Krooninen sairaus

tiivistelmä

edellisessä tutkimuksessa todettiin, että [6] -shogaol, merkittävä bioaktiivisen komponentin inkivääri, metaboloituu syöpäsoluissa ja hiirillä. On epäselvää, onko nämä metaboliitit säilyttävät bioaktiivisuus. Tavoitteena Nykyisen tutkimuksen tarkoituksena on syntetisoida suuria aineenvaihduntatuotteiden [6] -shogaol ja arvioida niiden kasvun esto ja apoptoosin induktio ihmisen syöpäsoluja. Kaksitoista metaboliitit [6] -shogaol (M1, M2, ja M4-M13) onnistuneesti syntetisoitiin käyttämällä yksinkertaista ja helposti kemiallisia menetelmiä. Kasvun estäminen analyysit osoittivat, että useimmat aineenvaihduntatuotteiden [6] -shogaol oli mitattavat toimintaa vastaan ​​ihmisen syöpäsoluja HCT-116 ja H-1299. Erityisesti, metaboliitin M2 suuresti säilytti biologisen toiminnan [6] -shogaol, jossa IC

50 24,43 uM HCT-116 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa ja IC

50 25,82 uM H-1299 ihmisen keuhkosyövän soluja. Myös esillä suhteellisen suuri teho oli tiolia konjugaatti M13, jossa IC

50-arvot 45.47 ja 47.77 uM kohti HCT-116 ja H-1299-soluissa, vastaavasti. Myrkyllisyyden arviointi synteettisen metaboliittien (M1, M2, ja M4-M13) vastaan ​​ihmisen normaali fibroblasti paksusuolen solujen CCD-18Co ja ihmisen normaali keuhkojen solut IMR-90 osoitti myrkkyjä Metabolinen biotransformaatio [6] -shogaol. Aktiivisimmat metaboliitti M2 oli lähes olematon myrkyllinen CCD-18Co ja IMR-90 normaaleihin soluihin IC

50s 99.18 ja 98.30 uM. TUNEL (Terminal deoksinukleotidyylitransferaasilla dUTP nick end merkinnät) määritys osoitti, että apoptoosin laukaisi aineenvaihduntatuotteiden M2, M13, ja sen kaksi diastereomeeriä M13-1 ja M13-2. Ei ollut merkittävää eroa apoptoottisten vaikutus [6] -shogaol ja vaikutus M2 ja M13 sen jälkeen, kun 6 tuntia hoidon.

Citation: Zhu Y, Warin RF, Soroka DN, Chen H, Sang S ( 2013) metaboliitteja Ginger Component [6] -Shogaol Remain bioaktiiviset syöpäsoluissa ja Lievästi myrkyllistä normaaleissa soluissa: kemiallinen synteesi ja biologinen arviointi. PLoS ONE 8 (1): e54677. doi: 10,1371 /journal.pone.0054677

Toimittaja: Joseph J. Barchi, National Cancer Institute at Frederick, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 lokakuu 2012; Hyväksytty: 13 joulukuu 2012; Julkaistu: 30 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Zhu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health myöntää CA138277 ja CA138277S1 SS. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

huolimatta suunnattomista ponnisteluista kohti kehittämisessä syövän hoitomuotoja viime vuosikymmenten, syöpä on edelleen merkittävä kansanterveydellinen ongelma maailmanlaajuisesti. Lisääntyvä näyttö on osoittanut, että hoidot käyttäen tiettyjä aineita tai inhibiittorit, jotka kohdistuvat vain yksi biologinen tapahtuma tai yksittäisen reitin yleensä epäonnistuvat syövän hoidossa [1]. Tavanomaiset kemoterapia-aineiden on osoitettu olevan yhteydessä hyväksyttävää myrkyllisyyttä. Uudet lähestymistavat valvontaan syövän kriittisesti tarvitaan. Kemopreventiossa on innovatiivinen alue syövän tutkimusta, joka keskittyy ehkäisyyn syöpä farmakologisen, biologinen, ja ravitsemukselliset toimet [2]. Kertyvät tutkimukset ovat osoittaneet, että ruokavalion phytochemicals läsnä kasveja ja hedelmiä, jotka pidetään yleensä ei-myrkyllisiä aineita, voi aktivoida tai estää useita tärkeitä reittejä, jotka osallistuvat syöpäsolujen selviytymistä ja kasvua [1], [3], [4] . Kemopreventiossa by syötävä phytochemicals katsotaan nyt olevan turvallinen, edullinen, helposti hyväksyttävät ja helposti lähestymistapa syövän ehkäisyä, valvontaa ja hallintaa.

