Krooninen sairaus

tiivistelmä

Prekliiniset terapeuttinen arviointi varassa kasvureaktio vahvistettu ihmisen solulinjojen ksenosiirrettyjä osaksi immuunipuolustus hiiriin, strategiaa, joka ei yleensä ole ennustettavissa kliinisen tuloksia. Immunokompetenteille geneettisesti hiiri (GEM) -johdannainen kasvain siirteen mallit tarjoavat erittäin taipuisa prekliinisissä vaihtoehtoja ja analysoinnin helpottamiseksi kliinisesti lupaavaa immunomoduloivat aineita. Tulostuva toimittajat ovat välttämättömiä Tarkkaan kasvaimen kasvua ja vasteen, erityisesti etäpesäkkeitä. Valitettavasti toimittajat kuten lusiferaasi ja GFP ovat vieraita antigeenejä immunokompetenteilla hiirillä, mahdollisesti haittaa kasvaimen kasvua ja häiritsevien terapeuttisen vaikutuksen. Täällä arvioineet reportteri-siedätetyiksi helmet kuin saaneilla kohdentamalla minimaalinen ilmaus lusiferaasi-GFP fuusio toimittaja, etummainen aivolisäkkeen (puhuttu ”Glowing Head” tai GH hiiri). Lusiferaasi-GFP toimittaja ilmaistuna kasvainsoluissa aiheutti haitallisia immuunivasteita villityypin hiiren, mutta ei GH hiiren, kuten elinsiirron isännät. Antigeenisyys optisen toimittajat pienensi sekä kasvun ja metastaattisen potentiaalin leimatun kasvaimen villityypin hiirissä verrattuna GH hiirillä. Lisäksi toimittaja ilmaisu voi myös muuttaa kasvaimen vaste kemoterapiaa tai täsmähoitoihin on kontekstisidonnaisia ​​tavalla. Täten GH hiiret ja kokeellisten lähestymistapojen seulottu tässä tarjota konseptin validointi ja strategia tehokkaan, toistettavissa prekliininen arviointi kasvun ja vasteen kinetiikka jäljitettävissä kasvaimia.

Citation: Päivä CP, Carter J, Ohler ZW, Bonomi C, el Meskini R, Martin P, et ai. (2014) ”Hohtava Head” Hiiret: geneettinen työkalu mahdollistavat luotettavan Prekliiniset Image-Based arviointi Syövät immunokompetenteilla Allotranplantaatit. PLoS ONE 9 (11): e109956. doi: 10,1371 /journal.pone.0109956

Editor: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 29 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 09 syyskuu 2014; Julkaistu: 04 marraskuu 2014

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Data Saatavuus: Kirjoittajat vahvistaa, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä projekti on rahoitettu kokonaan tai osittain liittovaltion varoja National Cancer Institute, National Institutes of Health, alle sopimuksessa nro HHSN261200800001E . Tätä työtä tukivat osittain Developmental Therapeutics Program Division of Cancer Treatment and Diagnosis ja Intramural tutkimusohjelma Center for Cancer Research, NCI, NIH. Leidos Biomedical Research Inc. tuettiin muodossa palkkojen tekijöille John Carter, Zoe Weaver-Ohler, Carrie Bonomi, Rajaa El Meskini, Philip Martin, Cari Graff-Cherry, ja Lionel Feigenbaum, mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Erityinen roolit nämä kirjoittajat ovat muotoutuneet ”kirjoittaja maksujen osiossa.

