Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Kello geenien ajaa noin 5-15% genominlaajuisten mRNA ilmaisun, ja häiriöitä vuorokausirytmin kello voi vapauttaa solun normaalia biologisia toimintoja. Cryptochrome 1 on keskeinen säätelijä vuorokausirytmin takaisinkytkentäsilmukan ja sillä on tärkeä rooli organismeja. Tässä tutkimuksessa tehtiin selvittää ilmaus Cry1 ja sen ennustetekijöiden merkitys kolorektaalisyövässä (CRC). Lisäksi funktio Cry1 ihmisen CRC tutkittiin soluviljelymalleissa.

Methods

Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR, Western blot-analyysi ja immunohistokemia käytettiin tutkimaan Cry1 ilmentymisen CRC solussa linjat ja ensisijainen CRC kliinisissä näytteissä. MTT: n ja pesäkkeiden muodostuminen määrityksiä käytettiin määrittämään vaikutuksia solun proliferaatioon kyky. Eläin mallia käytettiin tutkimaan Cry1 vaikutusta kasvaimen soluproliferaation kyky

in vivo

. Transwell-määritykset suoritettiin havaitsemiseksi migraation kyky solulinjoissa. Tilastolliset analyysit sovellettiin diagnoositietoja arvo ja yhdistykset Cry1 ilmaisun kliinisiä parametrejä.

Tulokset

Cry1 ilmentymistä ylös säädellään useimmissa CRC solulinjojen ja 168 ensisijainen CRC kliininen yksilöt proteiinitasolla. Kliinisiä patologisia analyysi osoitti, että Cry1 ekspressio korreloi merkitsevästi imusolmuke etäpesäke (

p

= 0,004), ja TNM-luokitus (

p

= 0,003). Korkea Cry1 ilmentyminen liittyy huono eloonjäämisaste CRC potilailla (

p

= 0.010). Kokeellisesti olemme huomanneet, että säätely ylöspäin Cry1 edistänyt leviämisen ja migraatio HCT116-solujen, kun taas alas-säätely Cry1 esti pesäkkeiden muodostumista ja kulkeutumista SW480-solujen.

Johtopäätökset

Nämä tulokset viittaavat siihen, että Cry1 todennäköisesti on merkittäviä rooleja CRC kehitykseen ja etenemiseen andCry1 voi olla ennustetyövälineenä biomarkkereiden ja lupaava terapeuttinen kohde CRC.

Citation: Yu H, Meng X, Wu J, Pan C, Ying X, Zhou Y, et ai. (2013) Cryptochrome 1 Yliekspressio korreloi taudin etenemiseen ja huonon ennusteen potilailla, joilla peräsuolen syövän. PLoS ONE 8 (4): e61679. doi: 10,1371 /journal.pone.0061679

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 10 tammikuu 2013; Hyväksytty: 13 maaliskuu 2013; Julkaistu 23. huhtikuuta 2013

Copyright: © 2013 Yu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Basic Research Program of China (973 Program, No. 2011CB504805, No. 2010CB52994), National Natural Science Foundation of China (30973448) ja Guangdong rekrytointi ohjelma Creative Research Group. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

vuorokausirytmiä päivittäin heilahtelut eri biologisia prosesseja. Viime vuosina sääntelyyn vuorokausirytmin on tullut paremmin ymmärretyksi. Molekyylimekanismi vuorokausirytmin heilahtelut suprakiasmaattiseen ytimet (SCN) ja ääreissoluihin perustuu palautteen silmukoita kahdeksan ytimen vuorokausirytmin geenit [1], [2]:

voimassaoloaika1 (Per1) B,

Period2 (Per2) B,

Period3 (Per3) B,

Kello

,

Bmal1

,

Kaseiinikinaasi I ε (CKIε) B,

Cryptochrome1 (Cry1) ja Cryptochrome2 (Cry2)

. Niistä kahdeksan geenien Crystal kertyy sytoplasmassa ja sitten menevän tuman, edistää muodostumista vakaa Per /Cry /CK1ε komplekseja. Kerran Tuman Crystal hajota Bmal1 /Clock liittyvät transkription monimutkainen, ja estää siten Cry ja Per transkription ja derepressiota Bmal1 transkription. Molekulaarinen kellon perifeerisissä kudoksissa koordinoi transkription vuorokausirytmin geenejä. Vuorokausirytmin geenit ovat pitkälti kudosspesifisiä ja linkittää avain kudoksen toiminnot vuorokausirytmin ympäristön, jonka avulla nämä tärkeät toiminnot käytettävissä tiettyinä aikoina, kun niitä eniten tarvitaan [3], [4], [5].

