Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Munasarjasyöpä on edelleen johtava kuolinsyy naisilla ja uusien hoitomuotojen kehittämiseen on välttämätöntä. Toinen mitokondriot johdettu aktivaattori kaspaasin (SMAC) on kuvattu herkistää apoptoosin. Olemme tutkineet pro-apoptoottista aktiivisuutta of LBW242, joka on jäljittelee SMAC /DIABLO puolesta munasarjasyövän solulinjoissa (A2780 soluissa ja sen solunsalpaajaresistentti johdannainen A2780 /ADR, SKOV3- ja HEI solut) ja ensisijainen munasarjasyöpäsoluja. Vaikutukset LBW242 on munasarjasyövän solulinjoissa ja ensisijainen munasarjasyöpäsoluja määritettiin solujen lisääntymistä, apoptoosin ja biokemialliset määritykset.

Keskeiset havainnot

LBW242 lisätä yksinään herättänyt vain kohtalainen proapoptoottinen vaikutus ; kuitenkin voimakkaasti synergistisesti tuumorinekroositekijän-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) tai syöpälääkkeiden apoptoosin sekä munasarjasyövän solulinjoissa ja ensisijainen munasarjasyöpä soluja. Mekaaniset tutkimukset osoittavat, että LBW242-indusoitua apoptoosia in munasarjasyöpäsoluja liittyy kaspaasi-8. Tämän mukaisesti mekanismi, c-FLIP yliekspressio inhiboi LBW242 välittämän apoptoosin.

Johtopäätös

LBW242 herkistää munasarjasyövän solujen antituumorivaikutukset TRAIL ja syöpälääkkeiden käytetään yleisesti klinikalla. Nämä havainnot viittaavat siihen, että SMAC /DIABLO matkivat LBW242 voisi olla hyötyä kehittämällä kokeellisia strategioiden munasarjasyövän hoitoon.

Citation: Petrucci E, Pasquini L, Bernabein M, Saulle E, Biffoni M, Accarpio F, et ai. (2012) pienimolekyylinen SMAC Mimic LBW242 voimistaa perävaunu ja syöpälääkettä välittämä solukuolema munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 7 (4): e35073. doi: 10,1371 /journal.pone.0035073

Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 heinäkuu 2011; Hyväksytty 9 maaliskuuta 2012 Julkaistu: 25 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Petrucci et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusten Italian terveysministeriön Ministeriöltä, Progetto Oncotecnologico UT. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syöpä on hyvin monimutkainen monivaiheinen sairaus, johon progressiiviseen kertymiseen geneettisten ja epigeneettiset poikkeavuuksia, mikä lopulta johtaa muutosta normaalien solujen osaksi pahanlaatuisten solujen näyttämällä olennaisia ​​ominaisuuksia syövän: vastustuskyvyn apoptoottisten mekanismien riippumattomuus kasvun signaaleja , ali negatiivisen kasvun signaaleja, invasiivisia ja metastaattinen kapasiteetti, rajoittamaton replikatiivisia potentiaali ja jatkuva angiogeneesissä [1]. Näistä eri ominaisuudet syöpäsolujen vastustuskyky apoptoosin varmasti on erittäin merkittävä rooli kasvaimen kehittymisen ja etenemisen. Kyky syöpäsolujen kiertää apoptoosin liittyvät erilaisiin biokemiallisiin ominaisuuksiin näiden solujen, ja erityisesti, että ylös-säätely antiapoptoottisten geenien, kuten tiettyjen jäsenten Bcl-2-perheen proteiinien ja jäsenten apoptoosi-inhibiittori (IAP ) perheen proteiineja, [2]. Erityisesti, kolme riviä todisteet tukevat rooli IAP-proteiinit syövän: (i) kohonnut ilmentymistaso IAP-proteiinien, erityisesti XIAP, c-IAP1 ja c-IAP2, useissa ihmisen syövän eri korreloivat kasvaimen ja ennusteen [ ,,,0],3]; (Ii) useita

in vitro

ja

in vivo

tutkimukset ovat osoittaneet, että downregulation XIAP tai c-IAP1 erilaisilla aineilla aiheuttaa herkistymistä syöpäsolujen kemoterapian ja gamma irradiation- indusoiman apoptoosin [4]; (Iii) kromosomaalisen alueen 11q21-q23, joka sisälsi c-IAP1 ja c-IAP2-geenien edellyttää kromosomien amplifikaation eri kasvaimissa [3], [4].

