Krooninen sairaus

tiivistelmä

Huolimatta siitä, että uusi hoito järjestelmät ovat parantuneet eloonjäämisaste potilaiden haastaa peräsuolen syöpä (CRC), ennusteen metastaattisen tilanne on edelleen rajoitettu. Bcl-2-perheen proteiinien on todettu lupaava anti syöpälääkkeen kohde-. Vaikka pieniä molekyylejä kohdistaminen Bcl-2 proteiinit ovat kliinisissä kokeissa, ei tiedetä kovin paljoa niiden vaikutuksista CRC. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia esikliinisesti tutkia arvoa ABT-737 ja Obatoclax kuten syöpälääkkeiden CRC hoitoon. Vaikutukset BH3-jäljittelijät ABT-737 ja Obatoclax CRC soluissa arvioitiin käyttäen elinkelpoisuutta ja apoptoosin määrityksiä. Haavan paranemista muuttoliike ja Boyden kammion invaasio määritykset sovellettu. 3-ulotteinen soluviljelmät käytettiin pitkän aikavälin arviointi hyökkäyksen ja leviämisen. Kliinisesti merkittävinä pitoisuuksina yleiseurooppalaisen Bcl-2-estäjä Obatoclax ei aiheuttanut solukuolemaa. Sen sijaan BH3 jäljittelevä ABT-737 indusoi apoptoosia annoksesta riippuvalla tavalla. Obatoclax aiheutti solulinja erityinen hidastuminen CRC solujen kasvua. Lisäksi Obatoclax, mutta ei ABT-737, talteen E-kadheriiniekspressiota ja johti heikentynyt maahanmuuttoa ja invaasion CRC soluja. Proliferatiivinen kapasiteetti ja invasiivisuus CRC solujen silmiinpistävän inhiboitui pieni annos Obatoclax pitkäkestoiseen 3-ulotteinen soluviljelmissä. Obatoclax, mutta ei ABT-737, aiheutti G1-vaiheen pysähtymisen mukana downregulation sykliini D1 ja säätelyä p27 ja p21. Yli-ilmentymisen Mcl-1, Bcl-x

L tai Bcl-2 päinvastaiseksi estävää vaikutusta muihin Obatoclax muuttoliikettä mutta epäonnistui palauttaa proliferatiivista kapasiteettia Obatoclax käsiteltyjen CRC soluissa. Esitetyt tiedot osoittavat, laaja ja monipuolinen antituumorivaikutukset yleiseurooppalaisen Bcl-2-estäjä Obatoclax CRC soluissa. Toisin kuin ABT-737, Obatoclax esti muuttoliike, invaasion ja proliferaation sublethal annoksina. Yhteenvetona, tässä tutkimuksessa suositellaan yleiseurooppalaisen Bcl-2-estoon on lupaava lähestymistapa kliinisten tutkimusten CRC.

Citation: Koehler BC, Scherr AL, Lorenz S, Elssner C, Kautz N, Welte S, et al . (2014) Pan-Bcl-2 Inhibitor Obatoclax Myöhästymiset solusyklin etenemisen ja Blocks muutto peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 9 (9): e106571. doi: 10,1371 /journal.pone.0106571

Editor: Andrei L. Gartel, University of Illinois at Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 23 maaliskuu 2014; Hyväksytty: 30 heinäkuu 2014; Julkaistu: 05 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Koehler ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki tiedot sisältyvät paperin.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Postdoctoral-Fellowship myönnetty BCK alkaen lääketieteellisen tiedekunnan yliopiston Heidelberg, Saksa (http: //www.medizinische-fakultaet- hd.uni-heidelberg.de), ja avustukset HSB Saksan tutkimussäätiön (Deutsche Forschungsgemeinschaft, https://www.dfg.de/, DFG SCHU 1443 /4-1). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kolorektaalisyöpää (CRC) edustaa neljäs kuolinsyy syöpään [1]. Esiintyvyys kasvaa maailmanlaajuisesti ja 40% kaikista potilaista on kaukainen elimen etäpesäke aikaan ensimmäisen diagnoosin. Systeemisen hoidon lähestymistavat ja leikkaus ovat parantuneet kokonaiselinaika, mutta ennusteen UICC vaiheessa IV on edelleen heikko. Bcl-2-proteiinin perhe koostuu keskeisten sääntelyviranomaisten apoptoosin toimii klo mitokondrion pinnalle. Antiapoptoottisten perheenjäsenet säädöksen sitomalla heidän proapoptoottiset sukulaiset, minkä vuoksi se suojaa solun kuolemalta. Antiapoptoottisten proteiinit Mcl-1, Bcl-2 ja Bcl-x