Kilpailevat edut: Muut tekijät John Carter, Zoe Weaver-Ohler, Carrie Bonomi, Rajaa El Meskini, Philip Martin, Cari Graff-Cherry Lionel Feigenbaum työskentelee Leidos Biomedical Research Inc. Leidos Biomedical Research Inc., on omistettu yhden sopimuksen käyttämään Frederick National Laboratory for Cancer Research (FNLCR), liittovaltion rahoittama tutkimus-ja kehittämiskeskus. Se ei ole osallisena missään työtä, konsultointi, patentit, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteet jne liittyvät tähän tutkimukseen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Keskimääräinen lääkeaineen kehittämä suurten lääkeyhtiöiden on arvioitu maksavan välillä 4 ja 11 miljardia dollaria [1], joka maksaa keskimäärin syöpäpotilaan noin $ 100,000 vuodessa. Nämä huikeat kustannukset johtuen osittain kyvyttömyyteen aikaisin kehityshäiriöitä putki tunnistaa luotettavasti lääkkeitä, jotka ovat tehokkaita, ja yleinen hyväksyntä korko Syöpätauteihin yhdiste on tällä hetkellä noin 5% [2]. Suuri osa tästä epäonnistumisesta johtuu riittämättömyyden prekliinisissä käyttää terapeuttisissa arvioinnissa. Historiallisesti prekliiniset eläinkokeet ovat hyödynnetty vuosikymmeniä vanha perustettu ihmissolulinjat, istutetut kuten ksenografteissa ihonalaisesti immuunipuolustus hiiriin [3]. Valitettavasti nämä mallit ovat olleet rajoitettu tehoa-ennustearvo lääkekehityksen, mutta on katsottu kriittinen parantamiseksi lääke- tuottavuuden ja potilaiden hoidon [4].

Ikärajapassin prekliinisen syövän tutkimuksiin liittyy tarkoituksenmukaisuus eläinmallissa itse. Paramount on läsnäolo täysin toimiva immuunijärjestelmä, joka on mukana lähes jokaisessa vaiheessa sairauksien kehittymisestä, ja kriittisesti määrittää hoitovasteita [5]. Kasvainsolut ovat vuorovaikutuksessa rakenteellisesti ja dynaamisesti immuunijärjestelmän ja muiden microenvironmental soluihin koko aikana metastasointiin ja myös seuraava terapeuttinen intervention [6]. Tämä vuorovaikutus on asianmukaisesti mallinnettu sekä kotoperäiset geneettisesti hiiri (GEM) syöpä malleja ja potilaalle tehdä elinsiirron GEM johdettujen allotransplantaatteja (GDA) otetaan täysin immunokompetenttien hiirten [7], mutta ei tehokkaasti nykyisessä ihmisen syövän ksenograftimalleissa. Lopuksi, terapeuttinen ja biologisten merkkiaineiden arvioinnin tulisi mieluiten luottaa prekliinisissä syövän malleissa pääpiirteittäin

luonnossa esiintyviä

etäpesäke, tappavin syöpä vaihe.

taipuisa prekliinisissä edellyttävät kykyä valvoa tarkasti taudin etenemistä ja hoitovaste , helpottavia kliiniset päätepisteiden [8]. Tautien valvonta on välttämätöntä etäpesäkkeitä ja muuten huomaamaton kasvaimia. Optisen kuvantamisen ekspressoivien solujen valoa tuottavien proteiinien hetkellä hallitsee Seurantateknologioiden johtuen niiden kyvystä mitata reaaliaikaisesti tapahtumiin, kustannustehokkuutta ja aika-tehokkuus [9]. Kuitenkin useimmat jäljitettävissä markkeriproteiinien, mukaan lukien suosittu tulikärpäsen lusiferaasi (ffLuc) ja meduusat tehostetun vihreän fluoresoivan proteiinin (eGFP), ovat elimistölle vieraita nisäkkäisiin. Niiden ilme luonnollisesti indusoi eri immuunivasteita immunokompetenteilla eläimillä, jolloin ristiriidassa toimintaa [10], [11], hylkääminen köynnöksen [12] ja tukahduttaminen metastaattisen aktiivisuuden [13], sekoittavat pätevyyttä prekliinisen johtopäätöksiä. Siten tehokasta käyttöä xenobiotic Toimittajat rajoittuu joko lyhyen aikavälin tutkimuksia, tai täysin immuunipuutteisilla eläinmalleissa, rajoittamalla prekliinisen vaihtoehtoja [9], [13].

