Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

kautta negatiivinen geeniekspression säätelyä, MikroRNA (miRNA) voi toimia syövät oncosuppressors, ja he voivat osoittaa muuttunutta ilmentymistä erilaisissa kasvaintyypeissä. Tässä olemme tutkineet medulloblastoma kasvaimet (MBS), jotka syntyvät jo varhaisessa heikentyvän kehityshäiriöitä prosesseja pikkuaivot, jossa Notch signalointi on osallisena monissa solun kohtalon määräävät vaiheissa. MBs esiintyä bimodally, jossa huippu esiintyvyys välillä nähdään 3-4 vuotta ja 8-9 vuotta iässä, vaikka se voi esiintyä myös aikuisilla. Notch säätelee osajoukko MB solut, jotka ovat kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia ja voi edistää kasvaimen kasvua. Sen Näiden todisteiden perusteella, me arveltu, että miRNA kohdistettu Notch polku voi säädellä näiden ilmiöiden, ja voidaan käyttää syöpähoitojen.

Menetelmät /Principal Havainnot

seulonta MB solusarjalla miRNA miR-199B-5p nähtiin säätelijänä Notch reitin kautta kohdentamalla transkriptiotekijän HES1. Down-regulation HES1 ilmentymisen miR-199B-5p säätelee negatiivisesti leviämisen nopeus ja kiinnittymisestä riippumatonta kasvua MB soluja. MiR-199B-5p over-ilmentyminen estää ilmentyminen useiden syövän kantasoluja geenit, heikentää toimivasti siirtyviin potentiaalia MB solujen pikkuaivot Kateenkorvattomien /nude-hiirten, ja erityisen kiinnostava, vähentää MB kantasolun kaltainen (CD133 +) solujen alapopulaatio. Meidän analyysi 61 potilasta, joilla MB, ilmaus miR-199B-5p ei-metastasoitunut oli korkeammalla tasolla kuin metastaattisen tapauksissa (P = 0,001). Korrelaatio selviytymisen näille potilaille, joilla on korkea miR-199B ilme oli positiivista parempaan eloonjäämiseen kuin heikosti ilmentävien potilailla. Nämä tiedot osoittavat alas-säätely miR-199B-5p metastasoitunutta MBs viittaavat potentiaalinen vaiennettu mekanismin kautta epigeneettisellä tai geneettisiä muutoksia. Kun induktio de-metylaatio käyttämällä 5-atsa-deoksisytidiinin alentaa miR-199B-5p ilmentymisen nähtiin paneelia MB solulinjojen tukemana epigeneettisestä mekanismi sääntelyn. Lisäksi kaksi solulinjaa (Med8a ja UW228) osoitti merkittävää säätely ylöspäin miR-199B-5p käsittelyllä. Infektio MB solujen indusoidun ksenograftimallia hiirellä pikkuaivot ja adenoviruksen käyttö kuljettaa miR-199B-5p osoittavat kliinistä hyötyä läpi tämän negatiivisen vaikutuksen miR-199B-5p kasvaimen kasvuun ja osajoukko MB Stern- cell kaltaisia ​​soluja, jotka tarjoavat edelleen proof of concept.

Johtopäätökset /merkitys

huolimatta edistysaskeleet ymmärrystämme patogeneesiä MB, kolmasosa näistä potilaista ovat edelleen parantumaton ja nykyiset hoidot voivat merkittävästi vaurioita pitkäaikainen eloonjääneitä. Tässä osoitamme, että miR-199B-5p ilmaisu korreloi etäpesäkkeistä, laatimassa uutta molekyylitason merkkiaine huono-riskiluokan potilailla, joilla MB. Olemme lisäksi osoittavat, että ksenograftimallia, MB kasvaintaakka voidaan vähentää, mikä osoittaa, käyttö miR199b-5p adjuvanttihoitona leikkauksen jälkeen, yhdessä säteilyn ja kemoterapian, parantamiseksi syövän MB hoitojen ja potilaan laatua life. Tähän mennessä tämä on ensimmäinen raportti, että ilmaus miRNA voi heikentävistä kasvain kantasolujen, mikä osoittaa mielenkiintoinen terapeuttinen lähestymistapa kohdentamiseen näiden solujen aivokasvaimia.

