Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Bone muodostavat etäpesäkkeitä ovat yleinen ja invaliditeettiin seuraus eturauhassyövän (CAP). Mahdollinen rooli osteoklastiaktiivisuutta CaP luun etäpesäkkeitä ei ole täysin selitetty. Tässä tutkimuksessa selvitettiin

ex vivo

onko osteolyytti- on toiminnassa ja miten se hallitsee korkki potilailla luun muodostaen etäpesäkkeitä.

Menetelmät

Neljäkymmentäkuusi potilasta vaikuttaa vasta diagnosoitu korkki ja terveillä verrokeilla otettiin. Diagnoosin, 37 potilaalla oli ensisijainen kasvain vain, kun taas 9 oli primaarikasvaimen ja samanaikainen luuta muodostavan etäpesäkkeitä. Kaikilla potilailla ei ollut näyttöä etäpesäkkeiden muille kuin luu sivustoja. Kaikkien potilaiden ja verrokkien keräsimme veren ja virtsan näytteitä. Arvioimme potilaiden luun homeostaasin; Teimme perifeerisen veren mononukleaarisissa solu (PBMC) viljelmät havaitsemiseksi

in vitro

osteoklastigeneesin; me annosteltu seerumi molekyylien ekspressiota osallisina syövän aiheuttama osteoclatogenesis, kuten RANKL, OPG, TNF-alfa, DKK-1 ja IL-7. Real-Time PCR, me määrällisesti DKK-1 ja IL-7-geenin ilmentymisen mikro-leikeltiin kasvain ja tervettä kudosta kohdat.

Keskeiset havainnot

CaP luun metastaattisen potilailla havaittiin luun aineenvaihdunnan häiriöitä kanssa lisääntynyt luun resorptio ja muodostuminen verrattuna ei-luun metastasoituneen potilaiden ja terveiden verrokkien. Korkki PBMC kulttuureissa osoittautui paremmaksi osteoklastigeneesia luun metastaattisen potilaille, koska kasvua RANKL /OPG-suhde. Havaitsimme lisääntynyt DKK-1 seerumin ja kudosten geenien ilmentymistä potilailla verrokkeihin verrattuna. IL-7 aiheutti korkea potilaiden seerumista, mutta sen kudoksen geenien ilmentyminen oli verrattavissa potilaiden ja verrokkien.

Johtopäätökset

Osoitimme

ex vivo

että osteoklastigeneesin on aktiivinen mekanismi kasvainten pesintää luunmuodostusyksikköinä metastasoituneen syövän ja että seerumin DKK-1 arvot kohoavat Cap potilailla, mikä viittaa siihen, että syvästi tutkia sen asemaa tuumorimarkkeri.

Citation: Roato I, D’Amelio P, Gorassini E Grimaldi A, Bonello L, Fiori C, et al. (2008) Osteoklastit toimivat Bone Muotoilu Etäpesäkkeitä Eturauhassyöpä Potilaat. PLoS ONE 3 (11): e3627. doi: 10,1371 /journal.pone.0003627

Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Ordway Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 syyskuu 2008; Hyväksytty: 15 lokakuu 2008; Julkaistu: 03 marraskuu 2008

Copyright: © 2008 Roato et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Compagnia di San Paolo ja Piemonten aluetta (Ricerca Sanitaria Finalizzata 2008).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhasen syöpä (CAP) on toiseksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien miesten [1]. Tyypillinen piirre korkki on kyky metastatize luun, sillä yli 80% miehistä, jotka kuolivat Cap kehittänyt etäpesäkkeitä luustossa [2]. Kasvu CaP luussa edistää ensisijaisesti osteoblastic vaurioita taustalla osteolyyttisiä alueita [1]. Fysiologisissa olosuhteissa osteoklastien (OC) ja osteoblastien aktiivisuus on hyvin tasapainoinen, mutta patologisen tilan tasapainotilan (luu homeostaasin) häiriintyy. Rooli OC vuonna osteolyyttisiä etäpesäkkeitä on selvästi osoitettu, ja on ehdotettu, että OC voisi olla tärkeä rooli osteoblastisissa etäpesäkkeitä samoin. Vuorovaikutus CaP soluja, osteoblastien ja toimintaolosuhteet mukaan luu tropismista saattaa johtua kasvaimen riippuvuus yhden tai useamman osteoblastien /OC johdettuja tekijöitä syöpäsolujen kasvua ja ylläpito [3].