Näiden ongelmien voittamiseksi, olemme kehittäneet GEM malli, joka on immuuni sietävä sekä ffLuc ja eGFP toimimaan isäntänä elinsiirtoon leimatun syngeenisten kasvaimia. Käyttäen rotan kasvuhormonin (rGH) promoottori, ilmentymisen ffLuc-eGFP fuusioproteiinia suunnattu aivolisäkkeen, ei-immuuni etuoikeutettu kaukana yleisesti seurataan elimiä prekliinisissä tutkimuksissa, mikä luo ”Glowing Head” (GH) hiiren [14]. Osoitamme, että villityypin hiirillä immuunivasteiden aiheuttama xenobiotic Toimittajat vaikuttaa merkittävästi etenemisen ja terapeuttisen vasteet kuvannettavan siirrettyjen kasvainten. Tärkeää on, että käyttämällä ennalta siedätetyiksi GH hiirillä minimoi tai eliminoi nämä poikkeamia, mikä lisää luotettava, mukautuva prekliinisissä.

Materiaalit ja menetelmät

lentivirusvektoreita

Lentivirusvektorit vektori, joka ilmentää tulikärpäsen lusiferaasi-tehostetun vihreän fluoresoivan proteiinin fuusioproteiinia (FerH-ffLuc-eGFP) on kuvattu aiemmin [10]. Se oli täällä muokattu poistamaan eGFP ja aseta sisäinen ribosomin sitoutumiskohta (IRES) ja histoni H2B–tagged eGFP (H2B-eGFP) tuottaa FerH-ffLuc-IRES-H2B-eGFP, joka kohdistuu ilmaus ffLuc ja eGFP että sytoplasmassa ja tumassa, vastaavasti. Yksityiskohtaiset tiedot vektorista sekvenssi annetaan pyynnöstä Dr. Dominic Esposito (sähköposti: [email protected]), Leidos Biomedical Research, Frederick, MD, Yhdysvallat.

Eläimet

vähentää bioluminenssina imeytymistä ja kokeellinen variaatio, albiino 6- 8 viikon ikäisiä sisäsiittoisia nainen hiiriä C57BL /6 (C57BL /6

c-lev /c-lev /Cr) tai FVB /N tausta käytettiin isäntinä elinsiirron tutkimuksiin. F1 hiiriä jalostukseen C57BL /6 129 (B6; 129) hiiriä käytettiin isogeenisiin isännät tutkimuksessa sääntelyviranomaisten

Q61K /p19

ARF-null melanooma, joka oli peräisin sekoitettu geneettistä taustaa [ ,,,0],15], [16]. Kaikki käytetyt eläimet Tässä tutkimushankkeessa hoidettiin ja käytettyjen inhimillisesti mukaisesti seuraavien politiikat: US Public Health Service valiokunnalle inhimillinen hoito ja käyttö Animals (1996); oppaasta Care ja käyttö Laboratory Animals (1996); ja Yhdysvaltain hallituksen periaatteet hyödyntäminen ja hoito käytettäviä selkärankaisia ​​Testing, Research, and Training (1985). Kaikki hiiri kokeet suoritettiin tiukasti mukaisesti Animal Study pöytäkirjat hyväksymän Animal Care ja Käytä komitea (ACUC), NCI, klo Frederick National Laboratory for Cancer Research, joka on akkreditoitu AAALACi ja seuraa Public Health Service valiokunnalle Care ja koe-eläinten käytön. Seuraavat pöytäkirjat hyväksynyt ACUC suorittamiseksi tämän tutkimuksen: ASP # 08-084, 11-044 ja 11-058.

Tässä tutkimuksessa hiirille tapettiin CO2 tukehtumisen seuraavat NCI-hyväksytty ACUC suuntaviivat : (1) Siirretään hiirten CO2 kammioon juuri ennen eutanasiaa. (2) Kytke CO2 2 litraa minuutissa standardin kokoinen kammion. (3) sisällä noin kaksi-kolme minuuttia, aikuisen hiiren pitäisi olla liikkumaton ja välinpitämättömiä; kun tämä on ilmeistä, virtausnopeuden lisäämiseksi korkea eli noin 10 litraa /min. (4) Kun hengitys lakkaa kaikille eläimille läpi nähtävissä häkin, aseta ajastin 2 minuuttia. Lopussa kaksi minuuttia, hiiret voidaan poistaa CO2-täytetty häkki. Varmista kuolema varmistamalla ei ole liikkeitä minkäänlaista vielä 60 sekuntia ulkopuolella CO2-täynnä häkki, ajastimen avulla.

