Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kiertävä kasvainsolujen (CTC), irtoa primaarikasvaimista ja levitetään perifeeriseen vereen, pelaavat merkittävä rooli etäpesäke. Senkin jälkeen eristäminen CTC verestä, kohdesolut ovat sekoitetaan asukkaan muita solutyyppejä. Täällä me ehdottaa uutta menetelmää analyyseistä solun seoksen klo yksisoluiset tasolla käyttäen mikrofluidilaitetta joka sisältää puettu sähköaktiiviset mikrokuoppia. Dielectrophoretic (DEP) voima, aiheuttama elektrodit kuvioidaan alapinnan mikrokuopissa, mahdollistaa tehokkaan pidättyvän on vakaassa asennossa yhden solujen high-throughput biokemiallisia analyysejä. Olemme osoittaneet, että eri on-chip analyysit kuten immunovärjäystä, elinkelpoisuuden /apoptoosimäärityksessä ja fluoresoiva in situ -hybridisaatio (FISH) klo yksisoluisia tasolla voitaisiin tehdä vain soveltamalla erityisiä reagenssit kutakin määritystä. Yksinkertainen tapa olisi suuresti auttaa syrjintää ja analyysi harvinaisten syöpäsolujen joukossa populaatio verisolujen.

Citation: Kobayashi M, Kim SH, Nakamura H, Kaneda S, Fujii T (2015) Cancer Cell Analyysit klo Single Cell-Level avulla Electroactive Microwell Array Device. PLoS ONE 10 (11): e0139980. doi: 10,1371 /journal.pone.0139980

Editor: Arum Han, Texas A M University, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 06 syyskuu 2015; Hyväksytty: 18 syyskuu 2015; Julkaistu: 11 marraskuu 2015

Copyright: © 2015 Kobayashi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: Kaikki tiedot ovat sisällyttää käsikirjoituksen.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain tukee Japan Science and Technology Agency for Core tutkimus lajikehityksellisen Science and Technology (CREST) ​​ja strategisen International Research Cooperative Program (SICP).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kiertävä kasvainsolujen (CTC), irtoa ensisijainen ja etäpesäkkeitä ja virtaa vereen, katsotaan koska merkittävä syy syövän etäpesäkkeiden [1]. Lukumäärän laskemiseksi CTC perifeerisen veren avulla on mahdollista seurata terapeuttisen vaikutuksen ja ennusteen [2]. Haasteena on havaitseminen CTC verinäytteestä on että olemassaolo CTC on erittäin harvinaista ja sekoitetaan normaalin veren komponenttien (1 10

9 verisoluja). Mikrofluidilaitteet soveltuvat lajitteluun ja analysointiin harvinaisten solujen sillä voidaan tehokkaasti käsitellä monimutkaisia ​​solujen nesteet mahdollisimman vähän vahinkoa keskeytetty soluihin [3, 4]. Lisäksi kyky mikrofluidilaitteiden käsitellä suuri määrä kokoverinäytteet on jo osoitettu, [5]. Viime aikoina useat ryhmät ovat kehittäneet mikrofluidilaitteissa eristää CTC normaalista veren komponentteja, esimerkiksi käyttämällä vasta-ainetta päällystetty microposts, dielektroforeesin, kokoon perustuva erottaminen mikrosuodattimen tai acoustophoresis, jne. [6-11]. Vaikka edellinen menetelmiä käyttäen mikrofluidilaitteet menestyksekkäästi osoittanut erottaminen CTC, erotetut solut ovat kerätään ja mieluiten analysoidaan yksisoluiset tason.

Käytännön ongelma on CTC analyysi on, että syöpäsolut sekoitetaan normaali verisolujen jälkeenkin eristämisen CTC verestä. Edellisen CTC eristämismenetelmää näyttää kompromissi elpymistä CTC ja ehtyminen valkosolujen (WBC: t) [9-11]; korkeampi palautumisnopeus CTC, alemman ehtyminen määrä WBCs. Nämä tulokset osoittavat, että eristetyt syöpäsolut ovat edelleen sekoitetaan suuri määrä WBCs. Esimerkiksi mikrofluidinen menetelmä, jossa käytetään magnetophoretic WBC väheneminen mahdollistaa 3,8-log-vähenemistä WBCs ja 97%: n saanto syöpäsolujen [12]. Jos alkuperäinen verinäyte sisältää 10-syöpäsoluja ja 10

6-WBCs, puhdistettu näyte sisältää 10-syöpäsolujen ja 156-WBCs eristyksen jälkeen kanssa magnetophoretic WBC ehtyminen menetelmällä. Näin ollen eristämisen jälkeen kohdesoluja verestä, syrjiä syöpäsolut ja WBCs on erittäin tarvitaan havaita tai analysoida kohdesoluihin.

