Krooninen sairaus

tiivistelmä

Siirtymäkauden cell carcinoma (TCC) virtsarakon on yleisin syöpä virtsateiden. Suurin osa TCC tapaukset ovat pinnallinen tyyppi ja hoidetaan höyläysleikkaus (TUR). Kuitenkin uusiutuminen on korkea ja nykyinen hoidot haittapuolena on indusoivan voimakkaan systeemisen myrkyllisyyden tai aiheuttaa kivuliaita kystiitti. Siksi olisi terapeuttista arvoa kehittää uusia konsepteja ja tunnistaa uusia lääkkeinä virtsarakon syöpään. Ki-67 on suuri nucleolar fosfoproteiini, jonka ilmentyminen on tiukasti sidoksissa solujen lisääntymistä, ja kurkumiini, joka on phytochemical johdettu juurakosta

Curcuma longa,

on osoitettu olevan voimakkaita syövän vastaisia ​​ominaisuuksia. Tässä tutkimuksessa arvioimme yhteenlaskettu teho kurkuma ja siRNA vastaan ​​Ki-67 mRNA (Ki-67-7) rotan (AY-27) ja ihmisen (T-24) virtsarakon syöpäsoluja. Syövänvastaisia ​​vaikutuksia arvioitiin määrittämällä solujen elinkelpoisuus, apoptoosin ja solusyklin analyysi. Ki-67-7 (10 nM) ja kurkumiini (10 uM), kun niitä käsitellään itsenäisesti, olivat kohtalaisen tehokkaita. Kuitenkin niiden yhteenlaskettu läsnäollessa, leviämisen virtsarakon syöpä solujen oli syvästi ( 85%) esti; määrä apoptoosin yhdistetyn läsnä kurkumiinin ja Ki-67-7 (36%) oli suurempi kuin mikä Ki-67-7 (14%) tai kurkumiini (13%) yksinään. Samanlainen synergia curcumin ja Ki-67-7 in asiakkuutta solusyklin pysähtymiseen havaittiin myös. Western blot-analyysi ehdotti, että esikäsittely Ki-67-7 herkistyneet virtsarakon syöpäsolujen curcumin-välitteistä apoptoosia ja solukierron pidättäneet p53- ja p21-riippumattomien mekanismien. Nämä tiedot viittaavat siihen, että yhdistelmä anti-Ki-67 siRNA ja curcumin voisi olla toteuttamiskelpoinen hoito leviämisen vastaisen virtsarakon syöpäsoluja.

Citation: Pichu S, Krishnamoorthy S, Shishkov A, Zhang B, McCue P , Ponnappa BC (2012) knockdovvn Ki-67 by Dicer-Alustan Sirna herkistää Virtsarakon syöpäsolujen Curcumin indusoima kasvain esto. PLoS ONE 7 (11): e48567. doi: 10,1371 /journal.pone.0048567

Editor: Bharat B. Aggarwal, The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 23 elokuu 2012; Hyväksytty: 28 syyskuu 2012; Julkaistu: 12 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Pichu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ osittain tuettu National Institutes of Health apurahan AA016551. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu, ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Virtsarakon syöpä on yleisin urologiset syöpä Kaakkois-Aasiassa ja toiseksi yleisin urologiset maligniteetti Pohjois-Amerikassa [1]. Siirtymäkauden cell carcinoma (TCC) osuus on yli 90% potilaista on diagnosoitu virtsarakon syöpä [2]. Suurempi kuin 70% TCC kasvaimet ovat pinnallisia kasvaimia rajoitu virtsarakon limakalvoon ja lamina propia -TA tai T1 lavastettuja kasvainten ja jäljellä ovat tyypiltään invasiiviseen. Ilmaantuvuus virtsarakon syöpä on jatkuvasti kasvanut viimeisen kahden vuosikymmenen [3]. Edullinen hoito pinnallisen kasvainten on höyläysleikkaus (TUR), mutta uusiutumisen riskiä (60-70%) johtuen kiinnityksen vapautuu kasvainsolujen ja kuoleman tauti (10-30%) on korkea [4]. Ensisijainen lähestymistapa estää kasvaimen uusiutuminen, kun TUR, on rakkoon tiputtamisen terapia (IVI) käyttäen kemoterapeuttiset lääkkeet [5], [6] mutta sytotoksisia vaikutuksia huumeet ovat huolestuttavia. Koska sen korkeamman tehon, rakkoon immunoterapia

Bacillus Calmette Guerin

(BCG) on tullut hoidon valinnan aikana kolmen viime vuosikymmenen aikana. Kuitenkin induktio kystiitin ja systeemisen toksisuuden ovat joitakin sen vakavia sivuvaikutuksia [2]. Huolimatta aggressiivinen hoitojen, virtsarakon syöpä on 5 vuoden pysyvyys on vain noin 50% [7]. Edelleen, huomattava määrä virtsarakon syöpä potilaat ovat resistenttejä tavanomaisille rakkoon hoitoon ja näin ollen on tarpeen kehittää uudempia ja edullisesti vähemmän myrkyllisiä lähestymistapoja taudin torjumiseksi.