IAP: t, ja erityisesti c-IAP1, c- IAP2 ja X-linked IAP (XIAP), toimivat inhiboimaan apoptoosia estämällä kaspaasien aktivaatio-8 tai inhiboimalla kaspaasien-9, -3 ja -7, vastaavasti [5], [6]. C-IAP1 ja c-IAP2 hallussaan E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla verkkotunnuksen, joka edistää proteasomin riippuva hajoaminen c-IAP1 ja c-IAP2 [7]. Aktiivisuus IAP: t antagonisoi SMAC /DIABLO (toisen mitokondrioiden johdetun aktivaattori kaspaasien /suora estäjä apoptoosin sitovan proteiinin kanssa matala pl), että vapautumisen jälkeen mitokondrioita vastauksena apoptoottisiin liipaisu, käy läpi kypsymisen ja pilkkominen sen N terminaalisia alue, josta on seurauksena altistuminen AVPI sekvenssin [8]. Tämä tetrapepetide sitoo XIAP ja kilpailee samalla sitoutumiskohtien, jotka osallistuvat vuorovaikutukseen caspases [9]. Tällä mekanismilla, SMAC /DIABLO estää takavarikoimista caspases by IAP: t, mikä helpottaa apoptoottisen reitin. Koska AVPI sekvenssi kykenee edistämään apoptoosia, yhdisteet pystyvät jäljittelemään tämän tetrapeptide, yhdessä kutsutaan SMAC-jäljittelijät, ovat edustettuina tavoitetta intensiivisen tutkimustyön ja useat näistä aineista on kehitetty näinä viime vuosina [10] – [15 ].

on tärkeää huomata, että vapauttaminen IAP: t voivat edistää kasvainten kehitystä ei vain caspases inaktivaation, mutta myös erilaisten mekanismien kautta ei riipu kaspaaseiksi inaktivaatiota. Siten tuore tutkimus osoitti selvästi, että: XIAP edistää etäpesäkkeiden

in vivo

ja solujen invaasiota

in vitro

riippumatta kaspaasien sitovia ja estäminen; XIAP monimutkaisissa surviviinipeptidillä ajaa NF-KB: n edistämään solujen invaasiota ja etäpesäkkeiden; c-IAP1 ja c-IAP2 ovat mukana myös syöpäsoluinvaasiota [16].

Näin inaktivaatio IAP: t, erityisesti yhdistettynä muihin hoitoihin (kuten chemotherapic huumeet, kuolema ligandit mukaan lukien TNF-alfan ja TRAIL ), johtaa kuolemaan useimpien kasvainsolujen, ainakin kudosviljelyolosuhteissa [11], [13], [16], [17]. Tärkeää on, inaktivointi IAP: t ei näytä olevan haitallista normaaleille soluille. Ensemble Näiden havaintojen on tukenut pienten farmakologisen estäjiä IAP: t, jotka on otettu käyttöön vaiheen I kliinisissä kokeissa [5].

LBW242 on peptidomimeettinen kohdistaminen IAP: t äskettäin raportoineet Zavvel ja työtovereiden kanssa kilpailevaa korkealla hengenheimolainen SMAC /DIABLO täyttöasteen XIAP BIR3 sitova tasku [17]. Tämä yhdiste osoitettiin kykenevän indusoimaan apoptoosin eri solutyypeissä, mukaan lukien multippeli myelooma, akuutti myelooinen leukemia, glioblastooma ja melanooma [18] – [21].

Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet kapasiteettia LBW242 indusoimaan apoptoottisen solukuoleman munasarjasyövän solujen lisätä yksinään tai yhdessä joko TRAIL tai syöpälääkkeiden. Tuloksemme osoittavat, että LBW242 parantaa herkkyyttä munasarjasyövän solukuolema joko TRAIL tai syöpälääkkeet kuten Topotekaani vaikuttamalla liittyy voimistaa kaspaasin 8 aktivaation. Nämä havainnot tukevat tulevia tutkimuksia tutkia mahdollisen roolin LBW242 munasarjasyövän hoitoon.

1a- A2780WT, A2780ADR, hei ja SKOV3- soluja on kasvatettu 48 h joko puuttuessa tai läsnä ollessa TRAIL (50 ng /ml) ja joko ilman tai, kun läsnä on kasvava pitoisuuksien LBW242 (1-10 uM) ja lopussa viljelmän määrä eläviä soluja määritettiin. Ero Ohjaus ja TRAIL oli tilastollisesti merkitsevä: p = 0,001 A2780WT ja HEI; p = 0,01 SKOV3-; p = 0,05 A2780ADR. 1B- A2780WT ja SKOV3- soluja on kasvatettu kuten edellä ja sen jälkeen 48 tunnin viljelyn osuutta apoptoottisten solujen määritettiin anneksiini V: n sitoutumisen määritys ja propide jodidi värjäystä. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen määritettiin virtaussytometrialla. Tulokset edustavat keskiarvoja havaittu kolmessa erillisessä kokeessa. Ero Ohjaus ja TRAIL oli tilastollisesti merkitsevä: p = 0,01 sekä A2780WT ja SKOV3- soluja.

Methods

Ethics selvitys

Tutkimus oli nimenomaan hyväksymä Institutional Review Board of Istituto Superiore di Sanità ja oli periaatteiden mukaisesti Helsingin julistuksen II. Kirjallisen tiedon sisältöä saatiin kunkin potilaan.

