Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Perustuu prekliinisessä havaintojen arvioimme tehoa kasvaimensisäistä injektion dendriittisolujen (DC) transdusoidaan adenovirusvektori ilmaisemiseen toissijainen lymfaattisen kemokiinin (CCL21) geeni (Ad-CCL21-DC) faasin I tutkimuksessa kehittynyt ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Vaikka tämä lähestymistapa osoittaa immuunivahvistus, valmistelu autologisten DC CCL21 geenimuuntelun on hankalaa, kallista ja aikaa vievää. Me arvioimme ei-DC lähestymistapa, jossa käytetään holvi nanopartikkeleiden kasvaimensisäistä CCL21 toimitettavaksi välittäjänä antituumorivaikutus keuhkosyövässä.

Keskeiset havainnot

Ohessa kuvataan, että holvi nanokapselissa alustan CCL21 toimitus aikaansaa antituumorivaikutus inhibitioon keuhkosyöpään kasvua. Vault nanokapselissa pakattu CCL21 (CCL21-holvit) osoitti toiminnallinen aktiivisuus kemotaktinen ja antigeenia esittelevien aktiivisuuden määrityksiä. Rekombinantti holvit vaikutti kemotaktinen migraation T-solujen ja tämä vaikutus oli pääasiassa CCL21 riippuvaisen CCL21 neutralointi kumosi CCL21 välittämä parannusta kemotaksista. Kasvaimensisäistä anto CCL21-holvien hiirillä keuhkosyövän parannettu leukocytic infiltraatit (CXCR3

+ T, CCR7-

+ T, IFNy

+ T-lymfosyytit, DEC205

+ DC), esti keuhkosyöpä kasvaimen kasvua ja vähensi taajuudet immunosuppressoivilla soluihin [myeloidinen peräisin suppressorisolut (MDSC), säätelijä-T-solut (Treg), IL-10-T-solujen]. CCL21-holvit aiheuttama systeeminen antituumorivaikutuksen vasteita kasvattamalla pernan T-solujen lyyttistä aktiivisuutta vanhempien syöpäsoluja.

merkitys

Tämä tutkimus osoittaa, että holviin nanokapselissa voi tehokkaasti toimittaa CCL21 ylläpitämään antituumorivaikutus ja estävät keuhkojen syövän kasvua. Holvi nanokapselissa voi toimia ”hyllyltä” lähestymistapa toimittaa kasvaimenvastaista sytokiinien hoitoon laajan syöpäsairauksia.

Citation: Kar UK, Srivastava MK, Andersson Å, Baratelli F, Huang M, Kickhoefer VA , et ai. (2011) Novel CCL21-Vault nanokapselissa kasvaimensisäisenä Delivery Estää Keuhkosyöpä Growth. PLoS ONE 6 (5): e18758. doi: 10,1371 /journal.pone.0018758

Editor: Siyaram Pandey, University of Windsor, Kanada

vastaanotettu: 21 joulukuu 2010; Hyväksytty 9 maaliskuuta 2011; Julkaistu: 03 toukokuu 2011

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Kalifornian yliopiston Discovery Grant (LHR ja VAK) Jonnson Kattava Cancer Center Fellowship UKK) ja National Institutes of Health Avustukset (RO1 CA95686 ja RO1 CA126944), University of California Los Angeles Keuhkosyöpä ohjelma, Department of Veterans Affairs Medical Research Funds ja tupakka Related Disease Program palkinto-ohjelma on University of California (15RT-0207). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän kuolemaan Yhdysvalloissa ja kaikkialla maailmassa [1]. Tähän mennessä nykyisten hoitomuodoilla, Yleinen pitkän aikavälin selviytyminen on vain 15%. Siten uusia terapeuttisia strategioita tarvitaan. Me arvioimme uutta holvi nanokapselissa todisteena konseptin toimituksen immuuni voimistamaan sytokiinien varten ”hyllyltä reagenssi” for immuuniperäisiä hoidon keuhkosyöpään.

holvit ovat sytoplasminen kaikkialla ribonukleoproteiini- hiukkaset ensin kuvattu 1986 [2]. Native holvit ovat 12,9 ± 1 MDa ovoid aloilla jonka mitat ovat noin 40 nm leveä ja 70 nm pituus [3], [4], lähes kaikilla-eukaryoottiorganismeja kanssa välillä 10

4 ja 10

7 hiukkaset solua kohden [5]. Huolimatta solujen runsaus, holvissa toiminto on edelleen heikko, vaikka ne on liitetty moniin solun prosesseihin kuten synnynnäisen immuunivasteen, monilääkeaineresistenssin syöpäsoluissa, monitahoinen signalointireittejä, ja solunsisäinen liikenne [6].