Yksi uudempi lähestymistapoja tukahduttaa kasvaimen etenemistä tapahtuu käyttämällä geenispesifisiä lääkkeet, kuten antisense-oligonukleotidit (AsODNs) tai pieni häiritseviä RNA: ita (siRNA: t) vastaan, mRNA: iden kasvaimeen erityisiä proteiineja. Havaitsemisen jälkeen RNA interferenssin (RNAi) on eri lajeja [8] – [10], on ollut valtava kiinnostus hyödyntämällä terapeuttista potentiaalia siRNA: iden hoidossa erilaisia ​​sairauksia [11], mukaan lukien syövän [12] ja tulehdussairaudet, [13]. Ki-67 on suuri nucleolar fosfoproteiini, jonka ilmentyminen on tiukasti sidoksissa solusyklin ja se on tiukasti liittyy solujen lisääntymistä [14]. Se on DNA-sitovan proteiinin kanssa ensisijainen rooli ylläpitää korkeamman asteen rakenteen DNA prosessin aikana mitoosin. Yksityiskohtaiset solusyklin analyysi paljasti, että Ki-67-antigeeni on läsnä ydinten lisääntyvien (G1, S, G2- vaihe ja mitoosia), mutta ei ytimet lepotilassa tai lepotilassa olevissa soluissa (G0- vaihe) [15]. Tämä viittaa siihen, että Ki-67-inhibiittorit voivat olla suhteellinen spesifisyys pahanlaatuisia soluja. Yoa et ai., [16], on raportoitu, että joukossa monia syöpään liittyvien geenien testattu, että Ki-67 ilmentyminen oli yksi korkeimmista rotan virtsarakon kasvaimia, oli lähes 20-kertaisesti korkeampi kuin normaali kudos. Siten Ki-67 on ollut yksi kiinnostuksen kohteena olevien geenien kohdistaa käyttämällä AsODNs [17], [18], tai siRNA: t, [19], [20]. Uudemmissa raportissa, AsODN vastaan ​​Ki-67 käytettiin vaiheen I kliinisissä kokeissa hoitoon ihmisen virtsarakon syövän [21]. Vaikka tehoa AsODNs osoittavat todisteita periaatetta, on tunnettua, että siRNA: t ovat vähintään suuruusluokkaa herkempi kuin AsODNs [22], [23], ja näin ollen paljon pienempi määrä lääkettä tarvitse voidaan käyttää samanlaisen tehokkuuden. Lisäksi on osoitettu, että mitä kauemmin (27 bp) Dicer-alustan siRNA: iden (DsiRNAs) ovat herkempiä kuin tavallinen 19-21 bp siRNA: t [24]. Siten siRNA: t /DsiRNAs tarjota parempi keino AsDONs kohdistaa kasvain-geenit.

Lisäksi antisense-molekyylit, viime vuosina, lääkkeet kasviperäiset ovat myös saaneet paljon huomiota, koska niiden valtavat ehkäisyyn ja syövän hoitoon [25]. Curcumin on polyfenolista phytochemical johdettu juurakosta,

Curcuma longa

. Koska sen voimakas antiproliferatiivinen ja tulehdusta estäviä, se on saanut paljon huomiota tutkijoiden syövän alalla. Tähän mennessä on yli 70 kliinisissä tutkimuksissa eri vaiheissa loppuun, tehokkuuden testaamiseksi curcumin vastaan ​​monia sairauksia (www.clinicaltrials.gov). Rooli curcumin nykylääketieteen on äskettäin arvioitu [26] – [28]. Syövän vastaista potentiaalia kurkuma on peräisin sen kyvystä estää leviämisen erilaisia ​​kasvainsoluja, jonka alas-ekspressiota säätelevät lisääntyvien geenejä, kuten COX2, MMP-9, kemokiinit, sykliini D1 ja tumatekijä KB (NF KB) [29]. Tharakan et ai., [30] käyttämällä ortotooppisten hiirimallissa virtsarakon syöpä, on raportoitu, että kurkumiini poisti konstitutiivisen NF-KB: n tuumorikudokseen, indusoitua apoptoosia ja laski COX-2: n ilmentymisen. Kuitenkin, kun läsnä on kemoterapeuttinen lääkeaine, gemsitabiini, pieninä pitoisuuksina curcumin voimistaa vaikutuksia lääkkeen modulaation kautta NF-KB-signalointireitin [31]. Nämä havainnot osoittavat selvästi terapeuttista potentiaalia curcumin hoidossa syövän.