nisäkkäillä, noin 5-15% genominlaajuisten mRNA ilmentymistä ohjaa vuorokausirytmiä geenejä, mukaan lukien keskeiset solusyklin sääntelyviranomaisten (esimerkiksi

sykliini D1

), onkogeenien ja tuumorisuppressoreilla, kuten

c Myc

ja

WEE-1

(eräänlainen kinaasi, joka estää solunjakautumisen) [6]. Häiriöt vuorokausirytmin kello voi vapauttaa normaalin solun biologisia toimintoja ja merkittäviä vaikutuksia ihmisen terveyteen aiheuttamalla sairauksia kuten unihäiriöt, ruoansulatuskanavan ja sydän- sairaudet, ja masennus. Vuorokausirytmin kello on myös liittyy lisääntynyt ilmaantuvuus useiden epiteelisyövissä [7], [8], [9], [10], [11], [12]. Hiiren malleissa, siirrettyjen kasvainten kasvaa kaksi kertaa nopeammin SCN vaurioittamia hiirten laparotomiakontrolleissa vaurioittamia eläimet [13]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että läheinen yhteys välillä vuorokausirytmin organisointi ja kehittää erilaisia ​​syöpiä. Väliset suhteet vuorokausirytmin geenien ja syöpä on osoitettu viime vuosina. Isäntä vuorokausirytmin kellon on raportoitu olevan tärkeä rooli endogeeninen kontrolli syövän etenemisen [14] .Cry1, yksi jäsen Cryptochrome perhe, on osoitettu olevan olennainen negatiivinen käsivarteen vuorokausirytmin takaisinkytkentäsilmukan [15] , [16].

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi kolmesta johtavista syistä syöpään liittyvää kuolleisuutta maailmanlaajuisesti [17]. CRC potilaat kehittävät usein imusolmukemetastaaseja alkuvaiheessa tauti. Aikana vaiheissa, suurin osa potilaista kehittää myös maksan, keuhkojen ja vatsakalvon etäpesäkkeitä. Osatekijöiden CRC etäpesäkkeitä ovat suurelta osin tuntemattomia; kuitenkin dysregulaatio molekyyli prosessien katsotaan johtaa kasvuun ja etäpesäkkeiden CRC. Näin ollen on tärkeää merkkiaineiden edistää CRC on korostettu, koska ne voisivat tarjota terapeuttisia kohteita [18], [19].

Kuitenkin tutkimukset arvioidaan suhteita Cry1 ilmaisun kliinis ja tulosten peräsuolen syöpä ei ole raportoitu. Olemme siis arvioi ekspressiotasot Cry1 ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän kudosten ja sovitettu ei-kasvain limakalvon ja analysoidaan kliininen merkitys Cry1 ilmaisun inCRC potilailla. Tuloksemme osoittavat, että Cry1 ekspressio korreloi merkitsevästi TNM ja imusolmuke tila. Siten Cry1 voi toimia uutena diagnoosin merkki ja terapeuttinen kohde CRC terapia.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja seuranta

Sata ja kuusikymmentäkahdeksan peräsuolen syöpäpotilailla kaikista TNM vaiheittain Cancer Center of Sun Yat-aurinko University välillä syyskuussa 1999 ja joulukuuhun 2005 oli mukana tutkimuksessa. Kymmenen pariksi kudokset 168 näytteistä käytettiin Q-PCR-määritystä.

Tutkimus hyväksynyt eettinen komitea on Sun Yat-sen University Cancer Center Institutional Board, ja kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilaista.

Kliiniset tiedot, kuten ikä, sukupuoli, kasvaimen koko, kasvain sijainti, ennen leikkausta karsinoembryonaalisesta antigeeni (CEA) tasot ja hiilihydraattiantigeeniä 19-9 (CA199) tasot, kerättiin käsittelemättömien tapausilmoitusten.

patologiset parametreja, kuten kasvain invasiivisia syvyys, erilaistumista laatu ja histologiset kuvio kerättiin patologinen raportit ja tarkastaa patologit. Potilaiden seuranta-up kolmen kuukauden välein ensimmäisen kahden vuoden kuuden kuukauden välein kolmantena ja neljäntenä vuonna, ja kerran vuodessa viidennen vuoden jälkeen leikkauksesta.

Kaikki potilaat otettiin yhteyttä puhelimitse tarkistaa niiden terveydentilaa; viimeinen seurannan päivä oli 1. maaliskuuta 2012. tautivapaan elinajan (DFS) ja kokonaiseloonjääminen (OS) kertaa laskettiin toiminnasta päivämäärä etäpesäke tai uusiutuminen tai päivä kuoleman tai viimeinen sensuroida ajan.