aiemmin osoitettu, että potilailla, joilla on osteolyyttiset etäpesäkkeet eri kiinteitä kasvaimia osoitti voimisti spontaania osteoklastogeneesiä, lisääntyneen T-solujen vapautumisen pro-osteoklastigeenisen tekijöistä, kuten TNF-alfa, IL-7 ja RANKL [4]. Rooli OPG /RANKL akselia osteolyytti- komponentin CaP välittämää luun etäpesäkkeitä on selvitetty [5], kun taas TNF-alfa ja IL-7 mahdollisista toiminnoista Cap luuston vaurioita ovat edelleen epäselviä.

Muita avaintekijöitä luun biologia ovat WNTs, perheen pieniä erittyy glykoproteiineja joka estää OC erilaistuminen [6], stimuloi osteoblastogenesis ja mineralizing aktiivisuus osteoblastien [7]. Aktiivisuus WNT perheen antagonisoi useat erittyvän tekijöistä, kuten dickkopf (DKK) proteiineja. Viimeaikaiset tiedot ilmoitetaan DKK-1 ilmentymisen joissakin ihmisen yksilöitä kasvaimia, mikä viittaa siihen, että syöpä välittämää modulaatiota WNT aktiivisuuden vaikuttaa metastaattisen fenotyypin [8], [9].

Tämä poikkileikkaus tutkimus suunniteltiin tutkia miten luunmuodostusyksikköinä etäpesäkkeet CAP vaikuttaa luun aineenvaihdunnan, OC muodostusta perifeerisen veren mononukleaarisia soluja (PBMC), ja tuotanto osteoklastigeenisen ja anti-osteoklastigeenisen tekijät kärsivät potilaat luun metastaattinen korkki.

Raportoimme lisääntynyt osteoklastigeneesin korkki luun metastaattisen potilaat, johtuen kasvusta seerumin RANKL /OPG-suhde, mikä viittaa siihen, että tehostettu OC muodostuminen on aktiivinen rooli luun muodostaen etäpesäkkeitä. Havaitsimme korkea DKK-1 seerumin ja geenin ilmentyminen Cap potilaita terveisiin kontrolleihin verrattuna.

Tulokset

Luun on lisääntynyt luun metastaattisen potilailla

luun liikevaihto oli suurempi potilailla luuetäpesäkkeistä verrattuna ei-luun metastasoituneen potilaiden ja terveiden verrokkien (taulukko 1). Yksityiskohtaisesti, CAP potilaat eivät osoittaneet merkittäviä eroja luun tiheys, mutta oli korkeampi PTH, BAP, BGP, TRAPC5b ja ristisidosyhdisteiden tasolla kuin terveillä verrokeilla. Nämä tulokset vahvistavat häiriintyminen luun homeostaasin lisääntynyt luun resorption ja muodostumisen Metastasoitunutta potilailla.

osteoklastigeneesin lisääntyy Cap luuetäpesäkkeissä

Sen arvioimiseksi, parantamiseksi luun resorption metastaattisessa potilaat johtuu kasvusta OC muodostumiseen, tutkimme kyky

in vitro

PBMC spontaanisti erilaistua OC potilailla, joilla on tai ei ole luumetastaaseja ja terveillä verrokeilla.

The OC eriyttäminen osoitettiin läsnäolo monitumaisten /TRAP-positiivisia soluja syövän potilaiden ja terveiden ohjaus PBMC: t (Fig. 1A-C). Kuten osoitti kuvassa. 1D määrä OC oli merkittävästi suurempi luun metastaattisen potilailla (keskiarvo ± SE, 216,22 ± 39,55) kuin potilailla, joilla ei luumetastaaseja (112,71 ± 14,76) ja terveillä verrokeilla (73,55 ± 11,69),

p

0,004 ja terveillä verrokeilla,

p

0,001 (B).