Koska luonnollisesti esiintyviä nanokapselissa, holvin hiukkanen voi olla ihanteellinen rakenne insinööri terapeuttisena järjestelmä yhdisteen kapselointi, suojelu, ja toimitus. Holvit ovat erittäin vakaita rakenteita

in vitro

, ja useat tutkimukset osoittavat, että hiukkaset ovat ei-immunogeenisiä [7]. Holvit voidaan muokata ja ilmaistava käyttäen baculovirusekspressiojärjestelmään ja heterologisia proteiineja voidaan kapseloidaan näiden yhdistelmä-hiukkasten käyttäen proteiini-kohdistaminen domain kutsutaan INT varten holvissa vuorovaikutukseen. Useat heterologisia proteiineja on fuusioitu INT domain (esim loisteputki ja entsymaattisen proteiinit) ja nämä fuusioproteiinit kun pakattu rekombinantti holviin, säilyttävät natiivi ominaisuuksia, ja siten antaa uusi holvi ominaisuuksia [8], [9].

CCL21 on tunnistettu lymfaattisen kemokiini, joka on pääasiallisesti ja ilmentävät konstitutiivisesti korkeita venulit imusolmukkeisiin ja Peyerin levyt, imusuonten ja stroomasolujen pernassa ja liitteessä [10]. CCL21 sitoutuu kemokiinireseptoriin CCR7 ja on kemoattraktantti kypsiä dendriittisoluja (DC), naiivien ja muisti-T-solujen [11], [12]. Tämä kemokiini, kanssa CCL19, tarvitaan normaaliin imukudokseen organisaatio, joka on viime kädessä välttämättömiä tehokkaan T-solu-DC vuorovaikutuksia. (NK) ja luonnon tappaja-T (NKT) antitumor effektorit myös ilmaista CCR7- reseptoria ja ovat Chemo houkuttelemina CCL21. Käyttö kemokiinien houkutella DC, lymfosyyttien, NK ja NKT effektorit kasvaimiin voi toimia tehokkaana antitumor strategiaa. Tämän ratkaisun olemme aiemmin osoittaneet, että kasvaimensisäisenä anto rekombinantin CCL21 vähensi kasvaintaakkaa hiiren keuhkosyöpään malleja [13]. Antituumorivaikutus aiheuttama yhdistelmä-CCL21 kuitenkin tarvitaan korkea ja usein annostelu, koska proteiinit annostella tuumorinsisäisesti ei säilytetä paikallisesti pitkään aikaan. Vaikka nämä tutkimukset rajattuja roolia CCL21 tehokkaana antituumoriaineena, usein korkean annoksen kasvaimensisäisenä hallinto kliinisesti rajoittava potentiaalia tarpeettoman syöpymistä. Perustuu tämän menetelmän rajoituksista, tutkimme käyttöä DC kasvaimensisäistä CCL21 toimitus [14], [15]. Prekliinisissä tutkimuksissa osoitimme, että kasvaimensisäisenä anto CCL21 muuntogeenisistä DC johti kasvaimen poistamiseen hiiren keuhkosyöpään malleja. Seuraavat alkuperäistä kuvaus antitumor toiminnan CCL21, useat ryhmät ovat raportoineet, että CCL21 on voimakas antituumoriominaisuuksia eri mallin järjestelmien [16], [17], [18], [19], [20]. Kaikissa malleissa, CCL21 oli voimakasta regressio kasvainten, jonka osoitettiin olevan riippuvainen isännän T-solujen immuniteetin.

