Krooninen sairaus

tiivistelmä

luonnossa esiintyvä triterpenoid betuliinihappoa (BA) osoittaa voimakas polypharmacology vaihtelevat tulehdusta anti-lipogeeniset toimintaa. Viimeaikaiset todisteet osoittavat, että melko monipuolinen solusignalointi tapahtumat voivat johtua samaan yhteiseen ylävirran kytkin solujen aineenvaihduntaan. Tässä tutkimuksessa tutki sen vuoksi aineenvaihdunnan aiheuttamien muutosten BA (10 uM) annon, joka keskittyy solujen glukoosiaineenvaihduntaan. Osoitamme, että BA nostaa hintoja solujen glukoosin sisäänoton ja aerobinen Glykolyysivaiheen hiiren alkion fibroblasteissa samanaikaisessa vähentäminen glukoosin hapettumisen. Ilman aiheuttivat merkkejä ilmeisestä solukuoleman BA johtaa heikentynyt mitokondrioiden toimintaa, lisääntyneen ekspression mitokondrion irtoamisen proteiineja (UCP) 1 ja 2, ja maksan kinaasi B1 (LKB1): sta riippuvaisen aktivaation AMP-aktivoitu proteiinikinaasi. AMPK aktivointi osuus lisääntynyt glukoosin oton ja Glykolyysivaiheen jotka puolestaan ​​ovat välttämättömiä solujen elinkyky BA hoitoa. Kaiken osoitamme ensimmäistä kertaa merkittävä vaikutus BA solu- bioenergetiikan joka voi olla keskeinen välittäjänä pleiotrooppisten toimien BA.

Citation: Heiss EH, Kramer MP, Atanasov AG, Beres H, Schachner D, Dirsch VM (2014) glykolyyttisissä vaihtaa vastauksena betuliinihappoa Non-syöpäsoluja. PLoS ONE 9 (12): e115683. doi: 10,1371 /journal.pone.0115683

Editor: Mika Jēkabsons, University of Mississippi, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 01 joulukuu 2014; Julkaistu: 22 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Heiss et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Itävallan Science Fund (lupanumeroon 23317) ja EHH Herzfelder ”sche Familienstiftung on EHH. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

betuliinihappoa (3β-3-hydroksi-LUP-20 (29) -en-28-happo, BA) on luonnossa esiintyvä pentasyklisestä triterpenoid kanssa monipuolista toimintaa profiilin. Monet tutkimukset paljastivat mm anti-virus, anti-proliferatiivinen, proapoptoottisten, tulehdusta, vasoprotective, sekä diabeteksen ja anti-lipogeeniset ominaisuuksia BA ja sen johdannaiset sekä

in vitro

ja

in vivo

[1] – [11]. Mukaisesti lukuisat raportoitu bioaktiivisuuksiin useiden molekyylikohteista on ehdotettu myös Nukleaaritekijä KB – [12], steroli- säätelyelementti sitova proteiini – [7], ja endoteelin NO nopaliinisyntaasin koulutusjakson [5], mitokondrio läpäisevyys siirtyminen huokosten (MPTP) [13], diasyyliglyseroli-asyylitransferaasin [14] Tgr5 sappihapon reseptori [6], lipaasien, [15] tai proteiinityrosiinifosfataasi 1B [16].

Se on hiljattain tullut yhä selvää, että metabolinen ohjelma ei ole passiivinen sivustakatsoja vaan aktiivinen modulaattori signaalitransduktion ja fenotyypin solun [17]. Muutos metabolisen ohjelma voi vaikuttaa kerralla useita ja ensi silmäyksellä jotka eivät liity signalointireittejä, esim. järjestämällä tai rajoittamalla keskeinen substraatit anaboliaa, solusuojaus tai posttranslational muutoksia, ja pitää yhtenä keskeinen ylävirtaan tekijä solukäyttäytyminen [18].

hypothesizing että jotkut bioaktiivisuuksiin kohdistaman BA ovat seurausta muuttuneen bioenergetics ryhdyimme tutkimaan vaikutuksia BA glukoosiaineenvaihduntaan.