RANKL /OPG-suhde on lisääntynyt metastaattinen potilailla

tutkiakseen tekijöitä vastuussa lisääntyneestä osteoklastigeneesin potilailla, me annostellaan seerumin TNF-alfa, RANKL ja OPG. TNF-alfa seerumissa eivät eronneet merkittävästi kolmesta ryhmästä (tuloksia ei ole esitetty), kun taas havaitsimme merkittävästi lisääntynyt suhde RANKL /OPG luun metastaattisen seerumista (19,62 ± 6,52) verrattuna ei-metastasoituneen potilasta (5,48 ± 2,48) ja terveillä verrokeilla (6,89 ± 2,6),

p

0,03.

IL-7 seerumin taso on kasvanut syöpäpotilailla

mitataan IL-7 seerumipitoisuuksilla potilaiden ja verrokkien. Seerumin IL-7-tasot olivat merkittävästi korkeammat luun metastaattisen potilailla (keskiarvo ± SE, 19,86 ± 2,01 pg /ml) kuin terveillä verrokeilla (7,07 ± 1,27 pg /ml), p 0,001. Me annosteltiin vertailukelpoinen IL-7 tasoa kuin luun metastasoituneen (19,75 ± 3,55 pg /ml) ja luun metastaattinen potilailla (19,86 ± 2,01 pg /ml), (Fig. 2A). Tämä tulos johti meidät tutkimaan, kasvainsolut olivat vastuussa lisäystä IL-7 tuotanto; Siksi tutkimme kvantitatiivinen IL-7 ilmentyminen suojus ja terveiden eturauhaskudoksiin. Syöpäsolut ilmaisi alhainen ja vertailukelpoiset IL-7 potilailla ja terveillä verrokeilla (Kuva. 2B). Tämä viittaa siihen, että lisääntynyt verenkierron IL-7 saattaisi riippua tuotannon immuunijärjestelmän solu, kuten T- ja B-lymfosyytit [4].

IL-7 seerumin potilailla, joilla on /ei luustometastaaseja ja terveisiin kontrolleihin mitattiin ELISA: lla. Bone metastaattinen (

p

0,01) ja ei-luun metastaattinen potilailla (

p

0,03) oli merkittävästi korkeammat IL-7 seerumissa verrattuna terveisiin kontrolleihin (A). Korkki ja terveiden kudosten analysoitiin Real-Time PCR, jotta määrällisesti IL-7-geenin ilmentymisen. IL-7-kvantisointi ilmaistiin IL-7: n β-Actin (valvonta-geeni) plasmidissa kopioluku. Histogrammi osoitti vertailukelpoinen IL-7 ekspressiotasot Cap ja terveen kudoksen.

DKK-1 ilmentymisen on korkeampi Cap potilailla

Kirjallisuus Ilmoitettujen tietojen perusteella DKK-1 on osallisena luun homeostaasin [8]. Me annostellaan DKK-1 seerumin tason Cap potilaiden ja terveiden verrokkien. CaP potilailla havaittiin korkeampi DKK-1 tasot kuin terveillä verrokeilla,

p

0,004 (Fig. 3A). Sen arvioimiseksi, onko DKK-1 tuotetaan syöpä kudoksiin, tutkimme sen lausekkeen korkki ja terveiden kudosten RQ-PCR. Tuloksemme osoittivat, että CaP kudos ilmaistaan ​​huomattavasti DKK-1 kuin tervettä kudosta, p 0,001 (Fig. 3B).

DKK-1 tasot annosteltiin seerumissa potilailla, joilla on /ilman luuetäpesäkkeistä ja terveillä valvontaa ELISA. Bone metastaattinen (

p

0,004) ja ei-luun metastaattinen potilailla (

p

0,01) oli merkittävästi korkeammat DKK-1 seerumissa verrattuna terveisiin kontrolleihin (A). Korkki ja terveiden kudosten analysoitiin Real-Time PCR, jotta määrällisesti DKK-1gene ilme. DKK-1 kvantisointi ilmaistiin DKK-1 β-Actin (valvonta-geeni) plasmidissa kopioluku. Histogrammi osoitti suurempi DKK-1 ekspressiotasot CAP kuin terveillä kudoksissa,

p

0,001 (B).