pohjautuu laajoihin prekliininen arviointi, me alkoi NCI rahoitetaan kliinisessä tutkimuksessa vuosi sitten arvioitaessa kasvaimensisäisenä injektion DC transdusoitiin adenovirusvektori ilmentävät CCL21 geeniä (Ad-CCL21-DC) faasin I tutkimuksessa edenneen ei-pienisoluisen keuhkosyövän (NSCLC) [21]. Vaikka meidän Kliinisissä tutkimuksissa hyödyntämällä kasvaimensisäisenä anto CCL21 muuntogeenisistä DC näyttää immuunivahvistus, valmistelu CCL21 ilmentävien autologisen DC on hankalaa, kallista ja aikaa vievää. Tehokkaalla off-the-shelf reagenssi helpottaisi arvioinnin tämän kemokiinin perustuvaan hoitoon. Tämän tavoitteen saavuttamiseksi, me arvioimme ei-DC lähestymistapa, jossa käytetään holvi nanopartikkeleiden kasvaimensisäistä CCL21 toimituksen varten aloittamiseksi antitumor immuunivasteiden keuhkosyövän. Arvioimme, että käyttö holvin nanohiukkasten kiertävät autologisen DC valmistelu, minimoida erien vaihtelu ja vertailukelpoisuuden ja standardointia. Lisäksi holvi nanohiukkasten suunniteltu vapauttamaan CCL21 voidaan käyttää hoitamaan monenlaisia ​​syöpäsairauksia.

Tässä tutkimuksessa arvioitiin vaikutusta holvissa nanokapselissa toimituksen CCL21 kasvuun Lewis Lung (3LL) kasvaimia

in vivo

. Tuloksemme osoittavat, että yksittäinen kasvaimensisäisenä annon CCL21-holvissa nanocapsules rekrytoi antituumorivaikutuksen -efektiboksejamme indusoi voimakas antituumorivaikutus ja kasvaimen kasvu estyy.

Materiaalit ja menetelmät

Yhdistelmä Vaults

CCL21-cDNA fuusioitiin kehyksessä joko INT tai mCherry-INT [22]. Hiiren CCL21 monistettiin PCR: llä alukkeilla: CCL21- eteenpäin GCGCGGATCCCCATGGCTCAGATGATG ja CCL21- kääntää GCGCAGATCTTCCTCTTGAGGGCTGTGTCTG. Muodostamiseksi mCCL21-mCherry-INT pFastBac, puhdistettiin CCL21 PCR-tuote pilkottiin BamH1 ja Bgl I ja ligoitiin BamH1 käsitelty fosfataasilla mCherry-INT pFastBac. Ihmisen CCL21 monistettiin PCR: llä alukkeilla: CCL-21 F-SpeI CCCCACTAGTC CAGTTCTCAGTCACTGGCTCTG, CCL-21-NheI CCCCGCTAGCTGGCCCTTTAGGGGTCTGTG, INT Nhel CCCCGCTAGCTGCACACAACACTGGCAGGA, INT Xhol GGGGCTCGAGTTAGCCTTGACTGTAATGGA muodostamiseksi hCCL21-INT. Rekombinantti (r) baculovirusten tuotettiin, kuten on kuvattu [7]. Sf9 solut infektoitiin mCCL21-mCherry-INT, hCCL21-INT tai CP-MVP koodaavat baculovirukset at infektiokertoimella (MOI) 0,01 65 tuntia. Infektoituja soluja valmistettiin, kuten on kuvattu [7]. Lysaatit sisältävät CP-MVP holvi sekoitettiin lysaatit sisältävät mCCL21-mCherry-INT tai hCCL21-INT, ja inkuboitiin jäillä 30 minuutin ajan, jotta INT fuusioproteiinien paketti sisällä holvit. Holvin puhdistettiin, kuten on kuvattu [8], suspendoitiin uudelleen steriiliin PBS: ään ja proteiinipitoisuus määritettiin BCA-määrityksellä (Bio-Rad, CA). Näytteen eheys analysoitiin negatiivinen tahra elektronimikroskoopilla tai Coomassie-värjäys SDS-PAGE ja sen jälkeen Western blot-analyysi. CCL21-INT proteiini holvissa kvantifioitiin densitometrisellä analyysi Western blotteja vastaan ​​puhdistettua yhdistelmä-INT-proteiinia standardina.

