Krooninen sairaus

tiivistelmä

Huolimatta monista todisteita tukemaan käsite ”onkogeenin riippuvuus” ja monia hypoteeseja järkeistämisestä se on edelleen puute yksityiskohtainen käsitys nimenomaiseen molekyylimekanismin taustalla onkogeeni riippuvuus. Tässä tilin, kehitimme matemaattinen malli kasvutekijän reseptorin (EGFR) signaloinnin verkkoon, johon liittyy EGFR-ajo leviämisen /pro-eloonjäämisen signalointireitteihin Ras /solunulkoisen-signaali säädelty kinaasi (ERK) ja phosphoinositol-3 kinaasi ( PI3K) /AKT ja proapoptoottisiin signalointireitin apoptoosisignaalin säätelevää kinaasi 1 (ASK1) /p38. Kun asetus jatkuva EGFR aktivointi, simulaation tulokset osoittavat pysyvä korkea leviämisen /pro-selviytyminen efektoreita fosfo-ERK ja fosfo-AKT, ja perustason proapoptootti- efektori fosfo-p38. Mahdollinen p38 aktivaation (apoptoottinen mahdollisten) vuoksi kohonnut reaktiivisia hapen lajeja (ROS) on suurelta osin tukahdutti negatiivinen välinen ylikuuluminen PI3K /AKT ja ASK1 /p38 polkuja. Kun akuutti EGFR inaktivaation, selviytyminen signaaleja rappeutuminen nopeasti, jonka jälkeen nopea kasvu apoptoottisen signaali johtuu vapautumisen apoptoottisten potentiaalia. Kaiken kaikkiaan meidän systeemibiologian mallinnus yhdessä kokeellisen vahvistusten paljastaa, että esto eloonjääntisignaaleja ja samanaikainen vapautuminen apoptoottisten mahdollisia yhdessä edistää kasvainsolun kuoleman jälkeen eston addiktoitunut onkogeenin EGFR koukkuun syövissä.

Citation: Zhou JP Chen X, Feng S, Luo SD, Pan YL, Zhong L, et al. (2011) Systems Biology Modeling Paljastaa mahdollinen mekanismi on kasvainsolukuoleman upon Oncogene inaktivaatio EGFR Addicted Syövät. PLoS ONE 6 (12): e28930. doi: 10,1371 /journal.pone.0028930

Editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kiina

vastaanotettu: 20 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 17 marraskuu 2011; Julkaistu: 14 joulukuu 2011

Copyright: © 2011 Zhou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (20872100, https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default124.htm) ja Youth Foundation Sichuanin maakunnassa (08ZQ026-030, http: //www.qnjj .sc.cn /). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

käsite ”onkogeenin riippuvuus” oli ensinnäkin esille Weinstein perustuu erikoinen ilmiöitä, jotka leviäminen ja selviytymisen joidenkin syöpien vahvasti riippuvaisia ​​vain yhdestä onkogeenisia proteiinia tai reitin, läsnäolosta huolimatta useiden geenimutaatioiden ja epigeneettiset poikkeavuuksia [1] – [3]. Nyt paljon todisteita on todettu tukemaan tätä käsitettä, mukaan lukien geneettisesti muokatuista hiirimalleihin [4], [5], mekaaniset tutkimukset ihmisen syövän solulinjoissa [6], [7], ja erityisesti hyvän kliinisen terapeuttinen teho sarjan vasta-aineita tai pienimolekyylisiä lääkkeitä, jotka kohdistuvat tiettyjen proteiinien ihmisen syövissä raportoitu viime vuosina [8] – [10]. Tällä hetkellä useat hypoteeseja on ehdotettu selittää ilmiötä onkogeenin riippuvuuden, mukaan lukien geneettiset selkeyttäminen [11], [12], synteettiset kuolleisuutta [13], onkogeeninen muistinmenetys [14], ja onkogeeninen sokki [15], [16]. Nämä olettamukset antavat erilaisia ​​selityksiä eri näkökulmista ilmiö onkogeenin riippuvuuden. Jopa niin, on vielä riittävästi yksityiskohtaista ymmärrystä tarkkaa mekanismia taustalla onkogeeni riippuvuus. Erityisesti molekyylitasolla joitakin olennaisia ​​liittyviä ilmiöitä onkogeenin riippuvuus on edelleen epäselvä, esimerkiksi, ilmiö, että akuutti onkogeenin inaktivaatio johtaa kasvainsolujen kuolemaan onkogeenin riippuvaisia ​​syöpiä, säästäen muut solut, jotka eivät ole samalla tavalla riippuvaisia.

on ehdotettu, että epämuodostuma solunsisäisten piiri (signaalitransduktion verkko) tai ”kytkentäkaavio” on tärkein syy, joka selittää ilmiöitä onkogeeni riippuvuuden [2], [17]. Monimutkaisuus solunsisäisen piiri yhdessä monen geneettisiä mutaatioita syöpäsoluissa vaikeuttaa ymmärtämistä molekyyliperustan perustana onkogeeni riippuvuus [18], [19]. Tilanne on nyt muuttunut hieman johtuen viimeaikainen edistys systeemibiologiaa [20] – [22], erityisesti laskennallisen systeemibiologian [23], [24]. Siten yksi on tällä hetkellä hyvät mahdollisuudet soveltaa näitä tekniikoita paljastaa mahdolliset molekyylitason mekanismit eri liittyviä ilmiöitä onkogeeni riippuvuus.