L on osoitettu olevan yliaktiivista useita yhtenäisiä ja hematologiset syövän yksiköille, myös CRC [2] – [4]. Nämä havainnot johtivat tutkintaan useita yhdisteitä suoraan kohdistaminen antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien. Ns BH3-jäljittelijät toimivat sitoutumalla BH3 halkeama antiapoptoottisten proteiinien [5]. Tämä vuorovaikutus johtaa vapautumisen proapoptoottiset Bcl-2-proteiinien lopulta edistää solukuolemaa. Kliiniset tutkimukset ovat osoittautuneet turvallisuutta ja tehoa BH3 jäljittelijät erilaisissa hematologisissa ja muutama kiinteät syöpäsairauksia [6]. Huolimatta kliiniset tutkimukset, voimassa prekliiniset tiedot tehoon BH3 jäljittelijät kuin hoitovaihtoehto CRC ovat rajalliset. Tässä tutkimuksessa tutkimme kasvaimen kasvua estävä aktiivisuus Obatoclax ja ABT-737 on CRC-soluissa. Molemmat ovat pienimolekyylisiä estäjiä antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien. Ne eroavat profiilin esto, koska ABT-737 ei estä Mcl-1 taas Obatoclax on yleiseurooppalainen Bcl-2-estäjä. Tutkimuksemme osoittaa, että ABT-737 indusoi solukuolemaa erilaisissa CRC solulinjoissa. Sen sijaan solukuolemaa indusoiva kapasiteetti Obatoclax on rajoitettu ja vaihtelee CRC-solulinjat.

kyky muuttaa ja hyökätä vieraita kudoksia on yhteinen piirre syöpäsolujen dramaattisesti edistää maligniteetti taudin. Ryhmämme on viime aikoina osoittanut, että downregulation Mcl-1, Bcl-x

L tai Bcl-2 johtaa silmiinpistävää heikentynyt muuttoliikkeen ja invaasion CRC solujen [7]. Täällä me tutkia merkitystä BH3-jäljittelijät Obatoclax ja ABT-737 niille pahanlaatuinen ominaisuuksia. Toisin kuin ABT-737, subletaalit annokset Obatoclax lohkon muuttoliikkeen ja invaasion CRC solujen Bcl-2-proteiinin riippuvaisella tavalla.

Lisäksi tämä tutkimus pyrkii arvioimaan proliferatiivista kapasiteettia CRC käsiteltyjen solujen Obatoclax ja ABT-737. Matala annos Obatoclax, mutta ei ABT-737, on vaikuttava estäviä vaikutuksia solusyklin etenemisen ja lisääntymistä. Tässä kuvaamme antiproliferatiivisia vaikutuksia Obatoclax riippumaton Bcl-2-proteiinien.

Yhteenvetona tietomme paljasti, että yleiseurooppalainen Bcl-2-estäjä Obatoclax kohdistaa eri antituumoriaktiivisuuksia riippumattomia solukuoleman induktio, suositellaan pannulla-Bcl- 2 eston kliinistä jatkokehitystä kolorektaalisyövässä.

tulokset

ABT-737, mutta ei Obatoclax mesylaatti indusoi apoptoosia CRC soluissa

arvioimiseksi solukuolemaa käsittelyn jälkeen CRC-solujen jossa Obatoclax ja ABT-737: ssa 48 tuntia, olemme analysoineet DNA pirstoutumista virtaussytometrialla. ABT-737 aiheutti solukuolemaa kaikissa solulinjoissa tutkittiin annosriippuvaisesti. Silmiinpistävin vaikutus havaittiin Colo205-soluja (yli 90% apoptoottisia soluja 48 tunnin kuluttua hoidon 10 uM ABT-737, Fig. 1A). Sen sijaan, kasvavien pitoisuuksien Obatoclax vain hieman indusoimaa solukuolemaa SW480, Colo205 ja Caco2-soluissa.

(A ja B) virtaussytometrinen analyysi DNA-pirstoutuminen indikaattorina apoptoottista kuolemaa neljä CRC solulinjoissa; 48 h hoidon ABT-737 tai Obatoclax. (C) MTT-määritystä HT29 kuluttua 72 h Obatoclax ja ABT-737 käsittelyä. (P-arvot: Oba 0,25 uM: 0,003; Oba 0,05 uM: 0,004; ABT-737 5 uM: 0.589) (D) edustaja Western blot varten pilkotun PARP kuluttua 24 h Obatoclax hoitoa. Tubulin toimi latauskontrollina. 2 uM hoito Staurosporiini 24 tunnin toimi positiivisena kontrollina solukuoleman induktioon. Määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Pylväät edustavat keskiarvoa ± SD. Määritykset ovat edustaa vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Oba = Obatoclax, STS = Staurosporiini.

HT29 ei osoittanut apoptoottinen DNA pirstoutuminen (Fig. 1 B).

varmistettiin lisäksi havaintomme Western blottauksella varten lohkaistun PARP. Mukaisesti virtaussytometrialla tiedot, ei ollut pilkottu PARP havaittavissa kaikissa CRC solulinjoissa kuten esimerkinomaisesti esitetty HT29 ja SW480 kuvassa. 1D.