Koska curcumin estää kasvainsolujen lisääntymistä kohdistamalla useita sivustoja apoptoottisten ja leviämisen reittejä, me arveltu, että päällekkäin multi-kohdistetun curcumin seuraavat molekyyli eston Ki-67, olisi suurempi estävä vaikutus kasvaimen kasvuun. Todellakin, meidän tiedot osoittavat, ensimmäistä kertaa, että esikäsittely virtsarakon syövän solujen DsiRNA vastaan ​​Ki-67-mRNA edistää solusyklin pysähtymisen ja herkistää solut curcumin indusoiman apoptoosin. N oletettu molekyyli tavoitteet kurkuma ja Ki-67 DsiRNA käsitellään.

Materiaalit ja menetelmät

siRNA Suunnittelu

Yhteensä kolme DsiRNA duplexes kohdistettu rotan Ki-67-mRNA suunniteltiin (Integrated DNA Technology, Coralville, IA, USA). Sekvenssit kolmen DsiRNAs ovat seuraavat; 1) Ki-67 -2; Sense-sekvenssin 5 ’- CGA ACA AAG UCA UCA GAC ACA GUG A-3′; antisense-sekvenssi 5’- UCA CUG UGU CUG elokuu ACU UUG UUC GUU-3 ’; 2) Ki-67-7; Sense-sekvenssin 5 ’- CAA GAG UGA GGG AGU GCC UUU GAA G-3’; antisense-sekvenssi 5 ’- CUU CAA AGG CAC UCC CUC ACU CUU GUU -3′ ja 3) Ki-67-9; Sense-sekvenssin 5’- CCA CCA GAG CCA AUA GAU ACU UCA G-3 ’ja antisense-sekvenssi 5′- CUG AAG UAU CUA UUG GCU CUG GUG GUG-3’. Merkityksetön DsiRNA, jatkossa ” ohjaus ’DsiRNA suunniteltiin ja on seuraava sekvenssi; Sense-sekvenssin 5 ’CAA GAG UGA GGG AGU GCC UUU GAA G-3’; antisense-sekvenssi 5 ’- CUU CAA AGG CAC CGG AUC ACU CUU GUU-3’. Vaikka lyhenne ”DsiRNA” käytetään aluksi korostaa sitä, että mitä kauemmin siRNA: ita käytettiin olevassa tutkimuksessa, yleisnimi ”siRNA” käytetään kaikkialla tekstissä.

Cell Culture

transplantable rottaperäinen TCC soluja (AY-27-solut) on ystävällisesti Dr. Ronal Moore (University of Alberta, Kanada). Luonnehdinta virtsarakon kasvain mallin käyttämisen transplantable solulinjaa on raportoitu [32]. Soluja pidettiin yksikerrosviljelmiin, elatusaineessa, joka koostuu RPMI-1640 (Gibco-BRL), jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 30 mM HEPES (pH 7,3), 1 mM pyruvaattia, penisilliiniä-streptomysiiniä ja 2,0 g /l NaHCO

3. Soluja pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ja 95% ilma-atmosfäärissä menetelmällä Xiao

et ai

[32]. AY-27-solut siirrostettiin kun yhtenäisiksi standardeilla trypsinisaatiolla ja reculturing menettely. Milloin on osoitettu, vertailutarkoituksessa ihmisperäinen T-24 virtsarakon syövän solulinjoissa (American Type Culture Collection) käytettiin myös tässä tutkimuksessa ja ylläpidetään kudosviljelmässä kuvatulla AY-27-soluissa.

siRNA transfektio

edeltävänä päivänä transfektion jälkeen solut trypsinoitiin, laimennettiin tuoreella alustalla ja siirrettiin 12-kuoppaisille levyille (0,8-1,0 x 10

5cells /kuoppa). DsiRNAs transfektoitiin käyttäen erityisesti suunniteltu reagenssi siRNA transfektiota (Lipofectamine ™ RNAiMax) valmistajan protokollan mukaisesti (Invitrogen, USA). Rutiininomaisesti, transfektio suoritettiin 8-10% cell konfluenssiin.

Curcumin hoito

Milloin on osoitettu, kasvaimen soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla curcumin (Sigma-Aldrich, USA), joko yksinään tai yhdessä DsiRNA. Curcumin liuotettiin DMSO: hon, ja missä tahansa tietyssä kokeessa, lopullinen DMSO: n pitoisuus oli aina alle 0,1% tilavuudesta.

Cellular Growth Curve

arvioidaan kasvaimen proliferaatiota, kasvaimen kasvu arvioitiin mittaamalla solujen kokonaismäärässä eri vaiheissa. Kussakin vaiheessa, solut irrotettiin trypsinoimalla, pestiin PBS: llä, värjättiin trypaanisinisellä ja elävät solut laskettiin hemosytometrillä. Kukin koeolosuhteissa toistettiin kolme tai kuusi kertaa.

