Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi suurin kuolleisuutta Yhdysvaltain väestöstä. Mukaan viimeisimmän käsite Karsinogeneesin ihmisen kasvaimissa on järjestetty hierarkisesti, ja sen päälle on käytössä pahanlaatuisia kantasolut (syöpä kantasolut, CSCS tai syöpään aloittamista solujen, CIC), joilla rajoittamaton itseuudistumisen ja kasvaimen -initiating valmiuksia ja kestää hyvin perinteisiin hoitoihin. Heijastaa monimutkaisuus ja monimuotoisuus ihmisen kasvaimissa ja antaa kliinisesti ja fysiologisesti relevantti syöpä malleja, suuret pankit tunnettu potilaasta peräisin matalan passage solulinjoissa, ja erityisesti CIC-rikastettu solulinjat, tarvitaan kiireellisesti.

Keskeiset havainnot

Kirjoittajat raportoivat, että perustetaan uusi CIC-rikastettu, erittäin tuumorigeenisemmiksi ja klonogeeniset koolonisyöpäsolulinja, CR4, peräisin maksasta etäpesäke. Tämä stabiili solulinja perustettiin yhdistämällä 3D viljelemällä ja 2D viljelemällä kantasolujen media, subkloonauksessa solujen määrättyyn muotoon, rinnakkaisviljelemällä syöpäliitteinen fibroblasteja (valuuttalisiin) ja sarja siirrettäväksi NOD /SCID-hiiriin. Käyttäen RNA-sekvenssi täydellinen transcriptome profilointi kasvaimia osa CR4 solujen verrattuna irtotavarana kasvainsolujen, olemme tunnistaneet noin 360 ekspressoituu differentiaalisesti selostukset, joista monet ovat stemness, pluripotenssia ja kestävyys hoitoon. Suurin osa vakiintunut CR4 solut ilmentävät yhteistä merkkiaineita stemness, kuten CD133, CD44, CD166, EpCAM, CD24 ja Lgr5. Käyttäen immunosolukemiallisten, FACS ja western blot-analyysit, olemme osoittaneet, että merkittävä suhde CR4 solut ilmentävät keskeinen markkereita pluripotenttisuuden markkereita, mukaan lukien Sox-2, Oct3 /4, ja c-Myc. Konstitutiivinen yliaktivoituvan ABC kuljettajat ja NF-kB ja puuttuminen tuumorisuppressoreita p53 ja p21 voi osittain selittää poikkeuksellisen lääkeresistenssin että CR4 solujen.

Johtopäätökset

erittäin tuumorigeenisemmiksi ja klonogeeniset CIC-rikastettu CR4 solulinja voi tarjota tärkeä uusi väline, jolla tuetaan löytö uusien diagnostisten ja /tai prognostisia biomarkkerit sekä kehittämään tehokkaampia hoitostrategioita.

Citation: Rowehl RA, Burke S, Bialkowska AB, Pettet DW III, Rowehl L, Li E, et ai. (2014) perustaminen Erittäin Kasvaimia synnyttävä paksu- ja peräsuolisyövän Cell Line (CR4) kanssa Properties Oletettujen Cancer Stem Cells. PLoS ONE 9 (6): e99091. doi: 10,1371 /journal.pone.0099091

Editor: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10 tammikuu 2014; Hyväksytty: 10 toukokuu 2014; Julkaistu: 12 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Rowehl et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Fusion TRO avustus (PI Dr. Botchkina, 1104347-5-37298), SBU Cancer Center ja SBU johtaja tutkimuksen (RSR 1111963-3-63845). Mukaan Fusion TRO olosuhteet, patologian osaston, Institute of Chemical Biology Drug Discovery (ICB DD) ja Simons Foundation ovat osittain vaikuttaneet tämän tutkimuksen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on kolmanneksi korkein ilmaantuvuus ja kuolleisuus Yhdysvaltain väestöstä [1]. Nykyinen puute parantavaa kemoterapian ja korkein henkilöstövaihtuvuus syöpälääkkeiden verrattuna muihin sairauksiin (vain 5% aineita, joilla on syövän vastaista aktiivisuutta prekliinisissä kehityksen lisensoitu; [2]) luovat kiireesti enemmän fysiologisesti ja kliinisesti merkittävää lähteet syöpäsolut, sekä osuvampia

in vitro

ja

in vivo

malleissa. Perinteiset syöpätutkimukseen ja prekliininen arviointi ehdokas syöpälääkkeiden perustuvat käyttöön valitsematta pitkäaikainen, korkea-passage perustettu syöpäsolulinjoissa kasvanut yksikerroksinen kulttuureissa. Kuitenkin pitkäaikainen

in vitro

huolto väistämättä kertyminen ylimääräisiä genomista ja epigenomic muutoksia, sekä valinnassa hallitseva solualapopulaatioiden. Itse asiassa se on äskettäin osoitettu, että yleisimmin käytetty vahvistettu syöpäsolulinjoissa ole mitään korrelaatiota alkuperäisen kliiniset näytteet [3]. Tämä viittaa siihen, että käyttö pysyvien solulinjojen tutkimukseen perimän muutoksia, löytö kliinisesti merkittävää molekyylikohteista, ja syöpälääke kehitys on kyseenalainen, koska käyttö näistä solulinjoista ei oteta huomioon monimutkaisuus ja patofysiologia

vuonna vivo

kasvaimia.

