuden [29], [31], [ ,,,0],33], [41], [42]. Olemme arvioineet merkitys ROS tuotannon herkkyyttä NSCLC solujen yhdistelmille AA ja 3-PO käsittelemällä BEAS-2B ja H1299 solujen yhdistelmällä 10pM 3-PO 300 uM AA ja mittaamalla solujen fluoresenssin ROS toimittaja 5- (ja-6) -chloromethyl-2 ’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diasetaatti, asetyyli esteri (CM-H

2DCFDA). ROS tasot olivat ei vaikuttanut merkittävästi BEAS-2B soluihin joko AA tai 3-PO yksin yli 4 tunnin hoitojakson aikana, tai yhdessä hoitojen 2 h tai vähemmän. Ainoa tilastollisesti merkitsevä (

P

0,05) vaikutus havaittiin BEAS-2B soluissa tapahtui yhdistelmällä hoitoa 4 h, jos 51%: n nousu ROS havaittiin (Fig. 4A ja kuvio. S1). Merkittävä (

P

0,05) lisäystä ROS tasoilla havaittiin jo 15 min H1299 soluissa käsitelty joko AA tai yhdistelmä 3-PO ja AA, jossa yhdistelmähoidon tason ollessa noin 2 kertaa suurempi kuin AA yksinään (Fig. 4B ja kuva. S1). ROS tasoilla AA-käsitellyissä soluissa jatkoivat nousuaan maltillisesti ja oli 4 kertaa suurempi kuin apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään 4 tuntia. 3-PO indusoi myös alhainen ROS tuotannon välillä 1 ja 4 h hoito, joka oli 2-kertaa suurempi kuin kontrolli. Sen sijaan yhdistelmä indusoi paljon suurempi ROS tasolle, että se saavutti huippunsa 2-4 tuntia; nämä tasot olivat 13 kertaa korkeammat kuin kontrollilla ja huomattavasti suurempi kuin summa vaikutuksia yksittäisten AA ja 3-PO hoitoja. ROS-tasot H1299-solujen 4 h oli 7-kertaa suurempi kuin yhdistelmä-käsitelty BEAS-2B-soluja. Nämä tulokset osoittavat, että yhdistelmät, AA: n ja 3-PO indusoivat selektiivisesti korkea ROS H1299 verrattuna BEAS-2B, ja viittaavat siihen, että ROS tuotanto on osa synergistisen induktion yhdistelmä-solukuolema havaittiin NSCLC-soluja.

BEAS-2B (A) ja H1299 (B) soluja käsiteltiin joko AA (300 uM), 3-PO (10 uM) tai yhdistelmä AA ja 3-PO varten ilmoitettu kertaa. Solut värjättiin 5 uM CM-H

2DCFDA 37 ° C: ssa pimeässä 30 minuutin ajan havaita solunsisäistä ROS. Tiedot edustavat keskiarvo ± keskiarvon kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta, jossa 100-125 solua näytettä kohti analysoitiin fluoresenssin intensiteettiä. A; tilastollisesti merkittävää eroa (P 0,05) ajoneuvon käsiteltyyn kontrolliryhmään. b; tilastollisesti merkitsevä ero (P 0,05) kontrollista ja yksittäisten AA ja 3-PO hoitoja.

määrittämiseksi, missä määrin H

2O

2 välittämää vaikutusta AA herkistettäessä NSCLCs 3-PO, H1299-soluja käsiteltiin yhdistelmällä 10 uM 3-PO 300 uM AA joko läsnä tai poissa ollessa katalaasin viljelyalustassa. Merkittävä (

P

0,05) annoksesta riippuvainen käänteinen sytotoksista vaikutusta AA ja 3-PO yhdistelmä havaittiin yli pitoisuusalueella 25-1500 yksikköä katalaasia (Fig. 5A). Pelastus katalaasi ollut täydellinen; estyminen solukuoleman tasaantui at -80% elinkelpoisuutta. Rooli H

2O

2 välittämisessä synergistinen aktivoituminen solukuoleman yhdistelmällä AA ja 3-PO testattiin edelleen esi-inkuboimalla soluja amitrolilla tunnettu katalaasi estäjä, ennen hoitoa AA ja 3-PO. Merkittävä (

P

0,05) annosriippuvainen parantamiseksi solukuolemaa verrattuna amitrolilla yksin havaittiin yli amitrolilla pitoisuusalueella 30-100 uM (kuvio. 5B). Tämä osoittaa, että inhibitio endogeenisen katalaasin aktiivisuutta lisää synergistisen solukuoleman induktioon yhdistelmä AA ja 3-PO. Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat mekanistinen merkitys H

2O

2 synergistisen induktion solukuoleman NSCLC soluissa yhtäaikainen käsittely AA ja 3-PO.

