Krooninen sairaus

tiivistelmä

Munasarjasyöpä on tappavin ja gynekologisten sairauksien ja viides syy syövän kuolema keskuudessa amerikkalaiset naiset. Tämä johtuu pääasiassa puutteesta prognostisia työkaluja kykenevät havaitsemaan varhaisvaiheessa munasarjasyöpä sekä korkea kestävyys nykyisen solunsalpaajahoitojen. Tässä skenaariossa koko 5 vuoden pysyvyys munasarjasyöpä potilaille diagnosoitu myöhäisessä vaiheessa on alle 25%. Poikkeavuudet liittyvät pahanlaatuiseen fenotyyppiin ja mekanismeja syövän etenemisen ei ymmärretty.

In vitro

tutkimukset ovat tarpeen, mutta on haitannut rajoituksista johtuen kera käytön munasarjasyövän solulinjoissa ja epäyhtenäisyyttä munasarjasyövän solupopulaatio on peräisin askites nesteitä. Tässä tutkimuksessa esittelemme yksinkertainen, nopea ja toistettava menetelmä eristämiseksi ja karakterisoimiseksi munasarjasyöpäsoluja kiinteästä kasvainkudoksen ja osoittavat, että entsymaattisesti 30 minuuttia dispaasilla II tulokset tehokkain elpymistä elinkelpoisten epiteelin munasarjasyöpä (EOC) solut. Tuloksena syöpä (EOC) soluvalmisteilla huomattu merkittävää tuotto, korkea elinkelpoisuus ja ovat fibroblasti-ilmaiseksi. Ne kasvavat jopa kuusi käytäviä ja pitää yllä kykyä muodostaa pallosia kaltaisia ​​rakenteita agaroosi. Lisäksi ne voidaan geneettisesti manipuloida ja käyttää lääkeaineiden seulonta-, mikä tekee niistä erittäin sopivia loppupään sovelluksiin. Erityisesti, eristäminen munasarjasyövän solujen kiinteät näytteet tällä menetelmällä on se etu, että eristämiseksi syöpäsolujen alkuvaiheessa munasarjasyövän sekä saada solut määritellään joko pää- ja /tai metastaattinen munasarjasyöpä sivustoja. Näin ollen, nämä solut ovat erittäin sopivia tutkimuksia, joiden tarkoituksena on ymmärtää munasarjasyöpä.

Citation: Sueblinvong T, Ghebre R, Iizuka Y, Pambuccian SE, Isaksson Vogel R, Skubitz APN, et ai. (2012) perustaminen, karakterisointi ja loppupäässä soveltaminen Primary munasarjasyöpäsoluja Johdettu kiinteitä kasvaimia. PLoS ONE 7 (11): e50519. doi: 10,1371 /journal.pone.0050519

Editor: Elad Katz, University of Edinburgh, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu 23. huhtikuuta 2012 Hyväksytty 22 lokakuuta 2012 Julkaistu: 30 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Sueblinvong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat puolustusministeriön Munasarjojen Cancer Research Program (OCRP) OC093424 MB ja APNS ja jonka Randy Shaver Cancer Research ja yhteisön rahaston megatavua. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

morfologinen ja molekyylitason geneettiset tutkimukset ovat osoittaneet, että munasarjasyöpä on heterogeeninen sairaus, joka käsittää useita eri histotypes myös korkealaatuista serous karsinooma [1]. Nykyiseen kemoterapiaa munasarjasyövän koostuu taksaanin ja platina-pohjainen terapia. Vaikka 80%: lla varhaisen vaiheen tauti näyttää 5 vuoden pysyvyys, hoidossa on rajallinen teho vastaan ​​myöhäisvaiheen epiteelin munasarjasyöpä (EOC). Tehottomuuteen diagnostisia ja prognostisia työkaluja munasarjasyöpä tekee tästä erityisen syöpä äärimmäisen vaikea hallita ja kehittyy useimmille potilaille kemoterapian resistenttejä kasvaimia ja uusiutumisen [2], [3], [4], [5], [6]. Suuri nykyiseen tietoa ihmisen munasarjasyövän on paljastunut käyttämällä vakiintuneita kuolemattomaksi munasarjojen pinnan epiteelisolujen (IOSEs), munasarjasyövän solulinjoissa ja ensisijainen munasarjasyöpäsoluja peräisin askites nesteistä [7], [8]. Käyttö IOSEs ja munasarjasyövän solulinjoissa on selvä myös niiden korkea proliferatiivinen kapasiteetti ja laajennettu elinikä. Valitettavasti sekä geneettiset ja fenotyyppiset muutokset liittyvät laajennettuun