on laajalti hyväksytty nyt ihmisen kasvaimista järjestetään hierarkkisesti, ja päälle tämän hierarkian on käytössä pahanlaatuisia kantasoluja, joilla rajoittamaton itseuudistumiseen ja kasvaimen aloittamista kapasiteettia. Mukaan viimeisimmän käsite Karsinogeneesin joka on mullistanut ymmärrystä tumorigeneesin ja syövän hoitoon, vain tietyn fenotyyppisen alaryhmässä (t) syövän kantasoluja (CIC) tai syövän aloittamista solujen (CIC) vastaavat kasvainten kehittymiseen, tuotantoa koko spektri eriytetty jälkeläiset, jotka muodostavat tuumorimassan, etäpesäke, ja kestävyys syöpähoitojen [4] – [6]. Tällaiset solut hiljattain eristetty kaikista merkittävin ihmisen syöpätyyppejä, mukaan lukien paksusuolen ja peräsuolen syöpiä [7] – [9]. Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että tietyt fenotyypit kantasilmukan kuten kasvain-aloittamisen syöpäsolut ovat erittäin lääkkeille vastustuskykyiset ja pystyvät itsestään uusiminen standardin hoitotoimenpiteiden [10] – [17]. Kaikki edellä mainitut seikat korostavat keskeistä roolia CIC löytö kliinisesti merkittäviä molekyylikohteista ja syöpälääkkeen kehittämiseen.

tunnistaminen ja luonnehdinta potilaasta johdettujen CIC, kehittää optimaalinen

in vivo

ja

in vitro

nonkliinisissä, ja CIC-kohdennettuja analyyseja lääkkeen aiheuttamista muutoksista edustavat kriittiset vaiheet arvioinnissa uusien syöpälääkkeiden. On selvää myös, että jotta voidaan säilyttää sopivat Fidelity alkuperäiseen kasvaimet, syöpä-aloittavat solut (CIC), sekä muita solutyyppejä, joita käytetään genomista ja proteomiikka profilointi, olisi eristää suuri kirjo ensisijaisen ja etäpesäkkeitä , eikä vakiintuneiden syöpäsolun linjat. On kuitenkin tunnetusti vaikea määritellä ensisijainen solulinjojen ja erityisesti CIC linjat tuoreista kasvain yksilöt [18]. Ensinnäkin on olemassa objektiivisia vaikeuksia eristämisestä puhdasta solupopulaatioiden heterogeeninen kasvain kudoksista. Kasvaimen epäpuhtautta (eri ei-kasvainsolujen) välityksellä ja multiclonality ovat hyvin dokumentoituja ongelmia [19], [20]. Molekyylitasolla, ei tällä hetkellä ole lopullisia markkereita todistaa pahanlaatuinen tai ei-pahanlaatuisten luonteeltaan solujen sekä tarkasti erottaa normaali ja syövän kantasoluja. Yhä enemmän todisteita viittaa myös siihen, että CIC voisi edustaa heterogeenistä alapopulaatio kasvaimeen aloittamista soluihin [21] – [25]. Kuitenkin yhdistelmä useita lähestymistapoja ja useita solun pinnan markkereita, jota seuraa perusteellinen toiminnallinen luonnehdinta eristetty solu fenotyyppien voi mahdollistaa puhdistuksen kaikkein toiminnallisesti merkittävä, eli kasvaimen ja etäpesäkkeiden-aloite- ja kaikkein lääke-resistentit solut. Useat peräsuolen solulinjoja eri solujen, biokemialliset ja molekyylitason ominaisuuksia on perustettu viimeisen kahden vuosikymmenen ajan [26] – [30]. Kirjoittajat raportoivat, että perustetaan uusi CIC-rikastettu, erittäin tuumorigeenisia peräsuolen syöpä solulinja eristettiin maksasta etäpesäke CRC potilaalle.