inkivääri, juurakosta

Zingiber officinale

, on ollut yleisesti käytetty mauste ja raakaöljyn lääkkeen monta vuotta kaikkialla maailmassa. Ginger on mainostetut sen helpotusta pahoinvointia, anti-inflammatorisia ominaisuuksia, ja otaksuttu syövän vastaista aktiivisuutta [5] – [7]. Tärkeimmät farmakologisesti aktiiviset komponentit inkivääri ovat gingerols ja shogaols (kuvio 1) [5]. Terminen käsittely gingerols antaa shogoals ensisijaisena ainesosina kuivattua inkivääriä [5], joka usein osoittaa enemmän anti-karsinogeeninen kuin niiden esiasteita. Esimerkiksi ryhmämme osoittivat, että [6] -, [8] -, ja [10] -shogaols näytteillä paljon suurempi antiproliferatiivinen teho kuin [6] -, [8] -, ja [10] -gingerols vastaan ​​H- 1299 ihmisen keuhko- ja HCT-116 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa [8]. Kim

et al

. raportoitu, että [6] -shogaol näytteillä paljon voimakkaamman kasvun estäviä vaikutuksia in A-549 ihmisen keuhko- syöpäsoluja, HCT-15 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa, SK-OV-3 ihmisen munasarjasyöpäsoluja, ja SKMEL-2 ihmisen ihon syöpäsoluja kuin [ ,,,0],4] -, [6] – [8] -, ja [10] -gingerols [9]. Yhdessä meidän yhteistyökumppaneita, olemme havainneet, että [6] -shogaol oli tehokkaampi kuin [6] -gingerol estossa 12-

O

-tetradecanoylphorbol 13-asetaatti (TPA) aiheuttaman kasvaimen edistäminen hiirillä [10 ]. Uudemmassa tutkimuksessa todettiin, että [6] -shogaol indusoiman apoptoosin, kaspaasin aktivaatio, ja Poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) pilkkominen sekä SMMC-7721 ihmisen maksasyövän solut ja SMMC-7721 tuumoriksenografteja kautta solulimakalvostoon (ER ) stressiin liittyvä mekanismi [11].

Tuoreessa tutkimuksessa ryhmämme on osoittanut, että [6] -shogaol metaboloituu hiirissä ja syöpäsoluissa, jossa kolmetoista metaboliittien (M1-M13 ) havaittiin ja tunnistettiin [12]. Trace määrä aineenvaihduntatuotteiden M6-M12 puhdistettiin ulostenäytteistä kerätty [6] -shogaol käsitellyissä hiirissä, ja niiden rakenteet luonnehdittiin perustuu analyysiin

1H,

13C, ja 2-D-NMR-tulokset [12 ]. Rakenteet jäljellä aineenvaihduntatuotteiden (M1-M5 ja M13) on selvitetty perustuu analyysiin niiden MS

n (n = 1-3) spektrit ja vertailu aitoja standardeja. Sen α, β-tyydyttymättömän ketonin rakenne, olemme huomanneet, että [6] -shogaol voidaan pelkistää aineenvaihduntatuotteiden M6-M9 ja M11. Olemme myös havainneet, että [6] -shogaol on substraatti tiolin konjugaatio kautta merkaptuurihapon polku muodostaa aineenvaihduntatuotteita M1-M5, M10, M12, ja M13. Koska suurin osa [6] -shogaol metaboloituu

in vivo

ja syöpäsoluissa, kriittinen kysymys on, onko aineenvaihduntatuotteiden [6] -shogaol ovat bioaktiivisia. Vaikka vähemmän tehokas kuin [6] -shogaol, ne voivat silti kokonaisnäytöstä biologista aktiivisuutta [6] -shogaol

in vivo

.

Nykyisenä haasteena tutkia bioaktiivisuutta aineenvaihduntatuotteiden on niiden puute kaupallisen saatavuuden. Hyvin pieniä määriä aineenvaihduntatuotteiden puhdistettiin hiiren ulostenäytteistä, olimme vain voi tutkia vaikutukset kahden päämetaboliitin M9 ja M11 kasvuun esto ja apoptoosin induktio ihmisen syöpäsoluja. Tuloksemme osoittivat, että M9 ja M11 ovat bioaktiivisia yhdisteitä, jotka voivat estää syöpäsolujen kasvua ja aiheuttaa apoptoosin ihmisen keuhko- ja paksusuolen syövän soluja, vaikkakin vähemmän tehoa kuin [6] -shogaol. Siksi on aika kehittää kemiallisia menetelmiä tiivistetään metaboliittien [6] -shogaol ja tutkia tarkemmin niiden syöpälääkkeen toimintaa. Nykyinen tutkimus kuvaa kemiallista synteesiä aikaisemmin tunnistetut aineenvaihduntatuotteet [6] -shogaol ja bioaktiivisuus analyysi syöpäsoluissa. Tutki myös ovat myrkyllisyyksiltä [6] -shogaol ja sen aineenvaihduntatuotteiden normaaleissa ihmisen keuhko- ja paksusuolen soluja, jotka tarjoavat vertailu [6] -shogaol n myrkyllisyydestä ei-syöpä malli.