in vitro

käytäviä ja heterogeenisyys johtuvat ensisijaisesti munasarjasyöpä soluja Askitesneste tekee niistä vähemmän kuin ihanteellinen malli munasarjasyöpää tutkimuksiin. Siten kyky eristää ja kulttuuriin tuoreen EOC soluja kiinteät näytteet munasarjasyöpä tarjoaa ainutlaatuisen mallin tutkimuksia uusien terapeuttisten lähestymistapojen munasarjasyövän hoitoon.

Useita menetelmiä on kuvattu ensisijainen kulttuuriin joko ihmisen munasarjojen pinnan epiteelisolujen (OSE) solujen normaalin munasarjat tai EOC-solut eristettiin vesivatsanesteestä syöpäpotilaiden [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15] . Kuitenkin kasvu pahanlaatuisten solujen kiinteitä kasvaimia on ollut ongelmallista, koska stroomasolulinja tai fibroblasti liikakasvuun, juurikaan mitään pahanlaatuisten solujen kasvuun, tai ennenaikaisen proliferatiivisen kapasiteetin kulttuuriin. Vaikka on olemassa useita vaihtoehtoja luoda yksisoluiset suspensiot kiinteiden kasvaimien kautta mekaanisesti tai entsymaattisia dissosiaatio, kukaan ei ole osoitettu, mikä tekniikka saadaan luotettavin tulos [16], [17], [18]. Tässä tutkimuksessa kuvaamme ensimmäistä kertaa systemaattisesti vertailemaan mekaaninen hajotus ja entsymaattisesti joko kollagenaasi A hyaluronidase tai dispaasi II eri aikaa 30-120 minuuttia eristämiseen EOC solujen kiinteiden munasarjasyöpä kasvaimia. Me raportoimme että entsymaattisesti 30 minuuttia dispaasilla II tulokset tehokkain elpymistä elinkelpoisten EOC soluja ja että pitkäaikainen altistuminen entsymaattisesti on mukana merkittävä lasku elpyminen elävien solujen.

EOC soluviljelmissä ovat fibroblasti-vapaa, arvioituna EpCAM värjäämällä MOC-31 ja Ber-EP4 mAb: t, ja kasvoi eksponentiaalisesti jopa kuusi kohtia ennen senesced ja kuolivat. Tärkeää on, että EOC viljelmiä säilytetään joitakin fenotyyppiset ominaisuudet kasvainten, josta ne ovat peräisin, mukaan lukien kyky muodostaa pallomainen kaltaisia ​​rakenteita agar alustoille. Lopuksi EOC viljelmät olivat sopivia loppupään sovelluksiin, koska ne olivat erittäin alttiita geenimanipulaatioiden avulla lentiviruksen infektion ja käyttökelpoisia lääkkeen seulontatestejä.

. Keskiarvo ± keskihajonta kokonaismäärästä elävien solujen per 500 mg kudosta, jotka ovat peräisin kustakin olosuhteesta välittömästi käsittelyn jälkeen (eli pre-adheesio viljelmät) ja sitten uudelleen 7-10 päivää tarttuvuuden kudosviljelmässä (eli adherenttiviljelmiä). B. Suhteellinen solujen elävyys kunkin kunnossa ilmaistuna prosentteina ennalta tarttuvuus kulttuureiden kiinnittynyt kulttuureissa. Vähiten neliö välineet (mukautettu rinnakkaiskokeista sisällä potilas) kahdeksan itsenäistä kokeita ja 95%: n luottamusväli esitetään.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

seuraavia aineita ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA) Soluviljelyväliaine: DMEM, naudan sikiön seerumia (FBS), 100 x penisilliini-streptomysiiniä, 0,05% w /v trypsiini-EDTA: ta. Entsyymit: dispaasi II ja kollagenaasi A: (Roche, Indianapolis, IN), hyalorunidase (EMD Chemicals, Gibbston, NJ).