Citation: Garzia L, Andolfo I, Cusanelli E, Marino N, Petrosino G, De Martino D, et al. (2009) MicroRNA-199B-5p heikentää Cancer Kantasolut kautta negatiivinen asetus HES1 in Medulloblastoma. PLoS ONE 4 (3): e4998. doi: 10,1371 /journal.pone.0004998

Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Ordway Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 marraskuu 2008; Hyväksytty: 23 helmikuu 2009; Julkaistu: 24 maaliskuu 2009

Copyright: © 2009 Garzia et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat FP6-EET putki LSH-CT-2006-037260 (MZ), FP7-Tumic TERVEYS-F2-2008-201662 (MZ), Associazione contro la lotta al Neuroblastooma Italiana ”Progetto Pensiero” (aI, MZ), AIRC avustus 2007 (MZ), Progetto AIRC Tumori Pediatrici 2008 (MZ). Associazione Open Neuroblastooma (AI), a Scuola Europea di Medicina Molecolare (SEMM-CEINGE) Fellowship (EY), ja AIRC-FIRC Yhteisöt (LG, NM). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat yksijuosteisia RNA: ita ~22 nukleotidia pitkiä, ja ne muodostavat uuden luokan geenin säätävät [1]. Eläimillä miRNA on säätelyvaikutukset kautta sitoutumalla epätäydellinen täydentävien alueiden sisällä 3′-alueet (3’UTRs) niiden mRNA tavoitteita. Altered ilmentymä monta miRNA nähdään useita kasvaintyypeissä: esim. B-solulymfooma (ryhmittyneet miR-17) [2], [3], pahanlaatuiset lymfoomat (miR-15a, miR-16-1; kohdistaminen BCL2) [4], glioblastooma kasvaimet (miR-21up-asetus) [5] , peräsuolen neoplasia (miR-143, miR 145 alassäädetty) [6], keuhkosyöpä (miR-29) [7], ja rintasyöpä (miR-10b) [8], jossa on useita enemmän kasvaintyypeille analysoitavana.

Täällä olemme keskittyneet yleisin pahanlaatuisen aivokasvaimen, medulloblastoomien (MBS). Mt näyttävät olevan peräisin kantasoluista ja rae neuroniesiasteiden ulkoisen rae kerros pikkuaivot [9], tai vaihtoehtoisesti, multipotenteista lähtöaineiden kammion vyöhykkeellä pikkuaivojen [10] – [12]. Eräästä kliinisestä näkökulmasta, nykyinen multimodaalinen hoidot ovat radikaali kirurginen resektio seuraa säteilyn ja kemoterapiaa. Vaikka nämä hoidot voivat parantaa eloonjäämisaste, MB pysyy parantumaton noin kolmannes näistä potilaista. Tärkein kuolinsyy on toistumisen liittyy kasvaimen levittämiseen, minkä jälkeen nykyiset hoitovaihtoehdot ovat vähän tehoa [13]. Nämä hoidot ovat myös myrkyllisiä ja voivat johtaa pitkäaikaiseen vammaiset [14] – [16]. Näin ollen, on olemassa huomattava tarve uusille, tehokkaan, matalan toksisuuden hoitojen lasten medulloblastooma.

MB-solut voivat myös sisältää funktionaalisesti tärkeitä subsets solujen kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia, jotka ovat yksilöllisesti pystyy etenemään kasvaimen kasvua [17], [18]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että sekä progenitorit ja kantasolut voivat vastata Sonic-Hedgehog (Shh) reitin ja voi toimia solujen alkuperän MBs [19].

Notch aktiivisuus on osoitettu säätelevän rae-cell esisolujen josta MBs syntyvät, jossa Notch2 geenin kopio määrä kasvoi 15%: MBs [12], [20]. Pysyvät ilmaus

bHLH HES1

, pääasiallinen Notch-reagoiva geenin, estää sekä kulkeutumista hermoesiastesolut pois kammion vyöhykkeen ja ilmaisun hermosolujen merkkiaineiden [21]. Hiiret puuttuu

Hes1

osoittavat ennenaikainen neurogenesis, nähdään säätely ylöspäin hermo bHLH transkriptiotekijöitä, mikä merkitsee huomattavia hermostoputken-putki vikoja [22]; esisolut johdettu näistä hiiristä on heikentynyt itseuudistuvien potentiaalia, joiden sitoutuminen kohti hermosolujen linjaa [23].

Merkittävästi ilmentyminen HES1 megatavuina on liittynyt huonompi kliiniseen tulokseen [24]. Huomionarvoista, joka on vuorovaikutus Shh jyvässolukasvainten esiaste kehitys on oletettu [25], kuten on cross-talk muiden polkuja, esim. Polycomb ryhmä geeni

BMI-1

[26].

Meidän lähestymistapamme alkoi etsiä miRNA (miRNA rekisteri) kanssa kohdegeenien mukana Notch koulutusjakson, ja tunnistimme miR199b-5p kuten kohdistaminen HES1, Notch efektori. Osoitamme, että miR-199B-5p ilmentyminen häviää metastaattisen potilaiden ja olettaa mekanismi sääntelyn seuraavista epigenetic hiljentäminen kautta metylointi prosessien aikana tapahtuneen Karsinogeneesin laatimassa uutta molekyylitason merkkiaine huono-riskiluokan potilailla, joilla MB. MiR199b-5p ilmaisu nimenomaan heikentää syöpää kantasolujen (CD133 +) väestö, mikä johtaa

in vivo

heikkenemiseen MB kasvainten kehittymistä pikkuaivot ksenograftissa hiirimallissa, mikä tarjoaa proof of concept. Kuten MikroRNA on äskettäin osoitettu olevan hyödyllisiä työkaluja vaientaa syövät, he saattavat pystyä täyttämään tämän aukon kautta valvonta useiden kohdegeenien. Tarjoamme täällä todisteita käytöstä miRNA klinikalla, meidän kasvainhoitojen kohdistaminen syövän kantasoluja miR-199B-5p.