Sen tutkimiseksi vaikutuksia Obatoclax jakautumiseen, me seurasimme solujen kasvua HT29 ajan (72 h). Solujen kasvu inhiboituu jopa pienellä annoksella Obatoclax, kun taas käsittelemättömät ja ABT-737 käsitellyissä soluissa edelleen lisääntyä. Tämä tulos on osoitus voimakas vaikutus Obatoclax on proliferatiivinen kapasiteetti (kuvio 1 C).

Seuraavaksi pyrittiin arvioimaan teho Obatoclax rinnalla kemoterapeuttisten aineiden hyväksytty CRC hoitoon. Havaitsimme, että Oksaliplatiini: n sytotoksisuus lisääntyi yhdistettynä Obatoclax. Vaikutukset näkyvät hoidon ajaksi 48 tunnin tavanomaisissa soluviljelmässä ja edelleen validoitu hoidon ajaksi 7 päivää 3D soluviljelmässä (Fig. S3). Kumpikaan Obatoclax eikä Oksaliplatiini yksin kykenivät indusoimaan solukuoleman SW480-soluissa (Prosenttiosuus pilkotun PARP positiivisten solujen: 1,3% [käsittelemätöntä], 1,7 [0,25 uM Obatoclax] ja 1,6% [20 uM Oksaliplatiini]). Sen silmiinpistävä sijaan 22,7% soluista koki apoptoosin kuten osoitetaan pilkotun PARP värjäystä kun Obatoclax ja Oksaliplatiini yhdistettiin (Fig. S3C). Tärkeää on, että ei ollut herkistävää vaikutusta yhdistelmän Obatoclax 5-FU: ta (tuloksia ei ole esitetty). Yhdessä havaintomme osoittavat annosriippuvaisen solukuoleman induktion ABT-737 ja annoksen ja solutyypin riippuva vaikutus proliferaatioon Obatoclax. Yhdistelmä Bcl-2: n estäjien ja kemoterapiaa, esim. oksaliplatiini, olisi analysoitava mahdollisena hoito lähestymistapa tulevissa tutkimuksissa.

Obatoclax toipuu E-kadheriinin CRC-soluissa, mutta jättää antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinin tasot muuttumattomana

Olemme äskettäin osoittaneet, että siRNA -välitteisen downregulation antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien heikentää maahanmuutto- ja invaasion CRC solujen [7]. E-kadheriinin on ensisijaisesti kalvoon sitoutunut proteiini, jonka keskeinen toiminto noudattamista risteyksissä ja Wnt-signaloinnin. Se on osoitettu menetetään malignin transformaation aikana [8]. Näyttävästi, löysimme merkittävä talteenotto E-kadheriinin kaikissa solulinjoissa, paitsi SW480-solujen, kun Obatoclax hoidon (Fig. 2A). Huomattavaa on, että N-kadheriinin, joka on raportoitu edistäjänä maahanmuuttoa, ei ollut havaittavissa neljässä solulinjoissa tutkittu (tuloksia ei ole esitetty) [9].

(A) Western blottauksella E-kadheriinin neljässä CRC solulinjoissa kuluttua 24 h hoidon Obatoclax suurennettavin annoksina (vasemmalla). Vastaavat Densitometrinen analyysi verrattuna käsittelemättömien kontrollien ja säädettiin Tubulin kuin latauskontrollina. (B) Western blotting varten Mcl-1, Bcl-2 ja Bcl-x

L HT29 (vasemmalla) ja SW480-soluja (oikealla) 24 tunnin jälkeen hoidon Obatoclax. Tubulin toimi latauskontrollina. Western blotit edustavat vähintään kolme blotteja riippumattomien kokeiden.

Toiset kertoivat, että antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien, esim. Ui-1, oli nopeasti ja täydellisesti pilkotut syöpäsoluja käsitellään Obatoclax [10]. Jyrkästi, tuloksemme osoittavat, ei laskua Mcl-1, Bcl-2 tai Bcl-x

L tasolla. Melko päinvastoin kokosolu proteiini immunoblottaus paljasti tehostettuun Bcl-x

L ja hieman enemmän Bcl-2 tasot HT29 kaikille Obatoclax pitoisuuksien sovellettu (Fig. 2B, vasen). Vuonna SW480-soluissa, Bcl-2 ja Bcl-x

L nousivat matalan annoksen Obatoclax, mutta osoitti tasot samanlainen käsittelemättömiä soluja suuremmat Obatoclax annoksia (Fig. 2B, oikea). MCL-1 tasot osoittivat merkittävämpi nousu alle Obatoclax hoitoon verrattuna Bcl-2 ja Bcl-x

L HT29 (Fig. 2B, vasen). Ei merkittäviä muutoksia Mcl-1 tasot havaittiin SW480-soluissa (kuvio. 2B, oikea).