Soluviljely

ihmisen CRC solulinjat SW480, SW620, HCT116, HT29, ihmisen sikiön munuaisen solulinjan GP293 ja normaalin paksusuolen epiteelin solulinja FHC saatiin American Type Culture Collection . THC8307 solut saatiin omassa laboratoriossamme kokoelma. CRC-solulinjoja kasvatettiin DMEM täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Invitrogen, Carlsbad, CA). FHC-soluja kasvatettiin DMEM: F12 -alustassa, joka sisälsi 0,005 mg /ml insuliinia, 10 ng /ml koleratoksiinia, 100 ng /ml hydrokortisonia ja 0,005 mg /ml transferriiniä, ja johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia, 100 ng /ml streptomysiiniä ja 100 U /ml penisilliiniä. Kaikki solulinjat viljeltiin kostutetussa kammiossa 5% CO

2 ja 37 ° C: ssa.

Quantitative käänteistranskriptio-PCR

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRIzol Reagent ® (DSBIO, Guangzhou, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden. Komplementaarisen DNA: n (cDNA) syntetisoitiin 2 ug kokonais-RNA: sta käyttämällä M-MLV käänteistranskriptaasia (Promega, Madison, WI). cDNA monistettiin AmpliTaq® Gold DNA-polymeraasia (Applied Biosystems, Foster, CA), ja alukkeilla. Seuraavia alukkeita käytettiin Cry1, 5’GAGTATGATTCTGAGCCCTTTG-3 ’(eteenpäin), 5′-GGTTGTCCACCATTGAGT-3’ (taaksepäin). GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina.

Western blot -analyysi

Yhteensä solun proteiinit uutettiin ja erotettiin SDS-PAGE-geelit ja Western blot -analyysi suoritettiin standardimenetelmien mukaisesti. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina samalla membraanin. Primaaristen vasta-aineiden, joita käytettiin sisältyvät monoklonaalinen anti-Cry1 (1:1000, Abcam, USA) ja anti-GAPDH (1:2000, Santa Cruz Biotechnology, USA). Proteiinit saatiin näkyviin käyttämällä ECL menettelyä (Amersham Biosciences, USA).

Cell transfektio

koodaava sekvenssi Cry1 monistettiin ja kloonattiin

Notl

ja

BamHI

site pcDNA3.1

+ tuottamaan pcDNA3.1

+ – Cry1 ilmentävällä vektorilla; Saatu rakenne varmistettiin sekvensoimalla. Cry1 siRNA (GCAAGAGAAUUUGCUUAAUTT) ja ohjaus siRNA (UUCUCCGAACGUGUCACGUTT) ostettiin Shanghai Genepharma Co. Ltd (Shanghai, Kiina).

lyhytaikaista transfektiota, SW480-soluja (6 x 10

5 solua kuoppaa kohti) ja HCT116-soluja (5 x 10

5 solua per kuoppa) ympättiin 6-kuoppalevyille 60% yhtymäkohdassa ja transfektoitiin 100 nM oligonukleotidien tai 4 ug plasmidia, käyttäen Lipofectamine 2000 ((Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeita. 6 tunnin kuluttua inkuboinnin 37 ° C: ssa, transfektio elatusaine korvattiin 3 ml: lla täydellistä alustaa, joka sisälsi 10% FBS: ää. Solut kerättiin western blot, leviämisen ja invaasion määrityksiä eri aikoina.

Retrovirus pakkaus ja transduktio

Cry1 ja controlsequences kloonattiin

Xho

I ja

Cla

I -kohtaan pLNCX2 retrovirusvektoriin. Virus pakkaus suoritettiin GP293 soluissa. GP293 soluja viljeltiin DMEM: ssä, jossa oli 10% FBS: ää 37 ° C: ssa inkubaattorissa 5% CO

2. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen, supernatantti kerättiin sentrifugoimalla 1000 g 10 minuuttia. HCT116-soluja transdusoitiin retrovirus sisältävä Cry1 tai säätelysekvenssit plasmideja. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia infektion jälkeen, G418 (600 ug /ml) lisättiin median 2viikko valita vakaa infektoidut solut retrovirus. Western blotting määrityksiä käytetään havaitsemaan ilmentymisen Cry1 kaksi stabiilit solulinjat, kuten edellä on kuvattu.

solunelinkykyisyysmääritys

3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) – 2, 5-bifenyyli liumbromidi (MTT) käytettiin havaitsemaan solujen lisääntymistä. HCT116-solut maljattiin 96-kuoppaisille 1 x 10

3 solua /kuoppa. Spektrofotometrinen jokaisen näytteen absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä. Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa, ja tulosten keskiarvo laskettiin.

pesäkemuodostusta, HCT116-solut (4 x 10

3 solua per 10 cm

2 levyä) yli-ilmentävät Cry1or ohjaus GFP ja SW480-solut (5 x 10

3 solua per 10 cm

2 levy) alassäädetty varten ilmaus Cry1 siRNA tai negatiivinen kontrolli ympättiin täydelliseen alustaan. Soluja viljeltiin 14 päivän ajan 37 ° C: ssa 5% CO

2 kostutetussa ilmassa. Pesäkkeenmuodostusta ja kasvua visualisoitiin kristalliviolettia värjäystä. Pesäkkeiden lukumäärät sisältävien 50 solut määritettiin, ja 12 kenttää laskettiin.