Koska ensimmäinen teos ymmärtää onkogeenin riippuvuus näkökulmasta systeemibiologian, vuonna tässä tutkimuksessa olemme kehittäneet matemaattinen malli epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) -associated signaloinnin verkkoon tutkimaan mahdollisia molekyylimekanismi kasvainsolun kuoleman jälkeen inhibitio riippuvainen onkogeenin. Tässä valitsimme EGFR-signaloinnin verkkoon lähinnä seuraavista syistä: (1) EGFR on yksi tärkeimmistä onkogeenien ja yhdistetty moniin ihmisen kasvaintyypit erityisesti keuhkosyövässä, pään ja kaulan kasvaimet [25], [ ,,,0],26]; (2) EGFR signalointi verkko on laajalti tutkittu kokeellisesti ja teoreettisesti [27] – [30], mikä tarkoittaa, että monet parametrit ovat saatavilla kirjallisuudesta, joka helpottaa mallin kehittämiseen. Tämä malli oli validoitu ensin, ja sitten hyödyntää simuloida normaalitilaan syöpäsolujen ja verkon vastauksia kun akuutti EGFR esto.

Tulokset

perustaminen matemaattisia malli EGFR-liittyvä signalointi verkko

Me täällä esitellä tavallisen differentiaaliyhtälön (ODE), joka matematiikan malli EGFR-liittyvä signalointiverkolla, johon liittyy EGFR-ajo leviämisen /pro-eloonjäämisen signalointireitteihin Ras /solunulkoisen-signaali säädelty kinaasi (ERK) ja phosphoinositol -3 kinaasi (PI3K) /AKT ja proapoptoottisiin signalointireitin apoptoosisignaalin säätelevää kinaasi 1 (ASK1) /p38. Ne osat Ras /ERK ja PI3K /AKT reittejä tässä mallissa perustettiin perustuvat tiedossa Ras /ERK ja PI3K /AKT malleja kuten esimerkiksi Brightman [31], Birtwistle [30], Schoeberl [29], ja Oda [32 ] malleja. Kirjoittajien tietämyksen kuitenkin, ei ole olemassa matemaattinen malli, p38-välitteisen pro-apoptoottista signalointireitin vielä raportoitu kirjallisuudessa. Meillä on siis rakennettu malli p38 signaloinnin ja sisällytti sen EGFR signalointia verkkoon. Malli koostuu 243 yhtälöitä ja vuorovaikutus 160 erillistä molekyyli- lajeja, ominaista 145 kineettiset parametrit ja 28 nollasta alkuperäisen molekyyli pitoisuuksia. Useimmat kineettisten parametrien ja alustava molekyylien pitoisuudet tässä mallissa on otettu kirjallisuudesta tai johdettu perus fysikaalis määristä [29], [30], [33]. Toiset arvioitiin sovittamalla malli tuottaa tunnettuihin kokeellisia tietoja hybridisiä lähes ensemble mallinnus algoritmi ehdottamat meille äskettäin [34]. Tärkeimmät ja parametreja on esitetty taulukossa S1, ja alustava molekyylien pitoisuudet taulukossa S2 (katso tukeminen Information). Tärkeä signalointireittejä ja keskeisten komponenttien mukana meidän verkon malli on esitetty kuvassa 1. Lyhyt kuvaus tälle EGFR-liittyvä verkko annetaan seuraavasti.

Yhtenäiset viivat nuolet osoittavat aktivoitumista proteiinien tai lipidien. Katkoviivat esittävät suoran proteiini-proteiini ja proteiini-lipidi vuorovaikutuksia. Kiinteät linjat tylpät päät ovat inhibition.