(A) vähennys yhdistelmä-solukuolema lisäämällä katalaasia viljelyalustaan. H1299-soluja käsiteltiin joko AA yksinään (300 uM), 3-PO yksinään (10 uM), yhdistelmä AA ja 3-PO, katalaasia yksinään (25, 50, 100, 200, 500, 1000, 1500 IU), tai yhdistelmiä AA, 3-PO ja katalaasia. (B) lisääminen yhdistelmänä solukuolema lisäämällä katalaasia inhibiittorin aminotriatsolin (ATA) viljelyalustaan. H1299-soluja käsiteltiin joko AA yksinään (300 uM), 3-PO yksinään (10 uM), yhdistelmä AA ja 3-PO, ATA yksinään (30, 50, 100 uM), tai niiden yhdistelmiä, AA, 3-PO ja ATA. Solut arvioitiin 24 h käsittelyn jälkeen käyttäen trypaanisinieksluusiolla elinkelpoisuuden määrityksessä. Tiedot edustavat keskiarvo ± keskiarvon määrätietoisesti kolmesta yksittäisestä kokeesta. A; tilastollisesti merkittävää eroa (

P

0,05) ajoneuvon käsitelty kontrolli. b; tilastollisesti merkittävää eroa (

P

0,05) kontrollista ja yksittäisten AA ja 3-PO hoitoja. c; tilastollisesti merkittävää eroa (

P

0,05) AA ja 3-PO yhdistelmähoitoon.

yhdistelmä AA ja 3-PO indusoi apoptoosia NSCLC Solut

mikroskooppinen tarkastelu NSCLC käsiteltyjen solujen yhdistelmiä AA ja 3-PO paljasti, että käsitellyissä soluissa näytteillä klassinen morfologiset muutokset liittyvät apoptoosin kuten solun kutistuminen, kupliminen ja muodostumista apoptoottisten kappaleiden. Tutkia tarkemmin, ovatko synergistisen induktion solukuoleman NSCLC soluissa yhdistelmä 3-PO ja AA oli todellakin johtuu apoptoosin, arvioimme DNA pirstoutuminen, tunnusmerkki solujen apoptoosin. DNA pirstoutuminen mitattiin ensin käyttäen comet in NSCLC H1299 soluissa ja BEAS-2B keuhkon epiteelisolujen käsitelty AA tai 3-PO yksinään ja yhdistelmänä (Fig. 6A ja B). Hoito 10pM 3-PO yksinään ei aiheuttanut merkittävää kasvua DNA pirstoutuminen joko solulinjassa taas 300 uM AA aiheutti vaatimaton, mutta merkittävä (

P

0,05) lisäystä sekä BEAS-2B ja H1299-solujen 24 tunnin käsittelyn jälkeen. Yhdistelmä 3-PO ja AA eivät aiheuta merkittävästi DNA pirstoutuminen BEAS-2B soluja kuin on havaittu soluissa käsitelty AA yksin. Sen sijaan, määrä DNA: n fragmentoituminen havaittiin H1299-soluissa oli merkittävästi (

P

0,05) suurempi yhdistelmähoidon (75,02 ± 2,29) verrattuna yksittäisten hoitojen ja ohjaus (AA 25,63 ± 2.38, 3-PO 19,63 ± 2,24, valvoa 17,96 ± 1,66) ja oli merkittävästi suurempi kuin summa vaikutuksia yksittäisten AA ja 3-PO hoitoja.

