Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

resveratrolin (3, 4 ’, 5 tri-hydroxystilbene), joka on luonnossa esiintyviä polyfenolien, on anti-inflammatorisia, antioksidantti, cardioprotective ja antituumoriaktiivisuuksia. Olemme äskettäin osoittaneet, että resveratroli voi tehostaa apoptoosia indusoiva potentiaali TRAIL eturauhassyöpäsoluissa läpi useita mekanismeja

in vitro

. Siksi tässä tutkimuksessa oli suunniteltu vahvistamaan, onko resveratrol voi parantaa apoptoosin indusoiva potentiaali TRAIL ksenograftimallia eturauhassyöpää.

Menetelmät /Principal Havainnot

resveratrolin ja TRAIL yksinään estivät kasvua PC-3-nude-hiirissä estämällä kasvainsolujen proliferaatiota (PCNA ja Ki67-värjäys) ja apoptoosin indusoimiseksi (TUNEL värjäys). Yhdistelmä resveratrol ja TRAIL oli tehokkaampi tuumorin kasvun estämisessä kuin yhden aineen yksinään. Vuonna ksenosiirrettyjä kasvaimia, resveratrol upregulated ilmaukset TRAIL-R1 /DR4, TRAIL-R2 /DR5, Bax ja p27

/K IP1, ja esti Bcl-2 ja sykliini D1. Hiirten käsittely resveratrolin ja TRAIL yksinään estivät angiogeneesiä (osoituksena vähensi verisuonten lukumäärä, ja VEGF ja VEGFR2 positiiviset solut) ja merkkiaineiden etäpesäkkeiden (MMP-2 ja MMP-9). Yhdistelmä resveratrolin TRAILin kanssa edelleen esti verisuonten lukumäärä kasvaimissa, ja kiertävän endoteelin kasvutekijän reseptori 2-positiivisten endoteelisolujen kuin yhden aineen yksinään. Lisäksi resveratrolin esti sytoplasmisen fosforylaatiota FKHRL1 johtaa sen parannettu aktivointi osoituksena kohonnut DNA-sitoutumisaktiivisuutta.

Johtopäätökset /merkitys

Nämä tiedot viittaavat siihen, että resveratroli voi parantaa apoptoosia indusoiva potentiaali TRAIL aktivoimalla FKHRL1 ja sen kohdegeenien. Kyky resveratrol estää kasvaimen kasvua, metastaasia ja angiogeneesiä, ja parantaa terapeuttista potentiaalia TRAIL viittaa siihen, että resveratroli yksin tai yhdessä TRAIL voidaan käyttää eturauhassyövän hoito.

Citation: Ganapathy S, Chen Q, Singh KP, Shankar S, Srivastava RK (2010) Resveratrol Parantaa antituumorivaikutuksen TRAIL eturauhassyöpäksenografteissa kautta aktivointi FOXO transkriptiotekijä. PLoS ONE 5 (12): e15627. doi: 10,1371 /journal.pone.0015627

Editor: Hiranmoy Das, Ohio State University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 syyskuu 2010; Hyväksytty: 17 marraskuu 2010; Julkaistu: 28 joulukuu 2010

Copyright: © 2010 Ganapathy et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

resveratrolin (3, 4 ’, 5 tri- hydroxystilbene), luonnossa esiintyvä polyfenolien, esittelee pleiotrooppista terveyshyötyjä myös tulehdusta, antioksidantti, cardioprotective ja antituumoriaktiivisuuksia [1], [2], [3], [4]. Tällä hetkellä useat prekliinisissä havainnot viittaavat resveratrol lupaavana aineena syövän ehkäisyyn ja /tai hoitoon. Mahdollisena syövän vastaisen aineen, resveratrolin on osoitettu inhiboivan tai hidastaa kasvua erilaisten syöpäsolujen

in vitro

ja istutetaan kasvaimiin in vivo [5], [6], [7], [8] [9]. Resveratrolin on osoitettu estävän aktivaation JAK2-STAT3, Src-STAT3, AKT ja IKK-NFKB reittejä ja indusoida apoptoosia useissa syöpäsolulinjoissa [10], [11], [12], [13]. Olemme viime aikoina osoittaneet, että resveratrol vaimentua ilmentymisen Bcl-2, Bcl-X