Keskustelu

Eturauhassyöpä kehittyy usein luuta muodostavia etäpesäkkeitä; kuitenkin reipas osteolyytti- aktiivisuus on läsnä metastaattinen verrattuna ei-metastasoituneen potilaista [10]. Mekanismeja, joilla CaP edistää poikkeavaa luun ei ole selkeästi määritelty. Paljastaminen kasvain pesivän luun voi tarjota uusia työkaluja varhainen diagnoosi luun etäpesäkkeitä ja ehdottaa uusia hoito-ohjausta varten CaP etenemisen. Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, miten osteolyyttiset komponentti luumetastaasin vaikuttaa luun aineenvaihdunnan, OC muodostusta PBMC, ja tuotanto osteoklastigeenisen ja anti-osteoklastigeenisen tekijät kärsivät potilaat luun metastaattinen korkki.

valinta CaP tapauksissa päätimme välttää potilailla, joilla on kehittynyt etäpesäkkeitä, koska hoito-saattaa merkitä bias analyysimme. Tässä tutkimuksessa olemme epätasapainossa luun ja ei-luun metastasoituneen potilaiden lukumäärä, joka riippuu läsnä pienempi määrä luun metastaattisen verrattuna ei-luun metastasoitunut CaP potilaiden diagnoosi [3]. Itse luonnollisessa historiassa taudin, luun etäpesäkkeitä ovat usein, mutta myöhään tapahtuma [11].

Luun aineenvaihdunta parannettiin luun metastaattisen potilailla, erityisesti havaitsimme molemmat lisääntyminen luun muodostumista ja resorption merkkiaineita. PTH taso oli hieman lisääntynyt luun metastaattisen potilaita terveisiin kontrolleihin verrattuna, mukaan PTH kyky edistää kasvua ja invasiivisuus eturauhassyöpäsolujen luussa [12].

Havaittu Luuresorption ja aiemmin osoittanut spontaani osteoklastigeneesin syöpäpotilailla osteolyyttisiin etäpesäkkeitä [13] sai meidät tutkimaan osteoklastigeneesin Cap potilaiden PBMC

in vitro

. OC muodostuminen oli suurempi luun metastaattisen potilaista verrattuna sekä ei-luu metastasoituneen potilaiden ja terveiden verrokkien. Tunnistaa tekijöistä kasvun OC muodostumiseen, mittasimme molekyylit enimmäkseen mukana osteoklastigeneesin, kuten TNF-alfa, RANKL, OPG, IL-7 ja DKK-1. TNF-alfa-pitoisuudet seerumissa ei merkittävästi lisääntynyt CaP potilaille, eri tavalla kuin muita luun etäpesäkkeitä, jossa TNF-alfa: lla on tärkeä rooli osteoklastogeneesiä [14]. Muuten RANKL /OPG-suhde oli suurempi luun metastaattisen potilailla, selittää lisääntynyt osteoklastogeneesiä ja mukaan aikaisempien saaduilla tiedoilla [15].

