Krooninen sairaus

tiivistelmä

tunnistaminen CD8

+ T-soluepitooppeja, jotka voivat aiheuttaa T-soluja tappamaan kasvainsoluja on olennainen askel kehittämisessä peptidin syövän rokote. Pote proteiini on vastikään todettu syövän antigeeni, joka havaittiin ilmentyvän monenlaisia ​​ihmisen syövissä, mukaan lukien eturauhas-, paksusuoli-, keuhko-, rinta-, munasarja- ja haima. Täällä määritetty HLA-A2.1-rajoitettu sytotoksinen T-lymfosyytti (CTL) epitooppeja Pote proteiinia, ja myös suunnitellut parannettu epitooppien aminohappoa (AA) vaihdot. Viisi 9-meeri-peptidien ensimmäinen valittu ja niiden sitoutumisaffiniteetti HLA-A2-molekyylien mitattiin T2 sitoutumismäärityksessä. Pote 272-280 ja Pote 323-331 voimakkaimmin HLA-A2 sitoutumisaffiniteettia. AA itujen peptidien Pote 252-9V (valiinilla asemassa 9), Pote 553-1Y (jossa tyrosiini asemassa 1) ja Pote 323-3F (fenyylialaniinillä asemassa 3) Siirretään suurempi affiniteetti HLA-A2, ja indusoi CTL-vasteita ristiin reagoiva villityyppisen antigeenejä. Vaikka Pote 252-9V oli vahvin tässä suhteessa, Pote 323-3F oli suurin kasvu immunogeenisyyttä verrattuna villityyppiin. Tärkeää on, kaksi modifioitu epitooppeja (Pote-553-1Y ja Pote-323-3F) indusoi CTL: iä, joka tappoi NCI-H522, joka on Pote-ilmentävät HLA-A2

+ ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinja, joka osoittaa luonnollisen endogeenisen käsittely näiden epitooppien. Lopuksi immunogeenisyyttä Pote epitooppeja voidaan parantaa peptidin muutos aiheuttaa T-solujen, jotka tappavat ihmisen syöpäsoluja. Yhdistelmä Pote 553-1Y ja Pote 323-3F epitoopit saattavat olla houkutteleva rokote strategia HLA-A2 syöpäpotilaille voittaa toleranssin aiheuttamien kasvainten ja karkaamisen estämiseksi.

Citation: Huang YH, Terabe M, Pendleton CD, Stewart Khursigara D, Bera TK, Pastan I, et ai. (2013) tunnistaminen ja HLA-A2.1-rajoitettujen CTL epitoopit New Human Cancer antigeeni-Pote. PLoS ONE 8 (6): e64365. doi: 10,1371 /journal.pone.0064365

Editor: Vladimir Brusic, Dana-Farber Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 tammikuu 2013; Hyväksytty: 13 huhtikuu 2013; Julkaistu: 04 kesäkuu 2013

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Dr. Yi-Hsiang Huang tukivat Taiwan Merit Scholarship (TMS-094-2-B-015) ja NCI sisäiset rahoitusta NCI Center for Cancer Research, National Cancer Institute, NIH, Bethesda, Maryland, USA; ja rahoittamalla Taipei Veterans General Hospital (V97S5-002, V100C-104 ja V101C-147). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Useimmat syövät ei voida curatively resektoitiin paitsi jos havaitaan varhaisessa vaiheessa. Muut nonsurgical lähestymistavat, kuten sädehoidon tai kemoterapian, vaikuttavat myös normaaleja soluja ja aiheuttaa sivuvaikutuksia, jotka rajoittavat hoitoa. Lisäksi kaikki hoidot uusiutuvassa tai metastaattinen ovat lievittävä. Niinpä uudenlaisten systeemisiä lähestymistapoja hoitoon kehittyneitä, toistuva tai metastaattinen ei tarvita. Immunoterapia voi olla suuri potentiaali lupaava syövän hoitoon potilaille, koska sen erityispiirteet ja vapautta myrkyllisiä vaikutuksia chemotherapies. Koska sipuleucel-T tuli ensimmäinen syöpä rokote lisensoitu Yhdysvalloissa [1], [2], siellä on huomattavasti uutta kiinnostusta syöpärokotteissa [3] – [5]. Siten, uusia kasvaimen antigeenejä ominaisia ​​tietyille syöpätyyppejä ovat erittäin kiinnostavia.