Tulokset

Patient yksilöitä ja primaariviljelmiä

Dissosioituneet solususpensiot 13 tuoreeltaan resektoitiin peräsuolen karsinoomat eri histologisia laadut ja 3 maksametastaaseista testattiin klonogeeniset ja Tuumorigeenisuustutkimuksissa

in vivo

ja

in vitro

kuvatulla tavalla menetelmät jaksossa. Kaksi näytteet pahoin bakteereja, ja huolimatta toistuvista hoitoja antibiooteilla, ensisijaisen pesäkkeet myös saastunut ja siksi hylätään. Kaksi primääriviljelmissä kehittynyt ensisijainen ja etäpesäkekasvainten yksilöitä aikaisemmin hoidettu kemoterapian koki syvällisiä solukuolemaa 1-2 päivän viljelyn ja eivät osoittaneet elävät solut seuraavan viikon aikana havainnoinnin. Yhdeksän muun näytteet sisälsivät alapopulaatio nopeasti kiinnittyneitä soluja (FA) ja tyypin I kollageenin, joka aluksi lisääntyneet seerumivapaassa kantasolujen keskipitkän ja indusoitiin kelluva pallosia, jotka ovat tunnusomaisia ​​CIC: t, sekä löysä monisoluisista aggregaatteja 3D kulttuureissa. Kuitenkin 6 9 primääriviljelmien menettäneet klonogeeniset ja palloja muodostavan kapasiteetin usean kohtia, mikä on linjassa useiden havaintojen ensisijainen syöpäsolut on rajallinen (noin 5-6 kohtia) elinikä [31]. Sitä vastoin tuumorisolut eristetty maksan etäpesäke miespotilas vaiheessa 4 paksusuolensyöpä jatkaa pitkän aikavälin

in vivo

ja

in vitro

kasvu (15 kohtia, tällä hetkellä) ja ne edustavat perustettu, CIC-rikastettu koolonisyöpäsolulinja, CR4. Kolme muuta primääriviljelmissä parhaillaan myös evoluutio samanlainen CR4 solulinjaan. Nämä solut ovat parhaillaan toimiva, genomista, solu- ja molekyylitason karakterisointi.

Cellular ja klonaalinen heterogeenisuus CR4 kasvainsolujen

Alkuvaiheen eristyksen nopean kiinnikkeiset tyypin I kollageenin primaarikasvaimen solut ja niiden leviämistä

in vitro

MSCB: hen tai SPC media, useita erilaisia ​​solun muodon ja klooni morfologia olivat ilmeisiä: (i) tiheästi pitkä kara kaltaisia ​​soluja edustavat syöpäliitteinen fibroblasteja (valuuttalisiin) ja normaalien fibroblastien, jotka olivat hallitseva solufenotyypin pian eristyksen jälkeen ja sen aikana useita varhaisia ​​kohtia viljelyn (kuvio 1A); (Ii) harva suuri pitkänomainen soluja dychotomized prosesseja (kuvio 1 B); (Iii) harvinainen pieni klooneja, jotka sisältävät pieniä pyöreitä soluja noin 7-10 pm halkaisijaltaan hyvin ohut vanteen sytoplasmassa ja suuri pitkänomainen ytimet (kuvio 1 C, D); ja niiden joukossa, (iv) harvinainen, erittäin suuri (≥100-200 um), usein monitumaisten solujen (MNC, kuvio 1E). Olemme usein tarkkailla tällaisia ​​soluja sekä vakiintuneiden ja ensisijainen paksusuolen ja eturauhasen syöpä solulinjoja kasvatettiin stemness edistävää olosuhteissa. Nämä monitumaisia ​​jättisoluja oli kykenee sekä hidasta lisääntymistä, jotka tuottavat joko lisää MNC (kuvio 1F) tai suuri mononukleaarisissa soluissa.

(A) Aluksi hallitsevat väestöstä tiheästi pitkänomaisen fibroblastin kaltaisia ​​soluja. (B) harvemmassa pitkänomainen kasvainsolujen kanssa prosesseihin. (C) Ulkonäkö pieniä klustereita hyvin pieniä soluja (noin 7 um) vieressä fibroblastin kaltaisia ​​soluja. (D) Tyypillinen holoclone aiheuttama pieni CR4 soluja. (E) Giant Monitumaiset solua CR4 holoclone pieniä soluja. (F) Colony of monitumaisiksi soluja.