Immunostaning tai fluoresoiva in situ -hybridisaatio (FISH) on laajalti käytetty menetelmä erottelun syöpäsoluja. Kuitenkin tavanomaiset protokollat ​​koeputkeen tai mikrotiitterilevyllä vaativat suuren määrän reagensseja, kuten vasta-aineita tai koettimia hybridisaatiota. Lisäksi sentrifugoinnit, tarvitaan muuttuvassa reagenssien kunkin testin, aiheuttaa mahdollisesti kriittinen menettämättä alkuperäisen näytteitä, tai vahinkoa solujen elinkelpoisuutta sekä solujen toimintaa, koska vahva keskipakoisvoiman voimat solussa [13-15]. Yksinkertainen ja tehokas menetelmä biokemiallinen määritys on siksi erittäin toivottavaa vähentää mahdollisia riskejä perinteiset menetelmät.

Täällä me ehdottaa uutta menetelmää on-chip yhden syöpäsolun analyysit käyttämällä elektroaktiivisia mikrokaivo array (EMA) laite. EMA sisältää kuvioitu ohutkalvo elektrodeja pohjassa jokaisen mikrokuoppalevyn varten yksisoluiset ansastusta kanssa dielektroforeesin (DEP) [16, 17]. Koska DEP voima on nopea, aktiivinen ja vakaa ansastusta voisimme tehokkaasti ansa syöpäsoluja keskeytettiin näyteliuoksessa. Loukkuun soluja voidaan pitää tukevasti sirulle DEP, mahdollistaa nopean vaihdon reagenssien kanssa erittäin pieni näytteen tilavuus. Siten suurikapasiteettisten biokemiallisia määrityksiä varten puettu yhden solut helpottuu. Olemme osoittaneet mahdollisuutta lähestymistapamme seoksella, jossa on erilaisia ​​solutyyppejä suorittamalla kolme erilaista määrityksistä; syöpäsolu syrjintä immunovärjäyksellä, elinkelpoisuuden /apoptoosimäärityksessä ja fluoresoiva in situ -hybridisaatio (FISH) analyysi. Koko prosessi testeissä vaatii vain peräkkäinen injektio solususpensiota ja reagenssit analyyseihin ilman monimutkaisia ​​venttiili tai letku järjestelmiä. Odotamme yksinkertainen menetelmä mahdollistaa suuren läpimenon ja rinnan yhden solun analyysit, samalla poistaa ylimääräinen solun manipulointia laitteen ulkopuolella.

Electroactive Microwell Array

Suunnittelu

Laite koostuu mikrofluidinen kanava on tehty polydimetyylisiloksaania (PDMS), ja lasialustan, joka sisältää suuren määrän mikrokuoppia valmistettu on lomittain indiumtinaoksidista (ITO) elektrodit (kuvio 1A). Välinen etäisyys elektrodien on noin 6 um ja halkaisija mikrokuoppia on 30 um, joka on suurempi kuin halkaisija kohdesolujen (20 um). Ja korkeus mikrokuoppalevyn rakenne, joka on valmistettu epoksihartsista, on 25 pm. Mikrokuoppia ovat linjassa lomittain ITO elektrodit, jotta paikantaa parin elektrodeja (anodi ja katodi) kussakin kuopassa. Yksi laite sisältää 3168 mikrokuoppia. Applied sähkökenttä on hyvin paikallista sisällä jokainen mikrokaivo koska lomittain elektrodit sijaitsevat pohjassa mikrokuopissa. Kuvio 1B esittää menettelyä yhden solun analyysi. Ensimmäinen, solut tuodaan mikrokanavan ja loukkuun osaksi mikrokuoppia käyttämällä positiivista DEP aiheuttama vaihtojännite syötetään elektrodeihin. Sitten reagenssit analyysien tuodaan fluidic kanavaan. Kuvio 1C esittää kuvan loukkuun solujen mikrokuoppia.

(a) laitteen rakenne ja mitat mikrokaivoisella ja lomitettujen elektrodeja. (B) Cell ansastusta ja reagenssi vastineeksi yksisoluisia analyysi. Solususpensio tuodaan mikrofluidinen kanavaan laitteen ja solut ovat loukussa osaksi mikrokuoppia positiivinen DEP. Sen jälkeen solu ansastusta, analyysit loukkuun solujen suoritetaan tuomalla tarvittavat reagenssit mikrokanavaan. (C) Kuva jääneen DU145-solujen (osoitettu nuolilla) mikrokuopissa.

