Krooninen sairaus

tiivistelmä

Mahdollisten kasvainmerkkiaineet auttaa kerrostuvat ja tunnistamaan kasvain pahanlaatuinen potentiaalia ja sen vastauksen tiettyihin hoitoihin. IL-6 on raportoitu olevan ennustaja erilaisissa syövissä. Näin ollen, esillä oleva tutkimus suoritettiin korostaa rooli IL-6 parantamaan hoidon ja ennusteen määrittämiseksi, virtsarakon syöpä. Ihmisen virtsarakon syövän solulinjat HT1376 ja HT1197 valittiin solu- ja eläinkokeissa, joissa biologisia muutoksia sen jälkeen, kun koe-manipulointi IL-6 tutkittiin, kuten kasvaimen käyttäytymisen ja niihin liittyvät signalointia virtsarakon syöpä. Lisäksi, kliinisissä näytteissä 85 potilaalla on lihas-invasiivisia, ja 50 ei-lihas- invasiivisia virtsarakon syöpä valittiin immunohistokemiallisella värjäyksellä arvioida ennustavan kapasiteetti IL-6 suhteen kliiniseen tulokseen. Tiedot osoittivat, että IL-6 on yli-ilmentynyt, että virtsarakkosyöpänäytteiden verrattuna ei-pahanlaatuisia kudoksia sekä mRNA: ta ja proteiinia tasolla. Positiivinen värjäys IL-6 korreloi merkitsevästi paremmat kliinisen vaiheen, korkeampi toistumisen määrä jälkeen parantava hoito, ja vähentää eloonjäämisaste. Kasvaimen kasvu ja invasiivisia kyky voitiin vähentää, kun IL-6 estettiin. Taustalla muutoksia olivat vähentynyt solujen lisääntymistä, vähemmän epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), väheni DNA metyylitransferaasin 1 ilme ja vaimennetaan angiogeneesiä. Lopuksi todettakoon, että päätelmien mukaan IL-6 voi olla merkittävä ennustaja kliinisessä vaiheessa ja ennuste virtsarakon syöpään. Lisäksi kohdistaminen IL-6 voi olla lupaava strategia virtsarakon syövän hoitamiseksi.

Citation: Chen MF, Lin PY, Wu CF, Chen WC, Wu CT (2013) IL-6 Expression Säätelee tuumorigeenisyyteen ja korreloi ennusteen Virtsarakon syövän. PLoS ONE 8 (4): e61901. doi: 10,1371 /journal.pone.0061901

Editor: Peter Canoll, Columbia University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 joulukuu 2012; Hyväksytty: 14 maaliskuu 2013; Julkaistu: 30 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan, myöntää CMRPG690332-3. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

virtsarakon syöpä edustaa kirjo kasvaimet, mukaan lukien ei-lihas- invasiivisia (NMIBC), lihasten invasiivisia, ja etäpesäkeleesioita. Siirtymäkauden cell carcinoma (TCC) virtsarakon on yleisin virtsarakon syöpään ja ilmenee kahdessa eri muodossa eri kliinisiä ja biologista käyttäytymistä. Noin 70% potilaista on ei-lihas- invasiivisia kasvaimia, kun taas loput 30% läsnä lihas-invasiivisen kasvaimet. Huolimatta hyvää ennustetta potilaille, joilla on pinnallinen sairaus, toistuminen on yhteinen ja liittyy kehittämiseen lihas-invasiivisen sairauden [1]. Lähes puolet kaikista potilaista, joilla oli lihas-invasiivisia sairauksia tai jotka ovat jo edenneet tähän tilaan satamaan piilevä etäinen etäpesäke ja huono 5 vuoden pysyvyys [2]. Toisin kuin muut urologiset syövät, virtsarakon syöpä ei ole kliinisesti hyödyllistä biomarkkereita ennustamiseen taudin vaiheessa ja kliiniseen tulokseen. Siksi molekyyli merkkiaineiden avulla voidaan osittaa ja tunnistaa kasvaimen todellisen pahanlaatuinen potentiaalia ja sen vastaavat erityisiin hoitoja tarvitaan.