MTT-määritys

antiproliferatiivisia vaikutuksia siRNA vastaan ​​Ki-67: n läsnä tai poissa curcumin määritettiin MTT-määrityksellä. Määritys perustuu kykyyn mitokondrioiden vähentää 3- (4, 5 dimethylthiaol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) väriaineen rotan (AY-27) ja ihmisen (T-24) virtsarakon syöpä solut kuten kerrotaan Plumb [33]. Lyhyesti, altistuksen jälkeen solut eri käsittelyolosuhteissa, väliaine poistettiin, huuhdeltiin PBS: llä, ja MTT-liuosta (5 mg /ml RPMI) lisättiin ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 3 tuntia. Tämän jälkeen väliaine poistettiin ja korvattiin hapolla-Isopropanoliliuotin sakan liuottamiseksi. Sisältö sijoitettiin ravistelijaan 5 minuuttia, ja absorbanssi mitataan aallonpituudella 570 nm.

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qPCR) B

transfektion jälkeen siRNA: illa ja /tai hoito curcumin, soluja talteen sopiva aikaväli, ja kokonais-RNA valmistettiin PureLink RNA mini kit (Invitrogen, USA). CDNA-synteesiä varten, 1 ug kokonais-RNA: ta käänteistranskriptio cDNA: ksi 20 ul reaktioita käyttäen Quantitect Käänteistranskriptio (Invitrogen, USA). qPCR suoritettiin Light cycler® 480 tunnistusjärjestelmä (Roche, USA) käyttäen Brilliant® SYBR® Green QPCR Master mix-protokollaa (Stratagene, USA). Lyhyesti, 2 ui cDNA: ta monistettiin PCR: llä 25 ui reaktiot, jotka sisältävät 12,5 ui 2 x SYBR vihreä reagensseja ja 0,2 uM kutakin aluketta. Alkuperäisen inkubaation 10 min ajan 95 ° C: ssa seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia ja 60 ° C 1 min. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Ki-67 Protein Expression: Immunofluoresenssivärjäys

Soluja viljeltiin 25 mm: n lasin peitelaseilla 6-kuoppaisille levyille. Seuraavat altistuminen siRNA ja /tai kurkumiini eri olosuhteissa, solut pestiin kylmällä PBS: llä ja kiinnitettiin 4% formaldehydiä. PBS-pesun jälkeen soluja inkuboitiin Ki-67 primaarisen vasta-aineen (M19, Santa Cruz Biotechnology Inc.,) (1:100) 3 tunnin ajan ja pestiin kolmesti PBS: llä. Peitinlasit inkuboitiin sitten FITC-leimattua sekundaarista vasta-ainetta (1:400) pimeässä tunnin ajan huoneen lämpötilassa, pestiin PBS: llä ja värjättiin 10 minuutin ajan propidiumjodidilla (PI) liuos. Peitinlasit pestiin sitten PBS: llä ja kiinnitetty dia läsnä ollessa Kiinnitysväliaine (mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää liuosta, Invitrogen, USA). Sitten lasit tarkasteltiin Bio Rad Radiance 2001 järjestelmä kytketään Olympus IX70 mikroskooppi 60 × ja 40 × öljyssä tavoitteisiin (UAp0340, NA 1,35). Dual linja Kr /Ar-ioni laser lähde käytettiin kuvantamisen heräte asetukset 488 nm FITC ja 588 nm PI.

havaitseminen Apoptoosi anneksiini V Pitoisuus

Apoptoosi mitattiin käyttämällä PE anneksiini V Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, USA) valmistajan protokollan mukaisesti. Lyhyesti, altistumisen jälkeen siRNA tai ulos curcumin, solut pestiin kylmällä PBS: llä ja suspendoitiin sitten uudelleen sitoutumispuskuriin, minkä jälkeen lisättiin PE anneksiini V: n ja 7-amino-Acitomycin (7-AAD) ja analysoitiin Beckman Coulter n Epics XL-MCL ™ Flow Cytometer, (USA). Rutiininomaisesti keskimääräinen fluoresenssi on peräisin 20000 solumäärä per näyte tallennettiin.

Cell Cycle Analysis

vaikutuksen määrittämiseksi anti Ki-67 DsiRNA ja /tai kurkumiinista solusyklivaiheista, AY-27-solut altistettiin useissa erilaisissa koeolosuhteissa, media poistettiin ja solut irrotettiin trypsinoimalla. Sitten solut pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin jääkylmällä 70% etanolissa 2 tuntia -20 ° C: ssa. Sitten solut pestiin kerran PBS: llä, suspendoitiin uudelleen 300 ul: lla jääkylmää modifioitu PI-liuosta (50 ug /ml PI liuosta, 0,1% Triton X-100, ja 0,1% natriumsitraattia, PBS: ssa) ja inkuboitiin 30 min ennen analyysiä. PI fluoresenssi mitattiin Beckman Coulter n Eepokset XL-MCL ™ Flow Cytometer, (USA). Rutiininomaisesti keskimääräinen fluoresenssi on peräisin 20000 solumäärä per näyte tallennettiin. Solut pisteytettiin prosenttiosuutena solujen kussakin solusyklivaiheista (G

o /G

1, S ja G2 /M).