(a) edustavia esimerkkejä ensisijainen EOC eristetyt solut syöpä näytteestä kahden päivän viljelyn ( nuoli osoittaa punasolujen); (B) Pyörre kaltaisia ​​klustereita EOC solujen 3-4 päivän viljelyn (nuoli osoittaa kasvavaa klusterit); (C) siirtomaa EOC solujen leviämisen annetun kudosviljelymuoviin 7-8 päivän viljelyn; (D) yksisolukerroksena EOC solujen kuvaa tyypillistä epiteelisolujen mukulakivikadut morfologia jälkeen 13-14 päivä viljelmässä; ja (e) yksisolukerroksena fibroblastien tässä käytetään negatiivisena kontrollina.

Vasta-aineet.

kaksi monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistavat EpCAM, Ber-EP4, ja MOC-31, hankittiin Dako (Carpinteria, CA) ja käytettiin pitoisuutena valmistajan suosittelemaa immunohistokemiallista analyysia varten. Valinta näiden kahden erityisesti anti-EpCAM mAb: t tehtiin, koska ne ovat osoittaneet enemmän spesifisyys epiteelisolujen verrattuna muihin epiteelin merkki [19], [20], [21], [22] ICC ensiarvoisen EOCs kulttuureissa oli suorittamat sertifioitu teknikoiden Immunosytokemia ja histopatologia laboratorio Fairview University Medical Center, University of Minnesota joissa näitä markkereita käytetään rutiininomaisesti värjäykseen kirurgisista näytteistä vahvistamaan epiteelin luonteen, kuten munasarjasyöpä kliinisistä näytteistä. PARP, β-aktiini ja peroksidaasi-kytketty anti-hiiri ja anti-kani immunoglobuliini G vasta-aineet hankittiin BD Pharmingen (San Diego, Kalifornia) ja Sigma (St. Louis, MO) vastaavasti ja hyödynnetään pitoisuuden valmistajan suositteleman ja immunoblot-analyysillä.

solulinjat.

ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa ES-2 ja NIH: OVCAR5 oli hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA).

FFPE lohkon normaalin munasarjan, joka kuvaa positiivisen värjäytymistä EpCAM sekä monoklonaalisia vasta-aineita Ber-EP4 ja MOC-31 normaalin munasarjan pintaan epiteelisolujen. FFPE lohko vakavien munasarjan adenokarsinooma kuvaavat positiivista värjäytymistä EpCAM sekä monoklonaalisia vasta-aineita Ber-EP4 ja MOC-31 EOC solujen kasvain. Immunosytokemiallinen värjäys parafinoidut EOC viljelmiä monoklonaalisia vasta-aineita Ber-EP4 ja MOC-31, joka esittää positiivista värjäytymistä EpCAM. Immunosytokemiallinen värjäys parafinoidut fibroblastiviljelmät kanssa monoklonaalisia vasta-aineita Ber-EP4 ja MOC-31, tässä käytettiin negatiivisina kontrolleina.

Reagent Setup

Täydellinen DMEM-alustassa.

DMEM täydennetty 10% FBS: ää, ja 100 yksikköä penisilliiniä-streptomysiiniä. Elatusaine säilytettiin 4 ° C: ssa ja lämmitettiin 37 ° C: ssa ennen käyttöä.

Entsyymit.

Dispaasi II (2,4 U /ml), hyaluronidaasia (0,0369 U /ml) ja kollagenaasia A (0,15 U /ml) laimennettiin PBS: ään, jaettiin osiin ja säilytettiin -20 ° C: ssa ei-huurtumaton pakastin.

. Viljelmiä EOC-solujen (luovuttaja 8), jotka ovat peräisin 30 minuutin entsymaattisella digestiolla dispaasilla II tai hyaluronidaasia arvioitiin niiden leviämisen aikana 5 päivää (D1, D3, D5). Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. B. kaksinkertaistaminen aikaa soluja käsiteltiin dispaasilla II 30 minuuttia (

Top) tai hyaluronidaasia 30 minuuttia (

alhaalla

) laskettiin epälineaarisella regressioanalyysillä.

Tissue kokoelma.

Kahdeksan kudosnäytteistä (-5 g kooltaan) alkaen EOC kasvaimet saatiin Minnesotan yliopiston kudostenhankintaryhmällä Facility (TPF) jälkeen Institutional Review Board komitea: Human Subject Board (IRB) hyväksynnän. Erityisesti suostumus oli luopunut IRB yliopiston Minnesotan.