L ja surviviinin ja voimistunut ilmentyminen Bax, Bak, PUMA, Noxa, ja Bim ja kuoleman reseptorit (TRAIL-R1 /DR4 ja perävaunu R2 /DR5) [1], [14], [15]. Lisäksi hoito eturauhasen syöpäsolujen resveratroilla johti sukupolven reaktiivisten happiradikaalien (ROS), translokaatio Bax ja mitokondrioita ja myöhemmin lasku Mitokondrioiden kalvon potentiaalia, vapautuminen mitokondrion proteiineista (sytokromi c, Smac /DIABLO, ja AIF) ja sytosoliin aktivaatio efektori kaspaasi-3 ja kaspaasi-9, ja apoptoosin induktio [1], [14], [15]. Resveratrol aiheuttama ROS tuotanto, kaspaasi-3: n aktiivisuuden ja apoptoosin inhiboi N-acetylcysteine, mikä viittaa ROS tuotanto, ainakin osittain, on rooli välittämisessä syövänvastainen toimintaan resveratrolin [1], [14], [15]. Resveratrol parannettu apoptoosin indusoiva potentiaali TRAIL PC-3-solujen ja herkistyneet TRAIL kestävä eturauhassyövän LNCaP

in vitro

[1], [14], [15]. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että resveratroli voi säädellä useita signalointireittien ja hallussaan useita terapeuttisia etuja.

PI3K signalointi on keskeinen rooli solunsisäisessä signaalitransduktioreitteihin mukana solutransformaatioon, solujen kasvua, ja kasvaimen kehittymisen [16], [ ,,,0],17]. Inaktivointi AKT tuloksia defosforyloinnilla ja aktivointi FOXO transkriptiotekijöiden, raportoitu välittävän solusyklin pysähtymiseen, DNA: n korjaukseen, ja apoptoosin [18], [19]. Nämä transkriptiotekijät, kuuluvat ”O” alaryhmä siivekäs kierteen /forkhead transkription tekijä perheen, pääasiallisesti vain neljä jäsentä FOXO1, FOXO3a, FOXO4, ja FOXO6 [20]. FOXO proteiinit ovat evoluutiossa säilyneitä transkriptiotekijöitä osallisena useissa olennainen solun prosesseja, jotka toimivat päätepisteenä transkription ohjelmien mukana apoptoosin, stressin vastaus ja pitkäikäisyys [21], [22]. Koska kumota FOXO toiminto havaitaan usein ihmisen syöpään, on aktivoida FOXO proteiinien on houkutteleva strategia syöpähoidon ja ehkäisyyn. FOXO proteiinit yhdistää sääntely tuotantopanokset eri ylävirran signalointireittien kaikkea vastauksena kasvutekijän ja stressi signalointi [23]. Viime aikoina FOXO tekijät on perustettu tuumorisuppressorien, edistämällä transkriptio proapoptootti- molekyylejä kuten FasL ja Bim kun PI3K /AKT-reitin on vaimentua vuoksi ravintoaineen tai seerumistarvaatio ja solustressiä [24], [25]. Kolmen poistogeeninen hiiri malleissa osoittautunut tuumorisuppressorigeenin ominaisuudet FOXOs, kuten hiiriä samanaikaisesti puuttuu tärkeimmistä jäsenistä nisäkkään FOXO alaperheen, FOXO1, FOXO3a ja FOXO4, ovat alttiita kehittämään hemangioomat ja lymfoproliferatiiviset sairaudet [26]. Sitä vastoin yksittäiset tai pariksi inaktivaation FOXO1, FOXO3a tai FOXO4 johti vähemmän vaikea muoto, joka tukee ajatusta toiminnallinen redundanssi näiden FOXO tekijät [26]. Lisäksi, pakko ilmentyminen FOXO on osoitettu estävän tuumorigeneesiä ksenograftimalleissa nude-hiirissä [27], [28]. Näin ollen, aktivoituminen FOXO perustuu sen tuumorisuppressorigeenin ominaisuuksia pidetään hyvin houkutteleva syövän strategiaa. Koska FOXO proteiineja on raportoitu olevan kriittisiä välittäjiä apoptoosin indusoiman syöpälääkkeiden, me olettaisi, että FOXO ilmentymistä tai transkriptionaalista aktiivisuutta voisi olla merkittävä tapahtuma vaikutukset välittyvät resveratrol.

TNF-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL ) on osoitettu TRAIL-R1 /DR4 ja TRAIL-R2 /DR5 [29]. Me ja muut ovat osoittaneet, että TRAIL voivat aiheuttaa apoptoosin erilaisissa syöpäsolutyyppien [29], [30], [31], [32], [33]. Prekliinisten tietojen perusteella näyttää siltä, ​​että TRAIL on erittäin lupaavalta ja selektiivinen syöpälääke [31], [32]. Resveratrolin on osoitettu lisäävän terapeuttista potentiaalia TRAIL

in vitro

[14], [34]. Vuorovaikutuksia resveratrolin ja TRAIL blokattiin joko hallitseva negatiivinen FADD tai kaspaasi-8 siRNA [14], [15]. Yhdistelmä resveratrolin ja TRAIL parannettu mitokondrioiden toimintahäiriöitä apoptoosin aikana. Resveratroli hoito voi aktivoida ulkoisen TRAIL-reseptori-välitteisen kuoleman reaktiotie, mikä lisää herkkyyttä TRAIL eturauhassyöpäsoluissa. Kuitenkin molekyylitason mekanismeja, joilla resveratroli voi parantaa terapeuttista potentiaalia TRAIL

in vivo

ei ole tutkittu.