A2780WT, A2780ADR ja SKOV3-solut on stabiilisti transfektoitu joko tyhjällä vektorilla (PINCO) tai vektorilla, joka sisältää cDNA: n c-FLIP (FLIP) ja tuloksena soluja kasvatettiin joko ilman (kontrolli) tai läsnä ollessa LBW242 (10 uM) tai TRAIL (50 ng /ml) tai molempia näitä aineita on edellä pitoisuuksina. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen määritettiin virtaussytometrialla käyttämällä anneksiini-V /PI-sitoutumisen määrityksessä. Tulokset edustavat keskiarvoja ± SEM havaittu kolmessa erillisessä kokeessa. Tilastollinen analyysi: * p = 0,05; ** P = 0,01; *** P = 0,001.

Cell Culture

Cisplatin-herkkä ihmisen munasarjan epiteelikarsinoomasolulinja A2780WT saatiin American Type Culture Collection (ATCC); adriamysiini-resistenttejä solulinja A2780ADR, jotka on saatu sen vanhempien munasarjasyövän A2780 soveltamalla vaiheittain nousu pitoisuuksina adriamysiinin saatiin European Collection of Cell Cultures (ECACC). A2780ADR-soluja käsiteltiin 10 uM adriamysiini joka 10 kohtia. SKOV3 ja HEI solulinjat saatiin ATCC.

A2780WT, A2780FLIP, A2780ADR, A2780ADR FLIP, SKOV3 ja SKOV3- FLIP solut on kasvanut kerrotaan kuviossa. 2 joko puuttuessa tai läsnä ollessa 40 uM zVAD-fmk tai zIETD-fmk ja sen jälkeen 48 tunnin inkuboinnin prosenttiosuus apoptoottisten solujen määritettiin anneksiini-V /PI-sitoutumisen määrityksessä. Tulokset edustavat keskiarvoja ± SEM havaittu kolmessa erillisessä kokeessa.

Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa ilmakehässä, jossa oli 5% CO

2 Advanced MEM, jossa on 3% naudan sikiön seerumia (FBS, Euroclone, Milano, Italia), 50 IU /ml penisilliiniä, 50 ug /ml streptomysiiniä, 50 ug /ml gentamisiinia ja 0,3 ug /ml glutamiinia. Soluja rutiininomaisesti tarkastaa läsnäolo mykoplasma.

paneeli C sekä täyspitkän (FL) ja katkaistun muodon (CF) kaspaasi-3 on esitetty. PARP immunoblottauksella osoittaa kaksi nauhaa, joista ylempi vastaa täyspitkän muodon PARP ja alempi kaista on pilkottu muoto PARP. Kuviossa on esitetty edustavien tietojen havaittiin yksi kolmesta suoritettujen kokeiden.

eristäminen ja in vitro -viljelyn primaaristen munasarjasyöpäsoluja

Intra-operointipisteestä koepaloja on saatu 9 munasarjasyöpä potilaille, vaikuttaa vakavien adenokarsinooma, joille debulking leikkaus joko ensisijaisena tai uusiutuva sairaus. Kasvainkudoksen on mekaanisesti liukenevat leikkaava ja kasvainsolun suspensio on saatu pilkkomalla kudosviljelyelatusaineeseen (RPMI 1640), joka sisältää kollagenaasia, deoksiribonukleaasi I ja hyaluronidaasia. Lopullinen kasvainsolujen suspensiota tarkastettiin osuus kasvainsolujen standardin sytologian ja prosenttiosuus epiteelisolujen virtaussytometrialla (määritettynä värjäämällä Ber-EP4-mAb, Dakopatt, Copenaghen, Tanska). Lyhyesti, arviointia varten Ber-EP4 reaktiivisuus solujen alikvootteja värjättiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa 5 ug /ml FITC-leimattua anti-Ber-EP4-mAb, pestiin ja analysoitiin fluoresenssiemissio käyttäen Becton Dickinson -virtaussytometriä. Kasvainsolun alikvootit (1 x 10

6 solua) on maljattiin 25 cm

3 kudosviljelypulloissa 10 ml: ssa soluviljelyalustaa, joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia. Kun oli kulunut 1 päivä

in vitro

kulttuuri, tarttumattomat solut (jotka sisältävät kudosjäte ja kuolleet solut) on poistettu ja tuoretta alustaa lisättiin viljelmään ja inkuboidaan sitten vielä 24 tuntia joko ilman tai läsnäolo TRAIL, tai LBW242 tai molempia reagensseja. 24 tunnin viljelyn soluja yhtenäisiksi. Kasvaimen viljelmät sisälsivät vähintään 80% kasvainsoluja.

transduktio A2780WT, A2780ADR ja SKOV3-soluja

A2780WT, A2780ADR ja SKOV3 solut, jotka ekspressoivat joko tyhjän vektorin PINCO-GFP (PINCO) tai vektori PINCO-GFP sisälsi c-FLIP

L (FLIP) ihmisen geeni on saatu aiemmin raportoidun [22]. Transdusoimattomia soluja rutiininomaisesti analysoitiin GFP: n ilmentymisen osalta virtaussytometriä käyttäen ja c-FLIP

L-ekspression Western-blottauksella.