Krooninen tulehdus usein edeltää tai tukee huomattavan määrän syöpiä [3] – [5] . Nostamalla tulehdusvälittäjiä on osoitettu johtavan kasvaimen edistämisen, invaasio, ja angiogeneesi [6] – [7]. Vaikka rooli kroonisen tulehduksen etiologiassa TCC virtsarakon ei ole vakiintunut, on olemassa yhä enemmän todisteita siitä, että tulehdusta edistäviä sytokiineja kriittisiä rooleja patogeneesissä virtsarakon syövän, kuten IL-6, IL-8 ja TNF α [8]. Lisäksi jatkuvasti STAT3 aktivaatio on osoitettu ylläpitämään konstitutiivista NF-KB: n aktiivisuutta, mikä antaa näyttöä suhde onkologian signalointireittien sisällä tulehduksellinen microenvironment [9]. IL-6 on merkittävä aktivaattori STAT3 signalointireittien, ja tärkein sytokiini vaikuttavat tulehdusvasteen ihmisillä [10], [11]. IL-6 signalointi on liitetty sääntely kasvaimen kasvua ja metastaaseja ja sen taso voidaan korreloida huonon ennusteen eri syöpiä [11], [12]. Lisäksi lisääntynyt IL-6-pitoisuus seerumissa on raportoitu liittyvän metastaasin ja heikkoon ennusteeseen eturauhasen, munasarjojen, ja virtsarakon syövät [13] – [15]. Vaikka on näyttöä siitä, että IL-6 voi olla kriittinen tekijä oli erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia, sen rooli virtsarakon syöpä on edelleen epäselvä. Siksi tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet taustalla olevien mekanismien IL-6 ja sen mahdollista hyödyllisyyttä käsitellään tarvetta aggressiivinen hoito virtsarakon syövän.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaan ominaisuudet

Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital hyväksyi tässä tutkimuksessa (Luvan numero: 99-0207B). Kirjalliset suostumukset allekirjoittivat potilaat heidän näytteen ja tiedot voidaan tallentaa sairaalassa ja käytetään tutkimukseen. Kaikkiaan 85 potilaalla on lihas-invasiivisia virtsarakon TCC (39 vaiheen T2 ja 46 osuuksilla T3 -T4), jotka ovat suorittaneet kurssin selvä kemosädehoito (CCRT) käsittely otettiin tutkimukseen. Päätyttyä CCRT, potilaalle tehtiin toista tietokonetomografia skannaa (CT) ja kystoskopia tutkimus selvittää hoitovasteen. Potilaita seurattiin 3 kuukauden välein ensimmäisen 2 vuotta ja joka 6 kuukausi sen jälkeen. Seuranta-potilaille jatkettiin sen kuolemaansa saakka, ja loppupisteet olivat kokonaiselinaika (OS), ilman taudin etenemistä, vika malli ja vastaus selvä CCRT. Sairauden etenemistä määriteltiin dokumentoitu paikallisen uusiutumisen tai kaukaisia ​​etäpesäkkeitä. Analyysit tehtiin SPSS versio 17.0.

immunohistokemiallinen (IHC) värjäys

Lisäksi kudosnäytteiden kerätään 85 potilaalla on lihas-invasiivisen virtsarakon syöpä, virtsarakon kudosnäytteet kerättiin immunohistokemiallista ( IHC) värjäys 17 kärsivien potilaiden rakkosyöpä- kaukaisiin etäpesäkkeitä, 50 NMIBC potilasta, ja 40 ei-maligniteetti potilaille. Formaliini-, parafiiniin upotetut kudokset saadaan höyläysleikkaus diagnosointiin leikattiin 5 um: n leikkeiksi, ja asennettu dioja IHC värjäystä. Histologista arviointia IL-6 värjäys, värjäytyminen pisteytettiin itsenäisesti kaksi tarkkailijaa, jotka olivat sokeita kliiniseen tulokseen potilailla; ristiriitainen tulokset tarkistettiin ja päästiin. Esillä olevassa tutkimuksessa, kriteeri on yli 10% positiivista värjäytymistä kasvainsolujen pidettiin positiivisena, on IHC pisteytys, joka määriteltiin receiver operating (ROC) käyrä analyysi.