Olemme jatkaneet kulttuurin sekoitetun solupopulaatioiden määrätyissä stemness tukevien olosuhteiden odottaa, että tämä lähestymistapa, samalla meidän aiemmin vahvistettu ensisijainen eturauhasen CIC-rikastettu solulinja, PPT2 [32] johtaa leviämistä harvinainen CIC. Mukaisesti havaintojemme osoitettiin aiemmin, että yhteistyö kulttuurin koolonkarsinoomasoluissa kanssa syöpä liittyvien fibroblasteja johti tehtävä enemmän määrän CIC aktivoimalla β-kateniinin reitin [33]. Lopuksi, rajoitettu siirrostamalla primaaristen solujen kantasolujen media johti ulkonäön lukuisia harva, pienisoluinen sisältävät, tiheästi kloonit sileät reunat (holoclones), jota ympäröi pitkänomainen solut (kuvio 2A). Tämä malli on ominaista alkion, aiheuttama pluripotenttien ja muiden kantasolujen tyyppisiä yhteistyössä viljelty fibroblastien [32], [34]. Sucloning tällaisten holoclones muotoutunut puhdistetun koolonisyöpäsolulinja, CR4, jossa kaikki perusominaisuudet CIC, kuten korkea kasvaimeen aloittamista, 3D pallojakaantuminen-ja holoclone muodostavien valmiuksia ja ilmaus pluripotenttisuuden ja kantasolujen-asiaa markkereita (kuvattu alla). Yhdessä oletetun sileäreunaiset holoclones, CR4 solut voivat aiheuttaa paraclones diffuusi reunat (kuvio 2C), jotka ovat ominaisia ​​progenitorisolujen. Aikana aikaisemmin kohtia, lähes kaikki CR4 holoclones sisälsi tasaisesti täynnä pieniä soluja keskeltä kehälle klooni (kuvio 2B). Kuitenkin myöhemmin kohtia oli paljon suurempi osuus suurten monitumaiset solut sijaitsevat pääasiassa kehällä kloonin, kun taas pieniä soluja miehitetty enemmän keskiosassa kloonin (kuvio 2 E, F). Erittäin alhainen kohdat CR4 soluja pidetään otetuista eristä nestemäisessä typessä; Tällä hetkellä, tämä linja on kulku 14. Kuvatun luonnehdinta, jäätyneen otetuista eristä kasvatettiin joko NOD /SCID-hiiriin tuumoriksenografteja, kelluva 3D pallosia tai tyypin I kollageenin kiinnittynyt kulttuureissa.

(A) Clone pieni CR4 soluja ympäröi pitkä fibroblastien kaltaisten solujen kanssa dychotomized prosesseihin. (B) Subkloonauksen jälkeen, pieni CR4-solut ympättiin alhaisen tiheyden seerumittomassa SPCM tyypin I kollageenin tyypillinen tiheästi holoclones ominaisuus kantasolujen eri alkuperää. (C) Paraclone pitkänomaisia ​​suurempi viereisten solujen pieni CR4 soluihin. (D) määrä alhainen puhdistetun pieniä soluja tuotetaan pääasiassa pyöreä-apajille holoclones ja harvinaisten paraclones kiinnikkeiset tyypin I kollageenin korkea hyötysuhde. (E) Korkeampi suurennos holoclone solujen suuri ytimet ja ohut reuna sytoplasmaan. (F) Large MNCs (≥200 m; hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäytyminen) sijaitsevat usein kehällä holoclones.

toiminnallinen luonnehdinta CR4 solujen

Vahvista stemness tila että CR4 solulinjan, useita toiminnallisia määrityksiä suoritettiin arvioida myös kasvaimeen aloittamista potentiaali (kyky muodostaa ihon alle kasvaimien immuunivajaissa NOD /SCID-hiiriin), palloja muodostavan kapasiteetin (kyky muodostaa tiheän kelluvan rakeita tarttumattomat 3D viljelmissä) ja kyky muodostaa klooneja (kyky muodostaa kiinnittynyt tyypin I kollageenin holoclones). Olemme määrittäneet, että CR4 soluilla korkea tehokkuus Kasvainten NOD /SCID-hiirissä (kuvio 3A) jälkeen sarja ihonalaisen transplantations suhteellisen alhainen solujen määrä. Näin ollen, 1 x 10

3 CR4 soluja tai 2-3 kelluva sferoideina indusoi suuria kasvaimia kaikissa hiirissä (6 hiirtä kutakin ryhmää kohti). Perustaa klonogeenisten ja palloja muodostavan kapasiteetit CR4 solujen, tunnettu määrä soluja ympättiin tyypin I kollageenilla päällystetty tai ultra-low tarttuva levyjen, vastaavasti. Viikon kuluttua inkuboinnin indusoidun kiinnittynyt kloonit tai kelluvan sferoideina laskettiin ja klonogeenisten tehokkuus laskettiin suhde määrä ympättyä solua verrattuna määrä indusoidun pesäkkeiden tai sferoideina. Erityisesti olemme päättäneet, että kun kylvö lajittelematonta CR4 solujen passage 13 sarjalaimennokselle (250, 100, 50 ja 25 solua /kuoppa 96-kuoppaisilla levyillä) noin yksi solu 10 (10%) indusoi täydellisen holoclones (kuvio 2B, D). Palloja muodostavan tehokkuutta CD133-positiivinen osa CR4 solujen 3D kulttuuri 5% tyypin I kollageenin in SPCM oli korkeampi verrattuna CD133-köyhdytettyä solupopulaatioiden (8,4 ± 2,6 versus 3,7 ± 0,6 pallosia per 100 ympätty solua /kuoppa , vastaavasti). Sekä holoclones ja sferoidit olivat täynnä hyvin pieniä soluja, jotka ilmentävät korkeita yhteisen stemness markkereita, mukaan lukien EpCAM, CD133, CD44, CD166 ja Lgr5 (kuvattu alla). Vaikka CD133 (klooni 293C3), sekä kaikki muut yhteiset markkereita, ei ole ihanteellinen paksusuolen CIC kuitenkin se mahdollistaa lisärikastukseen kasvaimen-aloittamista ja palloja muodostavan osa CR4 solujen.