Generation että ”Glowing Head” mouse

rGH -hGH rakentaa [17] (lahja Dr. Rhonda Kineman, University of Illinois-Chicago, Chicago, IL) modifioitiin insertoimalla ffLuc-eGFP-fuusiogeenin tuottaa aivolisäkkeen etulohkon kohdistaminen vektori, jota käytettiin tuottamaan siirtogeenisiä hiiriä sekä C57BL /6 ja FVB /N geneettinen taustoja alkiorakkulaan mikroinjektio. Pieniä yhdyskuntia Homotsygoottisen siirtogeenisiä hiiriä pidettiin jalostustarkoituksiin, ja niiden heterotsygoottinen jälkeläisten käytetään kaikissa prekliinisissä tutkimuksissa. Kaikki siirtogeeniset ja jalostukseen Teos kautta Laboratory Animal Science Program, Frederick National Laboratory.

Hiiren kasvaimia, syöpäsolun linjat, ja niiden merkinnät

Lewisin keuhkokarsinooma (LLC) kudos oli ylläpidetään vain

in vivo

koska sen johtaminen alkuperäisestä keuhkojen kasvain C57BL /6-hiirten [8]. Spontaanisti metastasizing sarja HGF-tg /CDK4

R 24c melanoomaihosyöpien siirtoleikkauksen synnytettiin ensisijainen melanooma indusoituu HGF-tg /CDK4

R 24c C57BL /6-hiirissä epikutaaninen soveltaminen karsinogeeni DMBA [18]. HGF-tg /CDKN2A

– /- melanooma tuumoreista saatuja indusoi HGF-tg /CDKN2A

– /- FVB hiiret UV-säteilyllä [19]. Nämä kasvaimet pidettiin vain hiirissä. Siirtoa varten, korjatun kasvaimen kudokset jaettiin 3 mm x 3 mm: n paloiksi ja kukin insertoitiin 5 mm leikata ihon hiirtä. Mvt-1 hiiren rintasyövän soluja, jotka ovat peräisin rintarauhasen kasvaimet MMTV-c-Myc /MMTV-VEGF bi-siirtogeenisen hiiren koskevasta FVB /N sisäsiittoinen tausta [20]. Ne perustettiin solulinja ja ylläpidetään in vitro kulttuuria. Siirtämiseen, 1,0 x 10

6 solua valmistettiin kulttuurin ja ruiskutetaan nahansisäisesti hiiri. Mutant sääntelyviranomaisten

Q61K /p19

ARF-null melanoomasoluja muodostettiin kuvatulla [15], [16]. Ensimmäisen kanavan, 1,0 x 106 solua in vitro -viljelyn ympättiin C57BL /6×129 F1-hiirten muodostamiseksi kasvaimia. Seuraavissa kohdissa, fragmentit erotettu korjatuista kasvaimen käytettiin siirtoa varten, kuten edellä on kuvattu.

tunnisteella

in vivo

yllä kasvaimia, solususpensiot valmistettiin

in vivo

-expanded kasvaimia tartutettiin

ex vivo

kanssa lentiviruksen by

ex vivo

spinokulaatiolla [10], [21]. LLC kudos infektoitiin lentivirus koodaus ffLuc-eGFP tai ffLuc-IRES-H2B-eGFP ja alistetaan sitten

in vivo

pyöräily saada tasaisesti leimattu kasvaimia, kuten aiemmin on kuvattu [8]. Solulinjoja leimattiin ffLuc-eGFP lentivirus

in vitro

, ja eGFP

+ populaatiot eristettiin käyttäen fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelija (FACS).

