Krooninen sairaus

tiivistelmä

yhdistelmä immunoterapian ja kemoterapia on osoittanut lupaus syövän. Interleukiini-7 (IL-7) voidaan mahdollisesti lisätä immuunivasteita kasvainta, kun taas oksaliplatiinin (OXP), platina-pohjainen lääke, voi edistää suotuisa immuunivaste mikroympäristön ja stimuloida syövän vastaista immuunivastetta. Arvioimme anti-kasvain aktiivisuus IL-7 yhdistyvät OXP vastaan ​​hiiren paksusuolen karsinooma in vitro ja in vivo, ja tutkittiin kasvaimen immuunijärjestelmän mikroympäristön tutkia, onko yhdistetty hoito vaikuttaa paikallisen immuunijärjestelmän solujen populaatioita. Hyödyntämällä keuhkojen ja vatsan etäpesäkkeiden malleja siirrostamalla CT26 hiirillä paksusuolen syöpäsoluissa, arvioimme antituumoritehoon yhdistämällä IL-7 ja OXP hiirillä malleissa. Kasvaimen immuuni microenvironment arvioitiin virtaussytometrianalyysillä ja immunohistokemiallisella värjäyksellä. Tutkimuksemme osoitti, että antaminen in vivo IL-7 yhdessä OXP inhiboivat merkittävästi kasvainten kasvua keuhkoissa ja vatsassa etäpesäke malleja paksusuolen syöpä. IL-7: llä ei ollut vaikutusta kasvaimen kasvua hiirissä ja IL-7 ei muuttanut solun herkkyyttä OXP kulttuuriin. Antituumorivaikutuksen vaikutus yhdistämällä IL-7 ja OXP korreloi selvästi lisääntynyt määrä kasvaimeen infiltroivien aktivoida CD8 + T-solut sekä huomattava väheneminen säätelijä-T (Treg-solut) pernassa. Tuloksemme viittaavat siihen, että OXP plus IL-7 hoito estää tuumorisolujen kasvua immunoregulaatio sijasta suoraan sytotoksisuuteen. Meidän päätelmät oikeuttavat lisäarviointia yhdistää IL-7 ja kemoterapia uusina kokeellinen syövän hoidossa.

Citation: Gou HF, Huang J, Shi HS, Chen Xc, Wang YS (2014) Chemo-immunoterapia kanssa Oksaliplatiini ja interleukiini-7 Estää Colon Cancer etäpesäke hiirissä. PLoS ONE 9 (1): e85789. doi: 10,1371 /journal.pone.0085789

Editor: Fabrizio Mattei, Instituto Superiore di Sanità, Italia

vastaanotettu: 16 syyskuu 2013; Hyväksytty: 05 joulukuu 2013; Julkaistu: 21. 2014

Copyright: © 2014 Gou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Oksaliplatiini (OXP), jota käytetään yleisesti peräsuolen syöpä, on hiljattain havaittu lisäävän immunogeenisyyttä syöpäsolujen ja indusoida immunogeenisen solukuoleman [1]. Lisäksi on havaittu, että OXP voivat parantaa immuunivastetta kasvaimia vastaan ​​vähentämällä sääntely /vaimennin-solut: säätelijä-T (Treg-solut) ja myeloidinen johdettuja vaimennin solut (MDSCs) ja suhde kasvaa sytotoksisten CD8 + T-lymfosyyttien (efektorisolujen ) versus immunosuppressiiviset solupopulaatioiden kasvaimen microenviroment [2], [3], [4].

interleukiini-7 (IL-7) on yksi interleukiini-2 (IL-2) liittyvien sytokiinien että osuus ja signaali kautta γ-ketju vaikuttaa T-solujen lisääntymistä, kehitys ja homeostaasin [5], [6], [7], [8]. IL-7 on tuotettu erilaisia ​​strooman solujen kateenkorvassa ja luuytimessä, ja myös verisuonten endoteelisoluissa, suolen epiteeli, keratinosyytit, ja follikulaarinen dendriittisolut [9], [10]. IL-7 edustaa mahdollinen hoito parantaa T-solujen saattamisen ja rokotteen tehoa kuin sillä on erilliset toimia eri osa T-solujen [11]. IL-7 edistää myös antigeenispesifisen T-solujen sytolyyttinen aktiivisuus [12], [13], [14]. IL-7 on jatkuvasti yhtä tehokas kuin IL-2 ylläpitäessään T-soluihin [13], [14]. Esimerkiksi on osoitettu, että tuumorisolulinjoja, jotka on transfektoitu IL-7-geeni vähentää T-solun riippuvainen kasvainten muodostumiseen hiiren malleissa [15], [16]. Samoin paikallinen tai systeeminen anto IL-7 on anti-kasvain vaikutuksia tehostamalla immuunivastetta kasvaimia [17], [18], [19], [20], [21], varsinkin yhdistettynä muiden immuunijärjestelmän hoitoon. Kyky parantaa immuunivastetta pahanlaatuisia kasvaimia IL-7 on huomattavia vaikutuksia immunoterapiaan kasvainten hoidossa.