Materiaalit ja menetelmät

Solut, kemikaalit ja vasta

Villityypin (WT) ja isogeenisistä AMPKα

1 – /- hiiren alkion fibroblasteja (MEF) ja WT ja LKB1 – /- MEF olivat ystävällisiä lahjoja Benoit Viollet, INSERM Pariisi, Ranska ja Reuben Shaw, Scripps Institute, La Jolla, USA, raportoitu [19] ja [20] vastaavasti. Hiiren 3T3-L1, C2C12, RAW 264.7 solut olivat LGC /ATCC (Wesel, Saksa). Ensisijainen ihmisen endoteelisolujen (HUVEC) olivat Lonza (Braine-L’Alleud, Belgia). Betuliinihappo (99%: n puhtaus) ostettiin Biosolutions Halle GmbH (Halle, Saksa). Tritiumleimattua 2-deoksiglukoosi (koira) saatiin NEN (Wien, Itävalta). CellTiterGlo, The CaspaseGlo- ja CytoTox96 ei-radioaktiivista sytotoksisuusmäärityksissä tuli Promega (Mannheim, Saksa). MitoTracker Green ja MitoSox Red ostettiin Invitrogen (Wien, Itävalta). Special soluviljelmälevyihin, patruunat, kalibrointiaineella ratkaisu sekä glykolyysin ja mitokondrioiden stressitestin sarjat tilattiin Seahorse Biosciences. STO609 tuli Calbiochem. Ensisijainen anti-AMPK (# 2532), anti-pAMPK (Thr172) (# 2535), anti-PACC (Ser79) (# 3661), anti-LKB1 (# 3047) anti-PDHE1 (# 2784) sekä vastaan ​​suunnattuja vasta glykolyyttisten entsyymien (glykolyysin sampleri pakkaus) tuli Cell Signaling Technology (Frankfurt am Main, Saksa). Anti-GLUT1 ja GLUT3 vasta tuli Millipore (Wien, Itävalta) (# CBL242; # AB1344), anti- UCP1 tai 2-vasta-aineita tilattiin Abcam (Cambridge, UK) (# 10983, 77363), anti-p -PDHE1 (Ser273) oli peräisin Novus Biologicals (Cambridge, UK) (# NB11093479) ja anti-aktiini vasta-aine oli peräisin mpbio (Eschwege, Saksa) (# 69100). Toissijainen piparjuuriperoksidaasi (HRP) kanssa kytkettyä anti-kani ja anti-hiiri-vasta-aineiden tuli Cell Signaling Technology ja mpbio vastaavasti ja HRP-anti-vuohi-vasta-aine oli Santa Cruz (Heidelberg, Saksa). Kaikki muut kemikaalit olivat yhtiöltä Sigma-Aldrich (Wien, Itävalta). Kaikki koeyhdisteet tai inhibiittorit liuotettiin DMSO: hon, valolta suojattuna niin pitkälle kuin mahdollista, eriin ja säilytettiin -20 ° C: ssa. Solujen kokeissa, lopullinen DMSO: n pitoisuus pidettiin vakiona kaikissa näytteissä ja koskaan ylittänyt 0,3% DMSO: ta.

Solujen viljely

Lukuun ottamatta HUVEC-solut rutiininomaisesti subcultivated Dulbeccon modifioidussa essential medium ( DMEM, 4,5 g /l glukoosia Lonza), jota oli täydennetty 10% lämmön avulla inaktivoitua sikiövasikan seerumia (Invitrogen) ja 2 mM glutamiinia (Lonza). HUVEC-soluja kasvatettiin endoteelin kasvualustaan ​​(EGM1) ja lisäysten sisältämät Lonza. Sillä erilaistuminen 3T3-L1-solut kypsyä adiposyytteihin ja C2C12 Myoblastien jotta lihasputkia vakioprotokollia käytettiin kuvattu muualla [21], [22]. Solut rutiininomaisesti testattiin mykoplasmaa-vapaa ja säilytetään kulttuurin 11 kohtia (perus HUVEC 5).

määrittäminen solun glukoosin sisäänoton nopeus

määrittäminen solun glukoosin oton korko suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [23]. Lyhyesti, solut valmistettiin 12-kuoppaisilla levyillä. Käsittelyn jälkeen kuten solut tasapainotettiin standardin Krebs Ringer Phosphate HEPES (KRPH) puskuria, joka sisältää 0,2% naudan seerumin albumiinia (BSA) 20 minuutin ajan. Glukoosin otto käynnistettiin lisäämällä 2-DOG, johon oli lisätty 2-deoksi-D- (1H3) glukoosi (lopullinen pitoisuudet 0,1 mM ja 0,45 uCi /ml). 15 minuutin kuluttua reaktio pysäytettiin nopeasti kolme pesua jääkylmällä PBS: llä. Glukoosin sisäänoton nopeus määritettiin nestetuikelaskennalla (Perkin Elmer, Brunn am Gebirge, Itävalta) solulysaattien (hajoamista 0,05 N NaOH: lla PBS: ssä), normalisoitu proteiinipitoisuuden arvioitava Rotiquant ™ (Carl Roth, Karlsruhe, Saksa) proteiinimääritys ja ottoa aika (saamiseksi radioaktiivisuus per mg proteiinia ja minuutti) ja korjattuna ei-kuljettaja välittämää glukoosin oton (jota ei ole estetty samanaikaisella käsittelyllä sytokalasiini B (10 uM) aikana tymämenetelmällä). Oligomysiini A (2 uM, 4 h) toimi positiivisena kontrollina lisääntynyt tyvi glukoosin ottoon.