Prekliiniset tutkimukset ja patologinen analyysi

prekliinisissä tutkimuksissa kylmäteknisesti säilynyt leimattu kasvain heräsi ja laajennettiin ihonalaisena elinsiirron hiiriin. Nämä kasvaimet resekoitiin saavuttaessaan 500 mm

3 ja laajentunut kulkuväylää tarvittava määrä hiirien todellinen tutkimusten kuvattu tekstissä. Kasvaimen koko mitattiin manuaalisesti ja laskea V (mm

3) = 0,5 x L x W

2, jossa L on pituus ja W on leveys mm. Prekliinisten mallinnus primaarikasvainten, hiiret jaettiin satunnaisesti ryhmiin tukeva rakenne, kun niiden kasvaimet saavuttivat 125 mm

3. Kontrolliryhmä sai vehikkeliliuosta, ja koeryhmä sai hoitoja kemoterapeuttisten aineiden kanssa. Annos ja aikataulu kussakin kokeessa on määritelty tulokset. Kun kasvaimet kasvoivat 2000 mm

3, hiiret olivat saavuttaneet päätepisteitä ja tapettiin jatkotutkimusta varten.

kokeellisissa malleissa spontaanien etäpesäkkeiden, primaarikasvainten poistettiin kirurgisesti saavuttaessaan 500 mm

3, ja hiiret satunnaistetaan tutkimuksen mukaan suunnitteluun. Etäpesäke ja toistumisen seurattiin ajoittain kuvantamisen avulla Xenogen IVIS järjestelmä [8] mitata BL flux (fotoni /sec /radial astetta). Kontrolliryhmä sai vehikkeliliuosta, ja koeryhmä sai hoitoja kemoterapeuttisten aineiden kanssa. Annos ja aikataulu kussakin kokeessa on määritelty tulokset. Kun hiiret osoittivat sairastavuuden määrittelemän eläimen tutkimussuunnitelman (esim lyhyt breathiness, vaikeuksia liikkuvat), he saavuttivat päätepisteen ja tapettiin jatkotutkimusta varten.

Lääkkeet Tässä tutkimuksessa käytetyt saatiin Drug Synthesis Kemian Branch, DTP, NCI (Bethesda, MD). Paklitakseli liuotettiin 10x haluttuun pitoisuuteen 100% etanolia, laimennettiin yhtä suurella tilavuudella Cremaphor EL ja laimennettiin sitten 1x pitoisuus suolaliuoksella ennen suonensisäistä injektiota hiiriin. Gemsitabiini liuotettiin veteen ja ruiskutettiin vatsakalvonsisäisesti hiiriin. Crizotinib suspensoitiin uudelleen 0,5% metyyliselluloosaa 0,9% suolaliuosta, ja kerran vuorokaudessa suun kautta letkulla (PO) yli 3 viikon jakson aikana 10 ml /kg. Hiiriä, joissa on ihon alle kasvaimien satunnaistettiin 3 ryhmään, joka perustuu kasvaimen mittauksen (200-500 mm

3), ja käsiteltiin vehikkelillä, crizotinib 50 mg /kg, tai Crizotinib 100 mg /kg.

korjattu kudokset kiinnitettiin 10% formaldehydiä ja parafinoidut. Vieressä sarja leikkeet värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05. Keskimääräinen elinaika laskettiin pienin selviytymisen aikaa, jona perhe toiminto saavutti 50%. Laskelmat tehtiin kanssa GraphPad Prism 6 (La Jolla, CA).

Tulokset

Reporter aktiivisuutta ffLuc-eGFP-leimattu hiiren kasvaimia on epäjohdonmukainen immunokompetenteilla hiirissä

ihonalaisesti Lewisin keuhkokarsinooma (LLC) on hyvin tunnettu metastaattinen malli, joka on hiljattain hyödynnetty useissa korkean profiilin prekliinisissä tutkimuksissa [22] – [24]. Olemme äskettäin haettu arkistoitu LLC kudosta koskaan mukautettu soluviljelmissä, ja osoitti, että transplantaation jälkeen ja resektion etäpesäkkeitä tapahtui hyvin lyhyt latenssi 90% Syngeenisten WT C57BL /6 hiirten [8]. Täällä leimattu LLC kanssa ffLuc-eGFP-koodattuja lentivirus

ex vivo

[10]. Koska virustransduktio tuloksia heterogeeninen solupopulaatio [25], asetamme tämä merkitty kasvaimen