yhdistelmä kemoterapian kanssa immuunivasteen muokkaajia, kuten interleukiini 2 (IL-2) tai interferoni-α (IFN-α), kutsutaan kemoterapia-immunoterapian, on osoittanut lupaavia antituumorivaikutus melanoomaan [22], [23]. Sytotoksiset kemoterapeuttiset aineet olivat perinteisesti pidetty immunosuppressiivista sivuvaikutuksia ja vaikuttaa haitallisesti kasvaimen vastaisen immuniteetin koska niiden epäspesifinen sytostaattinen ja sytotoksisia vaikutuksia. On kuitenkin kertynyt näyttöä siitä, että tietyissä olosuhteissa jotkut näistä aineet voivat vaikuttaa kasvain immunologinen microenviroment ja stimuloida syövän vastaisen immuunivasteen [3], [4], [24], [25], [26]. Se on järkevä kehitys yhdistää nämä immunostimulatiivisen sytotoksisten kemoterapeuttisten aineiden kanssa immuunivasteen määritteet.

Edellä esitetyn perusteella, me hypoteesia, jonka yhdistelmä IL-7 ja OXP voivat lisätä antituumorivaikutuksen indusoimalla laajentaminen T-solujen ja estää T-solujen estävä reittejä kasvain immunologiseen microenvironment. Tutkimuksessamme olemme arvioitiin antituumorivaikutuksen IL-7 yhdessä OXP vastaan ​​hiiren paksusuolen karsinooma in vitro ja in vivo ja tutkittiin kasvaimen immuunijärjestelmän mikroympäristön tutkimaan, onko tätä yhdistettyä hoitoa vaikuttaa paikallisen immuunijärjestelmän solujen populaatioita. Tuloksemme osoittavat OXP plus IL-7 on huomattavasti tehokkaampi kuin IL-7 tai OXP yksin estämällä kasvaimen kasvua in vivo. Tuloksemme viittaavat siihen, että OXP ja IL-7 käsittely inhiboi kasvainsolujen kasvua immunosäätelyssä eikä suoraan sytotoksisuuteen.

Materiaalit ja menetelmät

solulinja

koolonkarsinoomasolulinja CT26 oli saatu American Type Culture Collection (ATCC). Soluja viljeltiin rutiininomaisesti yksikerroksisina 75-cm

2 square kudosviljelypulloissa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2 ilmassa. Viljelyväliaine sisälsi RPMI 1640 (Life Technologies, Bedford, MA), jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä. Solulinja oli mycoplasma vapaa.

tumorigeneesin malli

Patogeenittomia naaras BALB /c (6-8 viikkoa vanhoja) hiiret hankittiin Vital River Laboratory Animal Technology Co Ltd, Beijing. Protokolla hyväksyttiin eläinten eettisen komitean Sichuanin yliopistossa. Kaikki eläinkokeet suoritettiin erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa in vakiintuneiden ohjeiden mukaisesti.

Ennen in vivo injektio hiiriin, syöpäsolut eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa otettiin talteen, pestiin kolmesti PBS: llä, laskettiin, ja laimennettu tämä ratkaisu ennen in vivo injektio. Perustaa keuhkojen etäpesäkkeiden malli, yhteensä 1 x 10

6 CT26 paksusuolen syövän soluja injektoitiin häntälaskimoon syngeenisten BALB /c-hiirissä. Perustaa vatsan etäpesäke malli, yhteensä 1 x 10

6 CT26 koolonkarsinoomasoluissa injektoitiin intraperitoneaalisesti. Kasvain jälkeen hiiriä tarkkailtiin kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen.

Päivänä 6 jälkikäsitelty tuumorin istuttamisen kutakin mallia satunnaistetaan 4 ryhmään 8 hiirtä kussakin ryhmässä edelleen hallinto seuraavasti: ryhmä ohjaus ( fosfaattipuskuriliuoksella, PBS), ryhmä IL-7, ryhmä OXP, ja ryhmä IL-7 yhdistettynä OXP. Vatsan etäpesäke mallia OXP annettiin i.p. annoksella 5 mg /kg 3 päivän välein 12 päivää. Keuhkoissa etäpesäke mallia, OXP annettiin i.v. annoksella 5 mg /kg 3 päivän välein 12 päivää. IL-7 (5 ug /päivä) annettiin i.p. päivittäin 12 päivää.