Apoptoosi arvioinnin anneksiini-V-värjäyksellä

jälkeen lääkehoitojen, solut suspendoitiin uudelleen 200 ui värjäysliuosta (sisälsi anneksiini-V fluoreseiini ja propidiumjodidia on Hepes-puskuria, anneksiini-V-FITC Apoptosis Detection Kit, Pharmingen, San Jose, CA, USA). Kun oli inkuboitu huoneen lämpötilassa 15 minuuttia., Solut analysoitiin virtaussytometrialla. Anneksiini-V sitoutuu näiden solujen, jotka ilmentävät fosfatidyyliseriinin ulkokerrokseen solukalvon ja propidiumjodidilla värjää solun DNA: han ja ne solut, joilla on heikentynyt solukalvon. Tämä mahdollistaa syrjinnän elävien solujen (värjäämätön joko fluorokromilla) apoptoottiselta soluista (värjätä ainoastaan ​​anneksiini V) ja nekroottinen soluja (värjätty sekä anneksiini V ja propidiumjodidia).

kvantifiointi apoptoosin ja solujen syklin analyysi propidiumjodidilla /fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu

Solut kerättiin trypsiinillä, pestiin, inkuboitiin ensin spermiinipääryhmän tetrahydrochloride pesuainetta, joka sisälsi trypsiiniä sulattaa solukalvojen ja solun tukirankojen, sitten sitraattipuskurilla, joka sisältää trypsiini-inhibiittori ja ribonukleaasi A estää trypsiinin toiminnan ja sulattaa RNA ja lopuksi suspensoitiin uudelleen 400 ui propidiumjodidia (PI) (50 ug /ml PI, 0,1% Triton X-100, ja 0,1% natriumsitraattia PBS: ssä) (Cycle Plus DNA -värjäyspakkausta, Becton Dickinson, USA). Tämän jälkeen solut analysoitiin virtaussytometrillä käyttäen ohjelmistoa omistettu DNA-analyysiä varten (ModFit LT ohjelmisto, Verity Software House, Topsham, ME, USA). Solut subdiploid DNA-pitoisuus kvantifioitiin prosenttiosuuden määrittämiseksi sisältävien solujen apoptoottisen, hajanainen DNA.

reagenssit käyttää indusoimaan apoptoosin kasvainsoluissa

munasarjasyöpä soluja esi-inkuboitiin yleiseurooppalaisen kaspaasi estäjä, N-bentsyylioksi-karbonyyli-Val-Ala-Asp (OMe) -fluoromethylketone (zVADfmk) tai N-bentsyylioksi-karbonyyli-Ile-Glu (OMe)-Thr-Asp (OMe) -fluoromethylketone (zIETDfmk), (molempien Sigma, St. Louis, USA) ennen kuin lisättiin eri yhdisteiden stimuloiva apoptoosia.

agonistinen monoklonaalisia vasta-aineita TRAIL-R1 (MAPATUMUMAB) ja TRAIL-R2 (LEXATUMUMAB) ovat täysin ihmisen vasta-aineiden IgG1-isotyyppiä [23 ], [24] ja oli jalomielinen lahjoitus Human Genome Science (Rockville, MD, USA).

hoito syöpälääkkeiden

joissakin kokeissa munasarjasyöpäsoluja on inkuboitu joidenkin syöpälääkkeiden käytetään yleisesti munasarjasyövän hoidossa: cis-diamineplatinum (II) kloridi (CPLAT); paklitakseli (TAXOL); Topotekaani Hydrichloride Hydrate (TOPO); Etoposidi (ETOPO); Doksorubisiinihydrokloridi (doxo). Kaikki nämä lääkkeet ostettiin Sigma Co (St. Louis, USA) ja lisättiin

in vitro

kahtena annoksena: matalan annoksen, joka vastaa plasman keskimääräinen huipputaso havaittu lääkeinfuusioiden syöpäpotilaille (ts 1,67 uM CPLAT, 2,45 uM TAXOL, 0,21 uM, 8,5 uM ETOPO, 0,17 uM syyli) ja korkea annos, joka vastaa viiden kertaa suurempi annos kuin alhaisen annoksen.

Western blot-analyysi

Koko solu-uutteet saatiin hajottamalla solut puskurissa, joka sisältää 20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2 mM EGTA, 0,5% NP-40, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 2 ug /ml leupeptiiniä, 2 ug /ml aprotiniini, 25 mM NaF ja 10 mM Na-

3Vo

4. Kun oli inkuboitu 30 minuuttia jäillä, proteiini lysaatit kirkastettiin roskat sentrifugoimalla 10000 g 10 minuutin ajan. Proteiinipitoisuus on liukoinen supernatantissa, määritettiin käyttämällä Bio-Rad proteiinimäärityksellä (Bio-Rad, Richmond, VA, USA).