Western blot -analyysi

Virtsarakon syöpäsolut, altistuksen jälkeen kurkumiinin ja DsiRNA eri olosuhteissa, käsiteltiin trypsiinillä, pestiin PBS: llä, ja lyysattiin jääkylmällä RIPA (Sigma- Cat # R0278) puskuria. Lysaatit pidettiin jäillä 20 minuutin ajan, pyöritettiin 3-4 kertaa, ja sitten sentrifugoitiin mikrofugissa nopeudella 12000 rpm 15 minuutin ajan 0-4 ° C: ssa. Supernatantit poistettiin, ja niistä määritettiin proteiinipitoisuus. Alikvootit (40 ug) proteiinia kustakin näytteestä liuotettiin 4 × NuPage litium-dodekyylisulfaatti (LDS) ja alistettiin SDS-PAGE: lla pelkistävissä olosuhteissa. Erotetut proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvolle ja blokattiin joko 5% naudan seerumin albumiinia (BSA) tai 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisälsi 0,1% Tween-20 (TBST) standardimenetelmillä. Membraanit inkuboitiin sitten yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden varalta seuraavat antigeenit: β-aktiini, sykliini E, ja p53 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA). Muita vasta-aineita käytettiin vastaan ​​pilkotun Caspase3, fosforyloitu-RB (pRb-P) (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA), sykliini D1, (BD Bioscience, San Jose, CA), Ki-67, NF-KB (p65 alayksikkö), P27 /Kip ja p21 (Abcam, Cambridge, MA). Jälkeen blotit pestiin perusteellisesti TBS-T: n ja inkuboitiin asianmukaisten piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-hiiri tai anti-kani (Pierce Biotechnology /Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL), sekundaarisia vasta-aineita laimen- 1:15,000 ja 1:20,000 vastaavasti 2 tuntia huoneenlämpötilassa ennen lopullista pesua TBST: llä. Proteiinivyöhykkeet havaittiin tehostetulla kemiluminesenssin järjestelmän avulla SuperSignal West Pico kemiluminesenssisubstraatilla (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). KODAK Image Station 440CF (Kodak Scientific Imaging Systems, New Haven, CT) käytettiin visualisoida ja mitata signaalin nettointensiteetti bändejä. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Edustaja blotit on esitetty.

Protein Assay

Proteiinipitoisuus solulysaateista mitattiin käyttäen Micro BCA ™ proteiinimäärityksellä (Pierce Biotechnology /Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) käyttäen naudan seerumin albumiinia sisäisen standardin.

tilastollinen analyysi

Milloin on osoitettu, arvot esitetään keskiarvona ± SE (n) määrityksen. Data kohdistui tilastollisen analyysin pariksi opiskelijan t-testiä käyttäen Microsoft Excel-ohjelman ja arvot P 0,05 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

esto Ki-67 Gene Expression and Cell Proliferation by DsiRNA

in vitro

tehokkuudet kolme DsiRNA rakentaa kohdennettuja rotan Ki-67-mRNA: n testattiin, kuten edellä on kuvattu AY-27-soluissa. Kuten kuviossa 1A on esitetty, kolmesta DsiRNAs (Ki-67-2, -7, -9), Ki-67-7 osoittivat maksimaalisen eston. MRNA: n ilmentyminen, analysoitiin qPCR, osoitti 39%, 50% ja 28%: n lasku ilmentymisen Ki-67-mRNA: n Ki-67-2, Ki-67-7 ja Ki-67-9 vastaavasti verrattuna soluihin käsitelty transfektioreagenssin yksin. Vastaavasti, solunelinkykyisyysmääritys MTT: n osoittivat, että Ki-67-7 hoito oli tehokkainta kolmen (Fig. 1 B). Täten Ki-67-7 valittiin tehokkaimpana DsiRNA vastaan ​​Ki-67 mRNA seuraavissa tutkimuksissa. Lisäksi, annos-vaste-tutkimukset osoittivat, että Ki-67-7 oli tehokkainta 10 nM pitoisuudessa (1c). Kokeellisissa olosuhteissamme, kasvaa edelleen Ki-67-7 pitoisuus ei lisätä anti-proliferatiivista vaikutusta siRNA.

x 10

5 solua /kuoppa), kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. 24 tunnin kuluttua, ne transfektoitiin kunkin siRNA-rakenteet (Ki-67-2, Ki-67-7 ja Ki-67-9) kohdistettu Ki-67-mRNA: n. 48 h jälkeen, RNA uutettiin ja mRNA määritettiin kvantitatiivisella PCR: llä, kuten on kuvattu menetelmät. Solut, jotka käsitelty transfektioreagenssi yksin käytettiin kontrollina. Nopeus ilmentymisen Ki-67 mRNA normalisoida ilmaus β-aktiini. Arvot edustavat dataa yhdeltä (kaksi) kokeen käyttäen kolmen rinnakkaisen määrityksen keskiarvoa. b) AY-27-soluja viljeltiin 12-kuoppaisilla (0,8 x 10