Arvio mahdollisten sytotoksisuuden kautta määritys julkaistiin laktaattidehydrogenaasin (LDH), ATP-tasot, kaspaasi pilkkominen ja biomassan

MEF kasvatettiin 96-kuoppalevyillä (istutustiheyteen 2,5 x 10

4 solua /kuoppa). Hoidon jälkeen kuten me määritetty julkaisun LDH (toimenpide kalvon eheys), ATP-tasot (toimenpide solujen elinkelpoisuus) ja kaspaasi pilkkominen (toimenpide apoptoosin induktio) kanssa CytoTox96 Non Radioaktiivista Sytotoksisuusmääritys, The CellTiterGlo Luminescent solunelinkykyisyysmääritys ja CaspaseGlo 3/7 luminesenssikoe, vastaavasti. Kaikki sarjat suoritettiin mukaisesti tarjotaan protokollia. Biomassa värjättiin kaatamalla pois keskipitkän ja inkuboimalla kiinnittyneitä soluja kristallivioletilla (0,5% (w /v) kristalliviolettia /20% (v /v) MeOH: ssa) 5-10 minuuttia. Huolellisen pesun vaiheet vesijohtovedellä (jotta päästään eroon irtoväriä) ja kuivataan sidottu väri liuotettiin joiden alkoholipitoisuus sitraattiliuosta (0,05 M sitraatti /50% (v /v) EtOH) ja kvantifioidaan absorbanssilukemia 595 nm. Absorbanssi ja luminesenssi seurattiin Tecan (Grödig, Itävalta) Sunrise ja GeniosPro levy lukija, tässä järjestyksessä. Triton (1%), staurosporiinille (1 uM) tai yhdistelmä oligomysiini A (2 uM) ja koira (10 mM) toimi positiivisena kontrollina vastaaville määrityksissä.

Nuclear tekijä E2 liittyvä tekijä 2 ( Nrf2) -riippuvaista reportterigeenimäärityksessä

Nrf2 riippuva reportterigeenimäärityksessä perustui lusiferaasiekspressio laukaisi aktivoitua antioksidantti vaste-elementin (ARE) hiiren glutathione-

S

-transferase ja suorittaa kuten aiemmin on kuvattu [24]. CDDO-IM, synteettinen triterpenoidi (100 nM), toimi positiivisena kontrollina ja luovutti ystävällisesti Michael Sporn, Geisel School of Medicine Dartmouth, Hanover, NH, USA.

Solunulkoisilla vuon analyysi määrittämiseksi glykolyyttisen ja hengityselinten kapasiteetit

MEF ympättiin sopiva kollageenipäällysteisiin 24 kuopan soluviljelmissä levyt (vuodesta Seahorse Biosciences, Kööpenhamina, Tanska) kennotiheys 2,7 × 10

4 solua /kuoppa). Käsittelyn jälkeen kuten soluja pidettiin seerumittomassa väliaineessa (DMEM plus 2 mM glutamiinia, 0 mM glukoosia, 0 (glykolyysiin stressitesti) tai 2 (mitokondrion stressitesti) mM pyruvaattia, pH 7,35-7,40) 37 ° C: ssa ja ympäristön CO

2 yksi tunti ennen tehtiin glykolyysistä (lukema: solunulkoinen happamoitumisen rate (ECAR) mph /min) ja mitokondrioiden (lukema: hapenkulutuksen (OCR) in pmol O

2 /min) stressitestit . Testi sarjat tulivat Seahorse Biosciences, tehtiin mukaan valmistajan ohjeiden ja analysoitiin Seahorse 24XF

e solunulkoisen vuon analysaattorin ja Wave ohjelmistot (www.seahorsebio.com). Optimoitu estäjän pitoisuuksia MEF oli 2 uM oligomysiini A, 1,5 uM carbonylcyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazon (FCCP), 1 uM rotenonin A, 1 uM Antimysiini-, ja 100 mM 2-DOG. Normalisoinnin solumassalle suoritettiin rutiininomaisesti kristalliviolettivärjäys- värjäyksen jälkeen analyysi, jotta huomioon mahdolliset erot solujen määrä.

määritys solunulkoisen laktaatin markkeri glykolyysille

MEF valmistettiin 24-kuoppaisille levyille. Käsittelyn jälkeen kuten solut pestiin PBS: llä ja inkuboitiin sitten standardin Krebs Ringer Phosphate HEPES (KRPH) puskuri, johon oli lisätty 0,2% BSA: ta ja 10 mM glukoosia 2 tuntia. Sitten supernatantit analysoitiin niiden laktaattipitoisuus kautta entsyymi-kytketyn fluoresenssimääritys, ja solut hajotettiin ja niiden proteiinipitoisuus määritettiin. Lyhyesti, yksi tilavuus supernatanttia (yleensä laimennettu 1:20) sekoitettiin yhteen tilavuuteen määrityspuskurissa (KRP-puskuria, jossa oli 10 uM Amplex Red, 1 U /ml laktaattioksidaasi ja 2,5 U /ml piparjuuriperoksidaasi), inkuboitiin 10 minuuttia ja sitten lukea joka flourimeter viritysaallonpituudella 535 nm ja emissio aallonpituudella 590 nm. Rinnakkainen seuranta ratkaisuja tunnettuja pitoisuuksia laktaattia helpotti lopullisen lukeman mol laktaattia /g proteiinia * min.