Potilaiden ikä vaihteli välillä 47 ja 68 vuotias. Keskimääräinen potilaan ikä oli 60. Tissue kerättiin alueilta makroskooppisesti tunnistettu syöpää patologia. Näytteet olivat deidentified ja rekisteröitiin protokollaa bionet Tissue Procurement Facility. Valitut kudosnäytteet pantiin steriiliin 50 ml: n kartiomaiseen putkeen, joissa jääkylmää DMEM, jotka toimitetaan sitten soluviljelmän laboratorio ämpäri jäätä 30 minuutin kuluessa tuore näyte kokoelma.

viereiset alueet kaikista kasvaimet tehtiin myöhemmin rutiinia kudosten käsittely (formaliini kiinnitys ja parafiiniupotusta). Histopatologiset analyysi osien arvioimiseksi alatyyppi, luokan munasarjasyöpä ja lavastus perustuu patologisen ja kuvatiedon suorittaa kirurgisen patologit yliopiston Minnesota Medical Center, Fairview.

(a) EOC soluja luovuttajalta 8 muodostavat sferoidia kaltaisia ​​rakenteita agaroosi; (B) NIH: OVCAR5 ihmisen munasarjasyövän solulinja muodostetaan myös pallosia (positiivinen kontrolli); (C) EOC soluja luovuttajalta 8 transfektoitu GFP ilmentävien lentivirus pEF-GFP-SIN; ja (d) vaihe kontrastia samalla alalla.

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä (EOC) eristysprotokollaa.

Kasvaimen yksilöt (-5 g) jaettiin veitsellä osaksi kymmenen kappaletta samanpainoiseen (~500 mg), joka oli sijoitettu 60 mm: n petrimaljoille, jotka sisältävät 5 ml DMEM ja edelleen leikata pienemmiksi paloiksi noin 2 mm. Mekaanisia häiriöitä, näyte liete puristetaan läpi 70 pm mesh, jossa ruiskun mäntä ja solun suodos sentrifugoitiin 1200 rpm 7 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Loput yhdeksän näytettä käsiteltiin kautta entsymaattisesti lisäämällä joko kollagenaasi A, hyaluronidaasi tai dispaasi II, inkuboidaan sitten 30-120 minuutin ajan, jolloin solu Lietteet läpi 70 pm mesh ja sentrifugoitiin kuten edellä on kuvattu. Uudelleensuspendoinnin jälkeen DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää, näytettä kutakin kunto arvioitiin solujen elinkelpoisuuden trypaanisinivärin syrjäytymistä. Medium vaihdettiin 24 tunnin kuluttua ensimmäisestä pinnoitus ja joka kolmas päivä seuraavien kahden viikon aikana.

immunosytokemi- analyysi.

immunosytokemi- analyysi EpCAM ilmaisun kanssa monoklonaalisia vasta-aineita MOC-31 ja Ber-EP4 oli suoritetaan munasarjasyövän solut, jotka oli viljelmässä 14 päivää. Erityisesti primaarinen munasarjasyöpä solut kerättiin trypsinisaatiolla, pestiin PBS: llä ja sentrifugoitiin. Johdettu Solupelletti sen jälkeen formaliinilla kiinnitetyt ja parafiiniin (FFPE EOC) tuottaa solun lohkoja. Osiot tehtiin immunosytokemialla käyttäen Ventana XT automatisoitu stainer Ventana Medical System (Tucson, Arizona). Lyhyesti, kalvot poistettiin parafiini ja seuraavat antigeenin haku, inkuboitiin monoklonaalisella vasta-aineita EpCAM (MOC, 31 ja Ber-EP4) 32 ja 16 minuuttia, vastaavasti, ennen värjäystä iView DAB detektioreagenssipakkaus Dako (Carpinteria, CA). Immunosytokemiassa suoritettiin histopatologia laboratoriossa Fairview University Medical Center, University of Minnesota.

mittaus solujen elinkykyä.

Solun lukumäärä ja elinkelpoisuus EOC viljelmistä määritettiin trypaanisiniekskluusiolla määritys.

Anchorage riippumaton määritys.

käytetty menetelmä ankkurointia itsenäinen määritys perustuu neste overlay tekniikkaa kuten aiemmin on kuvattu [23]. Lyhyesti, kieltää solun adheesiota substraattiin, 24-kuoppaisille kudosviljelylevyille (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) päällystettiin 200 ul: lla 0,5% SeaKem LE agaroosia (BioWittaker Molecular Applications, Rockland, ME) seerumittomassa media ja annettiin kiinteytyä 30 minuuttia 20 ° C: ssa. NIH: OVCAR5 tai EOC-solususpensiot (5000 solua) kerrostetaan Kiinteän aineen päälle agaroosin-päällystetyille levyille tilavuudessa 1 ml /kuoppa DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, ja sitten inkuboitiin 48 tuntia 37 ° C: ssa.

morfologia solujen ja pallosia.