5 solua /kuoppa) levyjä 24 h ja transfektoitiin eri siRNA-rakenteet, kuten on kuvattu menetelmät. Solujen elinkyky määritettiin 48 h transfektion jälkeen MTT: llä. Solut, jotka käsitelty transfektioreagenssin pelkästään toimi kontrollina (= 100%). Palkit osoittavat arvoja, jotka ovat keinoja ± S.E kolmen määrityksen. (

* P 0,05). c) AY-27-soluja viljeltiin 12-kuoppalevyillä (0,8 x 10

5 solua /kuoppa) kappaleessa Menetelmät kuvatulla tavalla. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia siRNA transfektion vaikutusta eri konsentraatioiden Ki-67-7 solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksellä. Solut, jotka käsitelty transfektioreagenssin pelkästään toimi kontrollina. Solujen elävyys arvot ilmaistaan ​​prosentteina ohjaus ja ovat keskiarvoja ± SE 3-8 määrityksen (

* P 0,05,

*** P 0,005).

Vaikutus curcumin kasvaimen leviämisen: Synergia Ki-67-7

vaikutukset kurkuma ja Ki-67-7 testattiin sekä ihmisestä peräisin (T-24) ja rottaperäinen (AY-27) virtsarakko syöpäsoluja. Sekvenssien vertailut osoittivat, että siellä oli 80% homologia kohdesekvenssin Ki-67-7 välillä rotan ja ihmisen Ki-67-mRNA: t. In annos-vaste-tutkimuksissa, me havaitsimme, että kasvainsolujen kasvu inhiboituu curcumin annoksesta riippuva tavalla (kuviot. 2A ja 2B) molemmissa solutyypeissä, mutta T-24-solut olivat herkempiä curcumin kuin AY-27 solujen 20 uM ja yläpuolella. Kuitenkin 10 μ M, inhibition (25-30%) oli samankaltainen molemmissa solutyypeissä. Molemmissa tapauksissa jyrkkä vähentäminen (60-85%) solujen elinkelpoisuuden välillä havaittiin 10 ja 20 uM curcumin. Kuitenkin varten vertaamalla kombinatorisista vaikutuksia DsiRNA ja kurkumiinin (CusiRNA), pienemmällä annoksella (10 uM) curcumin käytettiin yhdessä optimaalinen annos (10 nM), joka DsiRNA (Ki-67-7). Tiedot osoittivat lähes täysin (85%) inhibition solujen elinkykyä aikana yhdistetyn hoidon kurkumiinin ja DsiRNA (Fig. 3A ja 3B). Ohjaus siRNA oli vähäinen vaikutus solujen elinkelpoisuuteen viittaa spesifisyyden Ki-67-7 vastaan ​​kohteeseensa.

T-24 (2a) ja AY-27 (2b) solut maljattiin 12-kuoppaisille levyille (0,8 × 10

5 solua /kuoppa) ja viljeltiin 48 tunnin ajan (40-50% yhtymäkohta) kappaleessa menetelmät kuvatulla tavalla. Seuraavat altistuminen eri pitoisuuksia curcumin 24 tuntia, solut pestiin PBS: llä ja inkuboitiin vielä 24 h curcumin-väliaineessa. Soluja inkuboitiin DMSO: n kanssa (0,1%) yksinään käsiteltiin valvontaa. DMSO yksinään ei ollut vain vähän vaikutusta kasvainsolujen kasvua (tietoja ei ole esitetty). Solujen proliferaatio arvioidaan solujen elävyyden, MTT-määrityksellä mitattuna. Solujen elinkelpoisuus ilmaistu prosentteina elinkelpoisuuden havaittu DMSO-käsiteltyjen kontrollisolujen. Arvot ovat edustavasta (kaksi) (2a) tai 3-8 (keskiarvo ± S.E) määritykset (2b).

* P 0,05,

** P 0,01,

*** P 0,005.

Equal määrä (0,8 x 10

5 solua /kuoppa) virtsarakon syövän solujen T-24 (3a) ja AY-27 (3b) viljeltiin, kuten on kuvattu menetelmät joko transfektoitiin Ki-67-7 tai ohjaus DsiRNA (10 nM) tai käsitelty transfektioreagenssi yksin 24 h. Tämän jälkeen, jos on osoitettu, kurkumiini (10 uM) lisättiin soluille ja inkuboitiin 24 tuntia, jonka jälkeen vielä 24 tunnin inkuboinnin puuttuessa curcumin. Solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksellä lopussa 72 h transfektion jälkeen. Solut, jotka käsitelty DMSO plus transfektioreagenssin toimi kontrollina. Esitetyt tiedot ovat keskiarvo ± S.E 3-5 määrityksen (