Tulokset

Hsa-miR-199b- 5p hiljaisuudet HES1 ilmaisun kautta 3’UTR sitova

in-silico

analyysi mirBase kohdistuu tietokantaan [27] on suunnattu tunnistamiseen miRNA mahdollisesti kohdistuvat HES1, efektori Notch reitin , peruskeinoja säätelyssä MB solujen lisääntymisen. MiR-199B-5p ja miR-199-5p olivat parempia pisteytys miRNA, ja ennustettiin sitoa 3’UTR ihmisen bHLH HES1. Keskityimme miR-199B-5p johtuen sen kyvystä alentaa HES1 ilmentymistä ohimenevää yli-ilmentymisen verrattuna miR-199-5p (Text S1, Fig. S1A, B). MiR-199B-5p on menetetty keuhkotuumoreissa [28], ja se on kartoitettu genomialue poistettu virtsarakon syöpä [29]. MiR-199 * (tunnetaan myös nimellä miR-199-5p, ja joilla on identtinen sekvenssi miR-199B-5p) pienenee myös maksasolukarsinoomassa [30] – [32]. Analyysi miR-199B-5p ilmentymistä kahdessa MB solulinjoissa, ihmisen aikuisen kudosten ja hiiri pikkuaivot, näkyy teksti S1, Fig. S1C, D ja S2A, B.

Sen määrittämiseksi, onko HES1 on tavoite miR-199B-5p, The HES1 3’UTR kloonattiin alavirtaan lusiferaasireportterigeeniin vektori; pre-miR-199B-5p kloonattiin myös nisäkkään ekspressiovektoriin (katso teksti S1). HEK-293-solut transfektoitiin suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus osoittaa, että miR-199B-5p kotransfektiolla laski reportterigeenin aktiivisuuden, mikä osoittaa sitoutumisen 3′-UTR ja epävakauden tuottavan translaation lusiferaasin mRNA (teksti S1, Fig. S1E ). Kontrolleina, HES1 3’UTR mutatoituja miR-199B-5p sitoutumiskohdan ei vaikuttanut miR-199B-5p (Text S1, Fig. S1E), ja kun 2-O’-metyyli oligoribonukleotidi (2-OM) täydentävät kypsä miR-199B-5p on kotransfektoitiin, se torjua vaikutuksia miR-199B-5p transfektion palauttaminen toimittaja aktiivisuus (teksti S1, Fig. S1E). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin Daoy MB soluissa (Text S1, Fig. S1F).

määrittämiseksi roolin miR-199B-5p MB solubiologian, MIR-199B-5p ekspressiorakennelma transfektoitiin Daoy solut, ja useita stabiilien kloonien yli-ilmentävät miR-199B-5p valittiin. Yli-ilmentyminen varmistettiin reaaliaikainen PCR (Text S1, Fig. S1G). Kolme kloonia osoittivat vähentää HES1 proteiinin tasoja, joista yksi (199bSC1) ei osoittanut havaittavaa HES1. 199bSC1 ja 199bMC1 kloonit valittiin jatkotutkimuksiin (teksti S1, Fig. S1H). Nämä vaikutukset miR-199B-5p on HES1 proteiinin ilmentyminen ei rajoitu stabiilien kloonien tai Daoy soluja, kuten D283MED solut transfektoitiin väliaikaisesti ekspressiorakenteeseen miR-199B-5p osoitti myös vähentää HES1 tasoilla (teksti S1, Fig. S1B ).

vahvistamiseksi näiden havaintojen perusteella 199bSC1 klooni transfektoitiin 2-OM antisense miR-199B-5p ja käytettiin negatiivisena kontrollina (Text S1, Fig. S1i). Täällä HES1 tasot palautettiin, mikä viittaa 2-OM lohkon HES1 tukahduttamisen miR-199B-5p, joka tarjoaa vielä vahvistusta että miR-199B-5p tavoitteet HES1 suoraan. Muita mahdollisia kohteita miR-199B-5p tutkittiin myös tällä tavalla (Text S1, Fig. S2C, D).