(A) Large ihonalainen kasvain aiheuttama transplantaation CR4 soluja (1 x 10

3) NOD /SCID hiiri (passage 2). (B) Dense kelluva sferoidit aiheuttama sarja siirrostamalla että CR4 solujen 3D kulttuurin ultra-low-kiinnittyvä levyjä. (C) Kolmiulotteinen pallomainen indusoi pinnalle kiinnittyneiden CR4 holoclone. (D) muodostaminen suuri 3D organoidikappaleen pinnalle kiinnittyneiden CR4 holoclone. (E) Ulkonäkö pitkien prosessien pallomainen indusoiman CR4 solujen 3D viljelmä, joka sisälsi 15% kollageenin geelin, joka osoittaa korkean invasiivisia potentiaalin [35]. (F) Long dychotomized prosesseja kehittämät tarttuu pieniä CR4 soluja. (G) Pitkä prosessit tarttuneiden MNC.

aggressiivinen luonne ja poikkeuksellinen palloja muodostavan /klonogeeniset kapasiteetti CR4 soluja osoitettiin niiden kyky tuottaa kelluva sferoideja paitsi tarttumaton viljelmät (kuva 3B), mutta myös silmikoitumalla kiinnittynyt tyypin I kollageenin holoclones ja siitä irtoamisen muodostettu pallosia (kuvio 3C). CR4 holoclones oli myös pystyvät tuottamaan suuria kiinnittynyt monikerroksinen organoids suoraan yläpuolella holoclone pinnan (kuvio 3D). Kelluva CR4 sferoidit käyttäytyivät eri tavoin 3D kulttuuri järjestelmien kanssa ja ilman tyypin I kollageenin geelejä kantasolujen media (MSCBM tai SPCM). Siten sferoidit kasvatettu ilman tai alhainen prosenttia kollageenin geelin (enintään 5%) on yleensä sileät reunat (kuva 3B), kun taas korkeampi geeli konsentraatio (jopa 10-15%) johti ulkonäkö useita prosesseja, jotka muodostivat tähdellä -kuten rakenteet ympäröivä pallosia (kuvio 3E). Tällaiset fenotyyppiä kelluvien pallosia äskettäin liittyy korkeaan metastaattinen kapasiteetti erityisesti syöpäsolujen [35], mikä on linjassa sen kanssa, että CR4 solulinja perustettiin maksan etäpesäke paksusuolen syöpäpotilaan. Samoin kuin 3D-kulttuurin invasiivisia luonne CR4 solujen näkyi niiden kyky kehittää pitkä, iso, kahtia prosessien ulkoreunaan kiinnittynyt kloonia (kuvio 3F). Suuri monitumaisia ​​soluja kehälle klooneista, on kuvattu edellä, samoin kuin yhden valtavan monitumaisia ​​soluja, usein myös näkyy pitkä ja dychotomized prosesseja (kuvio 3G).

fenotyyppinen profilointi CR4 solujen

Kuten edellä mainittiin, alakloonaukseen pienisoluinen sisältävän holoclones johti dramaattiseen rikastumista solut, jotka ekspressoivat suuria määriä stemness ja pluripotenttisuuden markkereita (taulukko 1, kuviot 4 ja 5). Yleensä kantasolujen fenotyyppi

in vitro

on dynaaminen johtuu kaksijakoinen luonne CIC (ts niiden kyky itse uudistaa ja tuottaa progenitoreja). Siten varhainen ja väli- kohtien ensisijainen CR4 soluilla oli epävakaa fenotyyppi ilmentävät erittäin vaihteleva taso CD133, CD44 ja EpCAM (taulukko 1 ja kuva 4A). NOD /SCID-hiiriin tuumoriksenografteja indusoi näiden solujen ilmaistaan ​​samalla tasolla kaikkien tutkittujen markkereiden (kuvio 4B). Sitä vastoin puhdistettu CR4 solut säilyttävät suhteellisen vakaana fenotyyppi 3D ja tarttuu tyypin I kollageenin kulttuureissa. Siten kolme riippumatonta FACS-analyysit viime 7 kuukautta (kohdat 6-14) ovat osoittaneet, että lähes koko väestön CR4 solujen yhä erittelemätön (vain 3-5% ilmaistuna merkkiaine erilaistumisen, pan-keratiini), ja suurin osa soluista ilmentävät korkeita CD133 (62-82%), CD44 (65-99%), CD166 (97-98%), EpCAM (98-99%) ja Lgr5 (80-83%; edustavia FACS tiedot näkyvät kuvassa 4C). Erityisesti noin 65% soluista ilmensi korkeita CD133 ja CD44. Tärkeää on, noin 20% CR4 solut ovat positiivisia merkkiaine metastaattisen aktiivisuuden, CXCR4.