Soluviljely ja reagenssit

HT137 ja HT1197, ihmisen virtsarakon syövän solulinjat, saatiin American Type Culture Collection (ATCC). IL-6-neutraloiva vasta-aine saatiin R kaksi yksilöt kussakin vyöhykkeessä). Alukesekvenssit olivat seuraavat: (eteenpäin ja taaksepäin, vastaavasti) 5′-GTTCTTCCTCCTGGAGAATGTCA-3 ’ja 5′-GGGCCACGCCGTACTG-3′ ja DNMT-1; 5’-TACATCCTCGACGGCATCTC-3 ’ja 5′-GCTACATTTGCCGAAGA- -GCC-3’ IL-6. Β-aktiini alukesarjaa käytettiin latauskontrollina. Optimoitu PCR suoritettiin koskevasta iCycler iQ monivärinen reaaliaikainen PCR tunnistusjärjestelmä. Merkittävät fluoresoiva PCR-signaalit kohdunkaulan kudoksen normalisoitiin suhteessa keskiarvo saatujen signaalien ei-pahanlaatuisia kudoksia.

Entsyymi-immunologinen määritys (ELISA) ja IL-6 tasot

in vitro

ja

in vivo

Virtsanäytteet saatiin 60 virtsarakon syöpiä (25 potilailta, joilla NMIBC, 35 niistä lihasten-invasiivisia sairauksia), ja 20 näytettä potilailta ilman merkkejä maligniteetti. Näyte 10 ml: aan tuoretta virtsaa kerättiin kustakin aiheesta, ja sen jälkeen sentrifugoitiin 3000 rpm: llä 5 minuutin ajan. Tuolloin analyysin virtsan alikvootit sulatettiin ja virtsan IL-6 mitattiin supernatanteista. Kaupallisesti saatavilla ELISA-määritys (HS ihmisen IL-6-immuno-; R 0,05 katsottu viittaavan merkityksen. Merkitys ero näytteiden välillä määritettiin käyttämällä Studentin t-testiä. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM). Kolme toistot tehtiin arvioimiseksi kussakin kokeessa, ja toista koko joukko kokeita vähintään kahdesti. Todennäköisyys taso p 0,05 hyväksyttiin kauttaaltaan määrittämään tilastollista merkittävyyttä, ellei toisin mainita.

Tulokset

IL-6 ilmaisuja virtsarakon syöpiä

taso IL -6 kudosnäytteitä (kuusi pariksi syöpä ja viereisen ei-pahanlaatuisten kudosnäytteiden) tutkittiin käyttäen mRNA ja proteiini analysoidaan. Kuten kuviossa 1A on esitetty, virtsarakkosyöpänäytteiden ilmaistaan ​​huomattavasti korkeampaa IL-6 kuin ei-pahanlaatuisia kudoksia. IHC analyysi virtsarakon TCC (Fig. 1 B ja taulukko 1) osoitti positiivista värjäytymistä IL-6 51% T2 -T4 virtsarakon syövän kudoksissa [28% (11/39) T2 vs. 70% (32/46) in T3 -T4;

P

= 0,0001]. Lisäksi 65% (11/17) kehittyneempien kasvainten (potilailla, joilla on etäispesäkkeitä) osoitti positiivista värjäytymistä IL-6, mutta vain 17,5% (7/40) ei-pahanlaatuisten virtsarakon kudosten ja 26% (13 /50) alkuvaiheen kasvaimet (CIS tai T1) ilmaistuna IL-6. Kuten kuviossa 1C, positiivista värjäytymistä IL-6 korreloi merkitsevästi kliinisen vaiheen (T2 -T4 vs. T1 ja IVY;

P

= 0,005). Lisäksi virtsan tasoa IL-6 tutkittiin ELISA-analyysi. Keskimääräinen IL-6 tasoa virtsanäytteistä sairastavien potilaiden NMIBC (81 ± 30,8 pg /ml) ja T2 lihas-invasiivisia virtsarakon syöpä (98 ± 24 pg /ml) oli hieman suurempi kuin ilman pahanlaatuinen sairaus (25,14 ± 9,71 pg /ml), mutta erot eivät olleet tilastollisesti merkitseviä (Fig. 1 D). Virtsan IL-6 tasot olivat merkitsevästi koholla potilailla, joilla T3 -T4 paikallisen kehittynyt virtsarakon syöpiä (250 ± 27 pg /ml) verrattuna potilailla, joilla ≤T2 virtsarakon syöpä tai ei-pahanlaatuinen sairaus (

P

= 0,01).