Tulokset

kemiallinen synteesi metaboliitteja [6] -shogaol

Kaksitoista metaboliittien (M1, M2, ja M4-M13) syntetisoitiin onnistuneesti [6] -shogaol yksinkertaisilla ja helposti puolisynteettistä lähestymistapoja nykyisessä tutkimuksessa (kuviot 2 ja 3). Lyhyesti, reaktio [6] -shogaol L-kysteiini (Cys), N-asetyyli-L-kysteiini (NAC) tai L-glutationia (GSH), syntyy tioli-konjugaattien M2, M5, tai M13, vastaavasti (kuvio 2). Sen jälkeen, vähentäminen tioli-konjugaattien M2 tai M5 NaBH

4 johti hydroksyloitu konjugaatteja M1- tai M4, vastaavasti (kuvio 2). Selektiivinen pelkistys [6] -shogaol yhdistelmällä NaBH

4 ja CeCI

3.7H

2O johti M6 (kuva 3) [13]. Hydraus [6] -shogaol Pd /C: ssa saatiin M11, jota seuraa käsittely NaBH

4 tuottaa M9 (kuvio 3). Lisäksi demetylaation M11 käyttää BBr

3 antoi M8 (kuva 3). Michael reaktio [6] -shogaol NaOMe: lla tai NaSMe tuotti metoksi adduktin M7 tai metyylitio addukti M10, vastaavasti (kuvio 3) [14], [15]. Joista, metyylitio- addukti M10 käsiteltiin NaBH

4 antaa M12 (kuvio 3). Koska sekä vähentäminen ketonin ja Michael reaktiot tässä tutkimuksessa käytetyt ovat ei-stereoselektiivisen, metaboliittien M1, M2, M4-M7, M9, M10, M12, ja M13 syntetisoidaan diastereomeerien seoksina.

Reagenssit ja ehdot: i) L-kysteiini, NaHCO3 (kat.), MeOH /H2O, rt, 24 h; ii) NaBH4, MeOH, 0 ° C, 2 h; iii) N-asetyyli-L-kysteiini, NaHCO3 (kat.), MeOH /H 2O, rt, 72 h; iv) L-glutationi vähentää, NaHCO3 (kat.), MeOH /H 2O, rt, 3 h.

Reagenssit ja olosuhteet: i) H2, Pd /C (10% paino /paino), THF, rt, 18 h; ii) BBr3, DCM, -78 ° C: -RT, 2 h; iii) NaBH4, MeOH, 0 ° C: -RT, 2 h; iv) aq. 15% NaSCH3, THF, rt, 6 h; v) Na, MeOH, 0 ° C -RT, 4 h; vi) NaBH4, CeCl3.7H2O, MeOH, -78 ° C, 30 min.

Olemme täysin tunnettu rakenteita M5-M12 käyttämällä 1-D ja 2-D-NMR- ja massaspektrisellä data edellisessä tutkimuksessa [12]. Siksi rakenteita näiden synteettisten yhdisteiden vahvistettiin vertaamalla niiden

1 H ja

13C NMR-spektrit kanssa aitoja standardien saatu hiiren ulostenäytteistä. Rakenteet jäljellä synteettisen metaboliittien (M1, M2, M4 ja M13), aiemmin päätellä monivaiheisella massaspektrometrialla tekniikoita [12], varmistettiin vielä niiden 1-D ja 2-D-NMR-spektrit tiedot ensimmäistä kertaa.

M2 osoitti molekyylikaavan C

20H

31NO

5S pohjalta positiivisen APCI-MS at

m /z

398 [m + H]

+ ja sen

1 H ja

13C-NMR-tulokset. Molekyylipaino M2 on 42 massayksikköä pienempi kuin N-asetyylikysteiini konjugoitu [6] -shogaol (M5) [12] osoittaa, M2 oli kysteiini konjugoitu [6] -shogaol. Tämä oli yhtä mieltä siitä, että M2 tehtiin [6] -shogaol ja L-kysteiini. Tätä tukee myös havainto puuttuminen asetyyliryhmäksi että

1 H ja

13C-NMR spektri M2. Nostolaite on L-kysteinyyli osan sen [6] -shogaol tähteen C-5 perustettiin HMBC rajat huippujen välillä H

Cys-β (δ

H 3,18 ja 2,84) ja C-5 ( δ

C 42,3) (kuvio 1). Siksi M2 vahvistettiin 5-kysteinyyli- [6] -shogaol.

M1 oli molekyylikaava C

20H

33NO

5S pohjalta positiivisen APCI-MS osoitteessa

m /z

400 [m + H]

+ ja sen

1 H ja

13C-NMR-tulokset. Molekyylipaino M1 oli 2 massayksikköä suurempi kuin M2, vastaa sen tosiasian kanssa, että M1 on ketoni-pelkistetty tuote M2, ja tukee myös ulkonäkö happipitoista methines (kaksi protonia, että diastereomeerien δ

H 3,66 ja δ

H 3,90; ja δ

C 69,3) sen

1 H ja

13C NMR-spektrit. Key HMBC korrelaatioita H-3 (δ

H 3,66 ja δ

H 3,90) ja C-1 (δ

C 32,5) ja C-5 (δ

C 43,8), sekä H-1 (δ

H 2,68 ja 2,58) ja C-3 (δ

C 69,3) M1 (kuvio 1), perustettiin hydroksyyliryhmä C-3 alkyylisivuketjulla M1. HMBC rajat huippujen välillä H

Cys-β (δ

H 3,15 ja 2,85) ja C-5 (δ

C 43,8), ja H-5 (δ

H 2,94) ja C

Cys-β (δ

C 32,8) edellyttäen, että kytkös kysteinyyli osan ja C-5-asemassa M1 kautta tioeetterisidos. Siten M1 vahvistettiin 5-kysteinyyli-M6.