Eläimet tapettiin päivänä 13 ensimmäisen käsittelyn jälkeen. Metastaattinen kasvain kyhmyjä subpleural alueilla keuhkoissa laskettiin alla preparointimikroskooppia ja painotetaan. Kylvö etäpesäkekasvainten kyhmyt vatsaonteloon laskettiin paljaalla silmällä ja painotettuna.

reagenssit

Rekombinantti ihmisen IL-7 (IL-7) ostettiin Shanghai PrimeGene Bio-Tech Co., Ltd ja laimennetaan steriiliä tislattua vettä. OXP ostettiin Sanofi-Aventis (Ranska) ja laimennetaan steriili glukoosi. Fluoresoivasti konjugoidun virtaussytometrialla anti-hiiri-vasta-aineita (Ab: t) CD4, CD8, CD69, CD11, CD11 c, Gr-1, ja isotyypin vasta-aineita saatiin BD Pharmingen. F4 /80 saatiin BioLegend. Mouse Regulatory T Cell Värjäys Kit saatiin eBioscience. Immunohistokemiallisesti vasta paria hiiren CD8 ostettiin ABGENT. Ki-67 hankittiin Novus Biologicals, ja apoptoosi Detection Kit hankittiin (Promega Corp., Madison, WI).

3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5- difenyylitetratsoliumbromidia määritys (MTT) B

3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi 96-kuoppaisen levyn määritystä käytettiin määrittämään suhteelliset määrät solujen kuoppiin jälkeen altistuminen erilaisille tekijöille. CT26-solut maljattiin 1,000cells /kuoppa 96-kuoppalevyille, ja sitten inkuboitiin vielä 24 tuntia. Viisi rinnakkaista kuoppaa käytettiin näissä määrityksissä. Seuraavaksi eri pitoisuusgradientit IL-7 (25 ng /ml, 50 ng /ml, 75 ng /ml, 100 ng /ml) ja OXP (10 umol /l, 30 umol /l, 50 umol /l), lisättiin kaivoihin ja inkuboitiin 24 h, 48 h: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2 37 ° C: ssa. Kaikki määritykset sisältyvät asianmukaista valvontaa. Lopussa Inkubaation elävät solut kvantitoitiin käyttäen 3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT). Lyhyesti, 20 ui MTT-kantaliuos (5 mg /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan määrityksen. 2 h kuluttua inkuboinnin väliaine poistettiin ja muunnetaan väri liuotettiin DMSO: n kanssa (150 UL /kuoppa). Absorbanssi muutetaan väriaineen mitattiin aallonpituudella 540 nm. Muuntaminen solujen määrä perustui standardikäyrän. Prosenttiosuus solujen eloonjäämistä (eloonjäämisaste) laskettiin jakamalla absorbanssi arvo käsitellyn näytteen kuin käsittelemätön kontrolli kunkin ryhmän sisällä.

Virtaussytometrinen analyysi

Osoitetuilla aikapisteillä kasvaimet ja pernat kerättiin hiiristä, jauhettiin pieniksi paloiksi ja mekaanisesti dispergoidaan 3-5 ml: aan kylmää RPMI. Kasvaimet solut hajotettiin 1 mg /ml kollagenaasi IV (Sigma), 0,1 mg /ml DNaasia (Sigma) RPMI 1640: ssä 37 ° C: ssa 1 h. Pernasolut depletoitiin punasolujen osmoticlysis ja säädettiin pitoisuuteen 1 x 10

5 solua 100 ul: ssa PBS: ää. Tämän jälkeen yksisoluiset suspensiot tuumorisolujen ja pernasolujen värjättiin 30 minuutin ajan jäillä 1 ug seuraavista fluorokromileimattuja vasta-aineet, CD4, CD8, CD69, CD11, CD11 c, F4 /80, tai sovitettu isotypy kontrollivasta-aineita ja pestiin sitten kerran PBS: llä. Solunsisäinen värjäys FoxP3 suoritettiin käyttäen hiiren säätelevien T-solujen värjäytymisen kit, mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solut hankkineensa FACSCablibur -virtaussytometrissä (BD Biosciences), ja 10,000_20,000 porteilla tapahtumia kerättiin. Kerätyt tiedot analysoitiin FlowJo ohjelmisto 7.6. Vuonna Sytometrinen analyysissa portti dataa FSC ja SSC bivariate juoni, piirrä alueen ympärille klusterin lymfosyyttien ja sitten portti fluoresenssi histogrammi niitä. Tämä portti, FSC vs. SSC mielestä kerran perustettu, levitetään sitten analyysiin kaikkien myöhempien näytteiden. Kolme hiirtä kustakin ryhmästä tapettiin arvioimaan immunosyytti CD merkki ilme.