Flow-sytometrinen määrittäminen mitokondrion sisältö ja mitokondrioiden reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) tuotanto

MEF kasvatettiin 12- tai 6- kuoppalevyillä (istutustiheyteen 1,5 × 10

4 tai 3 x 10

4 solua kuoppaa kohti) ja käsiteltiin kuten on ilmoitettu. Määrittämistä varten mitokondrion sisältö solut värjättiin 50 nM MitoTracker Green (Invitrogen) 20 minuuttia ja sitten analysoitiin vihreä kanava (FL1, ex 488 nm; em 530/30 nm) FACS Calibur (BD Biosciences, Schwechat, Itävalta). Mielivaltainen keskiarvo vihreän fluoresenssin otettiin mittana mitokondrion sisältö korjauksen jälkeen autofluorisaatiota [25], [26]. Valinomysiinia toimi kontrollina mahdolliselle-riippumattomuus MitoTracker Green signaalia. Määrittämiseksi mitokondrion ROS-soluja inkuboitiin 5 uM MitoSox Red (Invitrogen) 10 minuutin ajan ja sitten analysoitiin niiden autofluorisaatiota korjattu punaisen fluoresenssin (FL2-kanavalla, ex 488 nm, em 585/42 nm) virtaussytometrissä. Mielivaltainen keskiarvo punaisen fluoresenssin otettiin lukema varten tuotetaan mitokondrion ROS. Antimysiini A (2 uM) toimi positiivisena kontrollina tässä määrityksessä.

Protein uuttamalla, SDS-polyakryyliamidielektroforeesilla ja immunoblot-analyysi

MEF valmistettiin 6-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin, kuten on ilmoitettu. Immunoblottianalyysi lukien proteiini uuttamalla, geeli aikavälillä siirto immunohavaitsemis- ja densitometristen arviointi suoritettiin kuten kuvattu muualla [23]. Havaitsemiseksi GLUT1 ja 3 näytteitä ei keitetty ennen elektroforeesia estämiseksi aggregaatiota ja saostumista. Havaitsemiseksi proteiinien samankokoisia (esim fosforyloitua muotoa vastaan ​​kokonaisproteiinia) kaksi samanlaista kalvoja ulos saman proteiinin uutteet valmistettiin ja arvioitiin, jotta vältetään mahdolliset esineet tai epäselviä signaaleja epätäydellisestä strippaus.

Tilastot

tilastolliset analyysit kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa (n≥3; itsenäisestä kokeesta (biologiset toistoa)). Pylväsdiagrammit kuvaavat keskimääräistä + SD. Kaksi ryhmää verrattiin käyttäen Studentin t-testiä, enemmän ryhmiä analysoitiin yhden tai kaksisuuntainen ANOVA lukumäärästä riippuen muuttujien tutkittujen aineistoja, jota seurasi Dunnettin tai Bonferronin post hoc testi. Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin kanssa GraphPad Prism. Erot p-arvot 0,05 pidettiin merkittävinä ja ne on *.

Tulokset

BA kasvaa solun glukoosinottoon

Ensin arvioitiin solujen glukoosin sisäänoton nopeus jälkeen hoidon BA eri solutyyppejä, mukaan lukien ensisijainen ihmisen endoteelisoluja (HUVEC), ikuisti hiiren makrofageissa (RAW264.7), eriytetty hiiri myo (C2C12) – ja rasvasolut (3T3-L1) sekä hiiren alkion fibroblasteja (MEF). Olemme johdonmukaisesti havaittu lisääntyneen tyvi glukoosin ottoa kaikissa solutyypeissä noin 50 100%: iin (Fig. 1A) BA: n kanssa pitoisuudella 10 uM (lähes optimaalinen pitoisuus kaikkien käytettyjen solulinjojen määritettynä pitoisuus-vaste kokeet; S1 Kuva.). Oligomysiini A inhibiittori mitokondriaalisen ATP-syntaasi, käytettiin positiivisena kontrollina. Nämä havainnot ehdottivat yleinen ja solu-tyyppinen riippumaton kasvu glukoosin sisällyttäminen BA. Lisääminen kyllästää pitoisuuksia insuliinia eriytetty rasvasolut ja lihassoluissa, kaksi suurta insuliiniherkissä glukoosin hävittämistä solutyyppejä, johtanut kasvaneeseen solujen glukoosin oton päälle BA vaikutuksen (Fig. 1 B) osoittaa insuliinin itsenäistä toimintaa BA.

(A) eri solutyyppejä (eriytetty adiposyyttien (3T3-L1), eriytetty lihasputkiksi (C2C12), endoteelisoluja (HUVEC), makrofageissa (RAW264.7) ja hiiren alkion fibroblasteissa (MEF)) käsiteltiin 10 uM BA (+) tai 0,1% DMSO: ta (-) 16 tunnin ajan ennen niiden solujen glukoosin sisäänoton nopeus määritettiin edellä kuvatulla. Oligomysiini A (OL, 2 uM 4 h) toimi positiivisena kontrollina lisääntynyt tyvi glukoosin oton. Pylväskaavion esittää glukoosin oton hinnat suhteessa keskiarvoon vastaavan DMSO-kontrollin (n = 3 (eli kolmen erillisen kokeen, kukin kolmena rinnakkaisena); * p 0,05 vs DMSO ctrl, ANOVA). (B) Eriytetyt rasvasolut (vasemmalla) ja lihassolujen (oikealla) käsiteltiin BA (10 uM) 16 tunnin ennen seerumistarvaatio ja insuliinistimulaation (15 min, 3T3-L1: 15 nM insuliinin C2C12: 100 nM insuliini). Sitten solujen glukoosin oton määritettiin. Pylväsdiagrammit kuvaavat glukoosin oton hinnat suhteessa keskiarvo vastaavan stimuloimattoman ajoneuvon ohjaus. (N = 3 (ts kolmen erillisen kokeen, kukin kolminkertaisena); keskiarvo + SD; * p 0,05 vs stimuloimattomasta DMSO ctrl, ° p 0,05 vs insuliinistimuloidun DMSO ctrl, kaksisuuntainen ANOVA, Bonferronin). Oligomysiini A (OL, 2 uM 4 h) toimi positiivisena kontrollina lisääntynyt tyvi glukoosin ottoon.