. Tasot IL-6 tutkittiin kuudessa yksilöt (pariksi syöpä (C) ja viereisen ei-pahanlaatuinen kudos (N); kaksi koekapaletta kaistaa) RT-PCR ja Western blotting-analyysi. Real-time RT-PCR-analyysi, y-akseli esittää suhdetta IL-6 syöpäkudoksessa jaettuna, että ei-pahanlaatuinen näytteen. Pylväät, keskiarvo kolmesta erillisestä kokeesta; Bars, keskihajonta (SD); *,

P

0,05. B. immunohistokemiallinen värjäys ihmisen virtsarakon syövän näytteet anti-IL-6-vasta-ainetta. Edustavia kuvia näytetään. C. IHC tiedot osoittivat, että IL-6-tasot olivat merkittävästi korreloi kliinisen vaiheen. D. Virtsan IL-6 tasoa potilaista tutkittiin ELISA-analyysi. Pylväät, keskiarvo kolmesta erillisestä kokeesta; Bars, SD; *,

P

0,05. (NT, joilla on ei-pahanlaatuinen sairaudet).

rooli IL-6 kasvaimen kasvua ja invaasiota

Sen tutkimiseksi, IL-6: lla on rooli aggressiivinen käytös virtsarakon syövän, HT1197 ja HT1376-solut transfektoitiin IL-6-GFP hiljentäminen vektori. Kuten kuviossa 2A on esitetty, IL-6 hiljentäminen vektori merkittävästi vähentynyt IL-6 ilmentymistä molemmissa solulinjoissa. Kuten selvitettiin elinkykyisten solumäärää yli kuusi päivää (kuvio 2B), IL-6 hiljentäminen vektori vaimensi merkittävästi leviämisen nopeus HT1197 ja HT1376-solut. Lisäksi käytetään ksenograftikasvaimissa mallia, estämällä IL-6 johti hitaampi kasvaimen kasvua

in vivo

(Fig. 2C). Tulokset osoittavat, että IL-6 hiljentäminen vektori estivät merkittävästi kasvuvauhti virtsarakon syöpäsoluja. Lisäksi IL-6 hiljentäminen vektori vaimensi merkittävästi invasiivisen kapasiteetti virtsarakon syövän solujen osoitettuna käyttäen muuttoliike naarmu määrityksiä [16] ja invaasiomääritys

in vitro

(Fig. 3A, kuvio. S1). Ortotrooppinen kasvaimen istutuksen tekniikkaa käytettiin vaikutusten tutkimiseksi IL-6 hiljentäminen vektori invasiivisista valmiudet

in vivo

(Fig. 3B). Kuusitoista hiiret saivat intravesicular tiputtamisen kunkin virtsarakon syövän solulinjaa. Jälkeen 28 päivää, 13 hiirtä (81%) instilled HT1197-solujen, neljä (25%) instilled HT1197-solujen ja IL-6 hiljentäminen vektori, 11 (69%), ja HT1376-solujen, ja kaksi (13%), ja HT1376-solujen plus IL-6 hiljentäminen vektori kehitettiin intravesicular kasvaimia. Tiedot osoittivat, että IL-6 hiljentäminen vektori laski invasiivisia valmiudet

in vivo

.

. Vaikutukset IL-6-GFP hiljentäminen vektori on IL-6-taso HT1197 ja HT1376-solujen osoitettiin immunofluoresenssianalyysillä. Edustavia micrographs näytetään, vastaavien immunofluoresenssimenetelmällä värit (DAPI, sininen, GFP, vihreä, IL-6, punainen). IL-6-tasot vähenivät merkittävästi IL-6-GFP hiljentäminen vektori verrattuna kontrolli-GFP-vektorilla. B. vaikutukset IL-6 hiljentäminen vektori lähtien hän leviämisen hinnat HT1197 ja HT1376 syöpäsoluja. Sama määrä soluja (10

4) maljattiin kullekin levylle päivänä 0 ja niiden annetaan kasvaa niiden kulttuureissa. Laskimme elinkykyisten solujen inkuboinnin jälkeen 2, 4 ja 6 päivää. Y-akseli edustaa elävien solujen määrä. Point, keskiarvo kolmen erillisen kokeen. Bars, SD. *,

P

0,05. C. vaikutukset IL-6-inhibition ksenograftin kasvaimen kasvua. Kukin piste edustaa keskiarvoa kolmesta erillisestä kokeesta; baaria, SD; *,

P

0,05. IL-6 arvioitiin myös immunokemiallinen värjäämällä ksenograftien. Edustavia kuvia näytetään × 400 suurennus.