In vitro

migraatiokokeessa

migraatio solujen kykyä mitattiin transwell kammioissa (8 um huokosia, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Alaosaan täytettiin 700 ul: aan DMEM: ää, joka sisälsi 10% FBS: ää. Migraatiokokeessa, kasvaimen soluja (1 x 10

5 solua yhteensä 200 ui) pantiin yläkammioon ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 kostutetussa ilmassa. 24 tunnin kuluttua viljeltiin, ei-vaeltavien solujen yläpinnan kalvo poistettiin, ja solut, jotka vaelsivat alapuolelle polykarbonaattikalvon kiinnitettiin etanoliin ja värjättiin kristallivioletilla 10 minuutin ajan. Määrä vaeltavien solujen määritettiin sitten 5 riippumaton mikroskooppikentästä. Keskiarvoa kolmesta määrityksiä kullekin koetilalle käytettiin analyysiin.

immunohistokemiallinen määritys

ilmentymisen Cry1 perus-kasvaimia ja viereisen noncancerous peräsuolen limakalvon tutkittiin käyttäen immunohistokemiallista määritystä. Immuunihistokemialliset Analyysi suoritettiin viiden päivän kuluessa jakson valmistelu. Parafiini leikattiin paksuuteen 4 um ja joka on asennettu silanoidun dioja. Sitten leikkeitä vahat, vedettömät ja blokattiin 0,3% vetyperoksidia. Tissue antigeenejä noutaa mikroaaltouunissa asetettu 95 ° C: ssa 25 minuuttia ja jäähdytettiin huoneen lämpötilaan 10 mmol /natriumsitraatti (pH 6,0). Kukin viipale pestiin sitten fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa Cry1 (1:400, klooni ab54649, Abcam, Cambridge, UK). Ensisijainen vasta-aineet laimennetaan tausta vähentämällä komponenttien (S2022, Dako, Glostrup, Tanska). Sekundaarinen vasta-aine käytettiin kanssa Envision Detection Kit (Dako). Objektilasit värjättiin 2 min diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla (DAB) ja sitten vasta- värjättiin hematoksyliinillä. Tissue käsiteltiin vasta-aineen laimennuksen liuosta käytettiin negatiivisena kontrollina. Kaikki säätimet tuotti tyydyttäviä tuloksia.

arviointi värjäystä

Näytteet arvioitiin kaksi tutkijaa, jotka olivat tietoisia kliiniseen tulokseen ja jotka itsenäisesti uudelleen värjättyjä laseja. Kukin dia arvioitiin alla mikroskoopilla at x 200 suurennus. Ilmentyminen Cry1 arvioitiin käyttämällä H-tulokset. H-tulokset koostui arviointi värjäytymisen intensiteetti ja prosenttiosuus värjäys alueen, jolla on tietty intensiteetti. Vain värjätään pahanlaatuisten solujen arvioitiin. Näytteet ryhmitelty seuraaviin neljään luokkaan sen voimakkuudesta tumavärjäystä: none (0), heikko (1), keskipitkän (2) ja vahva (3). Indeksoitu summa saatiin kertomalla intensiteetti arvosana prosenttiosuudella värjäyksen alue.

Cry1 ekspressiotaso oli kaksijakoinen mukaan DFS ja OS jonka ROC käyrä. Cut-off-arvo positiivisia oli maksimoitu summa herkkyyden ja spesifisyyden pistettä.

In vivo

proliferaatiomäärityksillä

Nainen joilta puuttuu kateenkorva BABL /c nude-hiirissä ( 4-5 viikkoa vanhoja) hankittiin Medical eläinkeskus Guangdong (Guangdong, Kiina). Kaikki eläinkokeet suoritettiin inaccordance NIH eläinten useguidelines ja nykyinen Kiinan sääntöjä ja standardson käyttöä koe-eläimiä. Voit selvittää leviämisen solun kapasiteettia linesstably erittäin vahvasti ilmentävä Cry1

in vivo

, yhteensä 1 x 10

6 solua ihonalaisesti vasempaan nude-hiirten ja negatiivinen kontrolliryhmä injektoitiin oikea (n = 9). Kasvaimen tilavuus arvioitiin seuraavalla kaavalla: tumorvolume = 4π /3 x (leveys /2)