* P 0,05,

** P 0,01). 3c) AY-27-soluja (0,8 x 10

5 solua /kuoppa) käsiteltiin täsmälleen, kuten on kuvattu edellä selite kuvioihin 3A ja 3B, ja lopussa 24, 48 ja 72 h kuluttua kurkumiini hoidon (joka on sama kuin 48, 72 ja 96 h kuluttua siRNA transfektion) solujen kasvua arvioitiin perustuen solujen määrä, kuten on kuvattu menetelmät. Tiedot ovat keskiarvo ± S.E kolmen määrityksen.

antiproliferatiivinen vaikutus määritettiin myös tarkkailemalla solujen kasvukäyrän. Kasvukäyrät, joka perustuu solujen lukumäärät määritettiin 24, 48 ja 72 tunnin kuluttua DsiRNA ja curcumin hoitoon. Yhdistetty hoito (CusiRNA) johti merkittävään soluproliferaation inhibointi ja jäljitteli samaa suuntausta kuin solujen elinkelpoisuutta koskeviin tutkimuksiin (Fig. 3C). Solu-proteiini-arvot myös korreloivat hyvin kasvukäyrät (tuloksia ei ole esitetty).

Effects of Ki-67-7 ja Curcumin Ki-67-mRNA ja Protein Expression

Voit selvittää vähentämistä kasvaimen solujen elinkyvyn aikana CusiRNA hoitoon liittyi Ki-67-proteiinin tasot, mittasimme tasot sekä Ki-67-mRNA: n ja proteiinin ilmentyminen. Tiedot osoittavat vähennykset tasot Ki-67-mRNA: n mukaan 17%, 37% ja 57%, kun se altistetaan curcumin, Ki-67-7 ja CusiRNA vastaavasti (Fig. 4A). Vastaavasti käyttämällä immunofluoresenssivärjäyksen tekniikkaa, havaitsimme, että toisin kuin Ki-67-7, curcumin

sinänsä

oli vain vähäinen vaikutus Ki-67-proteiinin ilmentymisen (Fig. 4B).

a) AY -27 soluja käsiteltiin Ki-67 siRNA: n läsnä tai poissa ollessa curcumin täsmälleen, kuten on kuvattu kuvatekstissä kuvioissa 3A ja 3B. Lopussa hoidon, RNA uutettiin ja Ki-67-mRNA: n ekspressio määritettiin kvantitatiivisen PCR: n avulla β-aktiini sisäisenä standardina Menetelmät kuvatulla tavalla. Ki-67-mRNA: n tasot on ilmaistu prosenttia nopeudella ilmentymisen kontrolli soluissa, jotka käsiteltiin transfektioreagenssin ja DMSO. Palkit osoittavat arvoja, jotka ovat keskiarvo ± S.E kolmen määrityksen. b) AY-27-soluja kasvatettiin lasipeitinlevyille sijoitetaan 12-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin siRNA (Ki-67-7), kurkumiini tai yhdistelmänä, kuten on kuvattu selityksessä kuvioissa 3A ja 3B. Lopussa hoitojakson ajan, solut altistettiin Ki67 primääristä vasta-ainetta (M19) ja FITC-leimattua sekundaarista vasta-ainetta ja sen jälkeen PI (Propidiumjodidia), ja niitä tarkkailtiin konfokaalimikroskoopilla Menetelmät kuvatulla tavalla. Mittakaava lisää = 5 um. Lisääntynyt säätely alaspäin Ki-67-proteiini johtuu Ki-67-7 havaittiin.

Apoptoosin indusointi Ki-67-7 ja Curcumin

Menetys solujen elinkelpoisuus on usein seurausta apoptoosin tai nekroosin. Apoptoosin laajuuden, ensimmäinen merkki solukuoleman, kvantitoitiin virtaussytometrisellä analyysillä käyttäen Annexin V havaita eri vaiheissa apoptoosin (Fig. 5). Tiedot viittaavat siihen, lievä apoptoosin induktiosta, kun solut käsiteltiin erikseen kurkuma tai Ki-67-7. Kuitenkin, siinä määrin kuin apoptoosin (oikealla kaksi kvadrantin kuviossa. 5), kun läsnä on CusiRNA havaittiin olevan synergistinen (36% vs. 13% kurkumiinin ja 14% Ki-67-7) korjaamisen jälkeen perustason apoptoosin ( 11%) hallitsee soluja (Fig. 5). Luku osoittaa myös (vasen ylä- neljänneksessä kuviossa. 5), että laajuus solunekroosin (anneksiini V negatiivinen, 7AAD positiivinen) oli vähäistä kaikissa hoidon olosuhteissa.