Vuorovaikutus joukossa kasvainsoluja, immuunijärjestelmän ja luukudoksen on tullut asiaan intensiivisen tutkimuksen. Koska IL-7 osallistumisesta luumetastaasipotilailla aiemmin osoitettu muissa kasvaimissa [4], [16], tutkimme tätä kysymystä osoittaa nostaa seerumin IL-7 tasoa korkki potilailla, joilla ei luuta vaurioita. Lisääntyminen IL-7 voi selittää RANKL /OPG augment, koska IL-7 stimuloi RANKL tuotannon T-soluista [17]. Arvioimme IL-7-geenin ilmentymistä korkki ja normaalissa eturauhasessa kudoksissa, joissa näkyi vertailukelpoinen IL-7 ilmentyminen eturauhassyövässä ja normaaleissa kudoksissa. Tämä tulos eroaa myös julkaistua tietoa keuhkosyöpä, jossa kasvain kudos ilmaistaan ​​korkeamman IL-7 tasoa verrattuna normaaliin vastine [18]. Ehdotamme, että tämä ristiriita saattaa johtua erilaisista kasvaimen tyyppi ja luun metastaattisen käyttäytyminen, kuten keuhkosyöpä aiheuttaa osteolyyttisiä etäpesäkkeitä, kun taas CaP tuottaa lähinnä luuta muodostavan vaurioita. Lisääntynyt IL-7 seerumin taso voi riippua immuunijärjestelmän aktivoitumisen kasvainta vastaan. Itse asiassa, on aiemmin osoitettu, että T- ja B-solut tuottavat IL-7, sekä kasvaimia ja muita patologioita liittyvät luun resorptiota [4], [19], [20]. WNT signalointi on tärkeä rooli luun kehittymisessä, koska se estää OC erilaistumista [6], stimuloi osteoblastogenesis ja mineraaleilla aktiivisuus osteoblastien [7]. WNT proteiinit ovat myös ilmaisseet korkki ja voi edistää kasvainten luun invaasio [21]. DKK on liukoinen estäjä kanoninen WNT signalointi [22]. Tuoreessa tutkimuksessa yhdistää DKK-1 ilmentymisen rintasyövän läsnäolon kanssa luuetäpesäkkeistä [23]. Koskevat tiedot DKK-1 ilmentymisen Cap ovat vähäiset: jotkut kirjoittajat raportoivat lisäyksestä DKK-1 ilmentymisen osteolyyttisiä vaurioita, mutta ei primäärikasvaimissa [8]. Hall

et al

raportoitu, että CAP-johdettu DKK-1 osallistuu osteoblastien luun etäpesäkkeitä, koska DKK-1 signalointi voisi selittää vaihtamalla luun vastaus Cap soluja osteolyyttinen ja osteoblastien ja päinvastoin [24 ]. Tässä työssä tutkittiin vain potilaille, joilla on luuston muodostavat etäpesäkkeitä, siksi emme voi korreloida osteolyytti- indusoimaa CaP solut ja DKK-1 ilmentymisen, kuten aiemmin on kuvattu [8]. Kuitenkin löysimme suuren määrän DKK-1 in serologisia näytteitä syöpäpotilaista ja parannettu DKK-1-geenin ilmentymisen Cap kudoksissa, mikä viittaa siihen, että seerumin DKK-1 tasot korkki potilaat saattavat riippua korkki solun eritystä. Tämä tulos on syvästi tutkia, jotta voidaan arvioida mahdollista roolia DKK-1 kuten tuumorimarkkeri korkki. Lisäksi voimme spekuloida, että CaP solut stimuloivat luuytimen ympäristö kasvattaa DKK-1 vapautumista tuntematon mekanismeja. Meidän luu metastaattinen potilailla, seerumin DKK-1 tasot ovat hieman lisääntynyt verrattuna ei-metastasoituneen potilaille, ilman tilastollisesti merkitsevää eroa. Tämä voisi riippua meidän pieni määrä potilaita, vaan tutkii suuri määrä potilaita, odotamme osoittaa eroa ryhmien välillä, mikä vahvistaa kirjallisuudessa data [23].