M4 osoitti molekyylikaavan C

22H

35NO

6S pohjalta positiivisen APCI-MS at

m /z

442 [M + H]

+ ja sen

1 H ja

13C-NMR-tulokset. Molekyylipaino M4 oli 2 massayksikköä suurempi kuin M5 (5-

N

-acetylcysteinyl- [6] -shogaol), joka täyttää siihen, että M4 oli ketoni-pelkistetty tuote M5. Tätä päätelmää tukevat ulkonäkö happipitoista methines (kahdet protoneja varten diastereomeerien δ

H 3,70 ja δ

H 3,88; ja δ

C 69,3) sen

1 H ja

13C-NMR-spektrit, katoaminen odotettavissa ketonin karbonyyliryhmään [6] -shogaol, ja avain HMBC korrelaatiot havaittiin H-3 (δ

H 3,70 ja δ

H 3,88) ja C-1 ( δ

C 32,5) ja C-5 (δ

C 43,8), sekä H-1 (δ

H 2,67 ja 2,58) ja C-3 (δ

C 69,3) sen HMBC-spektri (kuvio 1). Asetyyliryhmässä osoitettiin kiinnittynyt a-NH

2 kysteinyyli osaan millä HMBC korrelaatio havaitaan H

Cys-α (δ

H 4,54) ja CH

3CO (δ

C 174,0). Lisäksi HMBC rajat huippujen välillä H

Cys-β (δ

H 3,00 ja 2,80) ja C-5 (δ

C 43,8) antoi sidoksen sellaisen acetylcysteinyl osan ja C-5-asemassa M4. M4, niiden vahvistettiin olevan 5-

N

-acetylcysteinyl-M6.

M13, jolla on molekyylikaava C

27H

41N

3 O

9S perusteella positiivisen APCI-MS:

m /z

584 [m + H]

+ ja NMR-tiedot, tehtiin [6] -shogaol ja vähentää L-glutationia (GSH) .

1 H-

1 H COSY rajat piikit löytyy H

Glu-α /H

Glu-β /H

Glu-γ, yhdessä keskeisten HMBC korrelaatioita H

Glu-α (δ

H 3,65) ja Glu α-COOH (δ

C 174,0) sekä H

Glu-γ (δ

H 2,55 ja 2,51) ja Glu γ-CON ( δ

C 175,2), tunnustettu rakenne glutamyyliendopeptidaasi (Glu) (kuvio 1). Rakenne kysteinyylitähde (Cys) perustettiin

1 H-

1 H COSY rajat huiput H

Cys-α /H

Cys-β yhdistettynä HMBC korrelaatio H

Cys-β (kahdet protonien δ

H 3,05-2,95 ja 2,84-2,80) ja Cys α-CON (δ

C 175,2) (kuvio 1). Tämän jälkeen yhteys glutamyyli tähteet kysteinyyli osan välille perustettiin Glu γ-COOH ja Cys α-NH

2 kautta amidisidoksen, jonka HMBC korrelaatiot osoitteessa H

Cys-α (δ

H 4,50) ja Glu γ-CON (δ

C 175,2). Kiinnittämistä glysinyyli osan sen kysteinyylitähde välillä havaittiin Cys α-COOH ja Gly α-NH

2, jonka HMBC korrelaatiot havaittiin H

Gly-α (δ

H 3,80) ja Cys α -CON (δ

C 175,2). Siten GSH jäännös epäilemättä tunnistettiin γ-glutamyyli-kysteiiniglysiiniin. Näin ollen kytkös GSH osan on [6] -shogaol Jäännös perustettiin C-5 läpi tioeetterisidos jonka HMBC korrelaatioita löytyy H

Cys-β (kahdet protonien δ

H 3,05- 2,95 ja 2,84-2,80) ja C-5 (δ

C 42,2). Näin ollen, M13: n varmistettiin olevan 5-glutathiol- [6] -shogaol.

erottaminen M13 isomeerien preparatiivisella HPLC: lla johti kahden diastereoisomeerin, M13-1 ja M13-2, joka oli hyvin samankaltainen kuin

1H ja

13C NMR-spektrit. Suurimmat erot olivat

1H signaalit H

Cys-βb (δ

H 2,73 in M13-1 vs. 2,81 vuonna M13-2) ja H-4a (δ

H 2,76 M13 -1 vs. 2,70 vuonna M13-2) ja

13C signaalit C-4 (δ

C 49,9 vuonna M13-1 vs. 49,6 M13-2) ja C-5 (δ

C 42.0 in M13-1 vs. 42,4 vuonna M13-2) (kuva 4). Heidän NOESY spektri, havaitsimme väliset korrelaatiot H