Yli-ilmentyminen miR-199B-5p vähentää solujen lisääntymistä ja heikentää klonogeeniset potentiaalin MB solulinjat

199bSC1 ja 199bMC1 kloonit oli vähentänyt leviämisen hinnat tavanomaisissa viljelyolosuhteissa, verrattuna kontrolliin klooni. Niinpä etsimme mahdollisia solusyklin muutoksia näiden kloonien. FACS-analyysi 199bSC1 klooni osoitti 31%: n lasku S-vaiheen jakeet, ja lisää solujen G0-G1 on 15%, verrattuna tyhjän vektorin klooni (Fig. 1A). Tämä viittaa siihen, että poistuminen solusyklin on rooli alennetun leviämisen nopeus on Daoy solun 199bSC1 klooni. Sen sijaan 199bMC1 klooni eivät osoittaneet merkittäviä muutoksia sen solusyklin. Uskomme, että nämä havainnot johtua alhaisemmat tehokkuuden 199bMC1 vähentää HES1 proteiinin tasoja. Nämä solusyklin fenotyypit käännetty vähentynyt proliferaatio hinnat

in vitro

, kuten arvioitiin

in vitro

proliferaatiomäärityksillä vertaamalla 199bSC1 ja 199bMC1 kloonit tyhjällä-vektorin klooni ja ohimenevä transfektantin varten 2-OM suunniteltu vastaan ​​miR-199B-5p (Fig. 1 B). Sekä 199bMC1 ja 1999SC1 kloonit osoittivat selvästi vähentänyt leviämisen hinnat. Transfektio tämän antisense 2-OM indusoi selvästi lisääntynyt leviämisen tallin 199bSC1 klooni, kanssa palautettu ekspressiotasot HES1. Nämä tulokset on Daoy soluproliferaatioon vahvistettiin myös D283 ja ONS76 soluja (Text S1, Fig. S2F). Vaikutukset miR-199B-erityisiä 2-OM vahvistettiin myös villityypin Daoy soluihin, jossa se mahdollisesti vaikuttaa endogeeninen miR-199B (Text S1, Fig. S2G).

A) edustaja FACS analyysi propidiumjodi- jodi osoittavat laskua prosenttiosuudet solujen S-vaiheessa ja lisätä G0-G1 vakaan 199bSC1 klooni. Puuttuminen lapa signaalien kanssa G0-G1 punainen huippu 199bSC1 ja 199bMC1 kloonit sulkee apoptoottisia prosesseja. B) Proliferaatiomääritykset mukaan 3-4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli-5-3-karboksimetoksifenyyli-2-4-sulfofenyyli-2H-tetratsoliumsuolaa (MTS), joka osoittaa vähentynyt proliferaatio määrien vakaa 199bSC1 kloonin (punainen kolmiot) ja 199bMC1 klooni (vihreä ristit), verrattuna vakaa klooni tyhjällä vektorilla yksinään (sininen timantti). Tämä vaikutus miR-199B-5p over-ilmentyminen väheni 2-OM transfektio (vaaleanpunainen neliöt). Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kahdesta itsenäisestä kokeesta, kussakin suoritettiin kolmena kappaleena. C) Rapresentative mRNA ilmentyminen erilaistumisen (esim MASH1, MATH3 ja NEUROGENIN 2) ja lisääntymistä (esim c-MYC, sykliini D1) merkkiaineiden upon miR-199B-5p yliekspressio, mistä kertoo reaaliaikaisen PCR, vertaamalla vakaa 199bSC1 ja 199bMC1 kloonit tyhjällä vektorilla kloonin. D) Vakaa 199bSC1 klooni miR-199B-5p näkyy heikentynyt pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa määrityksissä. Juoni näyttää pesäkkeiden keinona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta, kukin suoritettiin kolmena kappaleena. E) edustaja Western blot käyttäen anti-c-Myc ja anti-sykliini D1-vasta-aineita näyttää näiden kahden proteiinin olevan alassäädetty tallissa 199bSC1 klooni; katso myös densitometrinen analyysi oikeassa paneelissa. F) Kuten E, osoittaa GABRA6 ja MATH3 proteiineja säädellään ylöspäin jälkeen miR-199B ilmaisua, mikä viittaa erilaistumisen induktioon. Anti-Laminin-β-vasta-aineita käytettiin normalisoitu ydinaseiden c-Myc ja sykliini D1 proteiinin ilmentymiseen. Anti-β-aktiini-vasta-aineita käytettiin normalisoidun soluliman GABRA6 ja MATH3 proteiinien ilmentyminen.

vaikutukset induktion miR-199B-5p arvioitiin molekyylimarkkereita proliferaation ja erilaistumisen reaali aika lähestymistapa. Kuten kuviossa. 1C, MAP2, joka on useimmiten ilmaistaan ​​kypsä hermosoluissa [33], oli säädelty tallissa 199bSC1 ja 199bMC1 klooneja. Vastaavasti, Daoy solujen on raportoitu ilmaista GFAP erilaistumisen jälkeen, jossa fenyyli- [34], ja vakaa 199bSC1 klooni, GFAP kohoamiseen. Kaiken kaikkiaan kuva geenien ilmentymisen meidän vakaa solulinjassa yli-ilmentävät miR-199B-5p on yhtä mieltä fenotyypin, joka on nähty aivojen

Hes1 – /-

hiiri [23]. Niistä muita geenejä, GABRA6, merkkiaine pikkuaivojen rae solujen erilaistumista, oli myös merkitsevästi yliekspressoitu tallin kloonien (Fig. 1 C).