Fabrication

Kuvio 2 esittää valmistusprosessin esillä olevan laitteen. Muoto elektrodit kuvioitu käyttämällä fotoresistin (AZP1350, AZ Electronic Materials) on ITO pinnoitettu lasisubstraatti (TOA optisia LTD.), Jonka jälkeen etsaus ITO 0,2 M FeCl

3 + 6 M HCI-liuosta varten 30 min huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen, substraatti puhdistetaan ja huuhdellaan poistaa AZP1350 jäljelle jäävän fotoresistin ITO. Mikrokaivo array on valmistettu fotoresistillä (KMPR1005, NIPPON KAYAKU CO.) Päälle kuviollinen elektrodit. Fotoresistiivinen oli spin-pinnoitettiin elektrodit, ja kromi valokuva-naamio kuviollinen varten mikrokaivo array rinnastettiin kuvioitu ITO elektrodit. Fotoresistin altistettiin ultraviolettivalolle läpi valokuva-naamio, jonka jälkeen kehitys ja huuhtelu.

(a) Microwell array. Lomittain elektrodit on valmistettu tavanomaisella kuviointi prosessi ITO ja mikrokuoppia valmistettu KMPR on kohdistettu elektrodiin. (B) PDMS fluidic siru. Fluidistorioskillaattorin siru on valmistettu kautta pehmeä litografia prosessi. (C) Valmiit mikrofluidilaite valmistettu sitomalla kaksi osaa yhteen.

PDMS fluidic siru on valmistettu vakio replica valuprosessin kuten kuvassa 2B. Fotoresistin (SU-8 2100, MicroChem Co.), joka toimii muottina, on kuviollinen piikiekon päällä. Muotti puhdistettava isopropanolilla ja deionisoitua vettä. PDMS (Silpot 184, Dow Corning Toray, CO. Ltd.) sekoitettiin kovetinta (10: 1 massan suhde) ja kaadetaan muottiin. Sitten PDMS kuumennettiin 75 ° C: ssa 1 tunnin ajan ja sen jälkeen irrottamalla polymeroidun PDMS muotista. Reiät pääsyä satamiin virtauskanavaan irrotettiin.

Jotta sitomiseksi mikrokaivoisella array ja PDMS nestevirtauskomponenttien siru, he olivat altistuneet O

2 plasma aktivoida vastakkaiset pinnat reaktiivista ionietsausta kone ( RIE-10NR, Samco CO.). Myös O

2 plasmakäsittely tekee KMPR mikrokuoppia ja PDMS kanava hydrofiilinen, mikä takaa helpon injektio vesipitoisen reagenssien kanavaan ja mikrokuoppia.

Cell Trapping käyttäminen DEP Force

tässä tutkimuksessa viedyt solut mikrokanavaan aktiivisesti ansaan mikrokaivo varustettu interdigitated elektrodilla DEP voima. DEP on ilmiö, jossa neutraali hiukkaset liikkuvat kun sitä sovelletaan epäyhtenäisiä sähkökentän. Aika keskimääräisiä DEP voima voidaan arvioida suhteessa dipoli vaikutuksia (1), jossa

ε

m

on ehdoton permittiivisyys väliaineen,

r

on säde hiukkasen, Re (

f

CM) on todellinen osa Clausiuksen-Mossotti tekijä (

f

CM) liittyvät aiheuttama dipolimomentin ja E on RMS arvo sähkökentän.

f

CM on (2) (3) (4), jossa

ε

p

on ehdoton permittiivisyys väliaineen. Hiukkanen siirtyy kentän maksimi (positiivinen DEP) tai kentän minimi (negatiivinen DEP) riippuen Re (

f

CM), joka edustaa eroa dielektriset ominaisuudet hiukkasen ja sen Suspendointiväliaine (kuvio 3) [18-20]. Re (

f

CM) voidaan ohjata säätämällä johtavuus suspendointiväliaineen ja taajuus sähkökentän. Näin solut ansaan mikrokaivo positiivinen DEP ollessa kyseessä EMA laite [16].

Hiukkaset ovat houkutelleet elektrodeihin johtuen positiivinen DEP voima, ja hylkivät elektrodien takia negatiivisen DEP voima .