Nikon Eclipse TE 2000E käänteismikroskooppi käytettiin kuvantamisen solujen morfologia vaihekontrasti. Kuvat otettiin Spot 3.5.8 hankinnan ohjelmistot (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI).

Infektio on EOC kanssa lentiviruksen.

lentivirusta pEF-GFP-SIN, The VSVG kirjekuori ja delta-8,9 plasmidit kotransfektoitiin osaksi 293T-soluihin viruksen tuotantoon, kuten aikaisemmin on kuvattu [24]. Virus Supernatantti spin-tartunnan, kun läsnä oli 10 ug /ml polybreeniä ja 1 x 10

5 EOC solut 2500 rpm 2 tuntia 33 ° C: ssa. GFP: n ilmentymisen seurattiin 48 tuntia infektion jälkeen.

Western blot-analyysi.

Yhteensä solun (10-20 ug) kustakin näytteestä erotettiin SDS-PAGE: lla, siirrettiin PVDF-kalvoille ja alistettiin Western blot-analyysi käyttäen PARP ja β-aktiini-aineita.

. Morfologisia muutoksia EOC soluissa joko mock käsitelty tai niitä käsiteltiin Bortetsomibi (2 nM) ja Vorinostat (6 uM) yksin ja yhdistelmänä 18 tuntia. B. Tyypillisiä esimerkkejä lysaatin EOC soluja luovuttajilta 1 ja 8 (

ja keskijohdon paneeli

) tai ES-2 ihmisen munasarjasyövän solulinja (

alapaneelin

) joko mock käsitelty tai käsitelty kanssa Bortetsomibi (2 nM) ja Vorinostat (6 pM) tai Bortetsomibi (6 nM) ja Vorinostat (3 uM) vastaavasti, yksin ja yhdessä 18 tuntia ja immunoblotattu tunnistavaa vasta-ainetta täyspitkän ja pilkotun muodot PARP. Yhtä suuri kuin proteiinin loading varmistettiin käyttämällä vasta-ainetta vastaan ​​suunnattu β-aktiini. * = Tietyllä taajuusalueella. C. korottaminen halkaistut-PARP lajien mock versus käsitelty EOC soluissa ilmaistuna lohkaistaan ​​täyspitkä /halkaistut PARP suhde.

Tilastollinen

Kaikki tulokset analysoitiin käyttämällä sekoitettu vaikutuksia lineaarinen regressio malleja, joissa kiinteiden vaikutusten hoitoon tai hoidon pituudesta tarvittaessa ja satunnainen vaikutus kasvainten lähde. Vaikka ei-normaalisuus joitakin tietoja, lineaarinen regressio mallit ovat hyvin kestäviä ja mahdollistaa sisällyttämisen satunnainen vaikutuksia. Pienimmän neliösumman keinoin ja keskivirheiden raportoitu ja p-arvot säädettiin monimuuttujille käyttäen Bonferroni korjausta. Kaikki merkitys tasot asetettiin 0.05. Laskeminen solujen kahdentumisaika (DT) saatiin epälineaarisella regressioanalyysillä käyttäen Prism (V.5 Graphpad, San Diego, CA).

Tulokset ja keskustelu

vertailu dissosiaatio Techniques

Vaikka mekaaninen hajotus ja entsymaattisesti edustavat kahta selvää vaihtoehtoa eristämiseen EOC solujen kiinteä kasvain yksilöitä, suora vertailu ei ole tehty, mitkä menettely johtaa suurempaan -solusaaliiseen ja elinkelpoisuus. Käsitellä tätä kysymystä, kahdeksan kiinteä munasarjasyövän kliinisissä näytteissä mukaan lukien viisi korkealaatuista vakavien adenokarsinoomat, kaksi serous rajatapaus ja yksi erilaistumaton korkealaatuista karsinoomat (taulukko 1) kerättiin leikkauksen aikana ja altistettiin pelkästään mekaaninen rikkominen tai entsymaattisesti seuraa mekaaninen hajotus. Erityisesti, kustakin näytteestä leikattiin näytteitä yhtä paino (500 mg), ja sitten altistettiin pelkästään mekaaninen hajotus käyttämällä 70 um solun seulan tai niitä entsymaattisesti 30, 60 tai 120 minuuttia dispaasilla II, hyaluronidaasi tai kollagenaasi A: ja sitten hajottaa mekaanisesti viemällä se 70 pm seulan. Jokaisen ehto, solujen lukumäärä ja elinkelpoisuus arvioitiin trypaanisinivärin syrjäytymisen kaksi ajankohtina: heti näytteen käsittelyn (pre-adheesio kulttuureissa) ja jakson jälkeen seitsemän-kymmenenpäivää (kiinnittynyt viljelmät).