BA ei indusoi solukuoleman MEF

Koska lisääntynyt glukoosin oton voi ilmoittaa solujen stressiä ja sytotoksisuus, ja BA on osoitettu olevan pro-apoptoottisen vaikutusten eri (syöpä) solutyyppejä, seuraavan kerran määritetään, onko havaittu kohonnut glukoosin otto on liitetty, mikä johtaa solukuolemaan. Käsittelimme MEF, solutyyppi valita kaikille lisätutkimuksia, 10pM BA 48 tuntia ja määritetään suhteellinen vapauttamaan laktaattidehydrogenaasin (LDH, suhde solunulkoisen ja yhteensä) kuin lukeman solukuolemaan ja kalvon hajoamista (Fig. 2A) , kaspaasien aktivaatio kuin lukeman apoptoosin induktioon (Fig. 2B), ATP-tasot kuin merkkinä yleisestä solujen elinkykyä (Fig. 2C) ja sitova kristalliviolettia niin yksinkertaista biomassan tahra (Fig. 2D). BA 10 uM ja 30 uM ei aiheuttanut merkittäviä muutoksia verrattuna DMSO hoidettuun kontrolliryhmään soluissa. Siten havaittiin lisääntynyt glukoosin sisäänottoa BA altistuminen on epätodennäköistä johtuen uhkaavan solukuolemaan. Lisäksi BA ei laukaista aktivointi transkriptiotekijän tumatekijä E2 liittyvä tekijä 2 (Nrf2), kuten on esitetty käytettäessä Nrf2-riippuvaisen reportterigeenin määritys. Nrf2 aktivointi on tunnettu indikaattori solun stressivaste altistettaessa vierasaineiden (S2 Kuva.). Puuttuminen myrkyllisyys jopa pitoisuuksia 30 uM voitaisiin myös vahvistettu endoteelisolujen, adiposyyttien ja lihassolujen (S3 kuvassa.) Ja tukee yleistä syöpä-selektiivinen myrkyllisyys BA.

MEF hoidettiin BA (10 uM ja 30 uM) 48 tunnin ajan ennen kuin ne tehtiin määritys kalvon eheyden (% LDH: n vapautuminen) (A), potentiaali proapoptoottiset tapahtumia (kaspaasi 3/7) (B), ja ATP-tasot (C ) ja biomassa (D). Pylväsdiagrammit kuvata kokoaminen kolmen erillisen kokeen (ilmaistuna taitteeseen DMSO keskiarvo B, C, ja D) jokainen neljänä (keskiarvo + SD, * p 0,05, ANOVA, Dunnettin post testi vs. DMSO ctrl). Staurosporiini (Stauro, 1 uM 6 h), triton (1% 1 h) tai yhdistelmä oligomysiini A (OL; 2 uM) ja koira (10 mM, 5 h) toimi positiivisena kontrollina määrityksissä.

BA kohottaa aerobista Glykolyysivaiheen

Seuraavaksi olimme kiinnostuneita aineenvaihdunnan nautitun glukoosi. Glykolyyttisellä korko tutkittiin käyttämällä solunulkoista flux analyysiä. Havaitsimme, että BA-käsitellyt solut osoittivat merkittävästi suurempi solunulkoisen happamuuden määrä (ECAR) lisättäessä glukoosia kuin vehikkelillä käsiteltyjen kollegansa (Fig. 3A ja B). Täydentävällä määrityksessä määritetään ekstrasellulaarisen laktaattitasot me jatkuvasti seurata kohonnut laktaatintuotto BA käsiteltyjä soluja (S4 kuvio.). Nämä havainnot osoittavat suurempaa glykolyyttistä verokantaa BA käsitellyissä soluissa ja jättää vaikutusta oletetun kalvo V-ATPaasi havaittuihin happamoitumista. Maksimaalinen glykolyyttisiä kapasiteetti (ECAR jälkeen oligomysiini lisäksi ja eston mitokondrioiden ATP tuotanto) on verrattavissa välillä DMSO: n ja BA-käsiteltyjä soluja. Näin ollen BA-käsitellyt solut hallussaan merkittävästi vähentynyt glykolyyttistä varakapasiteetin (ΔECAR