CD8

+ CTL: t voidaan tunnistaa ja spesifisesti tappaa ilmentävien kasvainsolujen peptidejä kasvaimeen liittyvistä antigeeneistä esitetään MHC-luokan I molekyylejä. Siksi useimmat nykyiset syövän immunoterapia strategioita keskittyä induktion CTL: ien, jotka hajottavat kasvainsoluissa [6]. Antigeenispesifisiä syövän immunoterapia perustuu usein tunnistamiseen epitooppien ilmaistaan ​​syöpäsolut, joita voidaan käyttää kohteina CD8

+ T-soluja. Kuitenkin luonnollinen CTL-epitooppeja syövistä eivät aina optimaalinen, koska CTL ohjelmistoon vastaan ​​suuren affiniteetin epitooppien usein siedätetyiksi [7]. Epitooppi lisälaite, jonka avulla muuttaminen AA-sekvenssin epitooppeja, on kehitetty tehokkuuden parantamiseksi rokotteiden ensisijaisesti lisäämällä affiniteetin peptidien MHC-molekyylien [3], [8]. Peptidirokotteet ovat viime aikoina osoittaneet huomattavaa lupaaviksi kliinisissä tutkimuksissa [9].

löytäminen kasvaimen antigeenejä on ratkaisevan tärkeää kehitettäessä tehokkaita syövän immunoterapiassa [5]. Äskettäin uusi kasvaimeen liittyvän antigeenin, Pote, tunnistettiin ihmisen erilaisten syöpien [10], [11]. Tämä kasvaimen antigeeni kutsutaan Pote, koska se oli ensimmäinen havaittu ilmentyvän normaalissa eturauhasessa, munasarjassa, kiveksissä ja istukassa kudoksissa, samoin kuin eturauhasen syöpä [10]. Pote geeniperheen havaittiin hajallaan kahdeksan eri kromosomeja (2, 8, 13, 14, 15, 18, 21, ja 22), joilla on eri pituus, mRNA: iden [12]. Kuitenkin Pote cDNA-sekvenssi useissa eri kromosomia on erittäin homogeeninen eroavuus on vähemmän kuin 10% [11]. Myöhemmät tutkimukset paljastivat, että Pote geenit ilmennettiin paitsi eturauhassyöpä mutta myös monenlaisia ​​ihmisen maligniteettien, mukaan lukien rinta-, koolon-, keuhko-, munasarja- ja haiman [11]. On olemassa erilliset kuviot ilmentymisen Pote normaaleissa kudoksissa ja syöpien [11]. Eri syöpiä, The Pote paralogit kromosomissa 2 (Pote-2γ) ovat yleisimmin ilmaistuna.

Koska Pote mRNA on havaittavissa vain rajallinen määrä normaalia ihmisen kudosten (eturauhasen ja kiveksissä miehillä, ja munasarja ja istukan naisen), The Pote proteiini pidetään jäsenenä syöpää kiveksen antigeeniperheen [11]. Expression of syöpää kivesantigeenien istukan tai kiveksissä ei pitäisi johtaa T-solujen aktivaation sillä hyvin alhainen MHC-luokan I molekyylien näissä kudoksissa [13], [14]. Syöpäpotilaille, jotkut reaktiivisuus vastaan ​​eturauhasen tai rintarauhaskudokseen on hyväksyttävää, koska kumpikaan ovat elintärkeitä kudoksia. Lisäksi rintasyövän tai eturauhassyövän potilailla, eturauhasen miehillä ja rintojen naisen olisi pitänyt kirurginen resekoituun tai säteilytetty. Huolenaiheita autoimmuunireaktio molemmissa kudoksissa ei olisi este hoidossa hengenvaarallisen syöpä. Siksi Pote antigeenin pitäisi olla houkutteleva kohde immunoterapiaa näiden syöpien.

Tässä tutkimuksessa määritetään ensin HLA-A2-rajoitetun epitooppeja Pote (2γ), ja niiden immunogeenisyydet testattiin AAD siirtogeenisissä hiirillä, joilla on kimeerinen MHC-luokan I molekyyli koostuu α1 ja α2 verkkotunnuksia HLA-A2 ja α3 verkkotunnuksen d

d [15]. Seuraavaksi parantanut sitoutumista HLA-A2.1-molekyylien epitooppiennustamisen lisälaite, jotta epitooppien immunogeenisempiä, menettämättä kykyä CD8-

+ T-solut tunnistavat villityypin epitooppiin merkittävässä määrin. Lopuksi vahvistettu muutettu epitooppeja indusoi CTL: iä, jotka tappoivat ihmisen syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet

AAD hiirissä [15], joka ilmentää kimeeristä HLA-A2.1 siirtogeenin kanssa α1 ja α2 verkkotunnuksia HLA-A2.1 ja α3 toimialue H-2D

d, jotta sitoutuminen hiiren CD8, on C57BL /6 tausta, käytettiin näissä kokeissa. Osat kokeet toistettiin HHD-2-hiirten (lahja tri François Lemmonier, Institut Pasteur), jotka ilmentävät kimeerisiä ihmisen HLA-A2.1 kanssa kovalenttisen ihmisen β2m, ilman hiiren luokan I molekyylin [16] – [ ,,,0],18]. Hiiriä kasvatetaan ja pidettävä asianmukaisissa eläinten hoitolaitoksissa. Kaikki toimenpiteet eläinten kanssa tehtiin mukaisesti toimielimen hyväksymät protokollia.

Peptidit

peptidit tässä tutkimuksessa syntetisoitiin Malli Symphony Peptide Synthesizer (Perkin-Elmer, Boston, MA) käyttäen tavanomaisia fluorenyylimetoksikarbonyyli (f-MOC) kemia ja lohkaistaan ​​hartsista trifluorietikkahappoa. Puhtaus ja molaarinen pitoisuus analysoitiin käänteisfaasi korkean erotuskyvyn nestekromatografialla C18-kolonnilla käyttäen gradienttia 0,1% trifluorietikkahappo vedessä ja 0,1% trifluorietikkahappoa asetonitriilissä ja puhdistettiin edelleen preparatiivisella käänteisfaasi-korkean erotuskyvyn nestekromatografia käyttäen samanlainen kaltevuus.