Alkuperäinen talteen saatujen solujen lukumäärään (eli pre-tartunta viljelmät) oli suurin, kun kasvaimia yksinomaan mekaanisesti hajotettu ilman entsyymikäsittelyillä. Ei ole yllättävää, kokonaismäärä solujen aluksi talteen seuraavat entsymaattinen käsittely lisäsi kanssa aika, joka kudos altistetaan eri entsymaattiset käsittelyt. Korkein osuus solujen toipuminen, joka perustuu alkaa solujen lukumäärä, tapahtui, kun solut altistettiin 30 minuuttia dispaasi II (kuvio 1A). Vaikka ei ole tilastollisesti merkitsevä, kun säätö useiden vertailujen keskimääräinen prosentti solujen talteenotto, kun solut altistettiin dispaasi II: ssa 30 minuuttia (58,0%) on suurempi kuin muut, erityisesti mekaaniset (19,9%; kuvio 1 B). Mielenkiintoista, viikko sen jälkeen pinnoituksen (kiinnittynyt viljelmät) näitä kudoksia, jotka olivat altistuneet pisimmän aikaa, että entsyymikäsittely osoitti tilastollisesti merkittävää laskua elpyminen elävien solujen (p = 0,02).

Taken yhdessä, tämä viittaa siihen, että mekaaninen rikkominen ja pitkäaikainen entsyymikäsittely oli erityisen ankara EOC soluihin ja että 30 minuutin altistus dispaasi II edustaa paras valinta saada sopivia EOC kulttuureissa.

kasvuominaisuudet EOC Cultures ja karakterisointi niiden Epiteelin Nature EpCAM Immunovärjäys

Seuraavaksi dokumentoineet morfologisia muutoksia ja kasvua ominaisuudet juuri eristettyjä EOC peräisin olevat solut kiinteitä kasvaimia. Kaksi päivää sen jälkeen, kun pinnoitus on DMEM, jossa on 10% FBS: ää, EOC solut alkoivat tarttua levyyn kuten on osoitettu pienet kiinnittynyt klustereita (kuva 2a). Päivänä 2, punasolujen (nuoli) vielä näytti olevan elinkelpoinen kulttuuriin. Päivällä 4 (kuva 2b), tarttuvaa pesäkkeet EOC solut muodostivat kiehkura kaltaiset muodot (nuoli) ja alkoi levitä kudosviljelymaljalla loput erytrosyytit vähitellen katosi viljelmästä. Suuri monisoluisten aggregaatit havaittiin myös tässä vaiheessa; nämä myöhemmin jaotellaan solujen yksikerroksia. 7. päivään mennessä, ensimmäinen EOC soluklusterit alkoi lisääntyä (kuvio 2c). Päivään 14 mennessä, EOC solut tuli yksisolukerroksena ja näytetään tyypillinen epiteelin cobblestone morfologia (kuvio 2d), joka näytti olevan erilaisia ​​yhdestä 14-päivän fibroblastiviljelmässä tässä käytettiin negatiivisena kontrollina (kuvio 2e).