AY-27-soluja käsiteltiin anti- -ki-67 siRNA, kurkumiini tai yhdistetyn läsnä sekä kuvattu kuvatekstissä kuvioissa 3A ja 3B. Lopussa hoidon aikana, solut kerättiin, värjättiin fluoresenssi-konjugoidulla anneksiini V: n ja 7AAD Menetelmät kuvatulla tavalla. Sen jälkeen virtaussytometrianalyysissä, prosenttiosuus (numero inserttejä kuvassa) normaalien solujen tai jotka saavat apoptoosin ja nekroosin laskettiin käyttäen sopivaa ohjelmistoa (Flow Jo v.9). Nopeus apoptoosin mitattiin lisäämällä prosenttiosuudet oikeaan kaksi neljännesten kussakin lukuja. Tiedot ovat peräisin edustavasta (kahdesta identtisestä) kokeessa.

Ki-67-7 ja Curcumin päälle solusyklivaiheista

The effect of Ki-67-7 solusyklin määritettiin, kun läsnä tai poissa curcumin. Tiedot osoittavat, yleinen suuntaus suuntaan G0 /G1 vaihe kaikissa käsittelyolosuhteet, mutta vaikutus oli maksimaalinen, kun läsnä on CusiRNA (Fig. 6). Ei ollut merkittävää muutosta G2 /M vaiheessa kun erikseen alttiiksi joko curcumin tai Ki-67-7, mutta pieneni 33% havaittiin, kun solut altistettiin CusiRNA. Mielenkiintoista on, että kasvun kanssa G0 /G1 ja lasku G2 /M-vaihetta, oli kaksinkertainen muutos (suhde G0 /G1-G2 /M) kohti kasvun pysähtymistä läsnä ollessa CusiRNA kontrolliin verrattuna (Fig. 6 ).

AY-27-soluja käsiteltiin Ki-67-7, curcumin tai molemmat, kuten on kuvattu aiemmin legenda kuvioihin 3A ja 3B. Lopussa itämisaika, solut käsiteltiin PI: n ja solujen jakauma eri solusyklivaiheista määritettiin virtaussytometrialla, kuten on kuvattu menetelmät. Solut pisteytettiin prosenttiosuutena solujen jakauma kussakin solusyklivaiheista (G

o /G

1, S ja G2 /M). Palkit osoittavat arvoja, jotka ovat keinoja ± SE kolmen määrityksen.

Effect of Ki-67-7 ja Curcumin Multiple Signaling: Molecular Targets in Cell Cycle Ja apoptoosi

esto solusyklin etenemistä, apoptoosin induktio tai molempien yhdistelmä, ovat keskeisiä tapahtumia, jotka liittyvät kasvaimen estoon. Edellä esitetyt tiedot osoittavat selvästi, että yhdistelmä kurkuma ja Ki-67-7 vaikuttavat sekä tapahtumia. Jotta ymmärtää rooli joidenkin molekyylien välituotteita, jotka todennäköisesti vaikuttavat näihin tapahtumiin, määritimme tasoja joidenkin sääntelyn liittyvien proteiinien apoptoosin ja solusyklin etenemisen. Kohonnut pilkkoa-caspase3 Western blot-analyysi vahvisti apoptoosin induktion, joka oli voimakkainta CusiRNA ryhmässä (Fig. 7). Oli kuitenkin vähentynyt selvästi tasojen tuumorisuppressoriproteiinia, p53, samassa ryhmässä. Sykliinit D1 ja E, proteiinit liittyvät G1-S siirtymisen solusyklivaiheista, myös syvästi inhiboi CusiRNA. Kuten odotettua, vähennys sykliini D1 liittyy vähenemiseen tasot pRb-P. Väheneminen p53 liittyi myös väheneminen p21, estäjä sykliini E. kuitenkaan ollut lisääntyminen p27-proteiinin, toinen estäjä sykliini E, joka näytti korreloivan hyvin esto sykliini E on CusiRNA ryhmässä. Nämä havainnot olivat samanlaiset molemmissa solutyypeissä. Toisaalta, esto transkriptiotekijä NF-KB: n oli johtuu curcumin hoidon AY-27-soluissa, kun taas T-24-solut, se inhiboi ensisijaisesti CusiRNA.

Virtsarakon syöpä solujen (T -24 ja AY-27) viljeltiin ja altistettiin Ki-67-7 ja kurkumiini kuten edellä on kuvattu kuvatekstissä kuvioissa 3A ja 3B. Lopussa hoitojakson ajan, yhteensä proteiini uutettiin ja sille suoritettiin Western blotting käyttäen sopivia vasta-aineita, kuten on kuvattu menetelmät. Tarkoituksiin liittyvien proteiinien erityisiä rooleja, ne ryhmiteltiin eri ryhmään, kuten geeni transkriptio (A), solusyklin etenemisen (B) ja apoptoosin (C). β-aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina. Koska eri proteiineja (esim. Sykliini D1 ja NF-KB) samasta kalvon havaittiin eri ryhmään, sama β-aktiini blot näkyy useammin kuin kerran.