. Invasiivista kapasiteetti virtsarakon syövän solujen kanssa tai ilman IL-6 hiljentäminen vektori arvioitiin muuttoliike tyhjästä määrityksiä. Tulokset edustaja kuvia näytetään. Sarakkeessa, keskimääräinen kolmen erillisen kokeen. Bars, SD. *,

P

0,05. B. invasiivinen kyky virtsarakon syövän solujen kanssa tai ilman IL-6 hiljentäminen vektori arvioitiin hiiren ortotooppisten kasvaimen istutuksen. Edustaja dioja ja määrälliset tiedot esitetään. Y-akseli edustaa suhdetta hiiret esittää intravesicular kasvaimia, normalisoitu, jotka saivat ortotooppisten kasvaimen istutuksen. IL-6 hiljentäminen vektori vähensi kasvaimen istutuksen virtsarakon ja liittyi pienempi kasvaimen kokoa. Sarakkeessa, keskimääräinen kolmen erillisen kokeen. Bars, SD. *,

P

0,05. (CV, jotka on transfektoitu kontrollivektorilla, IL-6 SV, transfektoitujen solujen IL-6 hiljentäminen vektori). C. muutos E-kadheriinin soluissa arvioitiin ja edustaja micrographs esitetään, vastaavien immunofluoresenssimenetelmällä värit (DAPI, sininen, GFP, vihreä, E-kadheriinin, punainen). D. muutos EMT liittyvien proteiinien transfektanttien arvioitiin Western blotting -analyysi (CV, jotka on transfektoitu kontrollivektorilla, IL-6 SV, transfektoitujen solujen IL-6 hiljentäminen vektori). E. muutos EMT liittyvien proteiinien soluissa käsitelty JAK inhibitor- AG490.

rooli IL-6 EMT muuttuu

EMT on keskeinen tapahtuma invasiivisuus [17] ja tutkimme, onko tämä on taustalla oleva mekanismi aggressiivista käyttäytymistä IL-6-positiivisia virtsarakon syöpä. Kuten kuviossa 3C on esitetty, D, IL-6 hiljentäminen vektori lisääntyneen ekspression E-kadheriinin liittyy väheneminen verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) ja matriisin metallopeptidaasi 9 (MMP-9) ilmaisuja tuumorisoluissa [18]. On raportoitu, että IL-6 on merkittävä aktivaattori STAT3 signalointia, ja aktivointi STAT3 signaloinnin tärkeä rooli induktio tuumorien aggressiivisempaa käyttäytymistä ja EMT muutokset syövässä [19]. Kun estetty STAT3 aktivaatio JAK estäjä-AG490, EMT liittyvät proteiinit vähenivät (kuvio. 3E). Nämä havainnot viittaavat siihen, että lisääntynyt aggressiivinen kasvaimen käyttäytymisen ja EMT aiheuttamia muutoksia IL-6 voi välittää STAT3 aktivointi, joka on ainakin osittain.

Effects of IL-6 angiogeneesiin

ELISA tiedot paljasti, että IL-6 hiljentäminen vektori selvästi vaimentunut IL-6 eritystä soluviljelysupernatantit ja seerumin hiiristä 28 päivän kuluttua kasvaimen implantaation (Fig. 4A). CD31-välitteistä endoteelisolujen-solu-vuorovaikutuksia ovat mukana angiogeneesin [20]. Kuvio 4B osoittaa, että IL-6 hiljentäminen vektori vaimennetaan angiogeneesiä osoittaa värjäytymistä CD31: n ja VEGF. Edelleen tutkittiin, kiertävän IL-6 helpottaa angiogeneesin induktio, intraperitoneaalisesti IL-6 (60 tai 100 ng per hiiri, 3 kertaa viikossa), aloitettiin yksi päivä ennen kasvaimen istutuksen. Kuten on esitetty kuviossa 4C, IL-6 laukeaa angiogeneesiä ja endoteelisolujen putken muodostumiseen kasvaimeen värjäämällä VEGF, MMP-9 ja CD31 hiirissä kasvaimia varten 2 viikkoa. Siksi angiogeneesin induktio voi olla yksi niistä mekanismeista, joka vastaa kasvaimen edistämisen IL-6.