maximal- ECAR

perustaso) (Fig. 3B). Nämä tiedot osoittavat, että BA ajaa soluja kohti täysimääräistä hyödyntämistä niiden glykolyyttisen potentiaalia epäsuosioon glukoosin hapettumisen (Fig. 3C). Havaitun lisääntynyt fosforylaatioon pyruvaattidehydrogenaasin E1 (PDHE1) lisäksi viittasi glykolyyttistä kytkimen päälle BA hoitoa. Fosforylaatio tekee PDHE1 vähemmän aktiivisia ja häiritsee oksidatiivisen dekarboksylaatiota pyruvaatti asetyyli-CoA suosimalla pyruvaatti vähennys laktaattia (Fig. 3d). Kuitenkin lisäkokeita tarvitaan yksiselitteisesti arvioida, missä määrin PDHE fosforylaatio vaikuttaa lähes maksimaalinen Glykolyysivaiheen BA-käsitellyissä soluissa. Ilmentymistaso useiden tutkittujen glykolyyttisten entsyymien ei muuttunut (S5 kuvio.), Joka ei kuitenkaan sulje pois muuttuneen entsymaattisen aktiivisuuden vuoksi kovalenttisen tai allosteerisiä muutoksia. Ilmentyminen glukoositransportterin GLUT1 nostettiin päälle BA hoitoa 16 h, kun taas taso GLUT3 ei muuttunut (Kuva. 3E). GLUT2 /4 eivät olleet havaittavissa meidän MEF.

MEF hoidettiin 10pM BA tai DMSO (0,1%) 16 tunnin ennen kuin ne altistettiin Glykolyysivaiheen stressitestin kuten kohdassa ”Materiaalit ja menetelmät”. (A) solunulkoista happamoituminen rate (ECAR) on kuvattu, kun altistaa solut peräkkäin glukoosille (10 mM), oligomysiini A (2 uM) ja deoksiglukoosille (DOG, 100 mM) (keskiarvo + SD; koottu raakadataa kolmen erillisen kokeen neljä teknistä rinnakkaista, joista kussakin). (B) nämä tiedot analysoidaan kannalta pohjapinta (glykolyyttisen ECAR jälkeen glukoosin lisäksi), maksimaalinen (glykolyyttisissä ECAR jälkeen oligomysiini) ja säästää (maksimaalinen miinus perusaktiivisuutta) glykolyyttisiä aktiivisuus (keskiarvo + SD, * p 0,05, t-testi , DMSO vs. BA). Määrän määrittäminen perustuu arvoon lopullisessa ajankohtana kunkin hoidon edellytys. In (C) arvot OCR ja ECAR (DMSO: n ja BA-käsitellyt solut (16 h)) lisäämisen jälkeen glukoosin piirrettiin toisiaan havainnollistaa siirtymistä glukoosin hapettumisen glykolyysistä. Havaittu muutos lisättäessä oligomysiini A lisätään juoni viitteenä. (D) MEF käsiteltiin DMSO (0,1%, D) ja 10 uM BA varten ilmoitettu aikoja ennen kokosoluliuotteista alistettiin immunoblot-analyysit pPDHE1 (Ser273) ja yhteensä PDHE1 (molekyylipaino 43 kDa). Edustavia blots kolmesta kokeet näkyvät. Jäljempänä olevassa kaaviossa esitetään koottu densitometristä arvot pPDHE /PDHE (n = 3; keskiarvo + SD; * p 0,05, t-testi; DMSO vs BA kunakin ajankohtana). (E) MEF käsiteltiin 10 uM BA tai DMSO: ta (0,1%) 16 tunnin ajan ennen kuin ne tehtiin immunoblot-analyysi GLUT1 (~ 50 kDa), GLUT3 (noin 55 kDa) ja aktiinin (42 kDa). Edustavia blots ulos kolmen erillisen kokeen näkyvät. Jäljempänä olevassa kaaviossa esitetään koottu densitometristä arvot GLUT1 /aktiini ja GLUT3 /aktiini, vastaavasti (n = 3; keskiarvo + SD; * p 0,05, t-testi; DMSO vs BA jokaisena ajankohtana).

BA heikentää mitokondrioiden toimintaan

Koska lisääntynyt aerobinen Glykolyysivaiheen voi kompensoida heikentynyttä ATP tuotannon oksidatiivisen fosforylaation tutkimme seuraavaksi mitokondrioiden toimintaan jälkeen BA hoidon. Havaitsimme lisääntynyt tuotanto mitokondrion ROS (Fig. 4A) ja kohonnut ilmentyminen irtoamisen proteiineja UCP1 ja UCP2 BA saaneilla MEF (Fig. 4B). Yhteenlaskettu mitokondrion sisältö pysyi ennallaan (kuvio. 4C). Altered mitokondrioiden toimintaa vahvistettiin mitokondrio stressitestin ja solun vuon analysointi. Solut näkyy hieman alennettua pohjapinta hapenkulutuksen (OCR), alennetun kytkentä hapenkulutuksen mitokondrioiden ATP tuotantoon (Δ (OCR

pohjapinta-OCR

oligomysiini), vähentynyt maksimaalinen hengitys (OCR jälkeen hajoamista protonin kaltevuus by FCCP), alennettua hengitysteiden varakapasiteetin (Δ (OCR