Matala annos Obatoclax silmiinpistävän heikentää maahanmuutto- ja invaasion CRC solujen

Jotta voitaisiin edelleen tutkia vaikutus Obatoclax CRC soluihin, suoritimme haavan paranemista muuttoliike määrityksiä. Jopa subletaali annokset kykenivät massiivisesti heikentää muuttavien kapasiteetti HT29 ajan. 48 h jälkeen mitattu kaventamiseksi oli 650 um kontrollisoluissa verrattuna 263 um Obatoclax käsitellyissä soluissa (Fig. 3A ja B, p 0,001). Lisäksi Caco2 solut vaelsivat merkitsevästi vähemmän hoidon aikana 0,25 uM Obatoclax. Kaventamiseksi oli 901 vs. 744 um (Fig. 3C, p 0,05). Huomattavaa on, että ABT-737 eivät estäneet maahanmuuttoa edes annoksella 5 uM kuvion. S1.

(A) edustaja kuvaa haavan paranemisen tyhjästä määrityksissä ajoneuvon (ylempi) ja Obatoclax (alempi) käsiteltiin HT29. Mittakaava hakea kaikki kuvat. (B) Gap sulkeminen HT29 kuluttua 48 h hoidon Obatoclax. (C) Gap sulkeminen Caco2 käsiteltyjen solujen 48 h Obatoclax. Määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Pylväät edustavat keskiarvoa ± SD. Määritykset ovat edustaa vähintään kolmen itsenäisen kokeen. * P 0,05, *** p 0,001. Oba = Obatoclax.

kolmiulotteisen soluviljelmäjärjestelmiä paremmin fysiologisia solun kasvua sekä morfologian ja edistää solu-vuorovaikutuksiin [11]. Lisäksi kolmiulotteinen järjestelmä nostaa esiin mahdollisuuden tehdä pitkään soluviljelmäkokeita lukien lääkealtistuksen saada enemmän tietoa kuin tavanomainen soluviljelmässä. Siten käytimme polystyrol tukirunkoja 7 päivän Obatoclax käsittely ja sen jälkeen arvioinnin invaasion, proliferaation ja apoptoosiin. HT29-solut eivät näytä apoptoosin induktion jälkeen hoidon Obatoclax (Fig. 1 B ja D). Silmiinpistävän oli massiivinen saarto invaasio 3D pitkällä aikavälillä soluviljelmässä (Fig. 4A ja B). Lisäksi Colo205 osoitti syvästi alentunut muuttoliikkeen pitkän aikavälin soluviljelmässä kuten osoitetaan lasku invaasion syvyyteen (Kuva. S2). Ei apoptoosin induktio, mutta arvonalentumista leviämisen, kuten pienentämällä Ki67 positiivisuus, havaittiin (Fig. S2). Tämä havainto korostaa edelleen laajaa antitumor tehokkuutta Obatoclax osalta Siirron estävä diagnosoimiseksi antiproliferatiivinen vaikutus, riippumaton solukuoleman induktioon.

(A) edustaja kuvia HT29 solujen tukirunkoja 7 päivän jälkeen hoidon Obatoclax (hematoksyliinillä ja eosiini värjäystä. Mittakaava koskee sekä kuvia) (B) Vastaava analyysi invaasion syvyyttä tukirunkoja. Määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Pylväät edustavat keskiarvoa ± SD. Määritykset ovat edustaa vähintään kolmen itsenäisen kokeen. *** P 0,001. Oba = Obatoclax.

Seuraavaksi tutkimme invasiivisuuden SW480-soluja käsiteltiin pienellä annoksella Obatoclax Matrigel sisälsi Boyden kammion määrityksessä. Jotta voidaan osoittaa asianmukainen kiinnitys solujen Obatoclax sisältävässä väliaineessa, soluja aiemmin ympättiin polystyrol levyille seurasi MTT-analyysi 24 tunnin kuluttua. Ei ollut heikentynyt kiinnitys havaittu läsnä Obatoclax (tuloksia ei ole esitetty). Invasion oli silmiinpistävän esti käsitellyissä soluissa 0,25 uM Obatoclax (293 tunkeutuneet kontrollisoluja vs. 89 tunkeutuu Obatoclax käsiteltyjä soluja, p 0,001, Fig. 5), ja edelleen kumottiin soluissa, joita käsiteltiin 0,5 uM Obatoclax (293 tunkeutuneet kontrollisoluja vs. 59 tunkeutuneet Obatoclax käsiteltyjä soluja, p 0,001, Fig. 5).

SW480-soluja ympättiin saliin on transwell. 48 h ymppäyksen jälkeen, ytimet alapinnan visualisoitiin Hoechst-värjäys. (A) edustaja kuvaa alemman insertin pinta jälkeen Hoechst värjäyksen (asteikko bar ilmoitettava suurennos kaikille paneelit). (B) Viisi näkökenttien kohti insertin laskettiin. N = 5 ryhmää kohden. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Määritykset ovat edustaa vähintään kolmen itsenäisen kokeen. *** P 0,001. Oba = Obatoclax, ctrl = ohjaus.

yli-ilmentyminen antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien palauttaa migraatio Obatoclax käsiteltyjen CRC solujen