normaali tila, verkon signalointi aloitetaan sitomalla epidermaalisen kasvutekijän (EGF) ja EGFR, jonka jälkeen dimerointi ja sen jälkeen keskinäisen trans-fosforylaatio useita tyrosiinitähteillä EGFR; vaikka EGFR perhe on kolme muuta jäsentä, mukaan lukien ErbB2, ErbB3, ja ErbB4 lisäksi EGFR (erbb1), joka voi muodostaa erilaisia ​​himmentimet (joko homo- tai hetero-dimeerit) [30], [35], vain EGFR ja EGFR-EGFR homo -dimers pidetään tässä mallissa yksinkertaistamista. Nämä fosfo-tyrosiinitähteillä toimivat telakointipaikkoina jotka mahdollistavat reseptorit rekrytoida adaptoriproteiineja Shc ja Grb2 [36], jota voidaan sitten rekrytoida guanosiininukleotidin vaihto tekijä SOS. SOS edistää korvaamista stä vuoteen GTP Ras, siten aktivoimaan Ras [37]. Aktivoitu Ras johtaa myöhemmin proteiinikinaasi Raf [38]; koska suora aktivaattori Raf-kinaasin ei ole vielä tiedossa, oletamme, että Raf fosforylaatio on aiheuttanut suoraan Ras-GTP-molekyylin tässä mallissa. Aktivoitu Raf lopulta aktivoi mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin kinase1 /2 (MEK), ja ERK kaskadiin tavalla [39]. Aktivoidut ERK voi fosforyloida ylävirtaan proteiinin SOS, siten aiheuttaen dissosiaatiota Grb2-SOS reseptorin kompleksin, joka muodostaa negatiivisen takaisinkytkentäsilmukan [40]. Lisäksi Grb2 vuonna cytomembrane voi myös rekrytoida Gab1, joka aiheuttaa fosforylaatio Gab1 ja seurauksena rekrytointi PI3K [41]. Vuonna cytomembrane, PI3K muuntaa fosfatidyyli 4,5-bifosfaatin (PIP2) osaksi fosfatidyyli (3,4,5) -trisphosphate (PIP3), joka indusoi aktivoituminen AKT kautta yhteistyössä 3-fosfoinositidi riippuvaisen proteiinikinaasi-1 (PDK1) [42 ]. Tässä prosessissa, fosfataasin ja tensin homologi (PTEN) ja proteiini fosfataasi 2A (PP2A) voi erityisesti defosforyloivat PIP3 ja AKT vastaavasti [43]. Fosforyloituu Raf, MEK ja ERK voidaan defosforyloitiin niiden erityiset fosfataasien [30].

P38 joka on ajateltu olevan tärkeä proapoptoottisten efektori voidaan aktivoida erilaisia ​​ympäristön korostaa ja tulehduksellisten sytokiinien [44] – [46]. Joista, erityisen tärkeää on stressi johtuu reaktiivisia happiradikaaleja (ROS). Esimerkiksi, Dolado et ai. raportoitu että onkogeenisel- H-Ras aiheuttama ROS on keskeinen rooli tuumorin aloittamisesta aktivoimalla p38 ja siten johtaa apoptoosin fibroblasteissa peräisin hiiren alkioiden [47]. Lisäksi lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että stimulaatio ihmisen syöpäsoluja EGF johtaa lisäykseen solunsisäisen pitoisuuden ROS [48] – [50]. Jin ja hänen kollegansa jopa havaittu nopeuden ROS sukupolven aiheuttama EGF stimulaation A431 [50]. Siten ROS on mukana mallissamme tärkeänä alkupään osa p38 signalointireitin. ROS laukaisee aktivoituminen ASK1, joka sitten indusoi fosforylaation mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi kinase3 /6 (MKK) ja p38 limittäin tyyli [51]. Erityisiä fosfataasit ASK1, MKK ja p38 ovat myös mukana tässä mallissa. Lisäksi on todettu, että aktivoitu AKT voi estää aktivoinnin p38 kautta fosforyloivaan ASK1, joka muodostaa negatiivisen välinen ylikuuluminen PI3K /AKT ja ASK1 /p38 signalointireittejä. Esimerkiksi Zhang et ai. ilmoitti, että AKT voi fosforyloida ASK1 työmaalla Ser83 estävän vetyperoksidia aiheuttamaa ASK1 /p38 signaloinnin aktivaation endoteelisolujen [52]. Yuan ja hänen työtovereitaan osoitti myös, että AKT voi estää sisplatiinin aiheuttamaa p38 aktivaation kautta fosforylaation ASK1 [53]. Näin ollen ylikuulumisen AKT-ASK1 välillä PI3K /AKT ja ASK1 /p38 signalointireitteihin osallistuu myös mallissamme.