hienosäädetään kaskadi positiivisten ja negatiivisten bHLH transkriptiotekijöitä on keskeinen neurogenesis, jossa geenejä, kuten

MASH1

,

MATH3

ja

NGN2

asiakkuutta neurogenesis, ja HES1-mutanttihiirillä näy sääntelyn näiden aktivaattori-type bHLHs [ ,,,0],35]. Sekä miR-199B-5p vakaa kloonien suurentunut ilmentyminen pro-hermo bHLH. Suostumuksella niiden väheneminen proliferaationopeus, leviämisen markkereita c-Myc ja sykliini D1 laskivat. Näistä kahdesta analysoidusta kloonista, 199bSC1 osoitti johdonmukaisuutta fenotyyppi; selitämme nämä tulokset tehokkaamman HES1 hiljentäminen tässä klooni.

Koska miR-199B-5p vakaa 199bSC1 klooni osoitti vahvempi ja yhtenäisempi fenotyyppi, tutkimme seuraavaksi sen standardin klonogeeniset määritys, määrittämään onko ankkurista riippumaton kasvu vaikuttivat miR-199B-5p. Tässä oli 80%: n vähennys pesäkemuodostusta potentiaalia, verrattuna tyhjän vektorin klooni (Fig. 1 D). Suostumuksella pienenemisen proliferaationopeus, leviämisen markkereita c-Myc ja sykliini D1 vähennettiin (Fig. 1 E). Olemme vahvistaneet myös proteiinitasolla että GABRA6 ja MATH3 kasvoi-säädellään 199bSC1 klooni (Fig. 1 F); jälkimmäinen tiedetään suoraan tukahduttaa vastaavasti HES1 [35].

MiR-199B-5p depletes puolella väestöstä osastotyypin Daoy solulinjassa, ja säätelee negatiivisesti MB kasvain kantasolujen populaatioiden

Lovi polku on yhdistetty osa MB syöpäsolujen satama esiaste kantasolujen merkkiaineita [36], ja HES1 on tehtävä itse uudistuksen multipotentteihin progenitorisolujen [23]. Tämä puoli väestöstä (SP) kasvainsolujen on rooli toimivasti siirtyviin kasvaimen eläinmalleissa [37]. Meillä on siis tutkinut vaikutusta miR-199B-5p väestöön syöpäsolujen sulkea Hoechst 33342 väriaine, strategia tunnistaa nämä SP-soluissa. Tämä määritettiin virtaussytometrialla on Daoy solulinjassa, SP, joiden osuus on korkeintaan 4,9% soluista, verrattuna verapamiili-käsiteltyjä soluja (negatiivinen kontrolli) (Text S1, Fig. S3A, B). Tämä verapamiili hoito perustui verapamiilin esto ioni-pumput vastaa Hoechst 33342 eksluusio, jolloin SP-soluja nähdään [38]. Värjäys 199bSC1 ja 199bMC1 solut osoittivat, että SP oli ablatoitu, koska siellä oli lähellä mitään eroja Hoechst-käsiteltyä näytettä ja Hoechst plus verapamiili näytteitä (Text S1, Fig. S3C-F).

on myös tunnettua, että keskushermoston kasvaimen kantasolut ilmentävät CD133-antigeenin, ja että nämä solut ovat ainutlaatuisesti kykenevät kasvainten muodostumista NOD-SCID-hiirissä [18], [39]. Lisäksi Notch polku on keskeinen rooli itseuudistuvien prosessi, jossa sen esto johtaa ehtyminen CD133-positiivisia (CD133 +) Daoy solut indusoimalla apoptoosin progenitorisolujen kaltaisia ​​soluja [36]. Äskettäin on osoitettu, että CD133 + Daoy solujen edistää kasvaimen kasvua kylkeen nude-hiirten, kun taas CD133- solut eivät [40]. Näistä syistä, arvioimme CD133 positiivisuus Daoy solujen verrattuna vakaa 199bSC1 ja 199bMC1 kloonia (Fig. 2). Tässä villityypin solut olivat 14,8% CD133 +, kun taas stabiili 199bSC1 ja 199bMC1 kloonien tämä laskettiin 2,4% ja 6,5% CD133 +, vastaavasti (Fig. 2C-F). Tämä siis osoitti rooli miR-199B-5p negatiivisessa sääntelyn tämän osa kasvaimen aloittamista soluihin.

A-F) edustaja FACS analyysit tallin 199bSC1 (D) ja 199bMC1 (F) kloonit osoittivat lasku solujen prosenttiosuus, jotka olivat positiivisia kantasolujen markkerin CD133 (B); A, C ja E ovat negatiiviset kontrollit (ei vasta-aine).