Seuraavaksi selvitti sitoutumista antiapoptoottisten Bcl-2 proteiinien siirtymisen estävää fenotyyppi aiheuttamia Obatoclax. Löysimme huomattavaa elpymistä maahanmuuton HT29 käsiteltiin 0,25 uM Obatoclax mutta yli-ilmentävät antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien. Tämä fenotyyppi palataan vaikutus havaittiin Mcl-1 (p 0,05), Bcl-x

L (p 0,001) ja Bcl-2 (p 0,001), ja voimakkain vaikutus Bcl-2 (Fig. 6A-D). Yliekspressio antiapoptoottisten proteiinien jatkuvasti tukossa estyminen muuttoliikkeen alle Obatoclax hoitoa yli 72 tuntia. Se on erittäin tärkeää tässä yhteydessä varmistamaan, että palauttaminen maahanmuutto ei ole toissijainen ominaisuus lisääntynyt leviämisen takia yli-antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien. Siksi tutkimme lisääntymistä soluissa yli-ilmentävät Mcl-1, Bcl-2 tai Bcl-x

L. Olemme havainneet, vaikutusta jakautumiseen tahansa proteiinien tutkittiin, kuten on esitetty yksityiskohtaisemmin kuviossa. S4. (A-D).

(A-D) Gap sulkeminen haavan paranemista muuttoliikkeen määrityksissä HT29 käsitelty Obatoclax. (A) Vector ja Mcl-1 transfektoiduissa soluissa (B) vektori ja Bcl-x L transfektoiduissa soluissa ja (D) vektori ja Bcl-2-transfektoiduissa soluissa. (C) edustaja kuvia haavan paranemisen vektori ja Mcl-1 transfektoituja soluja käsiteltiin Obatoclax. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Määritykset ovat edustaa vähintään kolmen itsenäisen kokeen. *** P 0,001. Vec = vektori.

Matala annos Obatoclax estää leviämisen kautta G1-vaiheen pysähtymisen mukana säätelyyn ylöspäin p27 ja p21 sekä downregulation sykliini D1

Koska CRC solujen 3D tukirunkoja osoittivat arvonalentumisen leviämisen alle pitkän aikavälin hoidon Obatoclax, päätimme edelleen leikellä solukierron säätelyssä. Värjäys DNA sisällön alle Obatoclax hoitoa paljasti valtavan siirtymistä G2- G1-vaiheen solusyklin joka on osoitus G1-vaiheen pysähtymisen tai häiritsi G1-vaiheen siirtyminen. Osuus solujen G2-vaiheen laski 37% kontrolli solujen 13%: HT29 käsiteltiin 0,25 uM Obatoclax (Fig. 7A ja B, p 0,001).

(A) edustaja virtaus cytomeric analyysi DNA sisällön HT29 käsiteltiin 0,25 uM Obatoclax. 2N = diploidisoluissa G1-vaiheessa, 4N = tetraploidi solut G2-vaiheen. (B) Graafinen analyysi solusyklin vaiheen jakauma vastaa (A). Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. *** P 0,001. (C) Rel. mRNA tasot sykliini D1, p21 ja p27 in HT29 ja CaCo 2 solut 24 tunnin kuluttua hoidon Obatoclax. mRNA-tasot kvantitoitiin QRT-PCR ja normalisoitiin GAPDH kuin taloudenhoito geeni. Määritykset ovat edustaa vähintään kolmen itsenäisen kokeen. (D) edustaja Western blotit sykliini D1, p21 ja p27 vuonna HT29 ja Caco2 soluja käsiteltiin Obatoclax 24 tuntia. Tubulin toimi latauskontrollina. Oba = Obatoclax, ctrl = ohjaus.

Lisäksi pyrittiin määrittämään keskeinen solusykliä sääteleviä proteiineja alle Obatoclax hoitoa. Sykliini D1 (CD1) edustaa avaimen Cyclin G1-vaiheen siirtyminen [12]. CD1 oli merkittävästi vaimentua alle Obatoclax hoito sekä mRNA ja proteiini tasolla HT29 (0,5 kertainen muutos) ja Caco2 soluja (yli 0,5 kertainen muutos, Fig. 7C ja D). p27 on sykliini riippuvaisen kinaasin estäjä (CDKI) ja sen säätelyä osoittaa solusyklin pysähtymisen [13]. Havaitsimme säätelyyn ylöspäin p27 mRNA: n ja proteiinin tasot HT29 ja Caco2-solut käsiteltiin Obatoclax (Fig. 7C ja D). Lisäksi havaitsimme merkittävä ja annosriippuvainen lisäys sykliiniriippuvaisten estäjät p21 mRNA ja proteiini tasoilla HT29 ja Caco2 soluja (Kuva. 7C ja D). Yhdessä nämä tiedot ilmaisevat solusykliä sääntelyä Obatoclax kautta keskeinen säätelyproteiineilla solusyklin siirtymävaiheessa, kuten sykliini D1, P27 ja p21.