Opinnäytetyön tarkoituksena oli selvittää molekyylitason mekanismeja, joilla resveratrol lisää terapeuttista potentiaalia TRAIL eturauhassyövän nude-hiirissä. Tuloksemme osoittivat, että resveratroli esti PC-3-ksenografti kasvua ja merkkiaineita etäpesäke, ja angiogeneesi aktivoimalla FOXO transkriptiotekijöiden. Siten meidän tiedot viittaavat siihen, että resveratroli voidaan käyttää yksin tai yhdessä TRAIL hallintaan eturauhassyövän.

Tulokset

resveratrolin parantaa antituumorivaikutuksen antituumorivaikutus TRAIL PC-3 ksenografteja

in vivo

Olemme äskettäin osoittaneet, että resveratroli voi tehostaa apoptoosia indusoiva potentiaali TRAIL

in vitro

. Siksi esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme onko resveratroli voi parantaa antituumorivaikutuksen TRAIL

in vivo

. PC-3-soluja ksenosiirrettyjä BALB c nude-hiirissä. Sen jälkeen kasvaimen muodostumisen, nämä hiiret hoidettiin resveratrolin, TRAILin tai resveratroli sekä TRAIL 6 viikkoa ja vaikutukset näiden aineiden kasvaimen kasvuun tutkittiin. Resveratrolin ja TRAIL yksinään estivät kasvun PC-3-ksenografteissa (Fig. 1). Vertailun vuoksi yhdistelmä resveratrolin ja TRAIL oli tehokkaampi tuumorin kasvun estämisessä kuin yhden aineen yksinään.

(A), PC-3-soluja injektoitiin oikeaan kylkiin Balb c-nude-hiirillä. Sen jälkeen, kun kasvaimen muodostumisen (noin 100 mm

3), hiiriä käsiteltiin suolaliuoksella, resveratrolin (30 mg /kg, kolme päivää viikossa), TRAIL (15 mg /kg, neljä kertaa kolmen ensimmäisen viikon) tai resveratroli sekä TRAIL . Kasvaimen tilavuus mitattiin viikoittain. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SE. *, # Ja $ eroavat merkittävästi ohjaus, P 0,05).

Nämä tiedot viittaavat siihen, että resveratroli voi parantaa antituumorivaikutuksen TRAIL eturauhassyövän.

asetus kasvaimen soluproliferaatiota ja apoptoosin resveratrolin ja /tai TRAIL PC-3 ksenografteissa

kasvainsoluproliferaation ja apoptoosin voi säädellä koko kasvain kulloinkin. Siksi teimme immunohistokemia tuumorikudoksissa mitata ilmaus Ki67 ja PCNA ja TUNEL määritys apoptoosin mittaamiseksi (Fig. 2A). Kasvainsolujen proliferaatiota mitattiin laskemalla Ki67 ja PCNA-positiivisia soluja, ja apoptoosi mitattiin laskemalla TUNEL-positiiviset solut (Fig. 2B-D). Hiirten käsittely resveratrolin ja TRAIL yksinään johti esto kasvainsoluproliferaation, ja induktion apoptoosin. Yhdistelmä resveratrol ja TRAIL oli tehokkaampi tuumorin solujen proliferaatiota ja aiheuttamaan apoptoosin kuin yhden aineen yksinään. Nämä tiedot viittaavat siihen, että resveratroli, vaikka tehokas yksin, voi parantaa antituumorivaikutuksen TRAIL eturauhassyövän.

(A), Immunohistokemia suoritettiin kasvainkudoksissa johdettu ohjaus, resveratroli ja /tai TRAIL käsiteltyjen hiirien viikolla 6 mitata soluproliferaation Ki67 ja PCNA värjäys ja apoptoosin TUNEL määrityksessä. (B, C ja D), kvantifiointi Ki67, PCNA ja TUNEL positiivisia kasvainsoluja. Kasvain dioja eri hoitoryhmään tehtiin näkyviksi mikroskoopilla, ja Ki67, PCNA ja TUNEL positiiviset solut määrällisesti. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SE. * Ja ** eroavat merkittävästi niiden valvontaa, P 0,05).