(A) edustaja FACS-analyysit eri solunpintamarkkereiden ilmentymistä alussa primääriviljelmässä nopean tarttumisen CR4 soluja kasvatettu tyypin I kollageenin in MSCB väliaineessa. (B) FACS-analyysi ensimmäisen kulkua FA kasvainsolujen eristettiin NOD /SCID tuumoriksenografteja aiheuttama varhaisen läpikulun CR4 soluissa. (C) voimakas kasvu ilmaus yhteisen merkkiaineiden stemness, kuten CD133, CD44, CD166, Lgr5 ja EpCAM myöhään-passage (P13) CR4 soluja. Huomaa, että 19% soluista myös ilmaissut merkkiaine CIC kanssa metastaattisen aktiivisuuden, CXCR4, joka tunnistettiin useita ihmisen syövissä.

(A) Nuclear lokalisointi keskeisten pluripotenttisuus markkereita, c-Myc, SOX- 2 ja Oct3 /4. (B) rinnakkaispaikantumisen ydin- c-Myc korkea kalvo ilmaus CD133. (A, B: immunosytokemi- analyysi CR4 soluja kasvatettu tyypin I kollageenilla päällystetty chambered dioja). (C) Western blot analyysi vahvistaa ilmentymistä c-Myc ja lokakuu-3/4 ydin- jakeet CR4 soluja. Sen sijaan ne ovat negatiivisia p53 ja p21. Tumafraktiota ilmaisi myös korkeimmilla tasoilla phosphorilated p65 (joka osoittaa konstitutiivista NF-kB), kun taas unphosphorilated p65 on sijoitettu pääasiassa sytoplasmaan. (D, E) edustaja FACS-analyysit osoittavat korkeampi ilmentyminen Sox-2 ja c-Myc in CD133-positiivisten solujen verrattuna lajittelemattoman soluihin. (F) immunohistokemiallinen analyysi osoittaa ydinvoiman ilmentymistä Sox-2 on CR4 aiheuttama NOD /SCID -tuumoriksenografti. (G) Negatiivinen kontrolli (kudoksen jakso ilman inkubaatio ensisijainen anti-Sox-2 Abs).

Käyttäen immunosolukemiallisten, FACS ja western blot -analyysit, olemme osoittaneet, että merkittävä suhde CR4 ilmentävät useita tärkeitä markkereita pluripotenttisuuden, kuten Sox-2, Oct3 /4 ja c-Myc. Nuclear lokalisointi näistä merkeistä esitetty ICC (kuvio 5A, B) varmistettiin western blotting (C), joka on osoittanut ilmaisun ydin- proteiinifraktion ja niiden puuttuminen on sytoplasman yhdessä. Olemme havainneet, että CD133

+ osa CR4 solut ilmentävät suurempi osuus useiden merkkiaineiden pluripotenttisuuden verrattuna lajittelemattoman CR4 soluja. Siten FACS-analyysi osoitti, että yli neljännes CD133

+ väestö ilmaisi Sox-2 ja 10% väestöstä oli positiivinen c-Myc (kuvio 5D). Sen sijaan, lajittelemattoman CR4 solut ja CD133-negatiivinen osa ilmaistaan ​​alhaisempi näistä pluripotenttisuuden markkereita (6 ja 4%, ja 1,4 ja 0,8%, vastaavasti, kuvio 5E, negatiivinen osa ei ole esitetty). Rinnakkaispaikantumisen analyysi on osoittanut, että vain solut korkein ilmentymä CD133 yleensä tumavärjäystä varten pluripotancy markkereita (kuvio 5B, vain c-Myc näkyy). Suuri osuus Sox-2positive soluihin ja sen tumaanohjaussignaali vahvistettiin myös IHC n NOD /SCID-hiirten tuumoriksenografteja (kuvio 5F). [On huomioitava, että käyttö anti-Oct3 /4 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) FACS-analyysi edellyttäen epäilyttävän korkea suhteet positiivisten solujen (yli 90%) ja nämä tiedot eivät sisältyneet.] Tärkeää on, että CR4 solut, samoin kuin eturauhasen PPT2 CIC-rikastettu solulinjassa [32], ei ilmaista kaksi suurta sääntelyviranomaisten apoptoosin ja tuumorisuppressorigeeneille, p53 ja p21 (kuvio 5C). Lisäksi ydin- osa CR4 soluja kasvatetaan tyypin I kollageenin kantasolujen väliaineessa erillisinä holoclones ilmentyy voimakkaasti fosforyloitiin p65, mikä tarkoittaa, että NFKB on konstitutiivisesti ilmentynyt kolorektaalisyövän CIC. Sen sijaan, fosforyloitumaton p65 on sijoitettu pääasiassa solulimafraktio. Kaikki edellä voi osittain selittää korkea tuumorigeenisemmiksi ja klonogeeniset valmiudet ja poikkeuksellinen lääkeresistenssin tämän CIC-rikastettu solulinjassa. Erityisesti, CR4 solut ovat sietää erittäin hyvin hoito yleisesti käytettyjen sytotoksisten lääkkeiden, kuten paklitakselia tai Taxol (kuvio 6). Niinpä sen jälkeen 72 tunnin hoito pitoisuusalueella 10 nM jopa 10 uM (MTT-määritys), CR4 solut ovat osoittaneet vähän tai ei ollenkaan sytotoksisuutta; Lisäksi ne usein lisäsivät proliferaatiota vasteena alentaa annoksia paklitakselia. Olemme havainneet, että useat jäsenet uuden sukupolven taksoidit, kuten SBT-1214, SBT-121602 ja SBT-12834 ovat tehokkaita CR4 kasvaimen aloittamista soluihin. IC50 kuolleisuus saavutettiin ≥10 uM kaikkien huumeiden keskittyminen. On huomioitava, että lupaava tehoa pieninä pitoisuuksina uuden sukupolven taksoidit voidaan edelleen parantaa niiden yhdistelmänä synteettisen johdannaisen curcumin, CMC2.24 (julkaisematon data), joka on linjassa edellisessä tutkimuksessa [32].