immunohistokemiallinen värjäys

irrotettiin kasvaimista kiinnitettiin 10% formaliinilla upotettiin parafiiniin ja leikattiin 4 um paksuuteen. Osat käytettiin analyysiä varten ekspression CD8, ja Ki-67 immunohistokemiallisesti värjäämällä asiaan monoklonaalinen vasta-aine. Näytteet immunovärjättiin tavallisilla leimattu streptavidiini-biotiini-protokollaa. Lyhyesti, osa 4 um asennettu silanoidun dioja ja sen annettiin kuivua yön yli 37 ° C: ssa. Jälkeen deparaffinization ja antigeenin haku, kudoksen leikkeitä inkuboitiin CD8-vasta-aineen (1:250 laimennos) ja Ki-67 antinbody (1:200 laimennos) 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan ja sitten 4 ° C: ssa yön yli. Sitten leikkeitä inkuboitiin biotinyloidun vuohen anti-hiiri immunoglobuliini G (Zymed Laboratories Inc., USA) ja sen jälkeen inkuboitiin piparjuuren leimatulla streptavidiinilla (Zymed Laboratories Inc., USA). 3, 3′-diaminobentsidiiniä käytettiin kromogeenista tai hematoksyliinillä kuin vastavärjättiin. Kolme hiirtä ryhmää kohti analysoitiin.

arviointi immunohistokemiallisella värjäyksellä

aste CD8 + tunkeutuminen havaittiin yli 10 itsenäistä suuritehoisia (x 200) mikroskooppikentäs- kunkin kudosnäytteen. Viisi mikroskooppikentäs- kanssa runsain jakauma valittiin sisällä syöpäsolun pesä. Keskimääräinen lukumäärä CD8 + T-solujen laskettiin viisi mikroskooppikentäs- [27]. Määritys proliferatiivisen aktiivisuuden Ki-67 imunohistochemistry suoritettiin kvantitatiivisesti laskemalla immunoreaktiivisten kasvainsolujen voimakkain värjäytyminen alueilla. Kussakin näytteessä, vähintään 1000 kasvainsolujen pisteytettiin mikroskooppisen alueilla osoittaa korkeaa Immuunivärjäystä ja tulokset ilmaistiin positiivisten solujen prosenttiosuuden [28].

Terminal deoksinukleotidyylitransferaasilla dUTP nick end merkinnät (TUNEL) Pitoisuus

kohdat, samat kuin ne, joita käytetään immunokemian analyysissä käytettiin in situ analyysi apoptoosin TUNEL. TUNEL värjäys suoritettiin in situ apoptoottisen solu- havaitseminen pakki valmistajan ohjeiden protokollaa. Levyjä tarkkailtiin Olympus fluoresenssimikroskoopissa kiinnitetty CCD-kenno kamera. Kuvat otettiin hankitusta × 10 ja x 40 tavoitteet käyttäen Image-Pro -ohjelmisto. Apoptotic indeksi määritettiin laskemalla keskimääräinen lukumäärä ytimien apoptoottisten solujen 5 korkean tehon mikroskooppikentäs- (× 400) valitaan keskialueelle elinkelpoinen kasvain alueilla, välttäen alueita sisältäviä kuolion [29].

Tilastollinen analyysi

Prism versio 5.0 (GraphPad Software) käytettiin piirustus kaavioita ja tilastollinen analyysi. Tulokset ilmoitetaan keskiarvona ± keskivirhe (SE). Dual vertailut tehtiin käyttämällä paritonta Student

t

testiä.

P

0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

In vitro

vaikutus OXP plus IL-7 kasvuun CT26 solut

Voit selvittää IL-7 vaikuttaa suoraan kasvuun CT26 solujen tai parantaa niiden herkkyyttä OXP in vitro, vaikutus IL-7 yksin ja IL-7 plus OXP on CT26 soluihin määritettiin kulttuuri . CT26-soluja viljeltiin in vitro IL-7 (25 ng /ml, 50 ng /ml, 75 ng /ml, 100 ng /ml) yksinään tai yhdessä OXP kolmena konsentraationa 10 umol /ml 50 umol /ml . Suhteellinen määrä elinkelpoisia soluja arvioitiin sitten 24, 48 tuntia myöhemmin vastaavasti. OXP aiheuttama odotettu pitoisuudesta riippuva solujen kasvun esto. Nopeus kasvainsolujen kasvua ei ollut merkitsevää eroa millään annostasolla IL-7 niistä havaittiin kontrolliviljelmiin. Ja lisäksi IL-7 ei merkittävästi muuttanut CT26 solujen kasvua tai niiden herkkyys OXP (Fig. 1).

CT26-soluja viljeltiin in vitro IL-7 (25 ng /ml, 50 ng /ml, 75 ng /ml, 100 ng /ml) yksinään tai yhdessä OXP kolmena konsentraationa 10 umol /ml 50 umol /ml ja suhteellinen määrä elinkelpoisia soluja arvioitiin 24, 48 tuntia myöhemmin vastaavasti. Kukin pylväs keskiarvoa ± keskivirhe (N = 5). a. OXP aiheuttama odotettu pitoisuudesta riippuva solujen kasvun esto. b. IL-7 yksin ei ollut vaikutusta CT26 solujen kasvua in vitro. Nopeus kasvainsolujen kasvua ei ollut merkitsevää eroa millään annostasolla IL-7 niistä havaittiin kontrolliviljelmiin. c ja d. Lisääminen IL-7 ei merkittävästi muuttanut CT26 solujen kasvua tai niiden herkkyys OXP.