2 x (pituus /2) .Four viikkoa injektion jälkeen eläimet tapettiin.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SEM, ellei toisin mainita. Laitepari

t

testiä käytettiin testaamaan eroja Cry1 ilmaisun välillä Hyväksytty kasvain ja hyvänlaatuinen limakalvon. Tilastollinen merkitys

in vitro

tutkimuksissa analysoitiin käyttäen Studentin

t

-testi. Kaplan-Meier ja log-rank testit tasa eloonjääneiden käytettiin piirtää eloonjäämiskäyrien korkea verrattuna alhainen Cry1 IHC tulokset (kuten määritelty ROC käyrä). Kaikki

p

arvot olivat kaksipuolisia, ja

P

0,05 oli tasolla tilastollisesti merkitsevä. Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin SPSS ohjelmistopaketin, version 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Tulokset

Ominaisuudet potilaiden ja kasvaimia

Yhteensä 168 potilaasta, jotka saivat radikaali resektio tammikuun 1999 ja joulukuun 2005 aikana tutkittiin. Ominaisuudet kaikki potilaat on koottu taulukkoon 1. Keskimääräinen potilaan ikä oli 54,6 vuotta (SD, 14,3). Mediaani seuranta kesto oli 84 kuukautta (vaihteluväli, 4-146). Kahdeksankymmentä-viisi kasvaimet (50,6%) sijaitsi paksusuolessa. Kymmenen ulos 168 kasvaimet (6,0%) oli T1 tai T2. Yhdeksänkymmentäneljä kasvaimet olivat TNM I-II (56.0.0%). Mediaani määrä korjatun imusolmukkeiden oli 19 (vaihteluväli 0-48). Cry1 proteiinin ekspressiotasoja käytettiin immunohistokemiallista analyysia varten. Cry1 värjättiin pääasiassa sytoplasmassa ja ydin- alueilla soluja. Korkea Cry1-proteiinin ekspressiota havaittiin 101 näytettä (60,1%) ja heikko tai negatiivinen värjäytyminen havaittiin 67 tuumorinäytteessä (39,9%, kuvio 1).

edustaja immunohistokemiallinen kuvia paksusuolisyövän kudosnäytteiden osoittaa negatiivista tai heikosti havaittavissa Cry1 värjäys (A ja B); kohtalainen Cry1 värjäytymistä (C); ja vahva Cry1 värjäytymistä (D) on esitetty. Suurennus on × 200 (A, B, C ja D).

Cry1 on yli-ilmentynyt kolorektaalisyövässä kudoksissa

Cry1 mRNA ilmaisun kolorektaalisyövässä tutkittiin käyttäen RT- PCR; analyysit Cry1 mRNA teloitettiin kymmenen pareittain paksusuolisyövän näytteiden ja viereisen noncancerous kudosnäytteistä. Cry1 mRNA ilmentyi suuremmilla tasoilla kahdeksan paksusuolen syövän kudosnäytteet kuin viereisten noncancerous kudoksissa. Differentiaalinen korkea ilmentyminen vaihteli 1,1-kertaisesti 13,1-kertaiseksi (kuvio 2D). Yhdenmukainen Näiden tietojen Cry1 proteiini myös ylös säännelty kolorektaalisyövissä verrattuna sovitetun kontrolli kudosnäytteet (kuva 2A-C).

(A) edustaja kuva Cry1 värjäyksen peräsuolen syöpä kudoksiin on esitetty. (B) edustaja kuva Cry1 värjäystä vierekkäisissä noncancerous kudoksiin on esitetty. (C) Cry1 ekspressiotaso oli korkeampi kasvainkudoksissa verrattuna viereiseen kontrollikudoksen havaittuna immunoblottauksella (keskiarvo ± SEM, n = 109; * **,

P

0,001). (D) Keskimääräinen T /N suhde Cry1 mRNA: n ekspression pariksi peräsuolen syöpä (T) ja normalmucosa kudosten (N) kvantitoitiin qPCR ja normalisoitiin GAPDH. Virhepylväät edustavat standardipoikkeamaa keskiarvosta (SD) laskettiin kolme rinnakkaista kokeissa. Suurennus on × 200.

välisestä assosiaatiosta Cry1 ilmaisun ja kliinis muuttujien

yhdistys Cry1 ilmaisun ja kliinis muuttujia analysoitiin edelleen. Cry1 ilmaisun ja kaikki muut kliinis parametrit kahtia kahteen ryhmään. Tulokset on esitetty yhteenvetona taulukossa 1. oli merkittävä korrelaatio Cry1 ilmaisun ja sekä TNM (

p

= 0,003) ja imusolmukkeiden tila (

p

= 0,004).