Yleisesti käytetty Paklitakseli (Taxol) annoksina alle 10 uM ei tehoa CR4 soluja ja usein lisääntyy niiden leviäminen. Sen sijaan, useita uuden sukupolven taksoidit indusoivat annoksesta riippuvaisen proliferaation inhibitiota näistä voimakas kasvaimen aloittamista soluihin. (MTT-määritys jälkeen lääkehoitoa 48 tuntia). Saatu

p

arvot kaikille lääkkeet ja kaikki lääkkeen pitoisuudet olivat paljon pienempiä, että 0,05. Suurin

p

arvo saatiin SBT-1214 10 nM pitoisuudessa (

p

= 0,0131); erityisesti 10 uM pitoisuutena SBT-1214

p

= 0,00032.

Histopatologisten ja IHC analyysit NOD /SCID tuumoriksenografteja

Kuten edellä mainittujen, ihonalainen transplantaatio on suhteellisen pieni määrä CR4 soluja (1 x 10

3 liukenevat CR4 soluja tai 2-3 kelluva sferoideina) aiheuttama suuri vascularized kasvaimia kaikissa pistetään NOD /SCID-hiirten (kuviot 3A ja 7A) . Hematoksyliini–ja eosiini-värjättyä kudosleikkeiden hiiristä tuumoriksenograftien osoittivat klassisen histologisen ominaisuuksia ihmisen metastaattinen paksusuolen syövän (kuvio 7B, C). Erittäin epätyypillinen epiteelisolujen muodostunut villous kaltaisia ​​rakenteita merkittävässä pitkänomainen ytimet ja yhdenmukaisia ​​huonosti eriytetty adenokarsinooma, lukuisat epätyypilliset mitoottisiin lukuja. Keski kuolion oli yleensä läsnä. Lukuisat suuret Monitumaiset solut olivat ilmeisiä suuremmalla suurennuksella (kuvio 7C, nuolet). Immunohistokemiallinen analyysi osoitti, että koko kasvaimen alueella (mutta ei tuumorin strooman) ilmaistuna korkea kalvoon paikallinen EpCAM (kuvio 7D, E). Samanlaisia ​​malleja ja ekspressiotasot olivat tunnusomaisia ​​CD166 (F). Sen sijaan, immunovärjäys polyklonaalisilla CD44 (klooni F10-44-2; Invitrogen /Biosources, USA) paljasti kolme on erilaiset ekspressiokuviot eri alueilla saman kasvaimen, eli selvästi kalvon (kuvio 7G), sekä soluliman ja selvästi ydin- muualla (kuvio 7H). Korkea cytolasmic ilmaus yhteinen merkki paksusuolen kantasolujen ja CIC: t, Lgr5, näkyi joissakin kasvaimen osaa (kuva 7J), kun taas muualla, se oli joko kohtalaisen tai heikosti ilmaistuna (K), tai jopa poissa. Suuret alueet tuumoriksenograftien ilmaisi vahvan tumavärjäystä varten pluripotenttisuuden merkki Sox-2 (kuvio 7L).

(A) iso kasvaimen aiheuttama elinsiirron 1 x 10

3 CR4 soluja. (B) hematoksyliinillä ja eosiinilla värjättyjen kudosleikkeiden näyttää klassinen histologinen piirteitä ihmisen metastaattinen paksusuolen syöpä. (C) Tehokas suurennos alueella on esitetty (B); nuolet osoittavat jättiläinen monitumaisten solujen papillaarisen rakenteissa. (D, E) Vahva solupintailmentymi- epiteelin merkki, EpCAM. (F) Vahva ilmentymisen solun pinnalla CD166. (G) Sytoplasmiset ilmentymä CD44. (H) mikroskooppinen tarkennuksen vahvat ydin- ja heikompi sytoplasmista ilmentymä CD44. (I) Negatiivinen kontrolli (ensisijainen Abs jätettiin pois). (J, K) Vahva ja maltillinen ilme, vastaavasti, paksusuolen kantasolujen markkeri, Lgr5 /GPR49. (L) Vahva ydin- ilmentymä pluripotenttisuuden merkki, Sox-2 suuressa osassa kasvaimen.