In vivo

sääntely kuoleman reseptori TRAIL-R1 /DR4 ja TRAIL-R2 /DR5 mukaan resveratrol ja /tai TRAIL

Koska resveratrol parantaa terapeuttista potentiaalia TRAIL indusoimalla apoptoosin

in vivo

, pyrimme tutkimaan molekyylitason mekanismeja, joilla resveratrol lisää antituumorivaikutuksen TRAIL PC- 3 ksenograftit. Olemme ensi tutkinut, mitä vaikutuksia resveratrol ja /tai TRAIL ilmentymistä koskevat kuolemareseptorien (TRAIL-R1 /DR4 ja TRAIL-R2 /DR5) immunohistokemiallisesti kasvainkudoksissa johdettu

in vivo

kokeessa (Fig. 3A , vasen ja oikea paneeli). Hiirten käsittely resveratrolin tehosti ilmauksia DR4 ja DR5. TRAIL hieman aiheuttama ilmaus DR4 ja DR5. Toisaalta, hiirten käsittely yhdistelmä resveratrol plus TRAIL merkittävästi osoitti parannettu ilmauksia DR4 ja DR5 proteiineja kuin hiirillä, joita hoidettiin resveratrolin yksin tai TRAIL yksinään.

(A), Immunohistokemia suoritettiin mitata ilmaisuja TRAIL-R1 /DR4 ja TRAIL-R2 /DR5 kasvainkudoksissa peräisin ohjaus ja hoidettujen hiirten viikolla 6. kvantifiointi DR4 ja DR5 positiiviset solut ovat myös esitetty oikeassa paneelissa. (B), ilmaisujen TRAIL-R1 /DR4, TRAIL-R2 /DR5 ja β-aktiini kasvainkudoksissa peräisin viikolla 6. Western blot -analyysi suoritettiin mittaamaan ilmentymisen DR: (vasen paneeli). Kvantitointi DR4 ja DR5 positiivisia kasvainsoluja (oikea paneeli). (C), mittaus DR4 ja DR5 ELISA: lla. Proteiinit uutteet valmistettiin ja ilmaisuja DR: mitattiin valmistajan ohjeiden.

vahvisti immunohistokemian tietojen tutkimalla näiden proteiinien ilmentymisen, jonka Western blot -analyysissä (kuvio. 3B). Hiirten käsittely Resveratrol ja TRAIL yksinään johti ylösajon kuolemareseptorien DR4 ja DR5. Vertailun, resveratroli plus TRAIL hoitoja oli enemmän vaikutuksia induktio DR4 ja DR5 verrattuna monoterapiana yksin. Nämä tiedot ovat yhtä mieltä immunohistokemia kun tietojen proapoptoottiset DR4 ja DR5 proteiinit voimistunut.

vieressä vahvisti immunohistokemian ja western blot tiedot tutkimalla ilmaisuja DRS ELISA (Fig. 3C, oikea paneeli). Hiirten käsittely resveratrolin ja TRAIL yksinään voimistunut ilmentyminen syöttämällä reseptorien (DR4 ja DR5). Vertailun vuoksi yhdistelmä resveratrol plus TRAIL indusoi enemmän DR4 ja DR5 ilmaisuja kuin yhden aineen yksinään. Nämä tiedot ovat yhtä mieltä immunohistokemiaan ja western blot kun tietojen proapoptoottiset DR4 ja DR5 proteiinit voimistuvan resveratrol ja TRAIL. Ylössäätöä DRS voi tehostaa apoptoosia indusoiva potentiaali TRAIL.

In vivo

sääntely Bcl-2-perheen jäsenten ja solusyklin sääntelyn proteiinien resveratroli ja /tai TRAIL

Koska Bcl-2-perheen jäseniä on tärkeä rooli apoptoosin, pyrimme ekspression tutkimiseksi Bax ja Bcl-2 kasvainkudoksissa peräisin resveratroli ja /tai TRAIL-käsiteltyjen hiirten (Fig. 4A, vasen paneeli). Hiirten käsittely resveratrolin ja TRAIL yksinään johti ylösajon Bax, ja esto Bcl-2: n ilmentymisen. Vertailun vuoksi yhdistelmä resveratrolin ja TRAIL oli tehokkaampi säätelemällä Bax ja inhiboimaan Bcl-2. Seuraavaksi me vahvisti Western blot tiedot tutkimalla ilmaisuja näiden proteiinien immunohistokemialla (Fig. 4A, keskimmäinen ja oikea paneeli). Hiirten käsittely resveratrol voimistunut ilmentyminen Bax ja esti Bcl-2. Vertailun hiirten käsittely yhdistelmä resveratrol plus TRAIL oli enemmän vaikutuksia säätelyä Bax ja inhibitio Bcl-2 kuin yhden aineen yksinään.