(A) Comet määritys kuvia BEAS-2B keuhkoepiteelin solut ja H1299-soluja käsiteltiin joko AA (300 uM), 3-PO (10 uM), tai yhdistelmä AA ja 3-PO. Soluja käsitellään 24 tuntia käsittelyn jälkeen ja vehikkelillä käsiteltyjä soluja sisällytettiin kontrollina. (B) määrän määritys DNA pirstoutumista havaitsee komeetan määritys BEAS-2B keuhkon epiteelisoluissa ja H1299 soluja käsiteltiin joko AA, 3-PO, tai yhdistelmä AA ja 3-PO. Soluja käsitellään 24 tuntia käsittelyn jälkeen. Mean komeetta hännän pituus tiedot ovat keskiarvo ± keskiarvon määritettiin kolmen erillisen kokeen olivat hännän pituus 150 solua per käsittely mitattiin kussakin kokeessa. (C) määrän määritys DNA: n fragmentoituminen TUNEL määrityksiä. H1299-soluja käsiteltiin joko AA (300 uM), 3-PO (10 uM), tai yhdistelmä AA ja 3-PO varten ilmoitettu kertaa. TUNEL positiiviset solut tunnistettiin käyttämällä DeadEndTM Fluorometric TUNEL System. Data edustaa keskiarvoja ± SEM kaksi erillistä koetta, joissa on vähintään 100 solua näytettä kohden visualisoitiin kussakin kokeessa. A; tilastollisesti merkittävää eroa (P 0,05) ajoneuvon käsiteltyyn kontrolliryhmään. b; tilastollisesti merkitsevä ero (P 0,05) ajoneuvon käsitellään ohjaus ja yksittäisten AA ja 3-PO hoitoja.

Lisätutkimukset DNA pirstoutuminen H1299-soluissa tehtiin käyttämällä terminaalista deoksinukleotidyylitransferaasia dUTP nick end merkinnät ( TUNEL) määrityksessä arvioimaan kinetiikka DNA-fragmentaation aikana ensimmäisten 24 tunnin aikana (Fig. 6C). Vaatimaton mutta merkittävä (

P

0,05) kasvaa DNA: n fragmentoituminen havaittiin soluissa, joita käsiteltiin joko AA tai 3-PO yksin alkaen 4 ja 12 h. 24 tunnin kuluttua hoidon määrä, DNA: n fragmentoituminen havaittiin AA-käsitellyn ja 3-PO-käsiteltyjä soluja oli 6-kertainen ja 2,5-kertainen, vastaavasti, verrattuna vehikkelillä käsiteltyyn kontrolliryhmään. Yhdistelmä AA ja 3-PO indusoi merkittävästi suurempi (

P

0,05) taso DNA pirstoutuminen verrattuna kontrolliin ja yksittäisten hoitojen jo 2 tuntia hoidon jälkeen. DNA: n fragmentoituminen yhdistelmänä-käsitellyissä soluissa alkoi tasaantua 12 h hoidon jälkeen, ja se oli 20-kertaa suurempi kuin ohjain 24 h käsittelyn jälkeen. Taso DNA: n fragmentoituminen havaittiin yhdistelmä-käsiteltyjä soluja kaikissa testattuina ajankohtina oli myös huomattavasti suurempi kuin summa vaikutuksia yksittäisten AA ja 3-PO hoitoja. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​comet tutkimukset ja viittaavat siihen, että apoptoosin induktio on osa yhdistelmä-indusoidun solukuoleman H1299-soluissa.

arvioida tarkemmin, jos solukuolema yhdistämällä AA ja 3- PO liittyi apoptoosin, tutkimme laajuus PARP pilkkominen. PARP on 116 kDa stressi-vastaus proteiinin mukana korjaus vaurioitunut DNA ja säätelee kromatiinirakenteeseen poly (ADP-ribosylaatiota) ydinvoiman proteiineja. Proteolyyttisen PARP osaksi 89 kDa ja 24 kDa fragmenteista caspases on osoitus apoptoosin [43]. Tasot pilkkoa PARP mitattiin immunoblottauksella solulysaateista 24 h käsittelyn jälkeen 300 uM AA, 10 uM 3-PO tai yhdistelmä AA ja 3-PO 24 h (Fig. 7A ja B). Käsittely 3-PO yksinään ei aiheuttanut merkittävää kasvua lohkaistaan ​​PARP (89 kDa fragmentti). Nostamalla kertyminen pilkkoa PARP havaittiin soluissa, joita käsiteltiin AA yksinään tai yhdistelmän AA ja 3-PO, joka oli merkitsevästi (

P

0,05) korkeampi kuin ajoneuvon hallintaan. Laajuus PARP pilkkominen soluissa käsitelty yhdistelmällä AA ja 3-PO oli merkitsevästi (

P

0,05) korkeammat kuin käsitellyissä soluissa AA yksin.