yhdessä IL-7 lisää kasvainten vastaisen vaikutuksen OXP in vivo

tutkii, onko IL-7 voi parantaa kasvaimen vastainen teho OXP tuumoreita hiirissä, kaksi mallia perustettiin. Hiiren CT26 paksusuolen syövän soluja injektoitiin BALB /C-hiiriä i.v. luoda keuhkometastaasitestissä malli ja i.p. vahvistaa vatsan etäpesäke mallia. Hiiret saivat seuraavat hoidot: PBS; IL-7 (5 ug /injektio); OXP (5 mg /kg /injektio); ja IL-7 (5 ug /injektio) yhdistettynä OXP (5 mg /kg /injektio), mukaan edellä mainitun aikataulun. Hiiret lopetettiin päivänä 13 ensimmäisen käsittelyn jälkeen.

keuhkometastaasitestissä malli, keuhkot poistettiin ja punnittiin. Kokonaismäärät keuhkojen etäpesäkenystyröiden osa-keuhkopussin alueiden keuhkot laskettiin alle leikkelyn laajuus. Tulokset ilmaistiin keskiarvona ± S.E. Tulokset osoittivat selvästi, että yhdistelmä-IL-7 ja OXP saavutetaan paras terapeuttinen vaikutus, kuten mitattiin anti-kasvain vaikutus. Kuten on esitetty kuviossa. 2a (n = 3), IL-7, kun sitä annetaan yhdessä OXP, oli suurempi kuin 2,55-kertaiseksi, 1,73-kertainen, 2,07-kertainen väheneminen etäpesäkenystyrät keuhkojen verrattuna PBS, IL-7 ja OXP potilaista. Keuhkot painotettu. Suhteutettuja vähenemistä keuhkoissa painoja havaittiin myös. Kuten on esitetty kuviossa. 2b, IL-7, kun sitä annetaan yhdessä OXP, oli suurempi kuin 1,88-kertaiseksi, 1,52-kertainen, 1,82-kertainen väheneminen painot keuhkoissa verrattuna PBS, IL-7 ja OXP ryhmiä vastaavasti. Käsittely IL-7 yksin johti merkittävään vähenemiseen keuhkoissa painot ja pieni, ei tilastollisesti määrän vähentäminen etäpesäkenystyröiden keuhkoveritulppa verrattuna PBS. Anto OXP yksinään ei toimittanut antituumorivaikutuksen verrattuna PBS keuhkojen etäpesäkkeiden malli.

Päivänä 6 jälkeisen tuumorin istuttamisen kutakin mallia satunnaistetaan 4 ryhmään 8 hiirtä kussakin ryhmässä edelleen hallinto seuraavasti: PBS, IL-7, OXP, IL-7 yhdessä OXP. Etäpesäkekasvainten kyhmyjä Saharan keuhkopussin alueiden keuhkot laskettiin alla leikkelyn mikroskoopilla. Etäpesäketuumorikudoksen kyhmyt vatsaonteloon laskettiin paljaalla silmällä ja painotetaan. Tulokset ilmaistiin keskiarvona ± S.E.

P

arvot: *,

P

0,05, **,

P

0,01; a. Etäpesäkekasvainten kyhmyt numero keuhkometastaasitestissä mallissa. b. Paino keuhkot keuhkometastaasitestissä mallissa. c. Etäpesäkekasvainten kyhmyt numero vatsa etäpesäkkeitä mallissa. d. Paino kasvaimen kyhmyjä vatsa etäpesäkkeitä mallissa. Kaikki a, b, c, d osoittivat IL-7, kun sitä annetaan yhdessä OXP, lisäsi kasvaimen vastainen vaikutus in vivo verrattuna PBS, IL-7 ja OXP ryhmien respectively.The anto IL-7 yksin johti vähentää merkittävästi keuhkoissa painot ja pieni, ei ollut tilastollisesti väheneminen lopullisessa kasvaimen tilavuuden verrattuna PBS keuhkojen etäpesäkkeiden malli. Anto OXP yksinään ei toimittanut antituumorivaikutuksen verrattuna PBS keuhkojen etäpesäkkeiden mallia. Vatsan implantaatiomallissa, hallinnon OXP yksinään johti merkittävään vähenemiseen painot kasvaimen kyhmyjä ja pieni, ei tilastollisesti määrän väheneminen kasvaimen kyhmyjä vatsaonteloon verrattuna PBS. Antaminen IL-7 yksin ei antanut mitään antituumorivaikutuksen verrattuna PBS vatsan implantaatiomallissa.

vatsan implantaatiomallissa, kasvain vatsaonteloon poistettiin ja punnittiin, ja kasvaimen kyhmyjä laskettiin ja painotettu. IL-7, kun sitä annetaan yhdessä OXP, lisäsi kasvaimen vastainen vaikutus in vivo verrattuna PBS, IL-7 ja OXP ryhmien vastaavasti (