Vasta

Ensisijainen vasta-western blot analyysit olivat kanin anti-MVP vasta-aineella (1 /1000-laimennos) [23], tai kanin anti-VPARP-vasta-ainetta (1/500-laimennos) [24] ja toisen vuohen anti-kani-HRP-vasta-ainetta (1:2000 laimennos) (Amersham). CCL21 ja CXCR3 (220803) mAb olivat R Keskiarvo ± SEM, * p 0,05 välillä mCCL21-holvit ja ohjaus holvit tai anti-CCL21-vasta hoitoryhmissä. B. mCCL21-holvit parannettu DC APC toimintaa ja estää CCL21 kääntänyt kasvu APC aktiivisuuden. B3Z-solut (1 x 10

5 solua /200 ul /kuoppa) viljeltiin yhdessä DC 2,4 (5 x 10

4 solua /200 ul /kuoppa) ja ovalbumiini (350 ug /ml) läsnä ollessa tai puuttuminen mCCL21-holvit (200 ng /ml) ja anti-CCL21-vasta-aine (5 ug /ml) tai kontrollivasta-ainetta (5 ug /ml vuohen IgG: tä), 24 tunnin ajan. Ohjaus holvit käytettiin pitoisuutena 200 ng /ml. T-soluaktivaation tilan mitattiin IL-2-tuotantoa ELISA: lla. Tiedot edustavat 2 toisistaan ​​riippumatonta koetta. Bars; Keskiarvo ± SEM, * p 0,05 välillä mCCL21-holvit ja ohjaus holvit tai anti-CCL21-vasta hoitoryhmissä.

CCL21-holvit parantaa rekrytointia leukocytic infiltraattien ja estävät 3LL kasvaimen kasvua

määrittää antituumorivaikutuksen mCCL21-holvit perustettu 3LL kasvain

in vivo

. Yksi kasvaimensisäistä injektio mCCL21-holvit (200 ng) johti merkittävästä vähenemisestä kasvaimen kasvua verrattuna tyhjä holvit (Fig. 3A). MCCL21-holvissa hoitoryhmässä osoitti parannettu kasvaimensisäisenä leukocytic suodattuu kontrolliin verrattuna holvit (Fig. 3B) ja immuunijärjestelmän värjäys osoitti, että infiltraatio pääasiassa CD3 ilmentävien T-solujen (Fig. 3C alhaalla oikealla paneeli). Antituumorivaikutuksen tehoa mCCL21-holvien määritettiin 7 vuorokauden perustettu potilaalle tehdä 3LL keuhkosyöpä malli. mCCL21-holvit esti kasvaintaakkaa 7-kertaiseksi verrattuna kontrolleihin (Kuva. 4A-B). Valvonta-hoitoryhmässä (laimennusaineiden tai valvontaa holvissa) oli 7-9% lasku keskimääräinen paino lopussa kokeellinen kestoa, mutta ei merkittävää painon muutos havaittiin CCL21-holvissa hoitoryhmässä. Arviointi kasvaimeen leukocytic populaatiot osoittivat parannettu taajuuden CD4, CD8, CD3 CXCR3, CD3 CCR7 ja DEC205 mutta harvennettua MDSC ja Tregs (Fig. 4C).

. CCL21-holvit esti kasvaimen kasvua ja parantaa kasvaimensisäisenä T soluinfiltraat- keuhkosyöpä. C57BL /6 hiirillä 9 päivää 3LL olevien kasvainten (

s.c..