(A), Western blot -analyysi suoritettiin mittaamaan ilmauksia Bax ja Bcl-2 kasvainkudoksissa johdettu ohjaus, resveratroli ja /tai TRAIL käsiteltyihin hiiriin viikolla 6 (vasen paneeli). Immunohistokemia suoritettiin mitata ilmauksia Bax ja Bcl-2 kasvainkudoksissa johdettu ohjaus ja lääkkeellä käsiteltyjen hiirien viikolla 6 (keskimmäinen paneeli). Kvantitointi Bax ja Bcl-2-positiiviset solut kasvainsoluissa (oikea paneeli). (B), Western blot -analyysi suoritettiin mittaamaan ilmauksia p27

/KIP1 ja sykliini D1 kasvainkudoksissa johdettu ohjaus ja lääkkeellä käsiteltyjen hiirien viikolla 6 (vasen paneeli). Immunohistokemia suoritettiin mitata ilmauksia p27

/KIP1 ja sykliini D1 kasvainkudoksissa johdettu ohjaus ja lääkkeellä käsiteltyjen hiirien viikolla 6 (keskimmäinen paneeli). Kvantifiointi p27

/KIP1 ja sykliini D1 positiivisten solujen kasvaimen kudoksissa (oikea paneeli).

vieressä tutki vaikutuksia resveratrol ja /tai TRAIL ilmenemistä p27

/KIP1 ja sykliini D1 kasvainkudoksissa Western-blottauksella ja immunohistokemia (Fig. 4B). Hiirten käsittely resveratrol johti solusyklin estäjä p27

/KIP1 ja estämällä sykliini D1 ilmentymisen (Fig. 4B). Vertailun vuoksi TRAIL ei ollut merkittävää vaikutusta p27 ilmentymistä, mutta hieman esti ilmaus sykliini D1 verrattuna kontrolliryhmään. Kuitenkin yhdistelmä resveratrol ja TRAIL osoitti upregulation p27, ja esto sykliini D1 verrattuna monoterapiana yksin. Seuraavaksi me vahvisti Western blot tietoja immunohistokemia tietoja tutkimalla ilmaisuja näiden proteiinien (Fig. 4B, keskimmäinen ja oikea paneeli). TRAIL ei ole merkittävää vaikutusta ilmaus p27 mutta hieman esti ilmaus sykliini D1. Vertailun resveratrol aiheuttama ilmaukset p27, ja esti ilmaus sykliini D1. Nämä tiedot viittaavat siihen, että resveratroli voi säädellä solusyklin jopa-ekspression p27 ja ekspression inhiboimiseksi sykliini D1.

In vivo

MMP-2 ja MMP-9 ilmentyminen resveratrol ja /tai TRAIL

Kohonnut ilmauksia metalloproteinaasien (MMP: t) ovat liittyy lisääntynyt metastaattista potentiaalia monissa kasvainsoluissa [35], [36], [37]. Siksi pyrittiin tutkimaan vaikutuksia resveratrolilla MMP-2 ja MMP-9 ilmaisuja kasvainkudoksissa peräisin ksenosiirrettyjä nude-hiirissä immunohistokemialla ja Western blot -analyysillä. Hoito xenogrfated hiirillä resveratrol johti inhibitio MMP-2 ja MMP-9 ilmaisuja kuin kontrolli tai TRAIL hoidetun ryhmän (Fig. 5A ja B). Yhdistelmä resveratrol ja TRAIL oli tehokkaampi inhiboimaan MMP-2 ja MMP-9 ilmaisuja kuin yhden aineen yksinään. Me seuraavaksi vahvisti immunohistokemian tietojen tutkimalla ilmaisuja näiden proteiinien Western blot -analyysillä (kuvio. 5C). TRAIL ei ole merkittävää vaikutusta ilmaisuja MMP-2 ja MMP-9. Verrattuna, resveratroli tai resveratrol sekä TRAIL esti ilmaisuja MMP-2 ja MMP-9. Nämä tiedot viittaavat siihen, että resveratroli ja /tai TRAIL voi estää eturauhassyövän etäpesäkkeiden estämällä MMP-2 ja MMP-9.

(A), Immunohistokemia suoritettiin mittaamaan ilmauksia MMP-2 ja MMP-9: tuumorikudoksissa johdettu ohjaus, resveratroli ja /tai TRAILtreated hiirillä viikolla 6. (B), kvantifiointi MMP-2 ja MMP-9-positiivisten solujen kasvainkudoksissa. (C), ilmaisujen MMP-2, MMP-9 ja β-aktiini kasvainkudoksissa mitattiin viikolla 6 Western blot-analyysi.