P

0,001, n = 6~7). Anto OXP yksinään johti merkittävään vähenemiseen painot kasvaimen kyhmyjä ja pieni, ei tilastollisesti määrän väheneminen kasvaimen kyhmyjä vatsaonteloon verrattuna PBS. Antaminen IL-7 yksin ei antanut mitään antituumorivaikutuksen verrattuna PBS vatsan implantaatiomallissa. (Fig. 2c, 2d) B

yhdistelmä OXP IL-7 esti lisääntymistä ja indusoi apoptoosin hiirillä paksusuolen kasvaimen

Analysoimme määrää lisääntyvien solujen avulla leviämisen merkki Ki-67. Yhdistetyt hoito OXP ja IL-7 esitetty pienempi Ki-67-positiivisia soluja verrattuna IL-7: n tai OXP yksin ja ohjaus (

P

0,05) (Fig. 3). Lisäksi TUNEL-määritys osoitti, että yhdistetty hoito OXP ja IL-7 indusoi huomattavasti kasvainsolujen apoptoosia (Fig. 4). Ryhmä sai yhdistelmähoitoa osoitti korkeimman apoptoottinen indeksi (

P

0,01). Nämä tulokset viittaavat siihen, että yhdistelmä OXP IL-7 vähensi merkittävästi solujen lisääntymistä ja indusoi apoptoosia

in vivo

.

resektoitiin kasvainten kunkin ryhmän analysoitiin immunohistokemiallisella värjäyksellä leviämisen merkki Ki 67. a. Edustaja kalvot Kunkin hoitoryhmän näkyvät. Alkuperäinen suurennos, × 200. b. Proliferatiivinen aktiivisuus arvioitiin Ki-67 värjäystä. Kunkin näytteen, joka on vähintään 1000 kasvainsoluja maalin mikroskooppisen aloilla, joilla on mahdollisimman suurta immunovärjäyksen, ja tulokset ilmaistiin positiivisten solujen prosenttiosuuden. Tulokset ilmaistiin keskiarvona ± S.E. (N = 3).

P

arvot: IL-7 + OXP verrattuna muihin hoitoryhmissä, *,

P

0,05, **,

P

0,01. Yhdistetty hoito OXP ja IL-7 esiintynyt vähemmän Ki-67-positiivisia soluja verrattuna IL-7 tai OXP yksin ja valvontaa.

a. Parafiinileikkeet värjättiin TUNEL-analyysi tunnistaa apoptoottiset solut winthin CT26 kasvain. Edustaja osat kunkin ryhmän esitetään. Alkuperäinen suurennos, × 200. b. Apoptotic indeksi määritettiin arvioimalla keskimääräinen lukumäärä ytimien apoptoottisten solujen 5 suuritehoisia mikroskooppikentäs-. Ryhmä yhdistelmähoidon oli suurinta apoptoottisen indeksin. Data edustaa apoptosic indeksi ilmaistiin keskiarvo ± keskivirhe (N = 3).

P

arvot: IL-7 + OXP verrattuna muihin hoitoryhmissä, *,

P

0,05, **,

P

0,01.

yhdistelmä OXP IL-7 indusoi merkittäviä aktivoidut T-solut kasvaimiin

CD69 on T-solujen aktivaation markkeri. Siksi määritetään, onko IL-7, ja /tai OXP hoito parantaa läsnäolo aktivoitujen CD8 + T-solujen (CD8 + CD69 + väestöstä) on kaksi mallia hiiren paksusuolen kasvaimia. Keuhkoissa metastaasin malli päivänä 13 ensimmäisen käsittelyn jälkeen, yksisoluiset suspensiot kasvainkudoksen kustakin ryhmästä analysoitiin aktivoitujen CD8 + T-solujen virtaussytometrialla. Kuten on esitetty kuviossa. 5, IL-7: llä ei ollut vaikutusta CD8 + CD69 + väestöstä. OXP yksin on lisännyt merkittävästi CD8 ja CD69-positiivisten solujen kasvaimissa verrattuna PBS valvontaa ja IL-7 liikaa. IL-7 yhdessä OXP on lisännyt merkittävästi CD8 ja CD69-positiivisten solujen kasvaimissa verrattuna PBS valvontaa ja IL-7 tai OXP yksin. Immunohistokemiallinen tutkimus suoritettiin kasvaimen näytteestä saatujen kunkin ryhmän hiirillä. Tutkimus suoritettiin määrän arvioimiseksi CD8 + T-solujen kasvainkudoksessa. Tulokset evealed, että kasvainten IL-7 ja OXP yhdistelmä-käsitellyistä hiiristä oli raskaasti suodattunut CD8 + T-solujen, verrattuna PBS: llä, IL-7: n tai OXP yksinään käsiteltyjen hiirten (

P

0,05) (kuvio. 6). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin vatsan implantaatiomallissa (Fig. 6).

a. Vuonna Sytometrinen analyysissa portti dataa FSC ja SSC bivariate juoni, piirrä alueen ympärille klusterin lymfosyyttien ja sitten portti fluoresenssi histogrammi niitä. Tämä portti, FSC vs. SSC mielestä kerran perustettu, levitetään sitten analyysiin kaikkien myöhempien näytteiden. Edustavia virtaussytometrillä kunkin ryhmän esiteltiin. b.IL-7 yhdistettynä OXP on lisännyt merkittävästi CD8 + /CD69 + positiivisten solujen kasvain verrattuna PBS valvontaa ja IL-7 tai OXP yksin keuhkomallissa. Tulokset ilmaistiin keskiarvona ± S.E. (N = 3).