HES1 yliekspressio pelastaa miR-199B-5p klooni fenotyyppi

Varmista, että solun fenotyyppi korreloi suoraan down-regulation HES1 teimme

in vitro

solu-pelastus kokeita. Valitsimme pelastaa johdonmukaisempi fenotyyppi, osoittaa vakaa 199bSC1 klooni. Kun täyspitkä HES1 cDNA kloonattiin ja transfektoitiin vakaa Daoy-cell 199bSC1 klooni, HES1 ilmentyminen palautui, kuten arvioitiin immunoblottauksella (Fig. 3A). Totesimme myös uudelleen ilmentymä sykliini D1, joka alassäädetty tallissa 199bSC1 klooni. Palautettu HES1 ilmaisu myös käänteinen vaikutukset miR-199B-5p soluproliferaatioon (Fig. 3B). Samaan aikaan, transfektio HES1 cDNA osaksi 199bSC1 klooni laski induktion pro-hermo bHLHs ja erilaistumisen markkereita, ja kohonneita leviämisen geenien (Fig. 3C). Lisäksi transientti transfektio HES1 cDNA vakaa 199bSC1 klooni johti kasvuun solujen prosenttiosuus S-vaiheessa, ja poistamalla lohkon G0-G1 vaiheeseen (Fig. 3d). Tämä oli päinvastainen vaikutus näkyy stabiili 199bSC1 klooni yli-ilmentävät miR-199B-5p (ks. 1C ja kuvio. 3C). Vaikutukset palautettu ilmaus HES1 on SP vakaa 199bSC1 klooni arvioitiin myös. Kun HES1 transfektoidut solut (GFP-positiivisten) arvioitiin niiden kyky sulkea Hoechst dye, he osoittivat vähintään kasvua SP, jopa 1,3%. Vaikka korkeampi kuin mitattu vakaa 199B kloonia (Fig. 3E-H), tämä oli edelleen alle tason SP solujen villityypin soluissa (ETA S1, Fig. S3). Tämä johtuu todennäköisesti lyhyen ajan uudelleen ilmentymisen HES1 jälkeen ohimenevän transfektion, jotka eivät ehkä ole riittävän täydellinen fenotyypin pelastus. Yritimme sitten pelastaa vaikutuksia CD133 osastoon; kuitenkin ohimenevä transfektion HES1 että 199bSC1 klooni ei johtanut merkittävään kasvuun CD133 + soluissa. Uskomme, että tämä johtuu siitä, että lyhyen väliaikaisen transfektion ajan, joka ei salli uudelleen järjestäminen Daoy solun hierarkia.

A) edustaja Western blot ja densitometrinen analyysi osoittaa, että pelastaminen HES1 ilmaisun yli- ilmentymistä HES1 cDNA tallissa 199bSC1 klooni palauttaa sykliini D1 ilmentyminen. B) Proliferaatiomääritys by 3-4,5-dimetyylitiatsol- 2-yyli-5-3-karboksimetoksifenyyli-2-4-sulfofenyyli-2H-tetratsoliumsuolaa (MTS), joissa on näkyvissä lisääntyvän leviämisen nopeus on vakaa 199bSC1 klooni HES1 ilme (tumma sininen neliö), verrattuna vakaa 199bSC1 klooni yksin (vaaleansininen ruutu). Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kahdesta itsenäisestä kokeesta, kussakin suoritettiin kolmena kappaleena. C) Rapresentative mRNA ilmentyminen erilaistumisen (esim MASH1, MATH3 ja NEUROGENIN 2) ja lisääntymistä (esim c-MYC, sykliini D1) merkkiaineiden upon solu-pelastus kanssa HES1 tallissa 199bSC1 klooni, vertaamalla villityypin soluissa, kuten paljastui real-time PCR. Ilmentyminen GABRA 6 ja MAP2 ovat alassäädetty pelastus kokeessa. D) edustaja FACS analyysi HES1 ilmentävien vakaa 199bSC1 klooni esittää fraktion lisäys solujen S-vaiheessa, ja lasku G1, suhteessa stabiili 199bSC1 klooni yksin. E-H) vaikutus miR-199B-5p ilme SP Daoy solujen päinvastaiseksi HES1 uudelleen ilme. 199bSC1 stabiili klooni transfektoitiin HES1 cDNA: n ja GFP-koodaavan plasmidin, sitten käsiteltiin 48 tunnin kuluttua Hoechst ja verapamiilin (E-F) tai Hoechst yksinään (G-H) ja analysoitiin FACS: llä. GFP-positiiviset solut (P5 portti), paneeli E ja G, analysoitiin läsnäolon väriaine-ilman-solujen (F-H, P6 portti). Transfektoidut GFP negatiiviset solut (P3 portti), ei analised.