Cys-βb (δ

H 2,73) ja H-5 (δ

H 3,10) in M13-1 ja H

Cys-BA- ( δ

H 2,97) ja H-5 (δ

H 3,10) in M13-2, mikä viittaa siihen, että H-5 M13-1 oli sama kokoonpano kuin H

Cys-βb ja H- 5 M13-2 oli sama kokoonpano kuin H

Cys-BA-(kuvio 4). On tunnettua, että H

Cys-α in GSH jäännös on

R

kokoonpano (kuvio 4). Kytkimen vakio (

J

= 5,0 Hz) H

Cys-BA- (δ

H 2,97) ja H

Cys-α (δ

H 4,49) on huomattavasti pienempi kuin (

J

= 8,7 Hz) H

Cys-βb (δ

H 2,81) ja H

Cys-α, mikä viittaa siihen, että H

Cys-BA- (δ

H 2,97) on sama

R

konfiguraatio kuin H

Cys-α ja H

Cys-βb on

S

konfiguraatio. Siksi kokoonpanot H-5 M13-1 ja M13-2 oli alustavasti määrätty

S

ja

R

, vastaavasti (kuva 4).

kasvua estäviä vaikutuksia vastaan ​​Human Cancer, ja normaalien solujen

kaksi ihmisen syöpäsolulinjoissa, HCT-116 ja H-1299, käsiteltiin [6] -shogaol tai sen synteettisen metaboliittien M1, M2, ja M4-M13 , jossa konsentraatio on 0-80 uM. Solujen elinkelpoisuus hyödyntäviä määrityksiä MTT johti kahdeksan aktiiviset metaboliitit M2, M5, M6, M8-M11, ja M13, vastaan ​​koolonkarsinoomasoluissa HCT-116, jossa on IC

50-arvot 24.43, 54.26, 68.77, 58.76, 82,22, 78.16, 83.97 ja 45.47 uM (kuva 5), ​​ja kahdeksan aktiiviset metaboliitit, M2, M5, M6, ja M9-M13, keuhkojen syöpäsoluja H-1299, IC

50-arvot 25.82, 72.62, 61,28, 82,50, 60,63, 66,50, 69,91 ja 47,77 uM, vastaavasti (kuvio 6). Niistä, M2, kysteiini konjugoitu metaboliitti [6] -shogaol, havaittiin olevan tehokkain kohti sekä HCT-116 ja H-1299-solujen IC

50-arvot 24,43 ja 25,82 uM, vastaavasti, mikä oli verrattavissa emo [6] -shogaol, jossa IC

50 18,20 uM HCT-116-soluissa ja IC

50 17.90 uM H-1299-soluissa. Toiseksi eniten aktiivinen metaboliitti oli 5-glutathionyl- [6] -shogaol (M13), jossa IC

50-arvot 45.47 ja 47.77 uM HCT-116 ja H-1299-soluissa, vastaavasti. 5-

N

-acetylcysteinyl- [6] -shogaol (M5) myös näytteillä havaittavissa bioaktiivisuus IC

50-arvot 54.26 uM HCT-116-soluissa ja 72,62 uM H-1299-soluissa. Tämä metaboliitti on kuitenkin näkyy vähentynyt aktiivisuus verrattuna, että 5-kysteinyyli- [6] -shogaol (M2), mikä viittaa siihen, asetylointi on α-NH

2 kysteinyyli osan vähentää aktiivisuutta M2. Lisäksi vähentäminen ketoni ryhmä alkyylisivuketjulla johti juurikaan mitään aktiivisuutta syöpäsolujen HCT-116 ja H-1299, havaittuna M1 ja M4 versus M2 ja M5 sekä M6, M9 ja M11 versus [6] -shogaol, osoittaa pelkistävä biotransformaatiota [6] -shogaol ja sen aineenvaihduntatuotteiden oli ensisijaisesti inaktivoimalla.

Bar

, keskivirhe (n = 6).

Bar

, keskivirhe (n = 6).

Arviointi sytotoksisuuden ihmisen normaalia fibroblastien paksusuolen solut CCD-18Co ja ihmisen normaali keuhkojen solut IMR-90 osoitti, että kaikki synteettiset metaboliittien (M1, M2, ja M4-M13) olivat vähemmän myrkyllisiä kuin vanhempi [6] -shogaol, ja useimmat niistä oli vain vähän tai ei lainkaan estävää vaikutusta (kuviot 5 ja 6), mikä osoittaa myrkkyjä metabolinen biotransformaatio [6] -shogaol. Vielä tärkeämpää on, metaboliitin M2, jolla on suurin teho vastaan ​​sekä HCT-116 ja H-1299 syöpäsoluihin, osoitti lähes mitään toksisuutta kohti normaaleja paksusuolen solujen CCD-18Co ja normaalin keuhkojen solut IMR-90 IC

50-arvot 99,18 ja 98.30 uM, verrattuna emo [6] -shogaol kanssa IC

50 43.91 uM kohti normaalia koolonsolulinjassa CCD-18Co ja IC

50 36.65 uM kohti normaalia keuhkojen solulinjan IMR -90. Lisäksi M13, jossa IC

50-arvot 75.50 ja 57.54 uM vastaan ​​soluja CCD-18Co ja IMR-90, vastaavasti, näytetään myös alhaisempi myrkyllisyys kuin vanhempi [6] -shogaol.