) Käsiteltiin kasvaimen sisään ohjaus holvit (200 ng), mCCL21-holvit (200 ng) tai laimentimen normaalia suolaliuosta (NS). Bisecting kasvain halkaisijat mitattiin jarrusatulat. B-C. mCCL21-holvit lisäsi virtaa CD3 ilmentävien T-solujen kasvaimen verrattuna kontrollieläimiin holvit. UBC-GFP /BL6 hiirillä 9 päivän perustettu kasvaimia käsiteltiin kasvaimen sisään ohjaus holviin tai mCCL21-holvit. Lokakuu jäädytetty kudos leikattiin, fixated päälle dioja, ja vastavärjättiin ydinvoiman väriaine DAPI (sininen). Kontrollituumorit (

yläpaneeli

) osoittaa hyvin rajallinen vihreän fluoresenssin (soluttautua solut) korkean tehon näkymä (suurennos, × 400). Useimmat vihreitä fluoresoivia soluja ovat suuria monikulmainen stroomasolut kun tuumorisolut vastavärjätään sinisellä DAPI. Immuuni värjäys T-solujen osoittaa hyvin harvat CD3 ilmentävien T-lymfosyyttien (ylhäällä oikealla paneeli). Sen sijaan näkyvä kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä, pieni pyöreä vihreitä fluoresoivia soluja ovat ilmeisiä kasvainten mCCL21-holvissa käsitellyissä hiirissä (nuoli,

alapaneelin

). Immuuni värjäys T-solujen osoittaa, että infiltraatit ovat CD3 ilmentävät T-solut (alhaalla oikealla). data; Keskiarvo ± SEM, * p 0,05 välillä mCCL21-holvissa ja kontrolliryhmässä, n = 10 hiirtä /ryhmä.

5 x 10

3 3LL-GFP-kasvainsoluja injektoidaan vasen keuhko kautta rintakehän reittiä. Viikon kuluttua kasvaimen injektiota, hiiret käsiteltiin laimentimen (NS), ohjaus holvit (2 ug) tai mCCL21-holvit (2 ug) kautta rintakehän reitti vasen keuhko. Päivä 28 kasvainten istutusta, keuhkot kerättiin analysointia varten kasvaintaakkaa ja leukocytic infiltraatit. A. H 0,05 välillä CCL21-holvit ja ohjaus holvissa ryhmiä, n = 10 hiirtä /ryhmä.

CCL21-holvit lisätä kasvainta infiltroivia T-soluja, joilla on tehostunut IFNy mutta vähensi IL -10 ja lisäävän systeemistä T-solujen sytolyyttinen aktiivisuus

Kasvain T lymfosyyttinen suodattuu peräisin mCCL21-holvissa käsitellyillä hiirillä oli lisääntynyt intracytoplasmic IFNy ja vähentää IL-10 (Fig. 4D-E). Kasvaimensisäisenä mCCL21-holvit aiheuttama systeeminen antituumorivaikutuksen immuuni aktiivisuus: pernan T-solut mCCL21-holvissa käsitellyillä hiirillä oli täydennetty hajotusaktiivisuudella vastaan ​​vanhempien kasvainsoluja

in vitro

(Fig. 4F).

Keskustelu

Olemme aiemmin osoittaneet, että kasvaimensisäisenä rekombinantti CCL21 tai CCL21 muuntogeenisistä DC indusoi T-soluista riippuvainen kasvain vähentäminen hiiren malleissa keuhkosyöpään [13], [14], [15], [28], [29]. Perustuen laajaan prekliinisessä mallintamiseen, olemme kääntänyt meidän kasvaimensisäisenä DC-AdCCL21 lähestymistapa hoitoon pitkälle keuhkosyöpä on vaiheen I kliinisen tutkimuksen. Vaikka alkuperäinen Tämän kokeen tulokset viittaavat immuunivahvistus, me arvioimme CCL21 toimitus mekanismeja, joiden poista tarvetta eristää ja kulttuuriin autologisen DC. Tämän vuoksi arvioimme CCL21-holvi nanokapseleita kuin ”hyllyltä” terapeuttinen alusta vastaan ​​kasvaimen kasvua

in vivo

hyödyntäen hyvin tunnettu 3LL syöpä malli. Meidän perustelut anto kasvaimeen CCL21-holvi nanocapsules on edistää rekrytointia T-lymfosyyttien ja DC kasvaimeen microenvironment varten vankka antituumorivaikutus.