Kasvaimen kasvu pienenee ksenografteissa johdettu vakaa 199SC1 klooni

havainnot tässä osoittivat, että miR-199b- 5p on potentiaalinen estäjä kasvaimen muodostumisen. Siksi tutkia roolia miR-199B-5p käytettäessä

in vivo

kasvain malli, me vakauttivat 199bSC1 ja ohjata Daoy kloonit ekspressiovektorilla kuljettaa lusiferaasin cDNA. Saadut kloonit testattiin lusiferaasiekspressio tasoilla ja myös validoitu säilyttämistä vanhempien fenotyypin, kannalta sekä HES1 ja miR-199B-5p lauseke (katso teksti S1, Fig. S4A-D). Nämä vakaa 199B-Luc1 ja CTL-Luc-4 Daoy kloonit ruiskutetaan vasempaan ja oikeaan kyljet vastaavasti viisi atyymisissä nude /nude-hiirissä. Kasvaimen kasvu arvioitiin viikoittain

in vivo

bioluminenssina kuvantaminen (BLI) ruiskutettua hiirillä. Kahdeksaksi viikoksi, kaikki hiiret osoittivat näkyvä massojen kullekin valvonta kylkeen, kun taas vain kolme kyljistä ruiskutettiin 199B-Luc1 osoitti kasvain toimivasti siirtyviin. Kaiken kaikkiaan merkittävä ero kasvainten välillä ohjaus kylkien ja miR-199B-5p kyljet nähtiin (Fig. 4A). Bioluminisenssimääri- mittaukset osoittivat merkittäviä vähennyksiä päästöt MIR-199B-5p puolin kasvaimen kasvun aikana, verrattuna kontrolliin sivut (esim. Hiiri # 4, kuva. 4B). Yhdeksän viikon ajan, neljä viidestä hiiret osoittivat tilastollisesti merkitseviä eroja näiden bioluminenssina signaaleja ohjaus puolin ja miR-199B-5p counter puolille (Fig. 4C). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että miR-199B-5p voi heikentää kasvainmuodostusta

in vivo

kateenkorvattomissa nude /nude-hiirissä. Ksenograftikasvaimissa hiirestä # 5 ja hiiri # 4 eksplantoitiin ja analysoitiin miR-199B-5p ja HES1 ilmaisun ja arvioidaan histopatologisesti (Text S1, Fig. S4E-H).

A) Vieraslajisiirteen koe yli yhdeksän viikon jälkeen sc injektio Viiden hiiren kanssa ohjaus Daoy soluja (CTR puoli) ja Daoy solut yli-ilmentävät miR-199B-5p (199B puolelta). Jossa CTR soluja, kasvaimet olivat havaittavissa paljain in 5/5 hiirillä; Yli-ilmentävien solujen sisään 3/5 hiirillä. Kasvaimen kokonaistilavuus ero CTR ja 199B ruiskutetaan puolin yhdeksän viikon kasvu oli tilastollisesti merkitsevä, kuten (keskiarvoja ± SD). B) Photon päästöt hiiri # 4 yhdeksän viikon kasvaimen kasvua. 199B puolella (199bLuc-1) oli johdonmukaisesti alhaisempi fotoniemissio kuin kontrollipuolta (CTL-Luc-4). Vertailut kasvaimen mitat on myös esitetty. C) Kun fotoniemissio (katso B) muutettiin solujen määrä; yksi viidestä hiiret osoittivat merkittäviä eroja (keskiarvo ± SD) (kaksi tailed pariton

t

testi). D) Photon päästöt 3 hiirtä ruiskutettiin neljännellä kammion kanssa vastaavasti: 199bLuc-1, CTL-Luc-4 tartunnan mock AdV5, ja CTL-Luc-4 tartunnan miR-199B-5p AdV5. E) Koko aivot eläin- ja injektiokohdan (valkoinen nuoli). Hematoksyliini /eosiini-värjäys pikkuaivot; Musta nuoli, sivusto kasvaimien synnyn alkaminen. F) BLI ruiskutettua hiirten kuin D, yhden kuukauden kasvaimen kasvua. Erot ryhmien välillä ovat tilastollisesti merkitseviä. G) BLI kahden valitun hiirillä osoittavat kehitystä kasvaintaakka kanssa CTL-luc4-AdV5-Mock # 7, ja pelkistämällä CTL-luc4-AdV5-199b # 3 ajan (0-8 viikkoa). H) Hematoksyliini-eosiinivärjäykset pikkuaivojen peräisin AdV5-Mock # 2 ja AdV5-199b # 3 eläintä 10 viikon kuluttua potilaalle tehdä injektion, osoittaa kasvaimia, jotka ympäröivät ulkoinen rakeinen kerros ja sisällä IV kammion (valkoinen tähti). Sininen, DAPY värjäys yhdessä GFP havaitsemiseen. Suurennus kuten on osoitettu.