In vivo

sääntely angiogeneesin resveratroli ja /tai TRAIL

Onko regressio kasvaimen kasvua resveratroli ja /tai TRAIL johtui angiogeneesin estäminen, olemme analysoineet merkkiaineiden angiogeneesin immunohistokemia tuumorikudoksissa peräisin ohjaus ja käsiteltyjen hiirten (kuvio . 6). Ensin tarkasteltiin vaikutuksia resveratrol ja /tai TRAIL hoidon verisuonten lukumäärä kasvainkudoksissa hyödyntämällä kolmea eri lähestymistapaa (Fig. 6A). Verisuonten tutkittiin värjäämällä kasvainkudoksessa H E ja numerot verisuonten laskettiin 400 X suurennuksella. Kukin pylväs edustaa keskiarvo ± SD. * Tai ** = merkitsevä ero ohjaus, P 0,05. Lähi-paneeli, verisuoni kvantifiointiin kasvaimia peräisin viikolla 6. tuumorisektioiden kontrollista ja lääkkeellä käsiteltyjen hiirten värjättiin anti-CD31-vasta-aine, ja lukumäärät CD31-positiivisten verisuonten laskettiin. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD. * Tai ** = merkitsevä ero ohjaus, P 0,05. Oikea paneeli, tuumorisektioiden kontrollista ja lääkkeellä käsiteltyjen hiirien saatu viikolla 6 värjättiin anti-von Willebrand -tekijän (vWF) vasta-aine arvioida verisuonia. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD. * Tai ** = merkitsevä ero ohjaus, P 0,05. (B), vasen paneeli, immunohistokemia suoritettiin mitata ilmentymisen VEGF tuumorikudoksissa johdettu ohjaus ja lääkkeellä käsiteltyjen hiirien viikolla 6. Oikea paneeli, määrällisesti VEGF-positiivisten solujen kasvain kudoksissa. Oikea paneeli, määrällisesti VEGF positiivisia soluja. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD. * Tai ** = merkitsevä ero ohjaus, P 0,05. Pohjalevy, ilmauksia VEGF ja β-aktiini kasvainkudoksissa johdettu viikolla 6 mitattiin Western blot-analyysi. (C), VEGF-reseptori 2: n (VEGF-R2) -positiivinen kiertävien endoteelisolujen hiirillä viikolla 6. verisolut perifeerisen veren kiinnitetty dia värjättiin anti-VEGF-R2-vasta-aineen, ja määrä VEGF-R2 positiiviset solut laskettiin mikroskoopin alla. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD. * Tai ** = merkitsevä ero kontrollista, P 0,05.

vieressä tutkittiin VEGF: n ilmentymistä immunohistokemialla ja Western blot-analyysillä (kuvio 6). Tutkiminen tuumorikudosten immunohistokemiallisesti osoitti, että kontrollihiiristä oli lisääntynyt VEGF-positiivisia endoteelisolujen verrattuna resveratrol tai TRAIL käsiteltyjen hiirten (Fig. 6B, vasen ja oikea paneeli). Yhdistelmä resveratrolin plus TRAIL verrokkeja vähemmän VEGF värjäystä kuin yhden aineen yksinään. Me seuraavaksi vahvisti immunohistokemian tiedot VEGF ilmentymisen tutkimalla proteiinin tasot Western blot -analyysillä (kuvio. 6B, alempi paneeli). Hiirten käsittely resveratrolin ja TRAIL yksinään esti VEGF ilme. Vertailun, resveratrolin sekä TRAIL inhiboi VEGF: n ilmentymistä.

Olemme osoittaneet, että määrä verenkierrossa verisuonten endoteelin kasvutekijän reseptori 2: n (VEGF-R2) -positiiviset endoteelisolut korreloi suoraan kasvaimen angiogeneesiä ja voi palvella kuten

in vivo

indikaattorit tuumoriangiogeneesin [31], [38]. Kuten odotettua, ohjaus hiirillä oli lisääntynyt kiertävän VEGF-R2-positiivisten endoteelisolujen verrattuna resveratrolin käsiteltyihin hiiriin (Fig. 6C). Resveratrol plus TRAIL-hoidetussa ryhmässä oli merkittävästi vähemmän VEGFR2-positiivisten solujen kuin resveratrolin tai TRAIL hoidetussa ryhmässä. Nämä tiedot vahvasti osoittavat, että resveratroli voi estää kasvaimen kasvua estämällä angiogeneesiä, ja se voi myös edistää antituumorivaikutuksen TRAIL

in vivo

.

In vivo

sääntely transkriptiotekijän FKHRL1

AKT: n on osoitettu fosfory- FKHRL1, ja inhibitio FKHRL1 fosforylaation aiheuttaa sen tumaansiirtymiseen, parantaa DNA: ta sitova ja transkription aktiivisuus [39]. Me seuraavaksi tutkittava, onko antituumorivaikutuksia resveratrolin ja /tai TRAIL ovat kohdistetaan aktivoimalla FKHRL1 (Fig. 7). Resveratroli ja tätä TRAIL inhiboi fosforylaatiota FKHRL1; kuitenkin, resveratrol oli tehokkaampi kuin TRAIL. Yhdistelmä resveratrolin ja TRAIL oli enemmän vaikutusta estämällä fosforylaation FKHRL1 kuin monoterapiana yksin. Tutkimme seuraavaksi fosforylaatiota FKHRL1 kasvainkudoksissa immunohistokemialla (Fig. 7B ja C). Resveratroli ja tätä TRAIL esti pitoisuudet sytoplasmassa fosforyloidun FKHRL1 kuten on esitetty kuviossa. 7B ja määrällisesti kuvassa. 7C. Yhdistelmä resveratrolin plus TRAIL oli enemmän vaikutusta estämisessä cytoplamic tasot fosforyloitua FKHRL1 kuin yhden aineen yksinään. Nämä tiedot viittaavat siihen, että resveratroli ja tätä TRAIL voi estää fosforylaatiota FKHRL1, jotka voivat johtaa sen tumaansiirtymiseen ja aktivointia.