Materiaalit ja menetelmät

Näytteiden esikäsittely

U937-soluissa (leukemiasolujen monosyyttien lymfooman solulinja, joka on saatu RIKEN Bio Resource Center, Japani), DU145-soluja ( eturauhassyöpä solulinja, joka on saatu RIKEN Bio Resource Center, Japani) ja PC3-solut (eturauhassyövän solulinja, joka on saatu RIKEN Bio Resource Center, Japani) viljeltiin kostutetussa inkubaattorissa (37 ° C: ssa ilmakehässä, jossa oli 5% CO

2). Viljelyväliaine kaikissa soluissa oli RPMI 1640 (Invitrogen Corp.), jota oli täydennetty naudan sikiön seerumia (10%, Gemini Bio-tuotteet) ja penisilliini-streptomysiiniä (1%, Sigma Chemical Co). Keskimääräinen halkaisija U937, DU145 solu- ja PC3 solun oli 10 um, 20 um ja 22 um vastaavasti. Solut dispergoitiin DEP-puskurissa (10 mM HEPES, 0,01 mM CaCl

2, 59 mM D-glukoosia ja 236 mM sakkaroosi; pH7.35) ja johtokyvyn säätämiseksi solususpensiota väliaineen (21,4 MSM

-1) positiiviselle DEP [21]. DEP puskuri sisälsi naudan seerumialbumiinia (1% paino /tilavuus) estämään ei soluadheesion. Solujen elatusaine sentrifugoitiin nopeudella 2000 rpm 5 min. Me varovasti poistanut elatusaineeseen ja lisättiin DEP puskuriin.

Kokeellinen asetukset

mikrofluidilaitetta oli asennettu x-y translaation vaiheessa sijaitsevat käänteismikroskooppi (IX71, OLYMPUS). Soluja tarkkailtiin kamera (DP73, OLYMPUS), joka oli asennettu mikroskooppiin. Sähköinen potentiaali DEP käytettiin lomittain ITO elektrodit funktiogeneraattorin (WF1974; NF Corp.) vahvistimen kautta (HSA4101; NF Corp.).

Immunovärjäys

Loukkuun solut mikrokuoppia kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä (fosfaatti-puskuroitu suolaliuos) 10 minuutin ajan ja pestiin PBS: llä 5 minuutin ajan. Sen jälkeen, ne tehtiin läpäiseviksi 0,2% Triton X-100 PBS: ssä 5 minuutin ajan ja pestiin PBS: llä 5 minuutin ajan. Solut immunovärjättiin Hoechst33342 (Dojindo) DNA-sisältöä, FITC-konjugoitu anti-sytokeratiini-vasta-aineita (BD) epiteelisolujen ja PE-konjugoitu anti-CD45-vasta-aineita (Life Technology) leukosyyttien soluja 30 minuutin ajan. Lopuksi solut huuhdeltiin PBS: lla 10 minuutin ajan. Koko prosessit tehtiin virtausnopeudella 3 ul min

-1.

Elinkelpoisuus ja apoptoosimäärityksessä

Loukkuun solut altistettiin anneksiini V Alexa Fluor 488 (Invitrogen) huoneenlämpöti- lämpötilassa pimeässä huoneessa 30 minuuttia, jonka jälkeen vaihtamalla reagenssit sekoitetaan reagenssit anneksiini sitomispuskuria (Invitrogen), propidiumjodidia (Invitrogen) ja kalseiinilla sininen (Invitrogen) 10 minuutin ajan. Koko prosessi suoritettiin virtausnopeudella 3 ul min

-1.

fluoresoiva in situ hybridisaatio (FISH) B

Interphase FISH suoritettiin loukkuun solujen mikrokuoppia mukaan standardin protokollan seuraavin muutoksin. Lyhyesti, loukkuun solut kiinnitettiin Carnoy ratkaisu. Laite pestiin 2 x suolaliuos natriumsitraattipuskuri (SSC, Abbott), kuivattu nousevassa sarjassa alkoholia, ja kuivataan ilmassa. Koetin mix (5’BCL-6 koetin merkitään punaisella ja 3’BCL-6 koetin merkitty vihreällä) hybridisaatioon lisättiin. DNA denaturoitiin 73 ° C: ssa 5 minuuttia ja sitten hybridisoidaan 37 ° C: ssa 16 tuntia lämpösyklilaite (BECKMAN COULTER). Inkubaation jälkeen 0,4 x SSC /0,3% Nonidet P-40 (NP-40) 73 ° C: ssa, laite siirrettiin 2 x SSC /0,1% NP-40 huoneen lämpötilassa, se ilmakuivattiin pimeässä huoneessa . DNA: t vastavärjättiin DAPI (Dojindo), sinetöity suojalasi.