P

arvot: IL-7 + OXP verrattuna muihin hoitoryhmissä, *,

P

0,05, **,

P

0,01.

a. Edustaja kalvot immunohistokemiallisella värjäyksellä CD8 kummassakin hoitoryhmässä on esitetty. Alkuperäinen suurennos, × 200. b. Aste CD8 + tunkeutumisen havaittiin yli 10 riippumattoman korkean tehon (x 200) mikroskooppikentästä jokaisesta kudosnäytteestä. Viisi mikroskooppikentäs- kanssa runsain jakauma valittiin sisällä syöpäsolun pesä. Keskimääräinen lukumäärä CD8 + T-solujen laskettiin viisi mikroskooppikentästä. Tulokset ilmaistiin keskiarvona ± S.E. (N = 3).

P

arvot: IL-7 + OXP verrattuna muihin hoitoryhmissä, *,

P

0,05, **,

P

0,01.

kasvaimeen liittyvien makrofagien ja dentritic solut (DC) ovat tärkeitä ainesosia leukosyyttien tunkeutumaan kiinteissä tuumoreissa. Olemme myös tutkineet useita makrofagien kasvaimen virtaussytometrialla F4 /80-vasta-aineen ja CD11-vasta-aineen määrä ja kasvainta infiltroivien kypsä dentritic solujen CD11-vasta-aineen ja CD11 c-vasta-aine keuhkojen etäpesäkkeiden malli. Kuitenkin, IL-7 ja OXP hoitoja ei ollut vaikutusta määrä CD11 + F4 /80 + solujen ja DC: tuumoreissa verrattuna IL-7 yksin, OXP yksin, ja PBS: llä käsitellyt hiiret keuhkojen etäpesäkkeiden mallin (kuvio. 7).

a. ja b. Edustavia virtaussytometrillä kunkin ryhmän esiteltiin. c. ja d. IL-7 yhdessä OXP ei ollut vaikutusta määrästä CD11 b + F4 /80 + solujen ja DC kasvaimissa verrattuna IL-7 yksin, OXP yksin, ja PBS-käsitellyt hiiret keuhkometastaasitestissä malli.

yhdistelmä OXP IL-7 vähensi Treg solut pernassa

Arvioimme, onko IL-7 ja OXP yhdistelmähoito vaikutti immunosuppressiivisen solupopulaatioiden. Pernat kunkin ryhmän eläinten kerättiin, ja Treg populaatiot (CD4 + FoxP3 + väestöstä) analysoitiin virtaussytometrialla. Keuhkoissa metastaasin malli, olemme havainneet, että yhdistelmä-käsitelty CT26 paksusuolen kasvainta kantavissa hiirissä oli alhaisempi Treg-solujen joukossa CD4 + T-solut pernassa, verrattuna IL-7 yksin, OXP yksin, ja kontrollihiiret (Fig. 6 ) (

P

0,05). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin vatsan implantaatiomallissa (

P

0,05) (Kuva 8).

a. Edustavia virtaussytometrillä kunkin ryhmän esiteltiin. b. IL-7 yhdessä OXP on vähentänyt merkittävästi FoxP3 + väestön CD4 + T-solut pernassa verrattuna PBS valvontaa ja IL-7 tai OXP yksin sekä keuhkojen ja vatsan etäpesäke malleja. Tulokset ilmaistiin keskiarvona ± S.E. (N = 3). P-arvot: IL-7 + OXP verrattuna muihin hoitoryhmissä, *,

P

0,05, **,

P

0,01.

MDSCs ovat heterogeenisiä populaatioita suppressorigeenien solujen fenotyypin hiirissä yhteispuheenjohtajiensa ilmentymä CD11 ja Gr-1 [30], [31], [32]. Olemme myös tutkineet useita MDSCs pernassa että keuhkoissa etäpesäkkeiden mallin virtaussytometrialla CD11b-vasta-aineen ja Gr-1-vasta-aine otetaan huomioon niiden kyky estää T-solujen immuunivastetta. IL-7 ja OXP eivät merkittävästi vähennä määrää MDSC pernassa verrattuna IL-7 yksin, OXP yksin tai valvonnan keuhkometastaasitestissä malli (Fig. 9).

a. Edustavia virtaussytometrillä kunkin ryhmän esiteltiin. b. IL-7 ja OXP eivät merkittävästi vähennä määrää MDSC pernassa verrattuna IL-7 yksin, OXP yksin tai valvonnan keuhkometastaasitestissä malli.