maksimaalinen-OCR

pohjapinta)), sekä lisääntynyt protoni vuotaa (Δ (OCR

oligomysiini – OCR

A + R) ) hoidetuilla BA 16 h (kuviot. 4E ja F). Nämä tiedot osoittavat, että hoito BA häiritsee mitokondrioiden toimintaan, mutta lievästi koska mitään laskua solujen elävyys laukaisee BA (kts. Kuva 2). Aika tietysti kokeet paljastivat, että irrottamisen hengitys (näkynyt lasku OCR käytetään ATP tuotantoon S6A kuvassa.) korreloi ajasta riippuvia induktion UCPs (S6b Fig.). kuitenkin kysymykset siitä UCP induktio selittää havaitun irrotus vai BA itse melko hydrofobinen molekyyli, jonka pKa-arvo 5,5 on heikko uncoupler tarvitsee lisätutkimuksia. Erityisesti kun lyhyt inkubaatioista BA (1-3 h) pohjapinta OCR yleensä nostetaan verrattuna DMSO-kontrollin soluihin odotetusti irrottamisen mitokondrioiden hengitykseen (S6A Fig.). Myöhempi väheneminen OCR nähdään BA käsiteltyjä soluja voi johtua vielä vaikeasti mukautuva tai muita mekanismeja laukaisi triterpenoid kuten hajoamista mitokondrion kalvon potentiaalia ajan tai heikentyneestä elektronin läpi Hengitysketjun.

(A) MEF käsiteltiin 10 uM BA tai 0,1% DMSO: ssa 16 tunnin ajan ennen kuin ne tehtiin virtaussytometria analyysi mitokondrion ROS käytön MitoSox Red ja antimysiiniherkkien (2 uM, 1 h), positiivisena kontrollina . (N = 3 (kukin kahtena tai kolmena kappaleena), keskiarvo + SD, * p 0,05, t-testi). (B) MEF hoidettiin DMSO tai 10pM BA 16 tunnin ennen kokosoluliuotteista alistettiin western blot-analyysi UCP1, UCP2 (bändi ~25-35 kDa) ja aktiini (42 kDa) kuin latauskontrollina. Edustavia blots kolmen itsenäisen kokeen on kuvattu. Jäljempänä olevassa kaaviossa esitetään koottu densitometristä arvot UCP1 /aktiini ja UCP2 /aktiini, vastaavasti (n = 3; keskiarvo + SD; * p 0,05, t-testi; DMSO vs BA). (C) MEF käsiteltiin 10 uM BA tai 0,1% DMSO: ssa 16 tunnin ajan ennen kuin ne tehtiin virtaussytometria analyysi mitokondrion sisällön käyttämällä MitoTracker Green. Valinomysiiniä (200 nM, 16 h), joka on tunnettu haitta, että mitokondrion kalvon potentiaalia toimi kontrollina mahdollisten riippumaton signaali MitoTracker Green. MEF käsiteltiin 10 uM BA tai DMSO: ta (0,1%) 16 tunnin ajan ennen kuin ne altistettiin mitokondrioiden stressitestin, kuten on kuvattu kohdassa Materiaalit. In (D) keskimääräinen hapenkulutuksen (OCR) kolmen itsenäisen kokeen on esitetty, kun solut saatetaan peräkkäin oligomysiini (2 uM), FCCP (1,5 uM) ja antimysiini A + rotenone (A + R; 1 + 1 uM). In (E) nämä tiedot analysoidaan kannalta hapenkulutuksen perusolosuhteissa, hapenkulutus ATP synteesissä, maksimaalinen hengitystiheys, vara hengityskapasiteetti ja protoni vuotaa (keskiarvo + SD, * p 0,05, t-testi, DMSO vs . BA).

BA aktivoi AMP-aktivoitu proteiinikinaasi (AMPK) B

Alennettu mitokondrioiden toimintaan on yhteydessä aktivoituminen AMPK (tarkistetaan [27]), yksi keskeinen aineenvaihdunnan master napa. AMPK aktivointi voidaan lisäksi selittää kompensoiva lisääntynyt glukoosin sisäänoton ja glykolyyttiset rate [28], [29]. Siksi tutkimme, BA johtaa aktivoitu AMPK. Käyttämällä immunoblot-analyysillä havaitsimme ohimenevä vauhtia AMPK fosforylaation treoniini 172, joka osoittaa koholla AMPK toiminnalta BA käsiteltyjen versus kontrolli soluja (Kuva. 5A). AMPK aktivointi Lukua tukevat lisääntynyt fosforylaatio asetyyli-CoA karboksylaasi (ACC) on seriini 79, yhteinen alavirran kohde AMPK. Käyttö isogeenisten WT MEF ja AMPK knockout vastaavien osoitti, että lisääntynyt glukoosin oton, lisääntyneen ekspression glukoosin kuljettajan GLUT1 ja kohonnut glukoosiaineenvaihdunnan kautta glykolyysin olivat riippuvaisia ​​läsnä AMPK (Fig. 5B, C, D). Kuitenkin BA indusoi verrattavissa vähentäminen mitokondrioiden toimintaa (esim. Vähentämiseen maksimaalisen hengityksen noin 40% verrattuna DMSO-kontrollin) sekä WT ja AMPK – /- MEF. Tämä havainto sijoitettu mitokondrioiden ylävirtaan AMPK aktivaation (kuvio. 5E) ollessa linjassa havaittu aktivointi AMPK, induktion GLUT1, kohonnut glukoosin otto ja lisääntynyt glykolyyttisissä korko upon lievä FCCP perimät irtoamisen (S7 Fig.). Huomattavaa on, että AMPK – /- solut oli yleensä pienempi hapenkulutus kuin WT MEF todennäköisesti osittain johtuu niiden määrän väheneminen mitokondrioiden (S8 Fig.). Vertaamalla WT ja solujen puutteellinen maksan kinaasi B1 (LKB1), The AMPK kinaasi reagoi muuttuneeseen AMP /ATP-suhde [30], ehdotti LKB1 suurimpana AMPK kinaasi mukana: LKB1 – /- soluilla vähentynyt AMPK fosforylaatiota upon BA hoidossa (Fig. 5F).