Mallin validointi

perustettu mallin kelpoisuus laskemalla ajanjaksoista useiden avainlajien aktivointi mukaan lukien Ras, ERK, AKT: n ja p38 lyhyen EGF stimulaatio ja vertaamalla simuloinnin tuloksia muiden julkaistun kokeellisen tai simulointi tutkimuksia EGFR signalointi. Kuvio 2 esittää simuloidun ajan funktiona kuvioita Ras, ERK, AKT: n ja p38 aktivaation altistuminen EGF vaihtelevilla 60 minuutin aikana. Lisättäessä EGR t = 0, koko pitoisuudet Ras-GTP, fosfo-ERK (p-ERK) ja fosfo-AKT (p-AKT) nopeasti nousta enimmillään 5 minuutin kuluessa niiden huiput riippuen EGR pitoisuus , jonka jälkeen rappeutunut niiden pohjapinta tasoilla 50 minuuttia. Tällä välin viivästynyt lisäys fosfo-p38 (p-p38), joka on huipussaan 15 minuutin jälkeen, on havaittu. Nämä ovat yhdenmukaisia ​​aiempien kokeellisten havaintojen. Esimerkiksi EGF stimulaatio PC12-soluissa johtaa nopeaan, ohimenevä aktivoituminen Ras ja ERK [27]. Taso Ras-GTP nopeasti saavuttaa maksiminsa 2 minuutin kuluessa altistumisesta EGF, mutta laskee 10 minuutissa ja vähitellen palautuu perustasolle 60 minuutin kuluessa. Samoin ERK aktivointi on maksimaalinen 5 minuutin, ja hajoaa alle 50% suurimmasta tason 30 minuuttia, ja alle 25% 60 minuutin kuluessa. Ohimenevä aktivoinnit ERK ja p38 jälkeen EGF stimulaation on havaittu myös verkkokalvon hiussuonten endoteelisolujen [54]. Sen jälkeen 5 minuutin altistuminen verkkokalvon hiussuonten endoteelisolujen EGF, ERK saavuttaa enimmäismäärä fosforylaation, joka on 20 kertaa suurempi kuin sen valvontaa. Seuraavina 2 tuntia, ERK aktivointi hajoaa, kunnes se saavuttaa perustason. P-p38, se lisää tason lähes kolminkertainen suhteessa sen ohjaus 15 minuutin kuluttua, jonka jälkeen lasku sen valvonnan tasolla.

Pitoisuus muutokset (A) aktiivinen ERK (fosfo-ERK), (B ) aktiivinen AKT (fosfo-AKT), (C) aktiivinen Ras (Ras-GTP) ja (D) aktiivinen p38 (fosfo-p38), kun ohimenevä stimulaation EGF eri pitoisuuksilla.

simulointi jatkuva aktivointi EGFR

sitten simuloida jatkuva EGFR aktivointi EGFR koukkuun syöpäsoluja. Tätä tarkoitusta varten reseptori sisäistämisen reaktiot poistettiin mallista, ja EGF pitoisuus oli asetettu kiinteä arvo. Kuvassa 3 on esitetty ajanjaksoista ERK, AKT: n ja p38 aktivaation. On selvää, että jatkuva EGFR aktivaatio johtaa lopulta stabiili korkean p-ERK ja p-AKT, kun nopea kasvu alussa. Kuitenkin p38 aktivaation jatkaa silti sen perustason vaikka havaittavissa pieni huippu p-p38 ensimmäisten 5 minuuttia. Kaiken jatkuva aktivointi EGFR johtaa lopputuloksena pysyviä korkean p-ERK ja p-AKT, mutta alhainen p-p38. Tämä on sopusoinnussa kokeellisten havaintojen EGFR koukkuun syöpäsoluja että ERK ja AKT pitää korkeatasoisen aktivointi ja p38 väittää alhainen aktivointi [16].

Pitoisuus muutokset (A) aktiivinen ERK (fosfo-ERK), (B) aktiivinen AKT (fosfo-AKT) ja (C) aktiivinen p38 (fosfo-p38), kun jatkuva stimulaatio EGFR eri tasoilla.

simulointi verkon vasteen akuutti EGFR inaktivaatiomenetelmät EGFR koukkuun syöpäsoluissa

Olemme juuri simuloitu normaali tila EGFR riippuvainen syöpäsolujen eli asetus jatkuva EGFR aktivointia. Tässä osiossa on simuloida verkon vasteen akuutti EGFR inaktivoitumista, joka jäljittelee tilannetta käyttäen EGFR: n estäjien EGFR koukkuun syöpäsoluja. Tässä simulaatio, akuutti EGFR inaktivaatio toteutettiin ennalta määritetty tapahtuma tiettyyn aikaan pisteen eli EGFR aktiivisuus oli asetettu sen perustasolle. Muutokset konsentraatiota aktivoitua ERK, AKT: n ja p38 akuutin EGFR esto on esitetty kuviossa 4. On selvää, akuutti EGFR inaktivaatio johtaa välittömästi laskua pitoisuus p-ERK ja p-AKT, ja viivästynyt lisäys p- p38. Simulaatio hyvin toistettu kokeellista ilmiöitä akuutti inaktivointi EGFR onkogeenin johtaa nopeaan heikkenemiseen solujen lisääntymistä /pro-selviytyminen efektoreita p-ERK ja p-AKT, ja myöhempi sitoutuminen proapoptoottisten efektori p-p38 EGFR riippuvaisiksi syöpäsolut [16], [55].

profiili pitoisuuden muutokset (A) aktiivinen ERK (fosfo-ERK), (B) aktiivinen AKT (fosfo-AKT) ja (C) aktiivinen p38 (phospho -p38). Virtuaalinen tapahtuma EGFR esto suoritettiin ajankohtana 0 h.