vahvista epiteelin luonne 14 päivän EOC kulttuureissa, me seuraavaksi suoritetaan immunosolukemialliset (ICC) varten epiteelin merkki EpCAM käytetään kahta eri monoklonaalista vasta, Ber-EP4 ja MOC-31. Tärkeää on, toisin kuin rutiininomaisesti päättäjät, joka voi erottaa epiteelisolujen, mesoteelisolujen tai fibroblastien, Ber-EP4 ja MOC-31-vasta-aineita yksinomaan värjää varten EpCAM markkeri epiteelisolujen [19], [20], [21], [22]. Värjäämällä nämä kaksi vasta antoi meille mahdollisuuden arvioida puhtaus eristetty EOC soluja. Kuten kuviossa 3 on esitetty, EOC soluilla ominaista sytoplasman värjäytymistä EpCAM sekä, Ber-EP4, ja MOC-31 monoklonaalisia vasta-aineita. EOC-solut, jotka me eristetty koostuivat homogeenisen populaation epiteelisolujen. Eroa puhtauden välillä havaittiin hajottamalla mekaanisesti tai entsymaattisesti tekniikkaa (ei esitetty). Positiivisiksi kontrolleiksi normaali munasarjojen pinnan epiteelisolujen (NOSE) soluja ja serous adenokarsinooma myös värjättiin epiteelin markkeri EpCAM sekä, Ber-EP4 ja MOC-31 mAb: t Kuva 3). Kahden viikon mittaisen fibroblastisia viljelmä altistettiin myös ICC kanssa varten epiteelin markkeri EpCAM Ber-EP4 ja MOC-31 mAb: t negatiivisena kontrollina (kuva 3).

kasvuominaisuudet EOC kulttuurien ja niiden alaspäin stream Sovellukset

jotta voitaisiin arvioida kasvun ominaisuudet saadaan ensisijaisen EOCs kulttuureissa, mittasimme leviämisen nopeus on EOCs soluja, jotka olivat peräisin 30 minuutin digestoimalla dispaasilla II ja hyaluronidaasia suunnilleen päivänä 14 eristäminen ( kun heistä tuli yksisolukerroksena, näkyy tyypillinen epiteelin mukulakivikadut morfologia ja positiivista värjäytymistä varten EpCAM epiteelin merkki). Soluja tarkkailtiin proliferaationopeus trypaanisinivärin syrjäytymisen laskemalla aikana seitsemän päivää. Kuten kuviossa 4A, EOC solut molemmista dispaasi II ja hyaluronidaasia hoitoja kasvoi kaksinkertaistaminen (DT) 3,1 ja 5,4 vuorokauden kuluttua vastaavasti laskettuna epälineaarisella regressioanalyysillä (4B

Top ja

pohjaan

). Lisäksi solut on saatu näiden kahden entsymaattisella digestiolla menetelmiä voitaisiin siirrostaa jopa kuusi kertaa aikana 4 viikkoa, ennen kuin ne senesced ja kuoli (ei esitetty).

ainutlaatuinen malli tutkimalla munasarjasyövän etenemistä sekä testaamalla herkkyys munasarjasyöpäsoluja uusiin kemoterapia-aineiden

in vitro

riippuu niiden kyky muodostaa sferoideja [23], [25]. Vatsaontelossa potilailla, joilla on munasarjasyöpä, sferoidit luonnollisesti muodostua askitesneste, ja kun on muodostettu

in vitro

, ne matkivat syövän kolmiulotteinen rakenne on itse kasvain. Niinpä testasimme ensisijainen EOCs viljelmiä niiden kyky muodostaa pallomainen kaltaisia ​​rakenteita käynneistä riippumattoman kasvun määrityksessä viljelemällä niitä kiinnittymättömälle agaroosi alustaan. Munasarjasyövän solulinja NIH: OVCAR5, jonka tiedetään pallosten muodostamiseksi, käytettiin positiivisena kontrollina [26]. EOC-solut ja NIH: OVCAR5 solut olivat yhtä, joka kykenee muodostamaan pallomainen kaltaisia ​​rakenteita yli seitsemän päivää (kuvio 5a ja 5b). Pallojen monen soluaggregaateiksi olivat erikokoista ja ne koostuivat kymmeniä jopa lähes sata solua per aggregaatti.

Genetic manipulointia ensisijainen munasarjasyöpäsoluja usein tarvitaan ymmärrystä rooli onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille aikana munasarjasyövän aloittamisen ja etenemiseen. Siksi testasimme ensisijainen EOCs viljelmiä niiden kyky käsitellä geneettisesti kautta infektion lentivirus- partikkeleita ilmentävät pEF-GFP-SIN. Infektion tehokkuudesta oli 80%, kun mitattu suhde GFP-proteiinia ekspressoivien solujen (kuvio 5c, sinisen kanavan) verrattuna solujen kokonaismäärä (kuva 5d, kirkas field). Nämä kokeet todistaa, että eristetty ensisijainen EOCs viljelmiä soluja säilytetään joitakin niiden fenotyyppiset ominaisuudet /attribuutteja.