Jotta vaikutuksen tutkimiseksi stereokemia aktiivisuuteen, metaboliitin M13, kuten diastereomeerien seos, erotettiin käänteisfaasi preparatiivisella HPLC: llä kahteen yksittäiset isomeerit, M13-1 ja M13-2. Syöpäsolut HCT-116 ja H-1299 käsiteltiin M13 tai sen muodostavia stereoisomeerit (M13-1 ja M13-2) yksittäin, jossa konsentraatio on 0-80 uM. Löysimme molemmat isomeerit olivat samanlaisia, mutta hieman vähemmän aktiivisuutta kuin M13, ja M13-2 olevan hieman tehokkaampi kuin M13-1, jossa IC

50-arvo 54.90 uM HCT-116-soluissa ja 63,77 uM H-1299 solut, vs. 71,20 uM ja 74,39 uM samoihin solulinjoissa (kuvio 7). Liuotettu M13 yksityishenkilöiden M13-1 ja M13-2 kanssa suhteessa noin 1:02 (molaarinen /molaarinen), joka on samanlainen suhde alkuperäisessä M13, näkyy vastaava aktiivisuus, IC

50-arvot 46,46 uM HCT-116 solujen ja 41.98 uM H-1299 solu, verrattuna alkuperäiseen M13 IC

50-arvot 45.47 uM HCT-116-soluissa ja 47.77 uM H-1299-soluissa. Tämä viittasi siihen, että havaittu kasvua estävää vaikutusta M13 ei voida osoittaa yhtä isomeeriä tai toisella.

Bar

, keskivirhe (n = 6).

M2 ja M13 indusoida apoptoosia ihmisen syöpäsoluja

monissa tapauksissa, solukuolema on seurausta aktivoinnin suuret sääntelyn reitti kutsutaan apoptoosia tai ohjelmoitua solukuolemaa. Meidän tavoitteena oli määrittää, onko apoptoosin laukaisi altistuksen jälkeen [6] -shogaol ja sen metaboliittien käyttämällä TUNEL määritystä, joka havaitsee DNA taukoja ominaista solujen apoptoosin. Tässä tutkimuksessa testasimme kaksi eniten aktiivisten metaboliittien vastaan ​​syöpäsolujen kasvua, M2 ja M13, samoin kuin yksi runsaasti metaboliitit, M6, sekä [6] -shogaol. Olemme inkuboitiin H-1299 ja HCT-116-solujen kanssa, ne eri pitoisuuksina määrittää aktiivisen erilaisia ​​näiden yhdisteiden verrattuna pelkästään DMSO. Tulokset on esitetty kuviossa 8. Kun 24 tunnin inkubaation, metaboliitin M6 ei ole mitään apoptoottista vaikutusta HCT-116 ja H-1299-solulinjat. Merkittävä apoptoosia havaittiin M2 ja M13 molemmissa solulinjoissa, paitsi M2 H-1299-solujen 20 uM. Apoptoosin mukaan [6] -shogaol oli merkittävästi parempi kuin sekä M2 ja M13 samana pitoisuutena (20 uM). H-1299-soluissa, vastaava apoptoottinen vaikutus [6] -shogaol voitaisiin saavuttaa, jos pitoisuus M2 ja M13 oli kaksi kertaa (40 uM) kuin [6] -shogaol. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin HCT-116-solut, paitsi että M2 apoptoottinen induktio oli huomattavasti korkeampi 40 pM. Kaikissa solulinjoissa, kasvu pitoisuudesta [6] -shogaol, M2, M13, M13-1, M13-2 tai M6 tuotti vastaavaa kasvua apoptoottisten tasolla syöpäsoluissa (kuvio 8A ja 8B).

TUNEL positiivisia soluja ei ole havaittu 400X voima. 10 näkökenttään objektilasia kohti on laskettu ja keskiarvo.

Bar

, keskivirhettä; o, ei merkittävää; +, P 0,05; *, P 0,01; **: P 0,0001. Kaikki tilastolliset testit ovat parittomia Studentin t-testi, 2 pyrstö, verrattuna DMSO tai vastaava [6] -shogaol keskittyminen.

Sen määrittämiseksi, jos apoptoottinen vaikutus havaittiin kuviossa 8A ja 8B oli vakaana, inkuboimme [6] -shogaol, M2 ja M13 HCT-116-solut vain 6 tuntia (kuvio 8C). 6 tunnin kuluttua inkubaation [6] -shogaol tai niiden aineenvaihduntatuotteita, M2 tai M13, pystyimme havaitsemaan huomattavasti korkeampi apoptoosin kaikissa 3 yhdisteiden verrattuna DMSO HCT-116-solut. Kiinnostavaa ei ollut merkittävää eroa apoptoottisten vaikutus [6] -shogaol ja vaikutukset M2 20 ja 40 uM, ja M13 on 40 uM. M13 oli merkittävästi tehokkaampi kuin [6] -shogaol 20 uM. Altistuminen HCT-116-solujen M13 isomeerit M13-1 ja M13-2 osoitti myös korkeampi apoptoosin, mutta isomeerit ”apoptoottinen vaikutus oli merkittävästi heikompi verrattuna [6] -shogaol molempien pitoisuuksia käytetään. Nämä tulokset osoittavat, että apoptoosin laukaisee [6] -shogaol metaboliittien M2, M13, M13-1 ja M13-2, ja se on mekanismi vastuussa, ainakin osittain, että solukuoleman havaittu aiemmin.