Keskustelu

Anitapoptotic jäsenet Bcl -2 proteiini perhe usein yli-ilmentyy ihmisen syövissä, mukaan lukien CRC [3]. Korkea antiapoptoottisten proteiinien on osoitettu myötävaikuttavan huono hoidon vastetta ja edistää kasvaimen etenemistä. Esimerkiksi Bcl-x

L ilmaisu korreloi imusolmuke etäpesäke, huono erilaistumista ja korkeampi Herttuan vaiheessa CRC [14]. Expression malleja Mcl-1 ovat ennustavia terapiaan vaste potilailla diagnosoitu metastasized CRC [15]. Siksi suuria ponnisteluja on tehty, jotta voidaan kohdistaa antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien, joilla pyritään syöpäsolun kuoleman induktion [16]. Tärkeää on, syvempi mekanistinen ja rakenteellinen oivalluksia johti kehittämiseen pienmolekyylisalpaajilla antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien. Tämä luokka pienten molekyylien toimii sitoutumalla hydrofobinen BH3-halkeama antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien siten matkien proapoptoottiset Bcl-2-proteiinien ja edistää solukuolemaa [17]. Turvallisuus ja annoshakututkimuksessa tutkimuksiin Obatoclax on tehty kiinteässä maligniteettien ja lymfooma [18], [19]. Huolimatta siitä, että BH3-jäljittelijät ovat jo varhain kliinisissä tutkimuksissa vain harvat tiedetään vaikutuksista Bcl-2-proteiinin inhibitio lukuun ottamatta solukuolemaa asetuksen [18], [19]. Olemme äskettäin osoittaneet, että knockdovvn Mcl-1, Bcl-2 tai Bcl-x

L silmiinpistävän estää invasiivisuus CRC soluja. Tässä edellisessä tutkimuksessa knockdown yhden Bcl-2-proteiinin (Mcl-1, Bcl-2 tai Bcl-x

L) oli riittävä estämään muuttoliikettä ja invaasiota [7].

Perustuen näiden aikaisempien tutkimusten meidän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia mahdollisuuksia Bcl-2 estämällä pieniä molekyylejä lääkeainekandidaateiksi CRC hoitoon

in vitro

. Ensin on verrattu Bcl-2 ja Bcl-x

L estäjä ABT-737 kanssa yleiseurooppalaisen Bcl-2-estäjä Obatoclax. Suora vertailu kahden estäjien sallii erottavien vaikutusten laaja yleiseurooppalainen Bcl-2 estosta Obatoclax peräisin tarkemmalla tavalla käyttäen ABT-737. Huolimatta siitä, että molemmat estäjät osoittivat merkittävää toksisuutta kliinisissä tutkimuksissa näitä yhdisteitä voidaan käyttää työkaluina prekliinisen

in vitro

käytönaikainen testaus Bcl-2-estoon [19] – [22]. ABT-737: n on osoitettu synergisesti Oksaliplatiini ja Selekoksibi tappoprosentin CRC-solujen [23], [24]. Havaitsimme annosriippuvainen apoptoosin induktion aiheuttama ABT-737 kaikissa solulinjoissa tutkittu. On hyvin dokumentoitu, että vastus kohti ABT-737 voidaan ohjata korkeita Mcl-1 estämällä proapoptoottiset NOXA [25]. Aivan hiljattain on osoitettu, että syöpäsoluja hypoksinen olosuhteet resensitized ABT-737, jonka menetys Mcl-1 [26]. Koska vaikutukset ABT-737 ovat selvästi proapoptoottiset ja determinantit herkkyyttä CRC on hyvin dokumentoitu, päätimme edelleen keskittyä antituumorivaikutukset Obatoclax.

Aivan toisin kuin ABT-737, Obatoclax ei johtanut merkittäviin solukuoleman induktio CRC soluissa. Tutkimuksessamme Obatoclax annokset olivat kliinisesti merkittäviä, kuten on esitetty vaiheen I tutkimuksissa eikä saavuta yhdiste IC

50 raportoitu Obatoclax [19], [27] Mielenkiintoista, Obatoclax hoito johti vakaita tai laajenemassa ekspressiotasot kaikkien antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien tutkittu. Toinen tutkimus osoitti downregulation antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien alle Obatoclax hoitoa lymfooman soluissa [10]. Koska tämä tutkimus osoittaa apoptoosin lymfoomasolujen aiheuttaman Obatoclax, alentuneesta antiapoptoottisten proteiinien voisi olla toissijainen aikana solukuoleman sijasta laukaisee suoraan sitova vaikutus Obatoclax.