in vivo

pyöräily, että ne tasaisesti leimattu [8], [26]. Lyhyesti, hiirillä siirrettyjen kasvainten tarkkaillaan etäpesäke, ja etäpesäkenystyröiden tullaan korjaamaan ihonalaisen elinsiirtojen aloittaa seuraavan kierroksen. Koska kukin kyhmy oli peräisin yksittäisestä solusta, kasvain on peräisin se on oletettavasti klonaalinen. Siksi homogeenisuus paranee läpi jokaisen jakson. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, seuraava ihonalaisesti elinsiirron ja resektio leimatun LLC viidessä hiirillä, jotka johtuvat etäpesäkkeitä oli helppo havaita

in vivo

bioluminenssina (BL) kuvantaminen. Tässä kohdassa, vaikka kasvaimet kasvoivat kaikissa isännät, etäpesäkkeitä havaittiin vain yhdessä (# 160 kuvassa. 1A, alempi paneeli). Me korjattu keuhkoja että hiiren ja tutkitaan sen

ex vivo

kuvantaminen (Fig. 1 B, ylempi paneeli). Epätasaisesti jakautunut BL intensiteetti heijastuneen heterogeenisyys transdusoitujen solujen primaarikasvaimen (Fig. 1 B, ylempi paneeli). Me kerätty hiirten kolmen yksittäisen hyvin merkitty keuhkometastaaseista, oletetaan olevan klonaalisia, jakamalla ne viiteen palasia siirrettäväksi viisi C57BL /6-hiiristä. Leimatun keuhkonoduluksia kuin hiiren kerättiin ja istutetaan vielä viisi C57BL /6-hiirten; kuitenkin, nämä kasvaimet sitten kasvoi hyvin hitaasti ja /tai ei esiintynyt havaittavaa reportterin aktiivisuutta (Fig. 1 B). Nämä tulokset osoittavat, että toimittaja aktiivisuus leimattuja soluja ei voitu johdonmukaisesti säilyy kohtia syngeenisissä immunokompetenteilla hiirillä jälkeenkin kloonivalinnan.

, hiiren Lewisin keuhkokarsinooma (LLC) solut infektoitiin ffLuc-eGFP ilmentävien lentivirukselle

ex vivo

, ja ihonalaisesti viiteen syngeneeisissä albiino C57BL /6 (c-BRD) hiiriä (# 160-164). Reportteri aktiivisuutta tarkkailtiin BL kuvantaminen ihonalaisen kasvaimen kasvua (runko) ja keuhkojen etäpesäkkeiden (rinta). 15. päivänä istutuksen jälkeen, metastaattinen BL-signaali havaittiin yhdessä hiiriä (# 160 alapaneeli). B, Keuhkot kerättiin # 160, ja yksi hehkuva metastaattinen kyhmy valittu

ex vivo

kuvantaminen (ylempi paneeli) transplantoitiin viiteen c-BRD hiiristä toisen kanavan. Imaging tulokset osoittivat, että toimittaja toiminta ei voitu johdonmukaisesti ylläpitää tuloksena ilmeni selvänä kasvaimet (alempi kuva).

onko toimittaja johdonmukaisuus riippui kasvaimen tyyppi, laajensimme analyysi hiiren melanooma. Sääntelyviranomaisten

Q61K transformoitujen, p19

ARF-puutosta melanocytic solulinjassa [15], [16] leimattiin käyttäen ffLuc-eGFP lentivirus ja istutetaan ihonalaisesti syngeenisiin immunokompetenteille hiiriin. Sen jälkeen resektio yksi korkean BL keuhkokasvaimen valittiin ihonalaisen siirrettäväksi kaksi hiirtä (Fig. S1A, vasen paneeli). Molemmat kasvaimia esiintyi merkittävä väheneminen normalisoitu BL toiminnan aikana ihonalaisen kasvua (Fig. S1A, oikea paneeli). Me tukevat näitä tuloksia kahdessa muissa malleissa. Melanoomasoluja korjattu suoraan HGF-siirtogeenisiä /CDKN2A-pudotuspelit FVB /N hiiri transdusoitiin kanssa ffLuc-eGFP geeni