Keskustelu

nyt on yleisesti hyväksytty, että luonnollisia yhdisteitä tarjoavat mahdollisuuden puuttua alkuvaiheessa syöpä tai estää sen kokonaan kehittymästä [16]. Nämä yhdisteet eivät on rajansa, kuten nopeasti

in vivo

liikevaihdon, vähäisiä määriä elintarvikkeissa, ja niiden mahdollinen myrkyllisyys suuremmilla annoksilla [17]. On huomionarvoista, että syöpälääkkeen vaikutuksia näiden yhdisteiden voidaan havaita kohorttitutkimuksissa huolimatta lyhyt puoliintumisaika ja nopea aineenvaihdunta kerran nautittuina [18]. Usein yhdisteen läsnä ollessa voidaan arvioida määrällisesti aineenvaihduntatuotteiden, mikä viittaa siihen, että nämä metaboliitit kiertävät elimistössä tietyn aikaa ja mahdollisesti vuorovaikutuksessa biologisten prosessien [19]. Näin ollen, yksi hypoteesi selittää bioaktiivisuus luonnollisia yhdisteitä on, että metaboliitit itsellään ja suorittaa osan tai kaikki alkuperäisen yhdisteen biologinen aktiivisuus. Tässä tutkimuksessa selvitettiin tätä mahdollisuutta käyttää [6] -shogaol, pääkomponentti kuivattua inkivääriä, ja sen aineenvaihduntatuotteet.

edellinen tutkimus on osoittanut, että [6] -shogaol metaboloituu hiirissä ja syöpäsoluissa ja enemmän kuin 90% [6] -shogaol muutetaan sen aineenvaihduntatuotteiden [12]. Olemme myös huomanneet, että ihmisen normaalien solujen IMR-90 jossain määrin metaboloituu [6] -shogaol samalla tavalla syöpäsoluihin (tuloksia ei ole esitetty). Tämän seurauksena nopea metabolia [6] -shogaol voisi antaa mahdollisuuden sen vakaan aineenvaihduntatuotteiden sekaantua biologisissa prosesseissa, jos heillä bioaktiivisuuksiin. Jotta voidaan tarkistaa tämän hypoteesin, se on kriittinen saada aineenvaihduntatuotteet stabiilissa muodossa. Erillään niiden luonnollisesta ympäristöstään ei olisi kätevää ja todennäköisesti ei saataisi tarvittavia määriä kokeellisen biologian. Kemiallinen synteesi on paljon toivottavaa, toistettavissa, ja tehokas. Olemme puhdistettu M6-M12 hyvin pieniä määriä (0,5-17 mg) ulostenäytteistä kerätty [6] -shogaol hoidetut hiiret [12]. Jotta tarpeeksi määrä edelleen tutkia biologista aktiivisuutta [6] -shogaol aineenvaihduntatuotteita, kuvaamme kemian vaiheet mahdollistaa synteesin tärkeimpien metaboliittien [6] -shogaol tässä tutkimuksessa. Kaksitoista metaboliitit [6] -shogaol (M1, M2, ja M4-M13) syntetisoitiin onnistuneesti käytännöllisiä lähestymistapoja. Rakenteiden synteettistä metaboliittien varmennettiin käyttäen 1-D ja /tai 2-D-NMR-tiedot sekä massaspektrit.

verrattuna kasvua inhiboivia vaikutuksia synteettisen metaboliittien [6] -shogaol kahdessa ihmisen syöpäsolut ja kaksi ihmisen normaaleja soluja. Tuloksemme osoittivat, että kaksi aineenvaihduntatuotteita, M2 ja M13, hallussaan parhaiten verrattavissa kasvua estäviä vaikutuksia on [6] -shogaol kohti syöpäsoluja. Tärkeintä on, M2 näytteillä syrjivä vaikutus, koska se ei näytä olevan myrkyllistä kohti normaaleja soluja. Tätä vaikutusta ei ole havaittu [6] -shogaol. M13 osoitti myös vähemmän myrkyllisiä vaikutuksia kohti normaaleja soluja verrattuna [6] -shogaol. Lisäksi M5, M6 ja M8-M12 oli myös tiettyjä teho vastaan ​​syöpäsolujen kasvua, mutta ei todettu myrkyllisyyttä kohti normaaleja soluja IC

50-arvot yli 100 mikroM (kuviot 5 ja 6). Tuloksemme osoittavat selvästi, että aineenvaihduntatuotteiden [6] -shogaol pysyvät bioaktiivisia syöpäsoluja vastaan, mutta ovat vähemmän myrkyllisiä kuin [6] -shogaol normaaleille soluille. Tämä vahvistaa hypoteesia, että aineenvaihduntatuotteet itsellään ja kuljettaa osittain tai kokonaan alkuperäisen yhdisteen biologinen aktiivisuus.