Herkkyystarkastelu kriittiset tekijät vastaavat p38 aktivaation

Herkkyysanalyysi on pitkään käytetty systeemibiologian tutkia, miten vaihtelu arvo simuloidun lähdön matemaattisen mallin voidaan kohdistaa eri lähteistä vaihtelua panos malli, jota voidaan käyttää kriittisesti proteiineja, jotka hallitsevat lähtö efektoriproteiini [29]. Tässä p-ERK, p-AKT ja p-p38 otettiin lähtömuuttujia herkkyysanalyysin. Kuvassa 5 on esitetty normalisoitu aika integroitu herkkyys lajien nollasta poikkeava arvoja EGFR signalointiverkon malli. On selvää, herkin solmut ERK aktivointia MEK ja Raf lisäksi välinpitämätön ERK: n ja EGF; ERK ja EGF ovat triviaaleja ratkaisuja koska ERK on suora prekursori p-ERK, ja EGF on aloitteentekijä verkon vasteen (yksinkertaisuuden, nämä välinpitämätön herkkä solmut ohitetaan myöhemmin). Sillä AKT aktivointi, herkin solmuun kuuluu Grb2, PIP2, Gab1, PI3K, PDK1, SOS, ja PTEN. Ja ne aktivointiin p38 pääasiassa ASK1, MKK, RacGDP, PP2A, AKT, PDK1 ja SOS.

Normalized ajan integroitu herkkyydet ERK, AKT: n ja p38 fosforylaatio (p-ERK, p-AKT, ja p-p38) kuhunkin nollasta poikkeava lajien EGFR-liittyvä verkon malli.

herkkyysanalyysi yläpuolella paljastaa kriittinen sääntelyviranomaiset verkossa eloonjäämisen efektoreja p-ERK ja p-AKT, ja pro-apoptoottisten efektori p-p38. Havaitsimme myös, että suurimmat positiiviset ja negatiiviset arvot herkkyys kaikki vastaavat tuotoksen muuttuja p-p38. Esimerkiksi AKT jolla on suurin negatiivinen arvo herkkyys proapoptoottiseen efektori p-p38 voi olla tärkeä negatiivisen säätelyn rooli solujen apoptoosin. ASK1, MKK ja RacGDP, jotka kaikki ovat keskeisiä komponentteja ROS /ASK1 /MKK /p38 signalointi cascade, on suurin positiivinen arvoja herkkyyden, mikä on keskeinen myönteistä roolia ROS liittyvän signaloinnin apoptoosia. Nämä havainnot voivat liittyä myös herkkyyttä kasvainsolujen tappaminen vaikutuksia kohdennettuja lääkkeitä. Jotta testata tätä hypoteesia, muutimme alkuperäinen verkko poistamalla joko ylikuulumisen AKT-ASK1 tai ROS, ja sitten uudelleen simuloitu verkon vastaukset asetuksissa jatkuva EGFR aktivointi ja akuutti EGFR inaktivaatiota. Kuvio 6A esittää simulointituloksia irrotettaessa ylikuulumisen AKT-ASK1. On selvää, korkea p-ERK ja p-AKT asettamisessa yllä EGFR aktivointi ja nopea lasku, kun akuutti EGFR esto (katso kuvio 6A) havaittiin, jotka ovat hyvin samanlaisia ​​kuin mallinnuksen tuloksista alkuperäisen verkkoon. Kuitenkin poistamisen jälkeen ylikuulumisen AKT-ASK1, p-p38 pitää korkealla tasolla, kun kyseessä on joko jatkuva EGFR aktivointia tai akuutti EGFR esto, mikä vahvempi apoptoottisia kapasiteetti. Kuvio 6B esittää mallinnuksen tulokset irrotettaessa ROS. Samanlainen tapaus poistettaessa AKT-ASK1, me edelleen seuraa korkea p-ERK ja p-AKT asettamisessa yllä EGFR aktivointi ja nopea lasku, kun akuutti EGFR esto. Kuitenkin ROS poisto johti alhainen p-p38, kun kyseessä on joko jatkuva EGFR aktivointia tai akuutti EGFR inaktivaatio. Nämä tiedot osoittavat, että poistaminen ROS johtaa menetykseen apoptoottisten kapasiteetin.

Virtuaalinen tapauksessa EGFR inhibitio suoritettiin ajankohtana 0 h. (A) vaikutukset poistaa ylikuulumisen AKT-ASK1 pitoisuudesta muutoksia p-ERK, p-AKT ja p-P38. (B) vaikutukset ROS poistoon pitoisuuden muutoksia p-ERK, p-AKT ja p-P38.