Knockdown tai yliekspressio Mcl-1 Bcl-2 tai Bcl-x

L ei viive solusyklin etenemisen ja leviämisen CRC soluissa [7]. Sitä vastoin alhaisen annoksen Obatoclax hoito aiheutti viivästyneen leviämisen tutkimuksessamme. Havaitsimme G1-vaiheen pysähtymisen mukana menetys sykliini D1 ilmentyminen ja säätelyä p21 ja p27. Sykliini D1 (CD1) on näkyvin G1-vaiheen sykliini ja on raportoitu onkogeenisessä kuljettaja syöpäsoluissa. CD1 ilmentyminen liittyy neoplastisen transformaation ja lisääntynyt syöpään syöpään [12]. G1 /S-faasimuutos on tiukasti säännelty CDKIs kuten p21 ja p27 kautta inaktivoitumisen G1 sykliini-sykliini riippuvainen kinaasien (CDK) kompleksit [13], [28]. Yhdessä meidän tietojen mukaan uusi solusyklin säätelevä ominaisuus Obatoclax kautta G1-vaiheen pysähtymisen. Tätä vaikutusta ei ole antagonisoi yliekspressio antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien. Lisäksi kumpikaan yliekspressio antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien eikä ABT-737 vaikuttaa solusyklin etenemisen. Viivästyttää solusyklin ja haittaa hallitsematon kasvu CRC solujen on ilmeisesti Bcl-2-proteiinin itsenäistä vaikutusta Obatoclax. Vaikka tarkka taustalla olevien mekanismien ja asianomaisten tavoitteet ovat vaikeasti, se voisi olla mahdollista, että mTOR signalointi on merkitystä tässä yhteydessä. Sitomisaktiivisuudes- Obatoclax on mTOR sekä myöhäisessä vaiheessa autophagy esto on hiljattain todettu ja voisi olla kausaalinen rooli kuvattujen antiproliferatiivisia vaikutuksia [29], [30]. Lisäksi kunnon molekyyli- analyysejä perusteltua leikellä Obatoclax asiaan vaikuttavat solukierron säätelyssä. Esimerkiksi CDK voidaan tutkia mahdollisina kohteina Obatoclax tulevissa tutkimuksissa.

Perinteiset kemoterapia-ovat tehokkaimmin jäljittelevän syöpäsoluja. Vaikka me osoittavat selvästi, että Obatoclax vähentää proliferatiivista ominaisuuksia CRC solujen tietomme osoittautuu Obatoclax kykyä voittaa solukuolemaan vastustuskyvyn Oksaliplatiini SW480-soluissa. Terapeuttinen potentiaali yhdistää platinan-pohjainen solunsalpaajahoitojen kanssa Obatoclax voittamiseksi apoptoosiresistenssiin on jo raportoitu ja on edelleen korostettu meidän data [31], [32]. Ruokatorven syöpä soluja, Obatoclax oli synergistinen toiminta yhdessä 5-FU: n [32]. Tutkimuksessamme synergiavaikutuksen Obatoclax rajoittuivat Oksaliplatiinilla osoittaa syöpäsolussa tyyppi riippuvainen vaikutus. Vahva vaikutukset Obatoclax on autophagy on osoitettu useissa viimeaikaisissa tutkimuksissa [32] – [34]. Kuitenkin merkitystä Obatoclax aiheuttaman autophagy signalointi edelleen heikko CRC.

Muuttoliike ja hyökkäys ovat edellytyksiä syöpäsolujen leviämistä, mikä johtaa paikalliseen invaasiota ja etäinen elin etäpesäke [35] – [37]. Ryhmämme osoittivat äskettäin sääntelyyn tehtäviä antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien maahanmuutosta ja invaasion CRC solujen riippumattomia solukuoleman ja lisääntymistä [7]. Kun otetaan huomioon, että Obatoclax voinut riittävästi aiheuttaa kuoleman CRC soluissa, tutkimme muuttoliikkeen ja invaasion CRC soluja Obatoclax hoitoa. Silmiinpistävän, pieni annos Obatoclax tukossa muuttoliikettä ja invaasio kaikissa solulinjoissa tutkittu. Pitkäaikainen 3D soluviljelmässä CRC soluja Obatoclax käsittely vahvistaneet tämän saarron muuttoliikkeen puutteesta huolimatta solukuoleman induktion. Tärkeää on, muuttoliike esti Obatoclax resistenttien solulinjojen kuten Colo205 ja Caco2. Kadheriineja ovat tärkeitä säätelijöitä solujen kiinnittymistä ja ovat mukana suuria signalointi verkkoja, kuten Wnt. On osoitettu, että ehdollinen suoliston erityinen tyrmäyksellä E-kadheriinin aiheutti lisääntynyttä maahanmuuttoa ja lisääntymistä suolessa [38]. Toisaalta, ilmentyminen E-kadheriinin hidastui muuttoliike ja lisääntymistä suolen kryptissa [39]. Vuonna peräsuolen syövän synnyn, funktionaalinen poistaminen E-kadheriineja on keskeinen vaihe hankintaan invaasiokyvyn [40]. Me siis pyritään tutkimaan muutoksia E-kadheriiniekspressiota. Osoitamme syvällinen palauttaminen E-kadheriinin CRC soluja hoidon Obatoclax. Kuitenkin E-kadheriinin ilmentymisen lisääntyminen voi edustaa molekyylitasolla kytkin takaisin vähemmän invasiivisia fenotyyppiä CRC solujen aiheuttaman Obatoclax.