Niistä 168 peräsuolen syövän potilaille, ei merkittävää korrelaatio löytyi Cry1 ilmaisun ja sukupuoli, ikä, sijainti ensisijainen massa, kasvaimen koko, kasvaimen erilaistumiseen laatu, histologinen tyyppi, Preoperatiivisen CA199 tai CEA tasolla (

p

0,05).

välisestä assosiaatiosta Cry1 ilmaisun ja selviytymisen

soveltaminen Cry1 ilmaisun ennustetyövälineenä merkkiaineena CRC potilaille tutkittiin myös. Lopussa seuranta-aikana (01 maaliskuu 2012), 32 potilasta oli kuollut peräsuolen syöpään liittyvien sairauksien. Viiden vuoden eloonjäämisaste DFS oli 74,7%, että Cry1 korkean ilmentymisen ryhmässä. Tämä osuus oli merkitsevästi alhaisempi kuin eloonjäämisaste (89,1%) heikosti ilmaisun ryhmä (

p

= 0,011). Samoin viiden vuoden eloonjäämisaste OS oli 77,6% vuonna Cry1 korkean ilmentymisen ryhmässä ja 92,3% matalan ilmaisun ryhmä (

p

= 0,010) (taulukko 2 ja kuva 3).

Kaplan-Meier-käyrät yhden muuttujan analyysi (log-rank) ja peräsuolen syövän potilaille, joilla on korkea Cry1 lauseke (n = 101) verrattuna alhainen tai olematon Cry1 lausekkeen kokonaiselinaikaa (n = 67) (A) ja taudista vapaan selviytyminen (n = 67) (B) on esitetty. Korkeampi ilmentymä Cry1 korreloi positiivisesti huono patientoutcomes.

Cry1 ilmentyy voimakkaasti useimmissa CRC solulinjojen

tutkimiseksi mahdollista roolia Cry1 että tuumorigeneesiin paksusuolen syöpä, ilmaus Cry1 mRNA: ta ja proteiinia, määritettiin viiden CRC solulinjojen (SW480, HT29, SW620, THC8307 ja HCT116), ja normaali paksusuolen epiteelin solulinjassa, FHC. Cry1 mRNA-ekspressio oli korkeintaan 10-kertaa suurempi ja peräsuolen syövän solulinjat kuin FHC soluissa (kuvio 4A). Cry1 proteiini ilmentyy suuresti peräsuolen syövän solulinjat ja vain heikosti ilmaistu FHC soluissa (kuvio 4B).

Expression of Cry1 mRNA: ta ja proteiinia paksusuolen syövän solulinjoissa (SW480, SW620, HT29, THC8307, ja HCT116) ja FHC tutkittiin qPCR (A) ja Western-blottauksella (B). Ekspressiotasot normalisoitiin GAPDH. Virhe palkit edustavat keskihajonta keskiarvosta (SD) laskettiin kolme rinnakkaista kokeissa *,

P

0,05.

Cry1 edistää kasvaimen kasvua ja lisääntymistä

Seuraavaksi tutkimme vaikutuksia Cry1 manipuloinnista (avulla voitto-of-function ja menettämisestä toiminto) proliferaatioon syöpäsoluja.

ulkoisesti yli-ilmennetään Cry1 että HCT116-soluissa, joilla on alempi endogeenisen ilmaisua. Vaikutus Cry1 on solujen lisääntymisen arvioitiin sitten käyttämällä MTT ja klonogeeniset määrityksissä. Tulokset osoittivat, että yli-ilmentyminen Cry1 voi edistää solujen lisääntymistä hetkellinen transfektio HCT116-solut (

p

0,001, Fig. 5B). Sitä vastoin, kontrolliryhmään ei ollut merkittävää vaikutusta solujen lisääntymistä. Pesäkkeiden muodostuminen määritykset osoittivat myös, että yli-ilmentyminen Cry1 lisännyt merkittävästi muodostuneiden pesäkkeiden määrästä sen jälkeen, kun 14 päivää viljelyn kontrolliin verrattuna soluihin (

p

= 0,033, Fig. 5C, D). Välinen yhteys Cry1 ja peräsuolen syövän solujen kasvua Lisäksi todettiin käyttäen pesäkkeiden muodostumisen määrityksiä jälkeen Cry1 knockdown. Kuten kuviossa 5E ja 5F, pudotus endogeenisen Cry1 ilmentymisen siRNA johti dramaattiseen inhibitioon kloonin muodostumisen SW480-soluja (

p

= 0,007) B

(A) Cry1 proteiinin tasot olivat yläreguloituja HCT116-soluissa ja vaimentua in SW480-soluissa. (B) MTT-määrityksiä HCT116-soluja 24, 48, ja 72 h transfektion jälkeen Cry1 tai GFP-ohjaus (***, p 0,001). (C-D) Pesäkkeenmuodostusta määritystä HCT116 transfektoitujen solujen Cry1 tai GFP ohjaus (*,

p

= 0,033). (E-F) estäminen SW480 solujen pesäkkeiden muodostumista kapasiteettia Cry1 siRNA suhteessa kontrolliin (**,

p

= 0,007). Kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa, ja edustavia tietoja on esitetty;

baareja

, SD. *,

P

0,05; **,

P

0,01, ***,

p

0,001.