Yhdessä simuloinnin tuloksista tässä viittaavat siihen, että on voimakkaampi apoptoottinen mahdollisia nykyisten normaalitilassa syöpäsolujen, joka tukahdutti negatiivinen ylikuulumisen AKT-ASK1 välillä PI3K /AKT ja ASK1 /p38 signalointireitteihin. Vapautuminen apoptoottisen mahdollisia johtuen hiipumassa negatiivisen ylikuulumisen AKT-ASK1 upon EGFR inaktivaatio voisi olla tärkeä tekijä aiheuttaa solukuoleman, lisäksi proliferaation esto /pro-selviytymisen signalointi. Erityisesti nopea vapautuminen kertynyt apoptoottisten potentiaali voisi olla keskeinen syy, joka johtaa herkkyyden kasvainsolujen tappaminen lääkkeiden vaikutuksia, jotka kohdistuvat addiktoitunut onkogeeni.

Kokeellinen todisteita olemassaolon ROS ja apoptoottisten potentiaalia EGFR-riippuvainen syöpäsolujen

mallia edellä kuvattu on hieman keinotekoista, jotka eivät välttämättä vastaa tarkasti todellista EGFR koukkuun syöpäsoluja. Siksi me myös suorittaa useita kokeita tutkia useita keskeisiä kysymyksiä, jotka liittyvät meidän mallinnus. Kaksi ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinjat HCC827 ja NCI-H460 (H460) valittiin kokeisiin; HCC827 on tyypillinen EGFR koukussa tasyöpäsolulinja, ja H460 ei EGFR riippuvainen, mikä on vertailun. Ensimmäinen koe suunniteltiin tutkimaan ROS tasoilla kaksi NSCLC solulinjoista. Solunsisäinen ROS taso näytetään 2 ’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diasetaatti (DCFH-DA) [56], joka on ROS reagoiva molekyylikoettimena, ja visualisoitiin käyttämällä käännettyä fluoresenssimikroskooppia. Kuten kuviossa 7 on esitetty, on hyvin korkea ROS havaittiin EGFR-riippuvainen HCC827 soluja, kun taas ROS voidaan tuskin havaita H460-soluissa. Tämä havainto heijastaa yhden että HCC827 kärsii suuri ROS stressi, tai toisin sanoen, HCC827 kantaa vahvempi apoptoottisten mahdollisia. Jopa niin HCC827 jatkaa silti voimakasta lisääntymistä kyky, mikä viittaa siihen, että apoptoottinen potentiaali on hyvin tukahdutetaan.

ROS koetin signaaleja sekä DAPI ydinvoiman lokalisointi HCC827 ja H460 esiteltiin yksin tai yhdistää (Merge).

Tämän jälkeen western blot -analyysillä ja virtaussytometria (FCM) määritykset käytettiin tutkimaan, onko aktivointi p38 sekä apoptoosin syöpäsoluissa voidaan laukaista kautta AKT inhibition. Käsittelimme HCC827 ja H460-solujen kanssa 1 uM wortmanniini; wortmanniini on estäjä PI3K /AKT signalointia. Kuten kuviossa 8A on esitetty, wortmanniini hoito HCC827 solut voivat aiheuttaa lähes täydellisen inhibition AKT ja suurten kertyminen p-p38 4 tunnin kuluessa hoidon. Sillä H460-soluissa, wortmanniini hoito voi myös aiheuttaa lähes täydellisen eston AKT, mutta hyvin pieni kertyminen p-p38 muuttamatta solunsisäisen ROS tasolla (kuva S1). Tulokset FCM määritykset (kuvio 8B) osoittavat, että wortmanniini hoito saattaa nostaa apoptoosin hinnat sekä HCC827 ja H460-soluissa. Verrattuna H460, HCC827 solut osoittivat paljon enemmän apoptoosia 10pM wortmanniini hoitoa. Nämä kokeet osoittavat, että inaktivointi selviytymisen efektori p-AKT johtaa vapautuu nopeasti kertynyt apoptoottisten potentiaalia EGFR-addiktoitunut syöpäsoluja, joka voi olla tärkeä syy, joka johtaa herkkyyden syöpäsolujen lääkkeille, jotka kohdistuvat addiktoitunut onkogeeni EGFR .

(A) immunoblottaus osoitti vasta näyttää fosforylaatioon AKT ja p38 in HCC827 ja H460-solut käsiteltiin 1 uM wortmanniini (WM). (B) apoptoosi HCC827 ja H460-solujen kanssa tai ilman 10 uM wortmanniini (WM) hoito 24 tunnin ajan. Apoptoosi hinnat annetaan prosentteina.