Apoptoosi on mekanismi usein vastuussa induktioon solukuoleman vastauksena sisäisiä tai ulkoisia stressiä. Jotta saadaan käsitys vaikutusmekanismia aineenvaihduntatuotteiden, teimme TUNEL määritystä HCT-116-soluihin käyttäen M2, M6, M13 ja sen kaksi isomeeriä, M13-1 ja M13-2 ja verrattiin niiden toiminta kuin [ ,,,0],6] -shogaol. Se osoitti, että sekä M2 ja M13, mutta ei M6, pystyvät indusoimaan syöpäsolujen apoptoosia sekä HCT-116 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa ja H-1299 ihmisen keuhkosyövän soluja (kuvio 8A ja 8B). M13, apoptoosin ei tiukasti johtua yhtä isomeeriä tai muita, viittaa siihen, että stereo-kokoonpano ei ole tärkeää biologista aktiivisuutta tätä yhdistettä. Havaitsimme, että molemmat M2 ja M13 voi laukaista apoposis HCT-116-soluissa tasolle samanlainen kuin [6] -shogaol klo 6 tunnin kohdalla (kuvio 8C). Kuitenkin, kun 24 tunnin altistumisen metaboliiteiksi prosenttiosuus Tunel-positiivisten solujen oli pääosin ennallaan 20 uM sekä M2 ja M13 vaikka vaikutus [6] -shogaol oli huomattavasti kasvanut. Induktion vaikutusta M2 apoptoosin, jonka konsentraatio on 40 uM kasvanut dramaattisesti klo 24 tunnin kohdalla verrattuna 6 tunnin kohdalla, joka oli merkittävästi korkeampi kuin M13 on 40 uM. Havaitsimme myös pitoisuudesta riippuvaa vaikutusta [6] -shogaol ja sen aineenvaihduntatuotteiden syöpäsolujen apoptoosia, jossa on havaittu yhdisteen konsentraatio, joka johti vastaavan lisääntynyt prosenttiosuus apoptoottisten solujen. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, että on todennäköistä, että aktivointi muita mekanismeja mukana käynnistävät syöpäsolun kuoleman, mutta apoptoosia näyttää olevan yksi tärkeimmistä aktivoitu väyliä [6] -shogaol metaboliittien aiheuttaa syöpää solukuoleman.

Se on aina haaste erottaa stereo isomeerejä. Kaikista syntetisoitu metaboliittien M13 oli ainoa diastereomeerit seoksen että pystyimme erottaa käyttämällä ei-kiraalista HPLC: llä sarakkeeseen. Tuloksemme osoittivat, että M13 kuin sekoitus M13-1 ja M13-2 oli hieman parempi kasvua estäviä vaikutuksia syöpäsoluihin kuin kaksi diastereomeeriä yksin M13-1 ja M13-2 oli samankaltainen aktiivisuus, vaikka M13-2 oli hieman tehokkaampi kuin M13-1. Vielä tärkeämpää on, emme tarkkailla M13 kuin metaboliitti [6] -shogaol muodossa seosta M13-1 ja M13-2 HCT-116 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa (tuloksia ei ole esitetty). Olisi hyödyllistä erottaa kaksi diastereomeeriä M2, kaikkein aktiivinen metaboliitti [6] -shogaol, käyttäen kiraalista pylvästä ja edelleen määrittää vaikutus stereokonfiguraatio aktiivisuutta tätä yhdistettä tulevaisuudessa tutkimuksessa. Olemme äskettäin tunnistettu M2 metaboliitti [6] -shogoal ihmisillä (julkaisematon data). Näin ollen on tärkeää määrittää, jos M2 on olemassa seoksena kahden diastereomeerin hiirissä ja ihmisissä.

Johtopäätöksenä on, että esillä olevassa tutkimuksessa olemme voineet osoittaa, että aineenvaihduntatuotteiden [6] -shogoal voi selittää bioaktiivisuus kantayhdisteen, ja nimenomaan laukaisee molekyylitason väyliä vastuussa syöpäsolun kuoleman samalla tavalla. Se viittaa siihen, että syövän vastainen vaikutus johtuu yhdisteiden, kuten [6] -shogoal on mahdollisesti osittain muunnellut aikaisemmin. Mikä oli alun perin ajateltiin olevan vaikutusta luonnon yhdiste saattaisi olla suoraa seurausta nopeasta metaboliasta yhdisteen, jolloin se vähemmän voivat herättää molekyylitason mekanismeja. Kuitenkin ilmestys sen aineenvaihduntatuotteet kohdekudoksissa tällöin täydentää, ylläpitää tai korvata kokonaan bioaktiivisia vaikutus alkuperäisen yhdisteen. Täydentävä

in vivo

tutkimuksiin perustuva saada lopullista vastausta tähän kysymykseen, mutta jo nyt tutkimuksen esitetään tässä avaa uusia tutkimuksen mahdollisuuksia tutkimukseen bioaktiivisten metaboliittien [6] -shogaol.