(A) MEF käsiteltiin DMSO: ta (0,1%) tai BA (10 uM) ja osoitettujen ajanjaksojen ajan. Kokosoluliuotteista alistettiin immunoblot-analyysi pAMPK (Thr172) ja yhteensä AMPK (60 kDa) (vasen paneeli) tai pAMPK (Thr172), PACC (Ser79) (~245 kDa) ja aktiini (42 kDa) (oikea paneeli). Edustavia blots ulos kolmen erillisen kokeen on kuvattu. Alla olevat kaaviot kuvaavat koottu densitometristä arvot pAMPK /AMPK tai PACC /aktiini, vastaavasti (n = 3; keskiarvo + SD; * p 0,05, t-testi; DMSO vs BA kunakin ajankohtana). WT ja AMPK – /- MEF käsiteltiin DMSO: ssa tai BA (10 uM) 16 tunnin ajan. Sitten solu glukoosin rokotuskattavuudesta (B) arvioitiin (n = 3 (kolmena kappaleena), keskiarvo + SD, * p 0,05, ANOVA, Dunnettin testin jälkeinen vs DMSO ctrl), samoin kuin ekspressiotasot GLUT1 (50 kDa), AMPK (60 kDa) ja aktiini (42 kDa) western blot analyysi (C). Yksi edustaja blot on esitetty kolmen riippumattoman kokeen. Jäljempänä olevassa kaaviossa esitetään koottu densitometristä arvot GLUT1 /aktiini, vastaavasti (n = 3; keskiarvo + SD; * p 0,05, t-testi; DMSO vs BA). In (D) solut altistettiin määrittämiseksi solunulkoisen happamoitumisen määrä (ECAR), kuten on kuvattu kuviossa. 3. Edustavia tuloksia kolmen erillisen kokeen (kolme tekniset rinnakkaisnäytettä kutakin) esitetään (keskiarvo + SD, * p 0,05, t-testi). (E) WT ja AMPK – /- MEF käsiteltiin DMSO: ta (0,1%) tai BA (10 uM) 16 tunnin ajan ennen kuin ne altistettiin mitokondrioiden stressitestin ja solun vuon analyysi. Koottu data kolmesta itsenäisestä kokeesta kuvataan (keskiarvo + SD). (F) WT ja LKB1 – /- MEF hoidettiin BA (10 uM) varten ilmoitettu aikoja ennen kokosoluliuotteista alistettiin immunoblot-analyysi pAMPK (Thr172), AMPK (60 kDa), LKB1 (-50 kDa ) ja aktiini (42 kDa). Edustavia blots ulos kolmen erillisen kokeen on kuvattu. Jäljempänä olevassa kaaviossa esitetään koottu densitometristä arvot pAMPK /AMPK, vastaavasti (n = 3; keskiarvo + SD; * p 0,05, ANOVA, Dunnettin (vs 0 h hoidon BA).

Nämä tiedot osoittivat, että BA lievä mitokondrioiden toimintaan, laukaisee AMPK aktivointi LKB1 mikä puolestaan ​​aikaansaama lisääntynyt glukoosin saannin ja siirtynyt solun glukoosiaineenvaihdunnan hapettumiselta aerobista Glykolyysivaiheen.

BA tekee solut riippuvaisiksi glukoosiksi

Kiehtoi havainto, että BA ajaa solujen parannettu glykolyyttisissä aktiivisuutta seuraavaksi testasimme, onko BA sulatettu solujen glukoosi koukkuun. tästä me arvioitu solujen elinkykyä (ATP-tasot, biomassa) MEF vehikkeliä tai BA ei ollut läsnä ja glukoosia 48 tuntia . sillä glukoosi-puutteellisista soluista lisäsimme mannitolia osmoottisen tasapainon. DMSO-käsiteltyjen kontrollisolujen selviytynyt hyvin glukoosin loppuminen kuten ilmeistä muuttumattomana biomassan ja ATP-tasot verrattuna ”plus glukoosi” kunnossa. koska glukoosin nämä solut näyttävät jopa toistettavissa suuntaus kohonneet ATP-tasot, jotka voidaan selittää pakko mitokondrioiden hapettamalla substraattien (esim sisältämien rasvahappojen seerumissa) on suurempi ATP tuotto kuin glukoosi.