Tulokset ja keskustelu

toteuttamiskelpoisuus Laite On-Chip Immunovärjäys

toteutettavuus esillä oleva laite on-chip yhden syöpäsolun analyysi osoitettiin suorittamalla immunovärjäyksellä jälkeen pyynnin seos kahdesta eri solulinjojen U937-soluissa (malli valkosolujen) ja DU145 soluja (syöpäsolu linja). Solususpensio tuodaan laitteeseen virtausnopeudella 3 ul min

-1. Positiivisen DEP, 10 Vp-p ja sinimuotoinen sähköinen potentiaali 8 MHz, levitettiin lomitettujen ITO elektrodit. Sen jälkeen solu trapping kanssa DEP, suoritimme immunovärjäyty- tunnistamiseksi loukkuun solujen. Loukkuun solut kiinnitettiin, permeabilisoitiin ja värjättiin peräkkäisellä ruiskuttamalla reagenssien laitteeseen aallonpohjasta pääsyn satamaan. Solut värjättiin Hoechst33342 (sininen) värjäämällä DNA: t, FITC-konjugoitu anti-sytokeratiini-vasta-aineita (vihreä) epiteelisolujen ja R-PE-konjugoitu anti-CD45-vasta-aineita (punainen) leukosyyttien soluissa (kuvio 4). Sytokeratiini-positiiviset solut pidetään syöpäsolun, kun taas CD45-positiiviset solut pidetään WBC. Kuvio 4 esittää loukkuun 11 soluja (10 kuoppiin lukien 1 hyvin 2 soluja loukkuun ylhäällä vasemmalla), 3 solut värjättiin anti-CK-aineella (vihreä), joka vastaa syöpäsolun ja 8 solut värjättiin anti-CD45-vasta-ainetta (punainen), joka vastaa WBC. Tällä tavoin tunnistaminen syöpäsolun ja WBC voidaan tehdä vain peräkkäisellä ruiskuttamalla tarvittavat reagenssit laitteeseen ilman monimutkaista läppäjärjestelmän tai lisälaitteita.

Trapped DU145 ja U937-solut värjättiin Hoechst33342 (sininen), anti-sytokeratiini-vasta-aine (vihreä) ja anti-CD45-vasta-aine (punainen). Yhdistetyn kuvan tunnistaa DU145 solujen mallina CTC (sininen + vihreä).

Trapping suorituskykyä eri solulinjoissa tutkittiin laskemalla loukkuun solujen mikrokuoppia jälkeen immunostaning. Kuvio 5A esittää pyydystäminen rakenteessa kunkin solutyyppien, jossa kuva edustaa koko joukko laitteen ja jokainen pikseli edustaa kunkin mikrokaivo. DU145 soluja yleensä loukkuun ylävirtaan mikrokuoppalevyn array taas U937-solut ovat levinneet satunnaisesti mikrokaivo array. Syynä olisi suurempi halkaisija DU145-solujen kuin U937-soluissa, tuottaa suurempia DEP voima, kuten on esitetty yhtälössä (1). Koska voima aiheuttama DEP on verrannollinen kuutiometriä solun säde, DU145 solu vastaanottaa suurempi voima kuin U937. Kokonaismäärä loukkuun DU145-solujen ja U937-solut olivat 763 ja 801, vastaavasti. 39% käyttöön soluja loukkuun osaksi mikrokuoppia, ja 33% mikrokuoppia hoitivat yhden solun. Koska esillä electroactive mikrokuoppia suunniteltiin tehokkaasti ansa yhden DU145 solu, joka halkaisija on suurempi kuin U937, laite näyttää hyvää suorituskykyä yhdellä DU145 solun ansastusta, jossa 728-kuopat miehitetty yhdellä DU145 solut (598-kuopat miehitetty yhdellä DU145 soluja, ja 130-kuopat miehitetty yhdellä DU145 solujen ja yhden U937-solut). Vain 15-kuopat käytössä kaksi tai kolme DU145 solua. Kuitenkin useat U937-solut voidaan helposti loukkuun osaksi samaan mikrokaivoiselle koska U937 (11 um) on pienempi kuin DU145 solun.

(a) Pixel kuva mikrokuoppalevyn laitteessa. Jokainen pikseli vastaa kunkin mikrokaivo laitteeseen ja (b) jakelu sisällön loukkuun solujen mikrokaivo. Värit osoittavat sisältö loukkuun solujen mikrokaivo.