Toksisuustutkimuksia haluttiin selvittää aktiivisuuden profiilia uusien chemotherapic aineiden ja niiden yhdistelmä syöpäsoluissa on ensiarvoisen tärkeää kohdennettuja hoitomuotoja munasarjasyöpä. Olemme aiemmin osoittaneet, että yhdistelmä proteasomin ja pan-HDAC-inhibiittorit indusoivat synergistisen tappaminen munasarjasyövän solulinjoissa säästäen niiden kuolemattomaksi vastine [27]. Niinpä verrattuna herkkyys tässä lääkeyhdistelmän ensisijainen EOCs viljelmiä sekä kaupallisesti saatavilla munasarjasyövän solulinja ES-2. Erityisesti, EOCs solut altistettiin optimaalinen pitoisuus on proteasomin inhibiittoria Bortetsomibi (2 nM) ja yleiseurooppalaisen HDAC-entsyymien estäjä Vorinostat (6 pM) joko yksinään tai yhdistelmänä, ja apoptoosin alkaminen mitattiin seuraamalla morfologisia muutoksia ja ekspressiotasot lohkaista PARP ensisijainen EOCs kulttuureissa ja ES-2 munasarjasyövän solulinja (luovuttajilta 1 ja 8) jälkeen 18 tunnin lääkkeelle altistumisen.

Kuten kuviossa 6A, yhdistelmähoito johti suurempaa apoptoosin liittyvät morfologisia muutoksia primaarisissa EOCs kulttuureissa verrattuna monoterapiana altistumista. Yhdistelmähoito johti myös kohonneeseen pilkotun PARP verrattuna monoterapiana altistuminen sekä ensimmäisen EOCs viljelmät (kuvio 6B

ylemmän ja keskimmäisen paneelin

) ja ES-2 munasarjasyövän solulinjoissa (kuvio 6B,

pohjapaneeli

). Kvantifiointi suhde pilkotun täyspitkä ja halkaistut PARP on ensisijainen EOCs kulttuureissa on esitetty kuvassa 6C.

Johtopäätökset

parempi ymmärtäminen aloittamisesta, kehittymistä ja etenemistä munasarjasyövän on ensiarvoisen tärkeää lopputuloksen parantamiseksi munasarjasyöpä potilaille. Yksi haastavimmista ongelmista liittyy näihin tutkimuksiin on puute luotettavuus vakiintuneita munasarjasyövän solulinjoissa, jotka ovat usein tehty satoja kohtia

in vitro

. Solulinjat voi enää muistuttavat syöpä, josta ne alun perin peräisin. Tässä tutkimuksessa kuvaamme tehokkain ja nopean menetelmän eristämiseksi EOC solujen kiinteitä kasvaimia. EOC solujen valmisteet ovat vailla fibroblastien ja kasvaa eksponentiaalisesti jopa 6 kohtia ennen senesce ja kuolevat. Mikä tärkeintä, nämä juuri eristettyjä EOC solujen pitää yllä kykyä muodostaa sferoidiviljelmiä kaltaisia ​​rakenteita, voidaan helposti transfek- avulla lentiviruksen järjestelmän, ja ovat käyttökelpoinen väline lääkeaineiden seulontaan. Siten nämä solut ovat sulatettu sopivia loppupään tutkimuskäyttöön.

Lopuksi, kyky eristää ja käsitellä munasarjasyöpäsoluja peräisin kiinteitä kasvaimia vastaan ​​askites-nesteestä on potentiaalinen etu eristetään EOC solujen alkuvaiheessa tauti ennen kun askitesnesteestä muodostumista tapahtuu. Erityisesti solulinjoissa, jotka ovat peräisin askites-nestettä, saadaan suhteellisen myöhäisessä vaiheessa taudin ja se ei ole mahdollista määrittää, onko solut, jotka ovat peräisin primaarikasvaimen sivuston tai metastaattinen päällä.

Tiedoksi

kiittää Drs. Linda Carson, Levi Downs, Melissa Geller, Peter Argenta, Patricia Judson ja Amy Jonson, Division of naistentautien Oncology, University of Minnesota, jotka auttaisivat valintaan kasvaimen näytteitä. Haluamme kiittää Karin Daniels päässä Fairview Medical Center ja Sarah Bowell peräisin kudoksen Facility Minnesotan yliopiston apunaan immunosolukemiallisten analyysi ja hankinta potilaiden kudosnäytteistä, vastaavasti. Haluamme myös kiittää tohtori Charles Landen, Division of Gynecologic Oncology, University of Alabama jotka auttaisivat protokollan asetukset.