(A) H1299 soluja käsiteltiin joko AA (300 uM), 3-PO (10 uM), tai yhdistelmä AA ja 3-PO. Solut kerättiin talteen 24 h käsittelyn jälkeen ja proteiinin uutteita alistettiin immunoblot-analyysillä käyttäen PARP-spesifistä vasta-ainetta. Monista immunobloteilla koetettiin aktiinia spesifistä vasta-ainetta toimi normalisointi valvontaa. (B) kvantitointi tasot pilkkoa PARP (Cl PARP) tehtiin käyttäen kuva-analyysi immunoblot käyttämällä Carestream Molecular Imaging Software versio 5.0. Intensiteetti mitat esitetään edustavat keskiarvoja ± SEM määritettiin kolmen erillisen kokeen. A; tilastollisesti merkittävää eroa (

P

0,05) ajoneuvon käsitelty kontrolli. b; tilastollisesti merkittävää eroa (

P

0,05) kontrollista ja yksittäisten AA ja 3-PO hoitoja.

Yksi varhaisista tapahtumista apoptoosin liittyy translokaatio fosfatidyyliseriinin pintaan solun, joka voidaan havaita käyttäen analyyseillä, jotka perustuvat anneksiini V: n sitoutumisen. Näin ollen edelleen arvioida, onko solukuolema in H1299-soluissa yhdistelmä hoitoja AA ja 3-PO johtuu apoptoosin, käsiteltyjä soluja analysoitiin anneksiini V: n sitoutumisen ja propidiumjodidivärjäys mitata alussa apoptoottinen (anneksiini V + /propidiumjodidin -) ja myöhäinen apoptoottiset (anneksiini V + /propidium- idodide +) solupopulaatioiden (Fig. 8A ja B). Hoito 10pM 3-PO yksinään ei ollut merkittävää vaikutusta määrään aikaisin tai myöhään apoptoottiset solut kontrolliin verrattuna. Hoito 300 uM AA indusoi merkittävän (

P

0,05) asteittainen kasvu sekä varhainen ja myöhäinen apoptoottisia soluja. Varhainen apoptoottisia soluja havaittiin heti 15 min käsittelyn jälkeen ja saavutti enintään 29%: iin 3 h jälkikäsittelyä. Prosenttiosuus alussa apoptoottisten solujen vähentynyt 4 tuntia. Samanlainen kertymisen myöhään apoptoottisten solujen tapahtui AA-käsitellyissä soluissa yli 4 h hoitojakson aikana, ja ensimmäinen havaittavissa merkittävä ero valvonta havaittu 30 min ja saavutti 18% 4 h. Yhdistelmä hoito oli myös asteittainen nostaminen alussa apoptoottisten solujen 15 min 3 h, kuitenkin prosenttiosuus varhaisen apoptoottisten solujen oli huomattavasti korkeampi kuin mitä havaittiin AA yksin ja saavutti enintään 56%: iin 3 h jälkikäsittelyä. Samanlainen AA yksin käsittelyn määrä alussa apoptoottisten solujen laski samanaikainen kasvu myöhään apoptoottisten solujen 4 h. Prosenttiosuus myöhään apoptoottisten solujen 4 h hoidon jälkeen oli 50% ja oli merkitsevästi (

P

0,05) suurempi kuin 26% havaittiin soluissa, joita käsiteltiin AA yksin.

( A) analyysi varhaisen apoptoottisten solujen ja (B) myöhäinen apoptoottiset solut anneksiini V: n sitoutumisen ja propi- idodide värjäystä. H1299-soluja käsiteltiin joko AA (300 uM), 3-PO (10 uM) tai yhdistelmä AA ja 3-PO varten ilmoitettu kertaa. Sitten solut värjättiin anneksiini-V: n ja propidiumjodidilla ja visualisoitiin fluoresenssimikroskopialla. Vähintään 200 solua mitattiin kullekin näytteelle, ja tiedot ovat keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. (C) analyysi kaspaasi 3/7 aktiivisuuden. Chen et ai. Chen et ai.