A- HEI soluja on inkuboitu 24 tuntia joko ilman ( kontrolli) tai, kun läsnä on LBW242 (30 uM) tai joko Sisplatiini (CPLAT 1,6 tai 8 uM) tai Paklitakselia (TAXOL 2,5 tai 12,5 uM) tai Topotekaani (TOPO 0,2 tai 1 uM) tai Etoposidi (ETOPO 8 tai 40 uM) tai Doksorubisiini (syyli 0,17 tai 0,85 uM) yksin tai yhdessä LBW242 ja analysoitiin solukuoleman induktioon virtaussytometrialla. Tulokset edustavat keskiarvoja ± SEM havaittu kolmessa erillisessä kokeessa. Tilastollinen analyysi: * p = 0,05; ** P = 0,01; *** P = 0,001. B – HEI-soluja on inkuboitu 24 tuntia, kun läsnä on kasvavia pitoisuuksia LBW242either puuttuessa (kontrolli) tai läsnä ollessa Sisplatiini (1,6 uM) tai Paklitakseli (2,5 uM) tai Topotekaani (0,2 uM) ja analysoitiin induktion solukuoleman virtaussytometrialla. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SEM havaittu kolmessa erillisessä kokeessa. Erot ohjaus ja Topotekaani (p = 0,001), ohjaus ja paklitakselia (p = 0,001) ja ohjaus- ja sisplatiinia (p = 0,05) olivat kaikki merkittävät.

A- LBW242 voimistaa proapoptoottiset vaikutusta topotekaanihydrokloridia, topoisomeraasi I: n estäjä. A2780WT PINCO ja FLIP (

ylälevyissä

) ja SKOV3 PINCO ja FLIP (

alapaneeleita

) soluja on inkuboitu 24 tuntia joko ilman (Control) tai läsnä ollessa joko DMSO 0,01% tai zVAD-fmk 40 uM, topotekaanihydrokloridia 1 uM, TRAIL 50 ng /ml tai LBW242 + zVAD-fmk, LBW242 + topotekaanihydrokloridia, TRAIL + zVAD-fmk, TRAIL + topotekaanihydrokloridia, topotekaanihydrokloridia + zVAD-fmk, LBW242 + TRAIL, LBW242 + TRAIL + zVAD-fmk, LBW242 + topotekaanihydrokloridia + zVAD-fmk ja analysoitiin apoptoosin induktion virtaussytometrialla. Tulokset edustavat keskiarvoja ± SEM havaittu kolmessa erillisessä kokeessa. Vuonna A7280 WT PINCO ja SKOV3- PINCO soluissa LBW242 + TOPO aiheuttama osuus kuolleita soluja korkeampi kuin havaittu joko LBW242 (p = 0,05) tai TOPO (p = 0,05). B ja C – arviointi kaspaasien-8 aktivaation A2780 ja A2780ADR soluja inkuboitiin joko ilman (kontrolli) tai, kun läsnä on LBW242 tai topotekaani tai molemmista LBW242 ja Topotekaani. Kaspaasi-8 aktiivisuus ehjien solujen mitattiin käyttäen kaspaasit-8 erityisiä fluorigenic alustaan. Alkuperäinen tulokset yhdestä edustavasta analyysi on raportoitu B, kun taas keskiarvoja ± SEM prosenttiosuuksien soluilla kaspaasin 8 aktivaation on raportoitu C. solujen prosenttiosuus, joilla aktivoidaan kaspaasit-8 oli suurempi sekä WT ja ADR solujen LBW242 kuin NT soluissa (p = 0,05) ja LBW242 + TOPO kuin LBW242 tai TOPO-käsitellyt solut (p = 0,05).

Vasta

Anti -caspase -9, -3 ostettiin Upstate (Upstate Biotechnology Lake Placid NY, USA ja R Anti-XIAP ja anti-Bcl-2 hankittiin BD Pharmigen (BD Pharmigen, San Diego, USA); anti-surviviiniperäisten ja anti-PARP ostettiin R anti-FADD ostettiin BioSource (BioSource, Camarillo, CA, USA); anti-c-FLIP (klooni NF6) ja anti-c-IAP ostettiin Alexis (Alexis Biochemicals, San Diego, CA, USA); anti-aktiini Oncogene (Oncogene Research Products, Cambridge, MA), käytettiin latauskontrollina.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Graph Pad ohjelma. Kaikki parametrit on raportoitu keskiarvoina ± SEM. Vertailla välillä ryhmäeroja, vankka ANOVA suoritettiin. P-arvot ilmoitetaan olivat kaksipuolisia. P-arvo on alle 0,05 ilmoitettu tilastollista merkittävyyttä. Isobologrammi analyysi suoritettiin käyttäen CalcuSyn ohjelmisto (Biosoft, MO, ja Cambridge, UK). Yhdistelmä-indeksi (CI) alle 1,0 osoittaa synergismiksi à CI 1,0 osoittaa lisäaineen toimintaa [25].