Koska olemme osoittaneet, että on olemassa apoptoottisten mahdollisia johtuen ROS stressiä EGFR-addiktoitunut syöpäsoluja, me edelleen olettaa, että rasite ROS stressi voi desensitize syöpä solujen kohdennettuja hoitoon. Tämän hypoteesin testaamiseksi käsittelimme HCC827 solut C-vitamiinia, antioksidantti, joka voidaan käyttää osittain lieventää ROS stressiä. Sitten FCM ja western blot analyysit tehtiin testaamaan apoptoosin altistuminen EGFR estäjä gefitinibi. Kuten kuviossa 9A on esitetty, C-vitamiini voi vähentää apoptoosia HCC827 solujen käsiteltiin gefitinibin verrattuna kontrolliin, jossa ei ole C-vitamiini on käytetty. Kuvio 9B esittää tuloksia Western blot määritykset, jotka osoittavat, että lievittäminen ROS todellakin vähensi p-p38 tasolla HCC827 soluissa käsitelty gefitinibi. Samaan aikaan meidän on myös huomannut, että lievittämisen ROS pienensi p-ERK ja p-AKT tasoja. Mahdollinen selitys voisi olla, että ROS stressi voi edistää proliferaatiota /selviytymistä, lisäksi apoptoosin [57] – [59], joten lieventäminen ROS consequentially johtaa lasku p-ERK ja p-AKT. Myönnämme, että tämä ei saa heijastuminen Mallinamme tuloksia, koska matemaattiset malli huomiotta signaloinnin ROS ERK /AKT, joka ei ole tällä hetkellä tiedossa. Lisäksi MTT-määritystä suoritettiin testaamaan elinkelpoisuuden HCC827 soluja. Tulos osoittaa, että C-vitamiini voi vähentää sytotoksisuuden gefitinibin HCC827 soluissa (kuvio 9C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että herkkyys HCC827 solujen EGFR estäjä gefitinibi on pienentynyt lieventämiseen apoptoottisten mahdollisia.

HCC827 soluja käsiteltiin C-vitamiinia (vc), gefitinibi (GEF) tai niiden yhdistelmä (GEF + vc). (A) Virtaussytometria havaitsemiseksi apoptoosin HCC827 solujen kunkin hoidon 24 tunnin ajan. Apoptoosin hinnat hoitoja annetaan prosentteina. (B) immunoblottaus osoitti vasta näyttää fosforylaatiota ERK, AKT: n ja p38 in HCC827 soluissa hoitaa osoitettu aineilla. 1 uM gefitinibi, 1 uM C-vitamiini tai niiden yhdistelmää käytettiin. (C) Solujen elinkelpoisuus HCC827 solujen altistuminen merkitty tekijöille mitattuna MTT. 1 nM gefitinibi, 10 nM C-vitamiini tai niiden yhdistelmää käytettiin.

Keskustelu

Käsite ”onkogeenin riippuvuus” on nyt hyväksynyt yhä enemmän tutkijoita kautta viime vuosikymmenellä . Kuitenkin taustalla oleva mekanismi onkogeenin riippuvuus on kaukana ymmärretty. Tässä tutkimuksessa kehitimme matemaattinen malli EGFR-liittyvä signalointi verkkoon. Tunnustamme, että vakiintunut verkko malli ei sisällä kaikkia signalointireittejä ja komponentit, jotka säätelevät säilymisen ja apoptoosin syöpäsolujen; luodaan täydellinen verkon malli on epäkäytännöllistä tällä hetkellä. Toisesta näkökulmasta, unohdetaan muut vaihtoehtoiset signalointireitteihin voi antaa onnekas onnenpotku, että vakiintunut malli enemmän sulkeutuu EGFR riippuvaisiksi valtion.

simuloinnitkin validoitu EGFR-liittyvä verkon malli ja kokeelliset validointi paljastaa olemassaolo apoptoottisten potentiaalia. Apoptoottiset potentiaali voitaisiin indusoida eri jännityksiä, tyypillisesti esimerkiksi ROS. Syöpäsolut usein osoittavat kohonneita solunsisäisiä ROS [60], [61]. Monet tekijät voivat vaikuttaa ROS [61]. Aktivointi onkogeeni EGFR voi tuoda ROS sukupolvi kautta peräkkäisen aktivoinnin PI3K, Rae ja NADPH oksidaasin [48]. Lisäksi, hypoksia-reperfuusio kasvaimen mikroympäristössä voi johtaa ROS tuotantoa, mikä puolestaan ​​voi aloittaa viskoosi sykli mitokondriovaurioita ja edelleen ROS [62]. Normaaleissa soluissa, ROS voitaisiin lieventää harjoittaa Glykolyysivaiheen ja alaspäin säätäminen mitokondrioiden toimintaa [63]. Syöpäsolut usein puute ROS vähennys järjestelmän vuoksi geneettisiä muutoksia, jotka vaikeuttavat puhdistumaan ROS [61]. Kertyminen ROS yleensä johtaa apoptoosin kautta juokseva ROS /ASK1 /p38 aktivaation [47], [64]. Kuitenkin, aktivointi pro-apoptoottisten efektori p38 inhiboi negatiivinen ylikuulumisen AKT-ASK1 syöpäsoluissa [52], [65]. Kun lieventämistä negatiivisen ylikuulumisen AKT-ASK1 kautta esimerkiksi inaktivaatio AKT, apoptoottisen potentiaali voidaan vapauttaa, siten indusoimaan apoptoosin [53].