(A), Inhibition of FKHRL1 fosforylaation resveratrol. Western blot -analyysi suoritettiin mittaamaan ilmentymisen fosfo-FKHRL1 kasvainkudoksissa on johdettu ohjaus- ja /tai lääkkeellä käsiteltyjen hiirien viikolla 6. (B), immunohistokemiallinen tutkimus fosfo-FKHRL1. Immunohistokemia suoritettiin mittaamaan ilmentymisen fosfo-FKHRL1 kasvainkudoksissa johdettu ohjaus, resveratroli ja /tai TRAIL käsiteltyjen hiirien viikolla 6. (C), kvantifiointi FKHRL-positiivisten solujen kasvainkudoksissa. (D), FKHRL1 DNA: ta sitovan aktiivisuuden. Tumauutteita valmistettiin kasvainkudoksista peräisin ohjaus ja lääkkeellä käsiteltyihin hiiriin. Gelshift määritys suoritettiin mitata FKHRL1-DNA: ta sitovan aktiivisuuden, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät.

vieressä tutki FKHRL1-DNA: ta sitovan aktiivisuuden gelshift määrityksellä (Fig. 7D). Tumauutteita valmistettiin kasvainkudoksista peräisin resveratrolin ja /tai TRAIL käsitellyissä hiirissä. Gelshift data paljasti, että TRAIL ja resveratrolin parannettu FKHRL1-DNA sitovia toimia. Yhdistelmä resveratrolin ja TRAIL oli merkittävästi enemmän FKHRL1-DNA sitova aktiivisuus kuin ainoana lääkkeenä yksinään. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että resveratroli ja TRAIL voi estää fosforylaatiota FKHRL1 mikä sen tehostetun tumaansiirtymiseen ja DNA: ta sitova toiminta.

Keskustelu

Olemme äskettäin osoittaneet, että resveratroli indusoi apoptoosia perävaunu herkkä PC-3-soluja, ja herkistää TRAIL-resistenttejä LNCaP-solut

in vitro

aktivaation kautta useita signalointireittien [14], [15]. Resveratrol indusoiman apoptoosin harjoittaa mitokondrioita, kuten on esitetty lasku mitokondrion kalvon potentiaalia ja kaspaasi-3 ja kaspaasi-9 sekä eturauhassyöpä PC-3 ja LNCaP-soluja [14], [15]. Resveratrol indusoima proapoptoottiset proteiinien (Bax, Bak, PUMA, Noxa ja Bim), syöttämällä reseptorit (TRAIL-R1 /DR4 ja TRAIL-R2 /DR5), ja se esti ekspressiota anti-apoptoottisten proteiinien (Bcl-2 ja Bcl-X

L) ja IAP: t (XIAP ja surviviinin). Meidän äskettäisessä tutkimuksessa resveratroli säännelty ilmaus TRAIL, DR4, DR5, Bim, p27

/KIP1 ja sykliini D1 kautta FOXO transkriptiotekijöiden

in vitro

, ja esto FKHRL1, FKHR ja AFX RNAi tukossa näistä haittavaikutuksista resveratrolin [40]. Tässä tutkimuksessa olemme validoitu meidän

in vitro

havainnot ja osoittaneet, että resveratroli ja TRAIL yksinään estivät kasvua PC-3 ksenografteissa, etäpesäke ja angiogeneesiä aktivoimalla FOXO transkriptiotekijöiden. Mielenkiintoista on, että yhdistelmä resveratrol ja TRAIL oli suurempi vaikutus kasvaimen kasvun inhibition, etäpesäke ja angiogeneesiä kuin kummallakaan aineella yksinään.