Solulinjat

T2-solulinja on puutteellinen varten TAP1- ja TAP2 kuljettaja proteiineja ja ilmaisee alhainen HLA-A2 [19]. C1R.AAD solulinja on peräisin ihmisen B-lymfoblastoidisolulinjaa HMYC1R transfektoitu HLA kimeerinen molekyyli, joka sisältää α1 ja α2 domeenit ihmisen HLA-A2.1 ja α3 hiiren H-2D

d, lahja Dr . V. Engelhard (University of Virginia, Charlottesville, VA) kuten aiemmin on kuvattu [15]. C1R.A2.1 solulinja (lahja tri William Biddison, NINDS, NIH) on myös johdettu HMYC1R transfektoitu HLA-A2.1 [20], [21]. C1R.AAD ja C1R.A2.1 soluja pidettiin täydellisessä elatusaineessa, joka koostuu 10% FCS-RPMI 1640, 1 mM natriumpyruvaattia, ei-välttämättömiä aminohappoja (Biofluid, Rockville, MD), 4 mM glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 50 uM 2-ME. NCI-H522 (Pote

+ /HLA-A2

+) ylläpidettiin täydelliseen alustaan. HTB-19 (Pote

+ /HLA-A1

+) ylläpidettiin Eaglen minimum essential keskipitkän (EMEM) 5% FCS. MDA-MB-231 (Pote

– /HLA-A2

+) pidettiin 10% FCS-DMEM.

T2 sitoutumismäärityksessä.

Peptidin sitomiskyky on HLA-A2-molekyyli mitattiin käyttämällä T2 solulinjaa protokollan mukaisesti kuvattu aiemmin [19], [22]. T2-soluja (3 x 10

5 solua /kuoppa) inkuboitiin yön yli 96-kuoppalevyillä elatusaineeseen (01:01 seos RPMI 1640 /Eagle-Hankin aminohappo, joka sisältää 2,5% naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä), 10 ug /ml β2-mikroglobuliinin (Sigma) ja eri titrattiin pitoisuuksia peptidejä (alkaen 100 uM 2-kertainen sarjalaimennos), kuten on esitetty kuvioissa pitoisuuden määrittämiseksi antaa 50 % kasvu sitovia (katso alla). Solut pestiin kerran kylmällä HBSS, joka sisälsi 0,1% BSA: ta ja inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa anti-HLA-A2.1 monoklonaalinen vasta-aine (klooni BB7.2) (laimennus 1:40 hybridoomasupernatantista). Pesun jälkeen solut värjättiin vuohen FITC-leimatun anti-hiiri-immunoglobuliini (BD, San Jose, CA), ja taso HLA ilmentyminen mitattiin virtaussytometrialla. HLA-A2-ekspressio kvantitoitiin kuten fluoresenssi-indeksi (FI) mukaan seuraavan kaavan mukaisesti: FI = (geometrinen keskiarvo fluoresenssi-intensiteetti peptidi – geometrinen keskiarvo fluoresenssi-intensiteetin ilman peptidiä) /geometrinen keskiarvo fluoresenssi-intensiteetti ilman peptidiä. Taustafluoresenssitasoja ilman BB7.2 vähennettiin kunkin yksittäisen arvon. Vertailla eri peptidiä, FI

0,5, peptidin pitoisuus, joka lisää HLA-A2.1 ilmentyminen 50% yli ei-peptidi-ohjaus tausta, laskettiin titrauskäyrästä kullekin peptidille. On huomattava, että FI

0.5 tarjoaa mitataan suhteellisesti peptidin affiniteetti tai vahvuus joukossa peptidit verrattuna vierekkäin, mutta ei voida pitää termodynaamisen affiniteetti.

Rokotukset

AAD tai HHD-2-hiiriä immunisoitiin sc pohjassa hännän 100 ul: lla emulsiota, joka sisälsi 01:01 epätäydellinen Freundin adjuvantti (Sigma) ja PBS: llä, jossa peptidien ja sytokiinien (50 nmol CTL-epitooppia, 50 nmol hepatiitti B-viruksen ytimen 128-140 auttajaepitoopin, 5 ug hiiren interleukiini 12, ja 5 ug hiiren granulosyytti-makrofagipesäkkeitä stimuloiva tekijä). Sytokiinit hankittiin Peprotech (Rocky Hill, NJ). Hiiriä kasvattivat 2 viikkoa myöhemmin, ja pernat poistettiin 2 viikon kuluttua vauhtia. Kaikissa kokeissa, kolmen ryhmissä hiiriä käytettiin.

interferoni-y-ELISPOT-määritys

numerot IFN-γ erittävien solujen määritettiin ELISPOT-kit (Mouse IFN-gamma-ELISpot SixPak; R R