nopea vapautuminen kertynyt apoptoottisten mahdollisten seuraava onkogeeni esto on tärkeä syy, joka johtaa herkkyyden kasvainsolujen tappaminen olevien lääkkeiden vaikutuksista, jotka kohdistuvat riippuvaisiksi onkogeeni, joka on tärkein tunnusmerkki onkogeenin riippuvuuden. Kuitenkin, se ei tarkoita, että koko apoptoottinen lopputulos vastauksena onkogeeni inaktivoituminen on myötävaikuttanut ainoastaan ​​apoptoottisen potentiaalia. On tunnustettu, että EGFR voi tuottaa proapoptoottisten tuloksen kautta aktivoimalla joitakin alavirtavaikuttajainhibiittorit polkuja, jotka on yhdistetty esiapoptoottisille tuloksia. Esimerkiksi EGFR voi sitoutua suoraan niin kutsutun ”kuoleman ligandi” FAS /CD95 [66], joten mikä johtaa apoptoottisten lopputulokseen. Alavirran Ras voi olla pro-apoptoottinen kautta vuorovaikutuksessa vaikuttajakohdesolujen Nore1 [67].

Havainnot tässä tutkimuksessa saattaa olla myös kliinistä merkitystä kohdennettuja syöpähoitojen sekä syövän lääkekehityksessä. Esimerkiksi käyttää pelkästään ERK tai AKT-estäjällä ei saa tuoda hyvä terapeuttinen vaikutus jopa potilailla, joilla EGFR-addiktoitunut syöpiä. Faber et al. [68] ovat osoittaneet, että PI3K /AKT esto ei edistänyt merkittävää apoptoosin EGFR koukkuun syöpiä. Kuitenkin saarto sekä PI3K /AKT ja Ras /MEK samanaikaisesti johtanut apoptoosia samalla tasolla kuin EGFR: n estäjien. Lisäksi, käyttämällä aineita, jotka hyödyttävät kasvu apoptoottisten mahdollisten voi edelleen lisätä herkkyyttä kasvainsolujen kohdennettuja lääkkeitä. Esimerkiksi on raportoitu, että ROS tuottavalle aineilla on selektiivinen tappaminen vaikutuksia kohdennettuja terapiassa kestävä syöpiä [69], [70]. Sitä vastoin aineita, jotka voivat auttaa lieventämään apoptoottista mahdollisuuksia voitaisiin vähentää herkkyyttä kasvaimen solujen EGFR: n estäjien [59], joita olisi vältettävä käyttää kliinisesti. Lopuksi, tämä tutkimus viittaa myös siihen, että hyvä syövän vastainen tavoite pitäisi olla merkki, joka sen toiminnallinen estäminen olisi hyötyä vapauttamaan kertynyt apoptoosin potentiaalia syöpäsolujen lisäksi saarron selviytymisen.

Yhteenvetona meidän systeemibiologian mallinnus paljastaa, että on olemassa voimakkaampi apoptoottinen potentiaalia nykyisiä että EGFR-riippuvainen syöpiä, joka on suurelta osin tukahdutti negatiivinen välinen ylikuuluminen PI3K /AKT ja ASK1 /p38 signalointireitteihin. Esto eloonjääntisignaaleja ja samanaikainen vapautuminen kertynyt apoptoottisten mahdollisia yhdessä edistää kasvainsolun kuoleman jälkeen eston koukkuun onkogeenin EGFR koukkuun syövissä. Kaiken kaikkiaan tämä on ensimmäinen yritys ymmärtää ”onkogeenin riippuvuus” alkaen systeemibiologian näkökulmasta. Edelleen oivalluksia mekanismeista onkogeenin riippuvuus alkaen systeemibiologian kannalta edelleen voimakkaasti tarpeen. Mikä tahansa alan kehityksestä hyödyttäviä tuloksia kohdennettuja syöpähoidon sekä syövän lääkekehityksessä.

Materiaalit ja menetelmät

Model Development

Verkko kehitettiin tuella Matlab (MathWorks, MA, USA, https://www.mathworks.com). Tiedot kaikista signalointireittien ja verkon topologia kerättiin eri julkaistuja teoksia. Molekyylivuorovaikutusten mallissa kuvattiin yhteen kytkettyjä ODES, jotka olivat peräisin perustuva lakien Mass Action.