. Taso IL-6 soluviljelysupernatantit ja seerumista hiirillä kasvaimia tai ilman IL-6 hiljentäminen vektori tutkittiin ELISA

in vitro

ja

in vivo

. Sarakkeessa, keskimääräinen kolmen erillisen kokeen. Bars, SD. *,

P

0,05. B. Muutos verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) ja matriisin metallopeptidaasi 9 (MMP-9), ja CD31 tuumoriksenografteja arvioitiin immunohistokemiallisella värjäyksellä. Tulokset edustaja kuvia näytetään. C. Vaikutus IL-6-ksenografti kasvaimen kasvun ja angiogeneesin induktio arvioitiin hiirissä, jotka kantoivat tuumoreita varten 2 viikkoa. Kasvaimen solut injektoitiin subkutaanisesti hiiriin kanssa tai ilman IL-6 injektiota kuten on esitetty materiaalit ja menetelmät, ja tutkittiin kasvaimen kasvun 2 viikkoa myöhemmin. Immunohistokemia käyttäen MMP-9, CD31, ja VEGF stained- edustaja liukuu osoitettiin.

suhde IL-6 ja DNMT1 virtsarakon syövän

Kuten aikaisemmin on raportoitu [21 ], korkeampi DNMT1 tasot liittyivät aggressiivinen kasvain käyttäytyminen ja EMT muutokset virtsarakon syöpiä. Löysimme oli merkittävä korrelaatio positiivisen värjäytymisen IL-6 ja DNMT1 siitä IHC värjäystä virtsarakkosyöpänäytteiden (Kuva. 5A). MRNA ja proteiini analyysi, vähentynyt IL-6 johti esti DNMT1 liittyy heikennetyn STAT3 ja Akt aktivointi (Fig. 5B-C). Olemme edelleen tutki, IL-6 esto väheni DNMT1 ilmentymisen eston kautta AKT: ä käyttäen PI3K estäjä-LY294002 [22], tai alaspäin säätely STAT3 kanssa STAT3 lyhyt häiritsevä RNA (siRNA). Kuten on esitetty kuviossa 5D, esto Akt-fosforylaation, mutta ei ole laskenut p-STAT3, vaimensi merkittävästi DNMT1 ilmaisua. Sen vuoksi on ehdotettu, että aktivointi AKT voi olla vastuussa lisääntyneestä DNMT1 IL-6-positiivisia virtsarakon syöpä.

. IL-6 taso korreloi positiivisesti DNMT1 ilmentymistä ihmisen virtsarakkosyöpänäytteiden (

P

0,0001). Edustaja kalvot valitun tuumorinäytesylinterin positiivisesti värjäämällä sekä IL-6 ja DNMT1, ja toinen tuumorinäytesylinterin negatiivisia sekä IL-6 ja DNMT1 näkyvät x 400 suurennuksella. B. Vaikutus IL-6 tasolla DNMT1, p-AKT, ja p-STAT3 tutkittiin Western blottauksella (CV, jotka on transfektoitu kontrollivektorilla, IL-6 SV, transfektoitujen solujen IL-6 hiljentäminen vektori ). C. Vaikutus IL-6 tasolla DNMT1 ja p-AKT arvioitiin immunohistokemiallisella värjäyksellä ja tulokset edustavien kuvia näytetään. D. vaikutus IL-6 inhiboi IL-6-neutraloivien vasta-aineiden, p-AKT inhibitiota PI3K-estäjä, ja p-STAT3 inhibitio STAT3 siRNA tasolla DNMT1 tutkittiin Western blottauksella (W, villityypin; IL -6

-, solut, joita käsiteltiin IL-6-neutraloivat Ab, STAT3

-, solut käsiteltiin Stat3 siRNA, PI3K-I, soluissa, joita käsiteltiin PI3K-estäjä.