Tulokset

LBW242 parantaa TRAIL-välitteisen solukuoleman munasarjasyövän solulinjoissa

Aiemmissa tutkimuksissa osoitimme pro-apoptoottinen vaikutus SMAC /DIABLO jäljittelevää yhdiste 3 munasarjasyövän solulinjoissa A2780WT ja niiden kestävä vastine A2780DDP ja A2780ADR [26]. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme vaikutus toisen SMAC /DIABLO jäljittelevää, LBW242 puolesta munasarjasyöpä malleissa. Ensimmäinen, selvitimme soluproliferaation annos-vaste-koe LBW242 yksin ja yhdessä TRAIL (kuvio. 1A). Solulinjaa A2780WT (

ylempi vasen paneeli

) oli vain hieman esti sen kasvua LBW242 lisätä yksinään; kuitenkin, yhdistetty hoito LBW242 TRAILin kanssa aiheutti merkitty synergistinen solujen kasvun esto. Samanlainen herkkyyden havaittiin HEI solulinjan (

vasen alapaneeli

). Isobologrammi analyysi vahvisti synergististä kasvaimen vastainen aktiivisuus LBW242 plus TRAIL (for A2780WT CI = 0,77 ja HEI CI = 0,80). Synergistinen vuorovaikutus LBW242 ja TRAIL A2780WT ja HEI solulinjoja voidaan intuitiivisesti visualisoida piirtämällä solujen kasvun dataa mittauksia LBW242 0 uM ja ilman TRAIL 100% ja kaikki myöhemmät mittaukset ilmaistu suhteessa omaan ohjaus (ks. S1). Tämä luku paljastaa lisäalentamiseen solujen määrä aiheuttama lisäämällä LBW242 päälle, joka indusoi TRAIL yksinään (Fig. S1).

harmaat palkit edustavat keskiarvoja ± SEM. Munasarjasyöpä eristetyt solut tuumoribiopsioissa on kasvatettu 24 tunnin ajan joko ilman tai, kun läsnä on LBW242 (10 uM) tai TRAIL (50 ng /ml) tai molempia tekijöille edellä pitoisuuksina.

Alahavas oikealla

: osuus kuolleita soluja oli korkeampi LBW242 tai TRAILin tai LBW242 + TRAIL käsiteltyjä soluja kuin verrokeilla ei-käsiteltyjen solujen (p = 0,01); Lisäksi prosenttiosuus kuolleita soluja oli pienempi LBW242 + TRAIL kuin TRAIL tai LBW242-käsiteltyjä soluja (sekä p = 0,05).

Alahavas vasemmalla

: Solu- määrä oli merkitsevästi pienempi LBW242 + TRAIL kuin TRAIL tai LBW242 käsiteltyjä soluja (sekä p = 0,05).

A2780ADR ja SKOV3 (

oikea paneeli

) solulinjat olivat järkevintä estävästä vaikutuksesta LBW242 soluproliferaatioon, joka oli kohtalaisen lisääntyi TRAIL lisäämällä. Isobologrammi analyysi osoitti additiivinen vaikutus LBW242 plus TRAIL kasvun estämisessä näistä solulinjoista (for A2780ADR CI = 0,97; SKOV3- CI = 1,0).

Sama käsittelyt suoritettiin A2780WT ja SKOV3 solulinjat vaikutuksen arvioimiseksi LBW242 prosenttiosuudesta apoptoottisten solujen (Fig. 1 B). A2780WT solut olivat tuskin herkkiä yhden hoitojen kanssa joko LBW242 tai TRAIL yksinään, mutta hyvin herkkä yhdistetyn hoidon (CI = 0,70). SKOV3- solut olivat herkkiä pro-apoptoottinen vaikutus LBW242, mutta tuskin herkkiä TRAIL; yhdistetty lisäksi kahden lääkkeen lisäsi edelleen apoptoosin (CI = 0,79) (Fig. 1 B).

Nämä tiedot osoittavat, että: munasarjasyövän solulinjoissa ovat herkkiä LBW242 vaikutuksia, erityisesti yhdistettynä hoidon TRAIL; LBW242 kykenee synergistisiä tai additiivisia antituumorivaikutuksen TRAILin kanssa munasarjasyövän solulinjoissa.