Kuten luonnossa esiintyvä, ei-immunogeeninen, proteiini-pohjainen nanomittakaavan kapseli, holvin hiukkanen on kaikki mahdollisuudet toimia joustavana terapeuttinen antovehikkeli. Suunniteltu Baculovirussysteemissä, hiukkasten kokoontuu itsestään yhdestä ilmennetty proteiini, joka voidaan muuttaa, jotta solujen kohdentaminen, erityisiä endosytoosin ja endosomin levinneisyys [7], [8], [9], [30]. Proteiineja ja peptidejä fuusioituna holvissa kohdistaminen verkkotunnuksen pakataan hiukkasen, suojattu ulkoiselta ympäristöltä ja vapautuu hitaasti. Tämä on ensimmäinen tutkimus, kuvata, että holvin nanokapseleita voidaan suunnitella pakata ja säilyttää biologisesti aktiivisia CCL21. Tuloksemme osoittavat, että vaikka tyhjä holvit ja rCCL21 ovat kumpikin kemotaktisia, pakkaamista kemokiinin osaksi holvissa synergistisesti T solujen vaeltamiseen, mikä viittaa siihen, että pitkäaikainen vapautuminen CCL21 jonka holvin hiukkanen voi muodostaa jyrkkä chemotatic kaltevuus. Neutraloivat vasta-aineet CCL21 kumosi kemotaktinen aktiivisuus CCL21-holvissa osoittaa, että kemotaktinen aktiivisuus oli pääasiassa CCL21 riippuvainen. Tulosten perusteella kemotaksista kokeita, arvioimme vaikutus CCL21-holvit DC APC toimintaa. CCL21-holvit lisätyn DC APC aktiivisuutta ja neutralointi CCL21 kumosi tätä toimintaa. Verrattuna rCCL21, CCL21-holvit stimuloi DC APC aktiivisuuden suurempaan at yksi kymmenesosa pitoisuus rCCL21, mikä viittaa enemmän DC affiniteetti CCL21-holvissa nanokapselissa.

Koska meillä

in vitro

havainnot, CCL21-holvit arvioitiin terapeuttisessa keuhkosyöpä malli

in vivo

. Tuloksemme osoittavat, että holvin suunnittelu on tehokas inhiboimaan olevien kasvainten kasvua. Yksi kasvaimensisäistä injektio CCL21-holvit johtaneet merkittäviin eston kasvaimen kasvussa verrattuna kontrolleihin. Tuloksemme viittaavat siihen, että CCL21-holvi muotoilu on yhtä tehokas verrattuna usein suuria annoksia rCCL21 [13]. Sekä ihonalainen ja potilaalle tehdä keuhkojen kasvain mallintaa CCL21-holvissa hoitoa annettiin kasvaimen. Jatkossa tutkimuksissa arvioitaessa tehoa kasvaimen antigeenispesifisen holvi nanocaspsules rokotus reittejä suoja- ja terapeuttinen asetukset, jotka sisältävät

iv

tai

ip

jakelureittejä, muutokset plasman /seerumin transaminaasien taso on määrällisesti holvi vaikutuksia maksan toimintaa. Vaikka migraatiokokeessa, ohjaus holvit osoitti kemotaktinen aktiivisuus, ohjaus holvit ei vaikuttanut kasvaimen kasvua verrattuna laimennusaineiden hoitoryhmässä. Tämä viittaa siihen, että CCL21 on kriittinen osa holvin nanokapselissa induktioon antituumorivaikutus. Tulevaisuudessa työssä me seulovat sekä proapoptoottisten ja anti-apoptoottisten proteiinien kasvainten muutosten määrittämiseksi vastauksena CCL21-holvissa nanokapselissa hoito mekanistisesti tutkia apoptoottinen ohjelmien aiheuttama tätä hoitoa.

In vivo

, ihmisen CCL21 sisältäviä holvit olivat yhtä tehokkaita kuin hiiren CCL21-holvissa vähentämisessä 3LL kasvaimen kasvua (tietoja ei esitetty). Verrattuna kontrolleihin, CCL21-holvissa hoito johti laajaan kasvain T ja DC leukocytic infiltraatit.