ex vivo

, ja istutetaan ihonalaisesti syngeenisiin FVB /N hiirillä. Vaikka kaikki kasvaimet kasvoivat, BL intensiteetti joko vähentää tai lisätä hitaammin (kuvio. S1B), ja BL intensiteetti /koon suhteen, toimii merkinnöistä säilyttäminen indikaattori, pieneni kolmessa viidestä kasvaimia. Toisessa mallissa, ffLuc-eGFP ilmentävien hiiren MVT-1 rintasyövän soluja istutetaan ortotooppisesti utarerasvaa tyynyt Syngeenisten FVB /N hiirillä osoittivat myös huono retentio BL signalointi (katso alla). Voimme päätellä, että ffLuc-eGFP ilmentyminen allotransplantaatteja immunokompetenteilla villityypin (WT) hiirillä on epäyhtenäisesti ylläpidetään hiiressä ja /tai kohtia, riippumatta kasvaimen tyyppi, geneettinen tausta tai elinsiirron päällä.

Generation of GEM mallin immunologisesti sietävä GFP ja lusiferaasi toimittajille

tulokset viittasivat siihen, että immunogeenisuutta xenobiotic reportterigeeni tuotteita on pitkälti vastuussa epäjohdonmukaisuus yhteydessä täysin toimiva immuunijärjestelmä. Voit kiertää tämän ongelman, me syntyy C57BL /6- ja FVB /N-pohjainen GEM malleihin tunnustaa ffLuc ja eGFP proteiinit itse. Sen korkea spesifisyys, rGH geenisekvenssien [17] (Fig. 2A) oli kohdistaa ekspression ffLuc-eGFP fuusio geenin etummaisen aivolisäkkeen hiiren, jolloin vältetään häiritsevä signaloinnin yleisimmistä metastaasien.

, rakenne-ekspressiovektorin sukupolven hehkuva Head (GH) siirtogeeniset hiiret. Expression of a tulikärpäsen lusiferaasi-eGFP-fuusiogeenin (ffLuc-eGFP) oli suunnattu hiiren aivolisäkkeen etulohkon käyttäen rotan kasvuhormonin promoottori (rGH) ja ihmisen kasvuhormonia geenisekvenssien, jotka sisältävät polyadenylylation päällä (hGHpA)

20. B, Optical ekspressiokuviota siirtogeenin GH hiirillä visualisoituina BL kuvantaminen. Toimittaja aktiivisuutta havaittiin aivolisäkkeen etulohkon molempien sukupuolten ja kivekset uroshiirten. C, Seerumin kasvuhormonin samanikäisiin GH hiiriä ja villityypin (WT) c-BRD hiirten arvioitiin ELISA (keskiarvo ± SE). Verta vedettiin samaan aikaan päivästä. Mitään merkittäviä eroja verenkierrossa kasvuhormonin tasojen GH ja WT hiirillä havaittiin. D, ffLuc-eGFP-leimattua LLC kasvaimia ihon alle istutetaan WT, GH, ja NOD-SCID-hiirissä. Verta vedettiin valmistamiseksi seerumista, kun kasvaimet saavuttivat 500 mm

3, ja seerumin anti-GFP-vasta-aine analysoitiin ELISA: lla. Tasot anti-GFP-vasta WT hiiret ovat huomattavasti korkeammat kuin GH ja NOD-SCID-hiirten (p 0,005), mutta ei eroa välillä havaittiin kuin GH ja NOD-SCID-hiirten (p = 0,19). Seerumit terveiltä hiiristä ilman kasvaimen siirron toimivat vertailuryhmänä määritellä nollapisteeseen.

etummaisen aivolisäkkeen ei ole immuuni-etuoikeutetun ja on siten osa verenkierrosta [27]. Siirtogeenin koodaaman ffLuc ja eGFP proteiinit ilmaistu etummaisen aivolisäkkeen alkionkehityksen aikana siksi osallistua valintaan T- ja B-solujen ja kirjataan self-antigeenejä, jolloin niiden tolerisaation. Vähentää valon adsorptiota pigmentti ffLuc-eGFP siirtogeenin oli kasvatettu osaksi albiino C57BL /6F (c-BRD) tausta. Kantaisälinjasta valittiin kunkin kanta, joka osoitti Mendelin transgeenin perintö- ja normaali hedelmällisyyden. Aiemmissa tutkimuksessa tunnistimme määritysrajan BL signaalin in vivo hiiren kuvantaminen oli 1,5 x 10