Materiaalit ja menetelmät

potilaat ja luun aineenvaihdunnan merkkiaineita

kokeelliset hanke ja kaikki tutkimukset suoritetaan potilailla oli hyväksynyt eettinen komitea meidän Institution (Azienda Ospedaliera-Universitaria San Giovanni Battista Torino) ja kirjallinen suostumus alkaen potilaiden ja terveiden verrokkien saatiin. Tutkitut Potilaspopulaatiosta 46 kärsivien vasta diagnosoitu korkki (37 oli ensisijainen kasvain vain, kun taas 9 oli primaarikasvaimen ja samanaikainen luunmuodostusyksikköinä etäpesäkkeet) ja 20 tervettä miestä. Kaikilla potilailla ei ollut näyttöä etäpesäkkeiden muille kuin luu sivustoja. On osoitettu, että estrogeenin menetys vaikuttaa merkittävästi osteoklastien muodostumisen [25]. Niinpä olemme tutkineet korkki, joka, ollen ainoa miespuolinen kasvain, vältetään oletusarvoisesti kaikki mahdolliset harhat takia syklinen estrogeenin vaihtelut ja postmenopausaalisen lasku estrogeenitaso naisilla. Potilaat ja verrokit Hyväksytty iän ja painoindeksi. Luun mineraalitiheys (BMD) mitattiin kaksinkertainen päästöjä röntgen absorptiometry kanssa Hologic QDR 4500 at lannerangan ja reisiluun kaulan sekä potilaiden ja verrokkien. Potilaat, joilla on suoliston imeytymishäiriö taudit, muu puutteellinen ravitsemustilaa, sekundaarinen osteoporoosi tai huumeiden aktiivinen aiheuttaman luun tai anti syöpähoidon suljettiin pois. Läsnäolo luuetäpesäkkeistä varmistettiin käyttämällä

99Tc luun skannauksen ja edelleen kuvantamistutkimukset standardin kliininen käytäntö.

Tutkiakseen luun aineenvaihdunnan tila, potilaiden ja verrokkien tehtiin analyysi normaaliin kliiniseen merkkiaineiden luun aineenvaihduntaa, kuten seerumin PTH, luun alkalinen fosfataasi (BAP), kalsiumia, fosfaattia, osteokalsiini (BGP) ja virtsan deoksipyridinoliini (virtsan siltoja) [26]. Erityisesti ristiinkytkee annos on valittu kliinisessä käytännössä valvoa luuston etäpesäkkeitä ja vaste anti resorptiopinnoille hoitojen, kuten bisfosfonaatteja [27], [28]. Koska luun resorption myös mitattava tartraatti resistentti hapan fosfataasi 5b (TRAP5b) seerumista [29], jonka BoneTRAP ELISA Kit (Suomen Bioanalytiikka Oy, Turku, FIN). Serologisia merkkiaineita, kuten PSA ja histologinen luokittelu mukaan Gleason, kirjattiin kaikki potilaat mukana tässä tutkimuksessa [30], [31]. Kaikki biokemialliset mittaukset suoritettiin yhdellä veren tai virtsan näytteestä yhdellä kertaa pisteen per aihe.

Soluviljelmät

Kuten aikaisemmin on kuvattu [13], kaikkien potilaiden ja terveiden kontrollien, PBMC: itä eristetty perifeerisestä verestä ja viljellään α-MEM, jota on täydennetty 10% FBS: ää, penisilliiniä 100 U /ml ja streptomysiiniä 100 ug /m (Cambrex, Bio Science, Walkersville, MD), lisäämättä eksogeenisiä stimuloivia tekijöitä, kuten m-CSF: n ja RANKL. Jälkeen 15 päivää, viljelmät lopetettiin, kypsä OC havaittiin monitumaisia ​​soluja, jotka sisältävät kolme tai useampia ytimiä ja positiivinen TRAP ilmentymisen (Sigma Aldrich, St. Louis, MO).

Sytokiinit annostus

jotta voitaisiin arvioida liittyvät tekijät osteoklastogeneesiä määrän seerumin kokonais-RANKL (vapaa ja OPG-sidottu), OPG, TNF-alfa, IL-7 ja DKK-1 määritettiin kaupallisesti saatavilla ELISA-kitillä mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Näytteet analysoitiin kahtena kappaleena, ja tiedot ilmaistiin keskiarvoina. Herkät olivat: 1,56-30000 pg /ml yhteensä RANKL (Apotech Corporation, Epalinges, CH); 0-4000 pg /ml OPG; 0,12-32 ug /ml TNF-alfa; 0,1-16 pg /ml IL-7 (R 0,05.

Kiitokset

Kiitämme Raffaele Troiano tekniseen tukeen.