Mikä tärkeää, ja toisin kuin kasvua estävä toiminto Obatoclax, muuttoliike oli täysin kunnostettu vuonna CRC soluissa yli-ilmentävät Mcl-1, Bcl-2 tai Bcl-x

L. Yhteydessä invasiivisuus, antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien näkyvät tärkeimmät vaikutusalaan tavoitteita. Tämä on linjassa aikaisempien raportti osoittaa säätelytoimintaa antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien on CRC solun invasiivisuus vaikuttamatta leviämiseen tai indusoimalla solukuolemaa [7]. Muut tutkimukset tukevat olettamusta, että Bcl-2-proteiinit ovat olennaisia ​​etäpesäkkeiden [41] – [43]. Kääntäen, ABT-737 hoito ei riitä estämään muuttoliikettä ja invaasion CRC soluja. Tutkimuksessamme osoitamme, että Obatoclax pystyy estämään molempien, muuttoliike ja invaasio, jopa hyvin pieninä annoksina. Tämä vaikutus Obatoclax on uusi ja huomattavasti, jopa pääasiallisesti resistentit solut. Koska ABT-737 ei estä muuttoliike, ehdotamme agentti-erityinen ja ainutlaatuinen piirre Obatoclax ryhmässä yhdisteitä kohdistaminen Bcl-2-proteiinien.

Johtopäätös

tietojen perusteella meidän tutkimus, voimme päätellä, että Pan-Bcl-2-estäjä Obatoclax ehkäisee erilaisten biologisten prosessien kannalta syövän etenemiseen. Tehoa Obatoclax CRC soluissa on laaja ja sisältää solukuoleman riippumaton mutta Bcl-2-proteiinin koukkuun eston muuttoliikettä. Toinen merkittävä vaikutus vaikuttaa solusyklin etenemisen ja on riippumaton Bcl-2-proteiinin kohdistamista. Siten pan-Bcl-2-estoon, kuten uusien erityisten ja vähemmän myrkyllisiä estäjien, on lupaava lähestymistapa CRC hoitoon ja tulisi analysoida tarkemmin, esim. yhdistettynä kemoterapia.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit ja solulinjoissa

CRC solulinjoissa HT29, SW480, Caco2 ja Colo205 ostettiin ATCC. Soluja viljeltiin kostutetussa atmosfäärissä (37 ° C, 5% CO

2) RPMI + Glutamax (Gibco, Karlsruhe, Saksa), johon oli lisätty 10% FCS: ää (PAA Laboratories, Cölbe, Saksa), 1% Pen /Strep (PAA Laboratories), 1% HEPES (Gibco) ja 1% ei-välttämättömiä aminohappoja (NEAA, Gibco). Obatoclax ja ABT-737 ostettiin Selleckchem (München, Saksa), Oksaliplatiini Sigma-Aldrich (München, Saksa).

Elinkelpoisuus ja solujen kasvua koe

Solut ympättiin 12-kuoppalevyille ja 24 h ymppäyksen jälkeen transfektoituja tai käsiteltävä ilmoitetulla. Solukasvu määritettiin käyttämällä kolorimetristä 3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT), kuten on kuvattu [7].

Quantitative reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (q-RT-PCR) B

n eristäminen kokonais-RNA: n ja cDNA: n synteesi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [44]. Q-RT-PCR suoritettiin käyttäen aluketta määritystä sarjat (Qiagen, Hilden, Saksa). Datan hankinta ja määritys geenin ilmentyminen suoritettiin käyttäen LightCycler-ohjelmistopaketti (Roche, Mannheim, Saksa). Kukin PCR-reaktio ajettiin kaksoiskappaleet. mRNA: n ekspressio oli normalisoitu ilmentymisen housekeeping-geeni GAPDH.

havaitseminen apoptoosin ja solusyklin vaihe jakelu

Päivänä yksi transfektion jälkeen, solut käsiteltiin kuten 48 tuntia. Supernatantti siirrettiin FACS-putkiin ja solut sitten varovasti irrotettiin käyttäen Accutasella. Sentrifugoinnin jälkeen solut suspendoitiin uudelleen hypotoniseen puskuriin, joka sisälsi 0,1% (w /v) natriumsitraattia, 0,1% (v /v) Triton X-100 ja 50 ug /ml propidiumjodidilla (Sigma-Aldrich). 1 tunnin inkubaation 4 ° C: ssa, DNA: n kokonaismäärä solujen mitattiin protokollan Nicoletti

et al.

Käyttämällä virtaussytometria [45]. Solusyklin analyysi tehtiin käyttämällä FACS Diva 6 (Becton Dickinson) ja FlowJo 7.6.5. (Puu Star Inc.). Solut, jotka kuvaavat sub-G1 osa kuvattiin apoptoottisiksi.

Solulyysis, SDS-Page, Western-blottauksella ja tiheysmittaus

Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille, niitä viljeltiin 24 tuntia ja käsiteltiin, kuten osoitettu. Solulyysiksen, SDS-Page ja Western blotting suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [46].