5 fotoni /sec /rad [8]. Vältetään mahdolliset vaikuttavat sekoittavat liittyy korkea ilmentymistä, ne kantaisälinjasta joilla pieni mutta johdonmukainen BL signaali yli taustan käsittelyssä (noin 2-6 x 10

5 fotoni /sec /rad) valittiin (Fig. S2A). Yhdenmukainen kohdistus raportoitu rGH promoottori [17], BL signaali näkyi pään ja kivekset siirtogeenisten linjojen (Fig. 2B); vaatimaton signaali voitiin havaita myös kilpirauhasessa, mutta vain käyttämällä

ex vivo

kuvantaminen (ei esitetty). BL elimistössä GH hiiret ovat lähellä näiden WT hiirillä, mikä osoittaa korkea spesifisyys siirtogeenin (Fig. S2B). Perustuen paikalle toimittaja aktiivisuuden ja rGH promoottoria käytetään kohdistukseen nämä helmet olivat puhuttu ”Hohtava Head” (GH) hiirillä.

mahdollisia vaikutuksia Transgeeniekspression aivolisäkkeen toiminto arvioitiin vertaamalla kiertävän kasvuhormonin tasot GH ja WT C57BL /6-hiiristä. Huomasimme, että seerumin kasvuhormonin tasot eivät olleet merkittävästi erilaiset välillä siirtogeenisiä ja WT (Fig. 2C), sukupuolesta riippumatta, mikä osoittaa, että ilmaus ffLuc-eGFP siirtogeenin ei avoimesti vaikuta aivolisäkkeen etulohkon toimintoa GH hiirillä.

arvioimiseksi immunologisia seurauksia reportterin ilmentymisen, solujen ffLuc-eGFP-leimattua LLC kasvaimet istutettiin subkutaanisesti GH ja WT C57BL /6-hiiret, sekä MHC-verraton immuunipuutteisilla ei-lihavilla diabeettisen /vaikea sekamuotoinen immuunivajavuus (NOD /SCID) hiiriin (BALB /c-taustalla). Kun kasvaimet olivat saavuttaneet 500 mm

3 verta vedettiin ja seerumit testattiin läsnäolo anti-GFP-vasta. Kun kasvain WT hiirillä hallussaan merkittäviä määriä verenkierrossa anti-GFP-vasta-ainetta (Fig. 2D ja kuvio. S2C), ei havaittu merkittävää eroa välillä kasvain GH ja NOD-SCID-hiirissä, joka on tunnettu epäpätevä tuottaa vasta-ainetta (kuvio . S2C). Nämä tiedot osoittavat, että vaikka immunogeeninen WT hiirillä, ffLuc-eGFP on siedetty ja kirjataan itse GH hiirillä.

kasvu ja etäpesäkkeiden ilmentävien kasvainsolujen tulostuva xenobiotic toimittajille muutellaan WT ja NOD /SCID-hiiriin verrattuna GH hiiret

Voit testata toimintaa GH hiiriä, me istutettu ffLuc-EGFP-leimatun kasvaimet ihon alle syngeenisiin WT ja GH hiirillä. Vaikka kasvaimen koko kasvoi vastaavasti molemmissa hiirten, BL nousu kasvaimet olivat merkittävästi viivästyneet WT-hiirissä verrattuna GH-hiiriä (kuvio. S3A). Tämä tulos viittaa siihen, että käyttämällä GH hiirten saaneilla voitaisiin korjata epäjohdonmukaisuuksia havaittu BL signaaleja merkitty kasvaimista istutetaan immunokompetenteille hiiriin. Validoida Tässä vaiheessa testasimme GH hiiri suuremmassa mittakaavassa tutkimuksessa, johon osallistui sekä primaarikasvaimen ja etäpesäke. Metastaattinen MVT-1 rintasyövän solujen [20], [28] oli transdusoitiin ffLuc-eGFP lentivirus ja siirrettyjen ortotooppisesti utarerasvaa tyynyjä GH tai WT syngeenisen FVB /N saajahiiret. Leimattu MVT-1-solut osoittivat merkittävää parannusta BL signaloinnin, kun istutetaan GH hiirillä vs. WT, joka ei säilyttää signalointi (Fig. 3A ja korkeampi paneelit kuvion. S4A).