tutkimiseksi edelleen kyky miR-199B-5p säädellä MB kasvua, me pistetään 199bSC1 vakaa klooni ortotooppisesti neljänteen kammioon nude-hiirten 5 viikon iässä (kuvio . 4D, E). Neljän viikon kuluttua on

in vivo

ei-invasiivista seurantaa kasvaimen kasvua BLI hiirissä injektoitiin 199bSC1 kloonata kasvaimen kasvu oli huomattavasti pienempi kuin havaittu kontrolli (CTL) soluja, jotka on injektoitu puolella. Koska lisävahvistusta Näiden vaikutusten, myös ruiskutetaan CTL-solut infektoitiin adenovirus koodaavan miR-199B-5p: in kanssa aiempia havaintoja, nämä hiiret osoittivat myös pienentää BLI 4 viikon kuluttua (Fig. 4F). Lisäksi BLI yritysostoja 8 viikon kuluttua implantaatiosta soluista on esitetty kuvassa 4G. Tällä hetkellä kaksi hiirtä tapettiin ja edelleen analysoitiin histopatologia. Hematoksyliini-siinilla värjäys jäädytettyjen kudosten osoittivat syöpäkasvaimen pikkuaivoissa AdV5-Mock # 2 ja AdV5-199b # 3 ruiskutettiin eläimiin. Serial rinnakkain jäädytetty histologista leikettä fluoresenssimikroskopialla endogeenisen vihreää fluoresoivaa proteiinia (GFP) ilmaistaan ​​adenovirus-infektoiduissa soluissa. Sitten, arvioimme HES1 proteiinin ekspressio immunohistokemiallisesti värjäämällä muiden parafinoidut kudoksissa, käyttämällä anti-HES1 vasta-aine. Kaiken kaikkiaan arvioidaan tasot pysyvyys adenoviruksen ilmaisun infektoituneissa soluissa, kuten alas-säätely HES1 ilmaisun takia miR199b kuljettaa adenoviruksen ilmaisua, mikä kasvaimen kasvua ajan myötä BLI katso kuva 4G-H, ja vasta värjäystä Kuva S4L -M (Hes1, Ki67, Gabra6, nestiinifenotyypin, Math-3, katso yksityiskohdat teksti S1 tiedot). Sitten kaksi nude-hiiriin (AdV5-Mock # 7; AdV5-199b # 5) tehtiin PET-CT-tutkimukset 12 viikon injektion jälkeen arvioida kasvaimen lisääntymisaktiivisuus (Fig. 5A, B). Muita BLI data yhdessä kaksi elokuvaa (Elokuva S1 ja elokuva S2), jotka osoittavat 3D jälleenrakentamiseen potilaalle tehdä engraftmentissa kuvataan Teksti S1 tiedot ja osoitti kuvassa S6. Nämä analyysit osoittivat merkittävästi vähentää kasvaimen massan AdV5-199b # 5 eläin, verrattuna AdV5-Mock # 7 ohjaus hiiriä, joissa PET-TT-analyysit tarjoavat myös kasvainten (0,024 cm

3 versus 0,044 cm

3, vastaavasti), kuten on kuvattu teksti S1. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot osoittavat edullinen vaikutus yli-ilmentyminen miR199b-5p, negatiivisena säätelijänä kasvaimen kasvua MB solujen tässä potilaalle tehdä ksenografti- nude-hiirimallissa.

PET-CT fuusio kuvia AdV5- Mock # 7 (A) ja AdV5-199b # 5 (B) hiirillä 12 viikon leikkauksesta ja injektio, jossa on 3D-volyymin mallinnus ja yhtäaikaisen näytön alueita FLT oton (sinivihreä, valkoinen nuolet). Laajempi luun vika occipito-päälaen osa kallo on ilmeiseksi AdV5-Mock # 7 hiirtä. Alla: taulukko mitat (cm

3) syöpäkasvaimen ryhdytty PET-CT hankinnan (kuten kuvataan Text S1).

Expression of miR-199B-5p ihmisen medulloblastoma kasvaimissa

Voit selvittää miR-199B-5p tehokkaasti ilmaistu terveen ihmisen lapsipotilailla pikkuaivoja, käytimme 13 ohjaus näytteestä saatujen NICHD Aivot ja Tissue Bank for Developmental Disorders, yliopistossa Maryland, USA. Mittasimme miR-199B-5p ilme, vertaamalla viisi pikkuaivot näytettä saatiin 0-1-vuotiaille lapsille kuuden 13-16-vuotiaille lapsille (Fig. 6A). MiR-199B-5p osoittivat suuremman ilmentymisen eksplanttien nuoremman terveiden verrokkien (Mann-Whitney testi,

P

= 0,006).

A) Box-käyrä ekspressiotasot asennuspalveli- 199B-5p terveille pikkuaivoja kahdessa ikärajat ilmoitettu. MiR-199B-5p osoittivat korkeampia ilmentymistä eksplanttien nuoremmat ohjaimet (Mann-Whitney testi,

P

= 0,006). B) MiR-199B-5p erittäin ilmentävät tapaukset ovat enimmäkseen M0

P

= 0,001 (Pearson Chi-Square test). C) Kaplan-Meier eloonjäämisennusteet vertaamalla potilaita, joilla on alhainen

versus

korkea (suhteessa mediaani) tasot miR-199B-5p lauseke (45 potilaalla, joiden seurantatiedot). D) MiR-199B-5p ilmentyminen reaaliaikaisella PCR paneelissa viiden MB solulinjojen käsittelemätön tai käsitelty 5-atsa-C (DAC – /+); Kuten on esitetty kuviossa.