Cry1 edistää themigration paksusuolisyövän soluja

Mitä Cry1 ilmentyminen liittyi imusolmuke asema, vaikutus Cry1 siirtyvien peräsuolen syövän soluja tutkittiin käyttämällä siirtokuoppaan määritys vaikutusten tutkimiseksi Cry1 yli-ilmentymisen tai poisto. Vuonna siirtokuoppaan määrityksissä, HCT116-solut transfektoitu Cry1 tai GFP-ohjaus plasmidit ympättiin kammioihin, ja niiden muuttopotentiaalia määritettiin 24 tuntia transfektion jälkeen. Analyysit osoittivat, että muuttoliike kapasiteetti HCT116-solujen yli-ilmentävät Cry1 kasvoi 112% kontrolliin verrattuna soluihin (

p

= 0,019, Fig. 6A).

(A) Migration määrityksissä HCT116-solut transfektoitu Cry1 tai GFP-ohjaus. (N = 3, *,

p

= 0,019) (B) Migration määrityksissä SW480-soluja, jotka on transfektoitu Cry1-siRNA: lla tai negatiivinen kontrolli. (N = 3, ***,

p

0,001). Edustavia kuvia yllä, ja keskimääräinen määrä kennoja kentässä ilmoitettuina ajankohtina on esitetty alla. Tiedot ovat keskiarvo kolmen erillisen kokeen.

Vahvistus että Cry1 edisti migraatio peräsuolen syövän solut arvioitiin transfektiota SW480-solujen Cry1-siRNA tai negatiivinen siRNA. 24 tunnin viljelyn jälkeen muuttoliike kapasiteetti knock-down Cry1 SW480-solujen määrä väheni 52,4% kontrolliin verrattuna soluihin (

p

0,001, Fig. 6B).

Cry1 edistänyt CRC kasvu

in vivo

tutkimiseksi edelleen onkogeenisiä ominaisuuksia Cry1

in vivo

rakensimme retrovirus vektori overexpressingCry1 ja perustettiin kaksi Pysyvien solulinjojen jotka olivat nimeltään ctrl-HCT116 ja Cry1-HCT116 (Fig. 7A). Nämä kaksi solulinjaa olivat injectedsubcutaneously osaksi paljaiden hiirien kylkiin. Syövän etenemistä tutkittiin ajan. At 4 viikkoa implantaation jälkeen, hiiret tapettiin, ja tuumorit poistettiin. Kuten shownin kuvio. 7B-C, tilavuus ja paino kasvaimia, jotka johtuvat injektion Cry1-HCT116-solut olivat huomattavasti suurempia ja raskaampia kuin peräisin ctrl-HCT116-soluissa. Takentogether nämä havainnot ovat sopusoinnussa

in vitro

tuloksia ja osoittavat, että Cry1 on kyky edistää CRC solujen kasvua

in vivo

.

(A): n ilmentyminen Cry1 oli merkittävästi lisääntynyt vakaa solulinjassa Cry1-HCT116 verrattuna ohjaus vakaa solulinjasta ctrl-HCT116. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. (B) edustaja kuviin kasvaimista peräisin Cry1-HCT116 tai ctrl-HCT116, ihonalaista ksenograftin elinsiirtojen nude-hiirissä (C) yli-ilmentyminen Cry1 edistää peräsuolen syövän kasvua. Kasvaimen solut injektoitiin subkutaanisesti nude-hiiriin. Hiiret tapettiin, kun 4 viikkoa, ja tilavuus kunkin kasvaimen mitattiin 4 päivän välein. Bars, ± SEM; *

P

0,05, **

p

= 0,01.

Keskustelu

Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus arvioimaan proteiinin ekspressiotasot Cry1 ihmisen peräsuolen syöpä. On selvää, Cry1 ilme oli suurempi syöpä- kudoksiin ja soluihin kuin normaaleissa kudoksissa ja soluissa. Tutkimme myös suhdetta ilmentymisen tasojen Cry1 ja hoitotuloksia ja kliinis. Tuloksemme viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen Cry1 geeni voisi olla hyödyllinen ennustaja imusolmuke etäpesäke, TNM ja huono tuloksia potilailla, joilla peräsuolen syöpä.