IL- 6 liittyy kliininen tulos virtsarakon TCC

mediaani ilman taudin etenemistä aikaa 85 potilasta valmistunut selvä CCRT hoito oli 36,97 kuukausi. By univariate analyysi, positiivista värjäytymistä IL-6 merkittävästi liittyvät paremmat kliinisen vaiheessa korkeampi tauti virhetaajuus jälkeen selvä hoidon ja lyhyempi elinaika (taulukko 1 ja kuvio 6). havainnot voimakkaasti korostavat osuus IL-6 ennusteen virtsarakon syöpään.

selviytymisen ero osoitettiin mukaisesti positiivista värjäytymistä IL-6. Kaplan-Meier eloonjäämiseen käyrät osoittivat, että potilailla, joilla on korkeampi IL-6 ilme oli lyhyempi selviytymisen aikoja.

keskustelu

Osoitimme että IL-6 ilmentyi korkeammalla tasolla virtsarakon TCC kuin ei-pahanlaatuinen kudosten. Lisäksi positiivista värjäytymistä IL-6 on edullisesti liittynyt lihas-invasiivisia virtsarakon TCC suhteessa alempaan vaiheen Ta T1 tauti. Virtsan tasoja IL-6 myös merkittävästi kohonnut potilailla, joilla on paikallisesti edennyt virtsarakon TCC verrattuna potilaisiin, joiden NMIBC. Siksi IL-6 ilmaisu saattaa liittyä entistä pahanlaatuinen fenotyyppi.

Sen tutkimiseksi, IL-6 vastasi aggressiivista käyttäytymistä virtsarakon TCC, IL-6 tukahdutettiin virtsarakon syövän soluissa vakaa transfektio vaiennettu vektori. Data osoitti, että estämällä IL-6 alensivat virtsarakon kasvaimen kasvu

in vitro

ja

in vivo

. Lisäksi IL-6 hiljentäminen vektori vaimensi merkittävästi invasiivisen kyvyn havaita solujen invaasiota määrityksissä ja hiiri potilaalle tehdä malleja. IL-6 on merkittävä aktivaattori JAK /STAT3-signalointi [10], [11], ja aktivoitu STAT3 signalointi on raportoitu myötävaikuttaa onkogeneesiin edistämällä proliferaatiota ja EMT [18], [23]. Lisäksi STAT3 aktivointi on osoitettu rooli altistavia urothelial tyvisoluissa kohti CIS etenemistä väylän invasiivisia virtsarakon syöpä [24]. Tuloksemme osoittivat, että inhibitio IL-6 heikennetty STAT3 aktivaatio liittyy lisääntynyt E-kadheriinin ja laski VEGF: n ja MMP-9 ilmaisuja. Lisääntynyt ilmauksia VEGF ja MMP-9 raportoidaan korreloivan EMT muutos ja huonon ennusteen virtsarakon syöpään [25], [26]. Siksi on todennäköistä, että STAT3 aktivointi on rooli IL-6 lähettävä loppupään tavoitteita, jotka säätelevät EMT ja invasiivisuus.

Osoitimme, että IL-6 tasoa seerumissa ja virtsassa oli koholla potilaiden alaryhmässä lihas-invasiivisia virtsarakon syövän, johdonmukainen muiden tutkimuksen [13], [27]. Angiogeneesi on yksi niistä mekanismeista, jotka edistävät syövän etenemiseen, ja angiogeenisten tekijöiden ilmentymistä ehdotetaan olevan ennustava arvo hoitovasteen ja lopputulos syöpäpotilailla [28]. Lisäksi IL-6 on raportoitu pelata useita toimintoja angiogeneesissä ja verisuonten mallintaminen [29], ja lisätä angiogeneesin transkription VEGF ja MMP-9 STAT3 riippuvaisesti. STAT3-aktivaatio osoitettiin moduloida geenien, jotka välittävät angiogeneesi;

e

.

g

., VEGF [30]. Siten yhteyksiä IL-6, angiogeneesi, ja edistäminen virtsarakon syövän kasvain kantavien hiirten tutkittiin tarkemmin tässä tutkimuksessa. Käyttämällä ksenografti kasvain malli, meidän tiedot osoittivat, että IL-6 taso liittyy myönteisesti angiogeneesiä ja STAT3 aktivointi. Nämä havainnot ehdottivat, että angiogeneesin induktio välittyy STAT3 aktivaatio voi olla yksi mekanismeista aggressiivisuus IL-6-positiivisia virtsarakon syöpä.