In vitro

resveratrol vaimentua ilmaisuja Bcl-2 ja Bcl -X

L ja voimistunut ilmaisuja p53, Bax, Bak, PUMA, Noxa, ja Bim mRNA ja proteiini tasoilla eturauhasen syöpäsolujen [41]. Olemme myös osoittaneet, että resveratrol voimistunut ilmaisu, fosforylaatio, ja asetylointi p53 androgeeniriippuvaisissa LNCaP-soluja [41]. Kyky resveratrolin säädellä geenin transkriptiota näkyi myös koska se aiheutti asetylaatio histoni H3 ja H4 LNCaP-soluissa [41]. Lisäksi hoito LNCaP resveratroilla johti translokaatio Bax ja p53 mitokondriot, reaktiivisten happiradikaalien lasku Mitokondrioiden kalvon potentiaalia, vapautuminen mitokondrion proteiineista (sytokromi c, Smac /DIABLO ja Omi /HtrA2), ja aktivointi kaspaasi-3, joka johtaa apoptoosin [41]. Lisäksi poistetaan Bax ja Bak geenit estivät täysin resveratroli aiheuttaman sytokromi c: ja Smac /DIABLO vapautumista hiiren alkion fibroblasteissa [42]. Esillä olevassa tutkimuksessa hoito Ksenosiirretyn hiirten resveratrolin johti downregulation Bcl-2 ja säätely ylöspäin Bax. Yhdistelmä resveratrolin plus TRAIL oli tehokkaampi säätelyssä Bcl-2-perheen jäseniä kuin yhden aineen yksinään. Meidän aiemmin julkaistu

in vitro

tiedot ovat yhtäpitäviä nykyisten

in vivo

tutkimuksia, jotka osoittavat, että resveratroli voi sitoutua solun sisäisen reaktiotien apoptoosin säätelemällä ilmaus Bcl-2-perheen proteiinien.

FOXO transkriptiotekijät ovat tuumorisuppressoreilla, että inaktivoidaan useimmissa ihmisen syövissä, mikä johtuu yliaktivoituminen PI3K /AKT-reitin [43]. FOXO proteiinit voivat säädellä erilaisia ​​geenejä, jotka vaikuttavat solujen lisääntymistä, eloonjääntiä, aineenvaihduntaa ja vasteena stressille [19], [20], [44]. FOXO transkriptiotekijät säätelevät synteesi, asetylaatio, fosforylaatio ja ubikitinaatio kolmella eri tasolla: Sijainti solussa vakautta ja transkriptionaalisen aktiivisuuden [19], [20], [44]. Kun aktivointi PI3K /AKT signalointi, FOXOs tehdään AKT-välitteinen fosforylaatio, joka edistää 14-3-3, tumasta läpi CRM1 ja sytoplasman sitomista. Stressiolosuhteissa tai ilman kasvua tai eloonjäämistä tekijöitä, kun PI3K /AKT-reitin estyy, FOXO proteiineja translokoituvat solun tumaan, jossa ne transkription toiminnot voidaan suorittaa [45]. Toinen sääntely kerros on FOXO asetylaatio by p300, CBP (CREB-sitova proteiini) ja Pcaf (P300 /CBP liittyvien tekijöiden) vastauksena oksidatiivisen stressin tai DNA: ta sitova [46], [47], [48], jonka jälkeen deasetylaatiolla luokittain I ja II histonideasetylaasit [48], [49], [50], mukaan lukien SIRT1, NAD

+ – riippuvaista deasetylaasin koodaama ortologisista hiiva pitkäikäisyys geenin SIR2 [51]. Olemme äskettäin osoittaneet, että estäminen PI3K /AKT-reitin parannettu FOXO-DNA: n sitoutuminen ja transkriptioaktiviteettia [40], [52]. Lisäksi fosforylaatio puutteellinen mutantti FOXO parannettu resveratrol aiheuttama FOXO transkriptionaalista aktiivisuutta ja apoptoosia. Translaation jälkeinen muutos FOXO proteiinien on tärkeä mekanismi, joka säätelee kyky eri transkriptiotekijöiden aktivoida erillisiä geenin sarjaa, osallistuvat solusyklin inhibitio [53], apoptoosin [54], suojaa oksidatiivista stressiä ja DNA korjaukseen [55]. Parannettu DNA sitoutumisaktiivisuus palvelee myös rajoittamaan saatavuutta FOXO proteiinien fosforylaatio AKT [46]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme osoittaneet, että resveratroli indusoiman apoptoosin eturauhassyöpäsoluissa aktivaation kautta FOXO transkriptiotekijöiden. Vastaavasti toisessa tutkimuksessa olemme osoittaneet, että inhibitio FOXO transkriptiotekijöiden mukaan shRNA estetty resveratrol aiheuttama säätelyä Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27

/Kip1 ja apoptoosin, ja resveratrolin inhiboivan vaikutuksen sykliini D1 eturauhassyövässä solut

in vitro

[40]. Tuloksemme viittaavat siihen, että resveratroli aiheuttaa solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin säätelyn kautta FOXO transkriptiotekijöiden eturauhassyöpäsoluissa.

FOXO transkriptiotekijöiden on osoitettu olevan konstitutiivisesti aktivoitua erilaisissa ihmisen maligniteettien, mukaan lukien eturauhassyöpä [39] , [56]. FOXOs on esitetty edistää kehitystä ja /tai etenemistä pahanlaatuisuuteen säätelemällä geenien ilmentymistä osallistuvat solujen kasvua, erilaistumista, apoptoosia, angiogeneesin ja metastaasin [39], [56].