Useat aiemmat tutkimukset ovat verranneet ekspressiotasot Cry1 välillä syöpäkudoksessa ja viereisten normaali limakalvo. Eräässä tutkimuksessa havaittiin, että Cry1 ja muut vuorokausirytmin geenin (Cry2, Per2 ja BamlI) mRNA: n ilmentymisen tasot olivat samanlaiset paksusuolen syövän ja viereisen normaalin limakalvon [20]. Toisessa tutkimuksessa havaittiin, että mRNA: n ilmentymisen tasot Cry2 ja Per2 olivat alas säännelty peräsuolen syöpä. Tutkimuksessa todettiin myös korkeampia Cry1 ilmaisun kasvain limakalvon syöpien sijaitsevat distaalisen peräsuolen segmenteissä. Cry1mRNA tasot CRC kudoksissa olivat myös merkitsevästi yhteydessä potilaan ikä ja sukupuoli [21]. Ihmisen epiteelin munasarjasyöpä, Cry1 mRNA ekspressiotaso oli selvästi korkeampi syöpäkudokset kuin normaaleissa kudoksissa [22]. Meidän tulokset ovat osittain eri mieltä näistä tutkimuksista. Tutkimuksessamme Cry1 geenin proteiinin ekspressiotasot olivat korkeampia syöpäkudoksiin kuin viereisen noncancerous kudokseen. Samat tulokset löytyivät kolorektaalisyöpäkasvainsoluja ja normaalit solut, ja yli-ilmentyminen Cry1 havaittiin kasvun ja muuttoliikkeen kolorektaalisyöpäkasvainsoluja. Ei kuitenkaan ole merkittäviä korrelaatio löytyi Cry1 ilmaisun ja sukupuoli, ikä, sijainti ensisijainen massa, kasvaimen koko, kasvaimen erilaistumiseen laatu, histologinen tyyppi, ennen leikkausta CA199 tai CEA tasolla (

p

0,05). Nämä tulokset näyttävät olevan kohtuullisia seuraavasta syystä. Cry1 proteiinin ekspressiotasot voidaan ristiriitaisesti liittyvän mRNA ekspressiotasot näille ympäristötekijät. Kuitenkin proteiinien pelata tärkein rooli biologisia vaikutuksia, ja havaitsemme proteiinin ilmentymistä Cry1 CRC kudoksissa.

tutki myös suhteisiin Cry1 ilmaisutapoja kliinis ja hoitotuloksia. Cry1 proteiini tasot olivat merkitsevästi liittyvä AJCC /TNM (korkeimman tason havaittiin TNM vaiheissa III-IV) ja imusolmukemetastaaseja (korkeimman tason havaittiin positiivisen imusolmukkeiden). Vuorokausirytmin geenit ovat sekaantuneet solukierron säätelyssä [23]. Cry1 mutanttihiiret on kohonnut taso WEE1- monissa kudoksissa, mukaan lukien maksa. WEE1- kinaasi estää solunjakautumisen estämällä G2-M siirtyminen. Korkea Cry1 ilmentyminen voi estää kykyä WEE1-, jotka edistävät solujen proliferaatiota, mikä tarjoaa selviytymisen etu CRC [24] .Moreover, The Cry1 proteiinin tiedetään kompleksi adenylaattisyklaasia, ja yli-ilmentyminen Cry1 vähentää cAMP-tuotantoa vasteena PGE2, isoproterenoli, ja jopa suora adenylyylisyklaasi aktivaattori, forskoliini [25]. Tutkimuksissa on raportoitu, että korkeat pitoisuudet cAMP voi estää migraation ja etäpesäkkeiden ihmisen eturauhasen syöpäsolujen. PKA on proteiinikinaasi, joka liittyy cAMP signalointireitin. Tutkimukset ovat osoittaneet, että PKA inhiboi ja toiminta RhoA [26], [27]. RhoA on keskeinen jäsen Rho perheen pieniä GTP sitovien proteiinien ja välittää liittyvä signalointi cytoskeletal järjestely, muuttoliike, leviämisen ja geenien ilmentyminen [28], [29], [30]. Aikaisemmat tutkimukset ovat havainneet, että invasiivisen kasvun ja etäpesäkkeiden oli tukahdutettu eri syöpäsoluja (mukaan lukien CRC-solut), kun RhoA aktiivisuus estyi [26], [31]. Nykyinen havainnot viittaavat siihen, että Cry1-cAMP /PKA-RhoA välittämä reitin osallistuu maahanmuutto- ja etäpesäkkeiden CRC.

immuunivärjäysmenetelmällä tiedot yhtyvät näihin tutkimuksiin. Korkeampi TNM-luokitus ja läsnäolo imusolmuke etäpesäke merkittävästi korreloivat korkeampi Cry1 ilmentymisen, mikä viittaa siihen, että Cry1 voidaan käyttää markkerina määrittämiseksi etenemistä CRC.