Kokeet suoritetaan käyttäen agonistinen anti-TRAIL-R1 (MAPATUMUMAB) tai anti-TRAIL-R2 (LEXATUMUMAB) mAb: itä todisteita siitä, että jälkimmäinen lasketaan yhteen LBW242 indusoi korkea apoptoosin kaikki neljä munasarjasyövän solulinjoissa tässä tutkittu (tuloksia ei ole esitetty).

c-FLIP

L yli-ilmentyminen estää pro-apoptoottinen vaikutus LBW242

Aiemmissa tutkimuksissa on osoitettu, että TNFa: n stimulaatio, kaspaasi-8 on kriittinen apoptoottisten proteaasi IAP-antagonisti-solukuolema [27] – [30]. Tutkia mahdollista roolia kaspaasin 8 aktivaation LBW242-välitteisen solukuoleman, käytimme stabiilisti transfektoitujen solulinjojen c-FLIP

L (A2780WT FLIP, A2780ADR FLIP ja SKOV3 FLIP), luonnollinen kaspaasi-8-estäjä. A2780WT, A2780ADR ja SKOV3- solut ilmentävät pieniä määriä C-FLIP, c-FLIP

L ainoana isoformi havaittavissa näissä soluissa (Kuva. 2 ja Fig. S2). Sen sijaan, koska on odotettavissa, A2780WT FLIP, A2780ADR FLIP ja SKOV3 FLIP ilmentävät korkeita c-FLIP

L (Fig. 2 ja Fig. S2). C-FLIP

S oli havaittavissa kaikissa näissä solulinjoissa (kuvio. S2).

Etenkin vuonna A2780WT, ADR ja SKOV3- soluja (Fig. 2,

vasen paneeli

s

) transfektoitu tyhjällä vektorilla (PINCO), yksittäinen hoito LBW242 tai TRAIL indusoi kohtalainen apoptoottinen vaikutus, kun taas yhdistetty hoito LBW242 TRAILin kanssa indusoi huomattava nousu solukuolemaan. Näissä soluissa yli-ilmentävät c-FLIP

L (Fig. 2,

oikea paneeli

s

) vaikutus LBW242 hoito yksinään tai yhdessä TRAIL on erittäin estyy, mikä tukee hypoteesi, että SMAC /DIABLO jäljittelevää voi toimia kautta induktio kaspaasin 8 aktivaatioreitin.

tätä varten solut käsiteltiin myös yleiseurooppalaisella kaspaasiestäjä zVAD tai tietyllä kaspaasi-8-estäjä, zIETD; kuvassa. 3 solukuoleman prosenttiosuutta ei raportoitu. Kuten odotettua zVAD suojaa soluja apoptoottisen vaikutuksen sekä yksi- että yhdistelmähoidot, mikä osoittaa, kaspaasin aktivaatio osallistumista LBW 242 + TRAIL-välitteistä solukuolemaa. Lisäksi on mahdollista todeta, että vaikutus zIETD on verrattavissa zVAD, mikä osoittaa keskeinen rooli kaspaasi-8 aktivaatio alle yhdistetyn toiminnan LBW242 ja TRAIL hoitoja (Fig. 3,

vasen paneeli

s

).

LBW242 lisätään yhdessä TRAIL indusoi kaspaasi-8 aktivaatio

Biochemical analyysit tehtiin tutkimalla ekspressiota eri proteiinien mukana apoptoottisen väylän A2780WT PINCO, A2780ADR PINCO, SKOV3 PINCO ja A2780WT FLIP, A2780ADR FLIP ja SKOV FLIP solulinjoja käsiteltiin kuten edellä mainittiin. Kuviossa. 4 A, B ja C 24 tunnin kuluttua hoitoja, on mahdollista huomata, että XIAP tasoja ei vaikuta LBW242. Tämä havainto on yhdenmukainen aiempien tutkimusten kanssa, jotka osoittavat LBW242 estää XIAP aktiivisuutta vaikuttamatta sen ilme [17] – [21]. Kuten odotettua perusteella aiemmissa raporteissa [17] – [21], LBW242 dramaattisesti downmodulates c-IAP1 tasolla ilmiö selvästi nähtävissä kaikissa solulinjoissa, mukaan lukien yli-ilmentävät c-FLIP

L. Munasarjasyövän solulinjoissa LBW242 indusoi vaikutus c-IAP2 ilmentyminen on hyvin erilainen kuin havaittu c-IAP1. Itse asiassa 24 h altistuminen solut LBW242 aiheuttama selvä upmodulation c-IAP2 tasot (Fig. 4), linjassa aiemman raportin [31]. Koska on odotettavissa, c-FLIP

L yliekspressio ei muuttanut vaikutusta LBW242 c-IAP2 tasot (Fig. 4). Toisaalta, TRAIL indusoi maltillista c-IAP2, toteaminen linjassa aikaisempien tutkimusten [32]. Varsinkin c-FLIP yliekspressio esti stimuloiva vaikutus TRAILin c-IAP2 tasot (Fig. 4). Yhdistetty hoito LBW242 ja TRAIL johti merkittävään upmodulation c-IAP2 tasot (Fig. 4). Lisäksi LBW242 onnistunut indusoimaan joko kaspaasin 8, kaspaasi-9 tai kaspaasi-3 aktivaation, koska se voidaan päätellä puuttuminen merkittävästi vähentää prokaspaasi-8, -9 ja -3 tasoa ja ulkonäkö aktiivisen kaspaasin pilkottu fragmentit (katso Fig. 4 A-C ja kuvio. S3). Mukaisesti Näiden havaintojen LBW242 onnistunut indusoimaan pilkkomisen PARP, herkkä tavoite aktivoitujen kaspaasi-3 (kuvio 4A C).