aiemmin raportoitu [21], että DNMT1 voisi olla merkittävä kliininen ennustaja virtsarakon syövän. Tutkimuksissa on todettu, että DNMT1 ekspressiota voidaan suoraan muuttaa pro-inflammatoristen sytokiinien, kuten IL-6 joidenkin pahanlaatuisten [5], [31], [32]. Positiivinen korrelaatio IL-6-positiivista näytettä ja tumavärjäystä varten DNMT1 löysi IHC analyysi tässä tutkimuksessa. Suhde IL-6 /STAT3 signalointi ja DNMT1 virtsarakon syövän edelleen selvittää, onko sääntely IL-6 /STAT3 signalointi aiheuttaa muutoksia DNMT1 ilmaisua. MRNA ja proteiini analyysi paljasti, että esti IL-6 signalointi tukahdutetaan ydin- DNMT1 ilmaisu liittyy pienentynyt p-AKT ja p-STAT3. Kuitenkin suoraan estämällä STST3 by STST3 siRNA ollut mitään ilmeistä vaikutusta DNMT1 ilme. Fosforylaatio Akt-kinaasin on raportoitu olevan mekanismi vastuussa tehostetun ilmentymisen DNMT1 stimuloitiin IL-6: [33], [34]. Kun me estetty fosfoinositidi 3-kinaasi /Akt signalointi käyttäen spesifisen inhibiittorin LY294002, vaimennus AKT aktivointi liittyy pienentynyt DNMT1. Siksi ehdotamme, että aktivoitu IL-6 signalointi parannettu aktivointi DNMT1 välittyy aktivoimalla Akt rakon TCC.

Mahdollisten tekijöiden on merkittäviä vaikutuksia kehittämistä ja valinta molekyylikohteista syövän hoidossa. Meidän kokeelliset tiedot osoittivat, että taso IL-6 on tärkeää aggressiivinen kasvain käytös nähdään virtsarakon syöpään. Siksi me tutki vielä ennusteita IL-6 koskien kliininen tulos virtsarakon TCC jälkeen varmaa CCRT. Tuloksemme osoittivat, että tehostettu ilmentyminen IL-6 merkitsevästi liittyä pienempi täydellinen hoitovaste hoidon jälkeen, korkeamman tauti virhetaajuus ja lyhyempi elinaikajakson, mikä osoittaa roolin IL-6 ennustamisessa ennusteeseen. Saadut tiedot esillä Tutkimus osoitti, että lisääntynyt IL-6-tuotanto on kriittinen kasvaimen aggressiivisuus ja ennusteen virtsarakon syöpä. Hahmoteltiin tärkeimmät signalointireittejä, jotka on ajateltu yhdistää IL-6 virtsarakon syöpä (Fig. 7).

Lisäksi IL-6, useita sytokiineja raportoitiin olevan tärkeitä tutkimuksia virtsarakon syöpä. TNF-α oli osoitettu stimuloivan virtsarakon syövän solujen tuottamaan MMP-9, joka on liitetty kasvaimen invaαsion ja etäpesäkkeiden [35]. Mian et. al. raportoitu, että IL-8 salpaus inhiboi merkittävästi ilmaisuja MMP-2 ja MMP-9, jolloin laskeva invaasio [36]. Lisäksi lisääntynyt IL-8 korreloi huonon ennusteen virtsarakon syövän [37]. Tulehdus voidaan pitää mahdollistaa sen panoksesta hankintaan ydin tunnusmerkki ominaisuuksia. Biologisten mekanismien yhdistää kasvaimen aggressiivisuutta IL-6, IL-8 ja TNF-α ole ymmärretty. Kysymystä tarvitsee lisätutkimuksia tulevaisuudessa.

Tutkimuksemme on joitakin rajoituksia. Ensin jälkikäteen tutkittiin ennustearvo IL-6 virtsarakon syöpäpotilailla vain osa positiivista värjäytymistä. Lisäksi se on retrospektiivinen analyysi väestön eri kliinisissä vaiheissa yhdestä laitos. Siksi lisäselvityksiään tasoja IL-6 potilailla, joilla on eri vaiheissa prospektiivisessa tutkimuksessa tarvitaan.

Yhteenvetona havaintomme osoittavat, että IL-6 on erittäin tärkeää aggressiivinen kasvaimen kasvua, ja kliininen tulos