Keskustelu

tehoa OXP plus IL-7 hoitoa vastaan ​​erittäin invasiivisia metastaattinen hiiri CT26 koolonadenokarsinooma arvioitiin perustuen vasteaika meidän kokeessa. Tuloksemme osoittivat, että kun annetaan sama annos, OXP ja IL-7 on huomattavasti tehokkaampi kuin IL-7: n tai OXP yksin inhiboimaan kasvaimen kasvua. Tutkimuksemme osoittaa, että OXP plus IL-7 yhdistelmä hoito esti merkitsevästi kasvaimen kasvua hiiren malleissa paksusuolen syöpä.

havainnot osoittavat, että IL-7: llä ei ollut vaikutusta kasvaimen kasvua hiirissä ja IL-7 teki ei muuta solujen herkkyyttä OXP kulttuuriin. Siksi on epätodennäköistä, että IL-7 on suora vaikutus kasvain. Virtaussytometria tiedot osoittavat, että yhdistelmä OXP IL-7 indusoi merkittävän tunkeutumisen aktivoitujen T-solujen kasvaimia ja oli alhaisempi Treg-solujen perna. Nämä tiedot osoittivat, että OXP plus IL-7 hoito esti kasvainsolujen kasvua immunoregulaatio sijasta suoraan sytotoksisuuteen. Antitumor vaikutukset OXP ja IL-7 liittyvän kohonneeseen prosenttiosuudet ja aktivoitujen CD8 + T-soluja. Oli liittyy myös vaikeuttaa kehityksen Treg-solujen.

IL-7 voidaan mahdollisesti parantaa immuunivasteita kasvainta läpi erilaisia ​​mekanismeja [8]. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että IL-7 laajenee ja tehokkaan T-solujen tuumoria kantavissa hiirissä. Esimerkiksi IL-7 voi parantaa rokotteen kasvaimen vastaisen immuniteetin edistämällä CD8 laajentaminen [21]. On huomattavasti kasvaimen vastainen aktiivisuus annon IL-7 /HGFb in vivo korreloi merkittävän kasvun määrä kasvaimeen infiltroivien CD4 + ja CD8 + T-solujen [18]. IL-7 toimii synergiassa IL-12 tai IL-21 parantaa kasvaimen vastaisen immuniteetin kautta augmentation sytotoksisten T-solujen funktion [33], [34]. Tehostettu sukupolven aktivoidaan dendriittisolujen IL-7 yhdessä muiden tekijöiden kanssa on toinen mekanismi, jonka avulla IL-7 voi parantaa tuumorin vastaista immuunivastetta [18], [20]. Lisäksi IL-7 voi parantaa kasvaimen vastaisen immuniteetin antagonisoimalla estävä verkot: suosimalla Th17 erilaistumista, vähen- tämisessä transformoiva kasvutekijä (TGF) -β tuotanto, rajoittaa TGF-β-signaloinnin, ja tekee efektorisolujen immuuniksi Treg-solujen [21] , [35], [36], [37]. Kyky apuaineen IL-7 antagonisoida estävää verkkoihin solutasolla ja molekyylitasolla vaikuttaa merkittävästi immunoterapiaa hoidossa kasvaimia.

Useimmat anti-kasvain toimintaa IL-7 havaittiin, kun se yhdistettiin muita terapeuttisia tapoja. Antituumoriteholla oli nimellinen, kun IL-7 käytettiin yksinään [16], [17], [18], [19], [20], [21], [35], [36], [38]. IL-7 yksin on havaittu olevan mitään vaikutusta ihmisen paksusuolen ksenografteja [38]. Kemoterapia aineet voivat aiheuttaa kasvaimen vastaisen immuniteetin ja nämä löydökset avoin mahdollisuuksia integroida immunoterapioiden kemoterapiaa. Anti-kasvain aktiivisuus yhdistämällä IL-7 ja kemoterapia ei ole tutkittu. On raportoitu, että OXP voi edistää suotuisaa immuuni mikroympäristön ja stimuloida syövän vastainen immuunivaste [3], [4]. Altistuminen kalretikuliini solupinnalla ja vapauttamaan HMGB1 on ehdotettu avainasemassa immunostimuloivan ominaisuuksien OXP [1].

OXP saattaa voimistaa immuunivastetta kasvaimia kallistamalla tasapainoa efektori ja sääntelyn /suppressorisolut hyväksi efektorisolujen, kuten on aiemmin kuvattu muiden kemoterapeuttisten lääkeaineiden [2], [3]. Suotuisa tasapaino T-efektori ja T-vaimennin soluissa on liittynyt parantuneita immuunivasteita kasvaimia [2], [39]. Puute tehoa OXP yksin aggressiivinen mallien in vivo on kuvattu [3], [40].