RNA-Seq täydellinen transcriptome profilointi CR4 pienten versus bulk kasvainsolujen

käyttäminen RNA-Seq, teimme toiminnallinen genominen analyysi kasvaimen aloitetaan fraktioiden CR4 (pieni) soluja kasvatettiin kiinnittynyt tyypin I kollageenin verrattuna kasvanut 3D sferoideja, verrattuna suurin kasvainsolujen (pitkä ja dychotomized soluja kasvatettiin standardiolosuhteissa viljelyolosuhteissa ). Käyttämällä HiSeq 2000, sekvensoimme välillä 40 ja 50000000 lukee per biologinen näyte, kuten aiemmin on kuvattu [35], [36], [37]. Lyhyesti, kirjastot NGS tehtiin 100 nanogrammaa kokonais-RNA. RNA Näytteiden laatu oli arvioitu Agilent Bioanalyzer. Kaikki RNA-näytteet oli RIN edellä 8. Sequencing kirjastoja luotiin käyttäen Illumina TruSeq Stranded mRNA LT kit valmistajan suositusten mukaisesti. Laatu kunkin kirjaston arvioitiin Agilent bioanalysaattorin suuri herkkyys määrityksessä, ja kvantifioidaan qPCR (Kappa Biosystem, CT). Kirjastot yhdistettiin yhteen 10 nM perusteella qPCR tuloksiin, ja sitten altaan kvantifioitiin jälleen qPCR. Yhdistetty kirjasto sekvensoitiin yksi kaista on HiSeq2000 pariksi pää 100bp virtausta soluun. Näin saatoimme havaita, jotka transkriptit ilmentyvät eri joukossa tämäntyyppisiä CR4 soluja, mikä rakentaa kattavan kuvan päälle tai tukahdutettu signalointireitteihin. Olemme havainneet, että pienet CR4-soluja kasvatettiin joko erillisinä holoclones kiinnittynyt tyypin I kollageenin tai 3D kelluva pallosia niillä on suuri määrä eri tavoin ilmentyvien geenien verrattuna suurin kasvainsolut kasvatettiin tavanomaisissa viljelyolosuhteissa. Täten kiinnittyneet pienet CR4 solut ja 3D-pallosia, 357 ja 365-geenien, vastaavasti, yli-ilmentää verrattuna CR4 pitkä (bulk) kasvainsolut. Näistä geeneistä, 287 olivat yleisesti voimistunut, mikä tarkoittaa, että molemmat viljelyolosuhteet sallivat ylläpidosta CR4 pienten solujen stemness tilassa. Erityisesti sekä pienet tarttuu ja 3D pallosia ilmaisi jopa useita suuruusluokkia säätelyyn ylöspäin seuraavasti: (i) useita yhteisiä markkereita stemness, kuten CD44, CD24, EpCAM, ESA, Lgr5, ALDH1A1 ja muut; (Ii) kasvutekijöitä, kuten epidermaalinen (EGR), fibroblasti (FGF) ja transformoiva kasvutekijä-beeta (TGF) perheenjäsenet; (Iii) transkriptiotekijöitä (TF: t), mukaan lukien useita homeobox (CDX1, CDX2, CEACAM6, MSX2) ja pluripotenttisuus TF: ien (POU5F1B, Oct4, Sox-2, Sox-9 (iv) tulehdusta edistävien sytokiinien ja niiden reseptorien, kuten IL18, IL20 , IL2RG, IL20RA ja muita; (v) ABC kuljettajat, (vi) vastaavien geenien siirtämiseksi energian korkea fosfaatin mitokondrioiden (CKMT1 ja CKMT1B) ja jäsenet sytokromi P450 perheensä CYP2B6-, CYP2J2, CYP2S1 ym. Mielenkiintoista , kasvain-aloittamista osa CR4 solujen yli-ilmentyy useiden geenien ohjaamiseksi solu-soluadheesion, mukaan lukien kadheriineja (CDH 1, 3 ja 17, ja CDHR5); intergins (ITGB4); geenejä, jotka koodaavat tiukka liitos proteiineja (CLDN3, 4 ja 6, COL17A1 ja muut); ja keratiineista (KRT19, 20, 23 ja KRTAP3-1). Tämä havainto tukee perinteisesti käytetty lähestymistapa aluksi rikastuminen eturauhasen ja paksusuolen kasvaimen aloittamista soluja perustuu niiden kykyyn kiinnittyä tyyppi I kollageenipäällysteisiin pinnat 15-20 minuutin inkuboinnin. saatu raaka RNA-Seq tiedot toimitettiin National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO), julkinen funktionaalinen tietovarastoon (ID numero on <