Elinkelpoisuus ja apoptoosimäärityksessä

Tutkimme elinkelpoisuutta loukkuun syöpäsolujen havaitsemiseksi ja valikoivasti analysoida elinkelpoisia CTC jotka voisivat olla mukana etäpesäke. Koska lähes kaikki syöpäsolut veressä tapetaan sytotoksisten solujen kuten T-solut, jne., Ja kuolleet johtuen anoikis tai aiheuttamien vahinkojen leikkausjännitys [22], se on erittäin tunnistamiseen tarvittavat elinkelpoisia syöpäsoluja keskuudessa solupopulaatio tarkempaa analysointia varten. Voit tarkistaa elinkelpoisuutta syöpäsolujen DU145 soluja loukkuun osaksi mikrokuoppia ja viljeltiin laitteen käyttöön viljelyalusta. 6 tunnin kuluttua, loukkuun solut värjättiin calcein (sininen) elinkelpoisten solujen, anneksiini V (vihreä) apoptoosin soluissa tai PI (punainen) kuolleita soluja. Lähes kaikki loukkuun solujen (85%) emittoivat sinistä fluoresenssia, mikä osoittaa, että solut ovat elinkelpoisia jopa sen jälkeen 6 tunnin inkuboinnin laitteen (kuvio 6).

anneksiini V (vihreä) värjää apoptoottiset solu, PI (punainen) värjäytyy kuolleiden solujen ja Kalseiini (sininen) värjää eläviä soluja. Yhdistetyn kuvan tunnistaa sekä apoptoottisia ja kuolleiden solujen (vihreä + punainen). Kuvia solujen loukkuun mikrokuoppia 6 tunnin kuluttua inkubaation.

fluoresoiva in situ hybridisaatio (FISH) B

suorittaa on-chip kalojen EMA paikallistaa läsnäolon tai puuttumisen spesifisten DNA-sekvenssit kromosomeissa koska syöpäsolut usein kromosomeja uudelleenjärjestely varten lääkeresistenssin. Esittely-, B-Cell Lymphoma6 (BCL6; geenistä apoptoosin [23]) geeni uudelleenjärjestely arvioitiin viljellyille PC3-soluissa käyttäen on-chip FISH. FISH-negatiivinen näyttää läheisyys punaisia ​​täpliä (ylävirtaan osa BCL6 geeni) ja vihreät täplät (alavirtaan osa BCL6 geeni). Kun taas FISH-positiivisia esityksiä dual-väri break-erilleen anturi. Kuviossa 7 esitetään tulos FISH-määritys varten PC3 solun mikrokaivo array. Translokaatio apoptoottisen geenin PC3 solut voidaan onnistuneesti tarkastaa on-chip FISH, ja kromosomi 3q27 solun ei aiheuttanut translokaatio koska punainen ja vihreä läikkiä samassa paikassa.

Nuolet osoittavat signaalin BCL6 koetin. Vihreä signaali osoittaa alavirtaan osaa BCL6 geenin ja punainen merkkivalo osoittaa ylävirtaan osa BCL6 geenistä. Yhdistä kuva keltaisena signaali koska punainen ja vihreä signaalit ovat samassa paikassa. Tämä tarkoittaa kromosomin 3q27 ei aiheuta translokaatio.

Johtopäätökset

Tässä tutkimuksessa ehdotimme uusi menetelmä yhden syöpäsolun analyysit käyttäen EMA laitetta. Laite meille mahdollisuuden harjoittaa tehokasta yhteen soluun ansastusta ja kolmenlaisia ​​biokemiallisia; Immunovärjäyksen, elinkelpoisuuden /apoptoosimäärityksessä ja kalaa yksisoluisia tason. Koska loukkuun yksittäinen soluja voitaisiin pitää tukevasti sisällä mikrokuoppia, toteutimme koko prosessi määritykset peräkkäin ruiskuttamalla reagenssien ilman monimutkaisia ​​venttiili tai letku järjestelmiä. Yksinkertainen EMA laite yhdistettynä erittäin herkkä analyyttisiä määrityksiä lupaa suuren suorituskyvyn ja parallelized analyysit harvinaisten syöpäsolujen populaatiossa muita solutyyppejä. Voidaan myös soveltaa tätä tekniikkaa lääkeaineen seulomiseksi ehdokas kasvaimen hoitoon seuraamalla vaste kohdesolujen avulla on-chip määrityksissä.