Kun LBW242 lisättiin yhdessä TRAIL merkittävästi voimisti tästä kuoleman ligandin on kaspaasin 8 ja kaspaasi-3 aktivointi ja PARP pilkkominen A2780 WT, A2780 ADR ja SKOV 3 solulinjat transfektoitiin tyhjällä vektoreilla, mutta ei niissä yli-ilmentävät c-FLIP

L (Fig. 4 A-C) . On tärkeää huomata, että kaspaasi-8 aktivaatio, laukaisee TRAIL ja enimmäkseen LBW242 + TRAIL, johtaa BID hajoamista, jolloin saavutetaan aktivointi luontainen apoptoottisen reitin (Fig. 4 A-C). Bid hajoaminen oli lähes täysin estää c-FLIP yli-ilmentymisen (Fig. 4 A-C).

LBW242 paransi proapoptoottinen vaikutus syöpälääkkeiden on munasarjasyöpäsoluja

Standardi sairaanhoidon munasarjasyövän liittyy ensi kädessä käyttöön platinan ja taksolin syöpälääkkeiden. Siksi tuntui kiinnostavia arvioida mahdollisen yhteistoiminnallinen vaikutus joidenkin syöpälääkkeiden, kuten sisplatiini, taksoli, topotekaani, etoposidi ja doksorubisiini yhdessä LBW242. Näin ollen, ensimmäisessä koesarjassa käsittelimme HEI soluja sisplatiinin tai paklitakselin tai Topotekaanin tai etoposidi tai doksorubisiini, lisättiin kaksi annosta, alempi kliininen annos, joka vastaa piikin annoksen havaittu infuusion aikana näiden lääkkeiden syöpäpotilaille ja 5 kertaa korkeampi supraclinical annos, yksinään tai yhdistelmänä, jossa on tasanne annos LBW242 (30 uM). Tulokset Tämän kokeen osoitti selvästi, että LBW242 pystyi sytotoksisia vaikutuksia kaikkien näiden lääkkeiden (Fig. 5A). Isobologrammi analyysi osoitti synergististä antituumorivaikutuksen of LBW242 sisplatiinin (CI = 0,82) tai plus Paklitakselia (CI = 0,70) tai plus Topotekaanin (0,72) tai plus Etoposidia (CI = 0,73) tai plus Doksorubisiini (p = 0,78). Toisessa kokeessa testasimme kykyä erilaisten annosten LBW242 parantaa sytotoksisuuden aiheuttama kliininen annos sisplatiinia, paklitakselia tai topotekaani. Tämä koe osoitti, että LBW242 annoksesta riippuvalla tavalla lisäsi sytotoksista vastetta näille lääkkeille, saavuttaa maksimaalinen vaikutus 20-30 uM annoksilla (kuvio. 5B). Isobologrammi analyysi osoitti synergististä antituumorivaikutuksen of LBW242 plus Topotekaani (CI = 0,70) tai Taxol (CI = 0,71) tai sisplatiinia (CI = 0,82).

Näiden havaintojen perusteella, toisessa koesarjassa me keskittäneet huomiomme kapasiteetin LBW242 parantaa vaikutuksia topotekaani, joka on lääke, jota käytetään munasarjasyövän hoidossa ja tunnetaan mahdollisena kaspaasi-8 aktivaattori [33].

kuviossa. 6A on mahdollista huomata, että Topotekaani kohdistaa merkittävä pro-apoptoottinen vaikutus, kun sitä lisätään yhdessä LBW242 ja TRAIL A2780WT PINCO soluissa; solukuolemaa tuumorisolujen aiheuttamaa näitä aineita, kun niitä käytetään yhdistelmänä suuresti estää yleiseurooppalaisen kaspaasiestäjä zVAD-fmk ja siksi on pääasiassa välittyy kaspaasin aktivaation.

A2780WT FLIP-solujen apoptoottisen induktion aiheuttama yhdistyksen välinen LBW242, TRAIL ja Topotekaani on estää lähes täysin mikä viittaa merkittävän roolin kaspaasin 8. induktion kasvaimen solukuoleman (Fig. 6A).

Nämä havainnot on vahvistettu SKOV3 PINCO ja SKOV3- FLIP-solut (Fig. 6A). Rooli for caspases-8 aktivaation topotekaanin aiheuttaman kuoleman munasarjasyöpäsoluja päätelmää tukevat kokeet kvantifiointiraja kaspaasien-8 aktivointia.