Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Äskettäin uusi variantti ER-α, ER-α36 tunnistettiin ja kloonattiin. ER-α36 puuttuu luontainen transkription aktiivisuutta ja pääasiallisesti välittää nongenomisia estrogeeni signalointi. Täällä tutkimme rooli nongenomisia estrogeenin signalointipolkujen välittämiä ER-α36 in tamoksifeenia vastuksen ja agonistivaikutus.

Menetelmät

Matkapuhelinverkko lokalisaatio ER-α36 tutkittiin immunofluoresenssilla MCF- 7-soluissa ja Hec1A soluja. MCF-7-rintasyöpäsolujen MCF-7-solut, jotka ilmentävät rekombinantti-ER-α36 (MCF-7 /ER36), Hec1A kohdun limakalvon syövän solujen ja Hec1A solujen siRNA pudotus ER-α36 (Hec1A /RNAiER36) käsiteltiin 17β-estradial ( E2) ja tamoksifeeni (TAM) puuttuessa ja läsnä estäjät U0126 ja LY294002. Tutkimme fosforylaatio signalointimolekyylien ja ilmaisu c-Myc immunoblottauksella, ja kasvainsolujen kasvua MTT: llä.

Päätelmät

ER muunnos ER-α36 parantaa TAM agonistiaktiivisuus aktivoimalla kalvo-aloitettiin signaalireaktioteissä kohdun limakalvon syöpä, ja että ER-α36 osallistuu

de novo

ja hankittu TAM resistenssin rintasyöpä.

Citation: Lin SL, Yan LY, Zhang XT, yuan J, Li M, Qiao J, et al. (2010) ER-α36, muunnelma ER-α, Edistää tamoksifeenin Agonist Toiminta Endometrial Syöpäsolut kautta MAPK /ERK ja PI3K /Akt Pathways. PLoS ONE 5 (2): e9013. doi: 10,1371 /journal.pone.0009013

Editor: Syed A. Aziz, Health Canada, Kanada

vastaanotettu 11 joulukuuta 2009; Hyväksytty: 13 tammikuu 2010; Julkaistu: 2. helmikuuta 2010

Copyright: © 2010 Lin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Basic Research Program of China (2006CB504004, 2006CB944005). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Tamoksifeeni on selektiivinen estrogeenireseptorin modulaattori (SERM) kanssa seka-agonisti /antagonisti toimintaa, jota on käytetty laajalti tehokas hoito kaikissa estrogeenireseptorin (ER) -positiivinen rintasyöpä [1]. Tamoksifeeni estää rintasyövän uusiutumista ja vähentää esiintyvyys kontralateraalisen rintasyövän 49% [2]. Tamoxifen on myös käytetty chemopreventive agentti naisilla, joilla on korkea riski sairastua rintasyöpään [3]. Uskotaan, että tamoksifeeni toimii antagonistina kilpailemalla estrogeenin ligandia sitovan domeenin ER, estäen siten ER-välitteisen mitogeeninen estrogeenin signalointi [4]. Kuitenkin suuri este tamoksifeeni käyttö on tamoksifeenin vastus, mikä tapahtuu

de novo

tai voidaan hankkia sen käytön jälkeen [5]. Lisäksi tamoksifeeni käyttö lisää kohdun limakalvon syövän postmenopausaalisille naisille pitkäaikaiseen hoitoon [6]. Molekyylimekanismeja taustalla sekä

de novo

ja hankitun tamoksifeenin vastus ja sen agonistin toimintaa kohdun kudoksessa huonosti.

ER kuuluu steroidi hormoni perheen tumareseptorisuperperheen. Se on vallitsevasti katsotaan, että ER toimii transkriptiotekijänä, joka on pääasiassa lokalisoitu solun tumassa [7]. Kuitenkin saatu todisteita on osoittanut, että ER myös olemassa solukalvon ja osallistuu nopean estrogeenin signalointi. On raportoitu, että ER on modifioitu translaation jälkeinen palmitoylation ligandin sitovan domeenin, joka voi vaikuttaa sen membraanilokalisaatiota [8]. Association of ER ja caveolin-1 oli myös osoitettu helpottavan ER lokalisointi solukalvon [9]. Caveolin-1 on rakenteellinen proteiini kaveoleja ja toimii tukirakenteena proteiinin rekrytoida molekyylejä, kuten kasvutekijän reseptorit, G-proteiinit, Src-perheen tyrosiini- kinaasien ja PI3K [10]. Oletettiin, että estrogeeni voi nopeasti aktivoida erilaisia ​​signalointireittejä, kuten MAPK /ERK, fosfolipaasi C, PI3K /Akt ja G-proteiiniin kytketty reseptori-aktivoituvien reittien on kaveoleja [11].

Viime aikoina olemme tunnistettu ja kloonattu uusi variantti ER-α, jonka molekyylipaino on 36 kDa, joka oli nimetty ER-α36 [12]. Alkuperäinen 66 kDa ER-α nimettiin ER-α66 [13]. ER-α36 transkripti aloitetaan promoottorista sijaitsee ensimmäisen intronin ER-α66 geeni ja tuotetaan kaksi vaihtoehtoista silmukoitumistapahtumista. ER-α36 proteiini puuttuu näin ollen ligandista riippuvaa ja riippumattaman transaktivaatiodomeenin (AF-1 ja AF-2), mutta se säilyttää DNA- sitova domeeni ja osittainen dimerisaatiodomeeni ja ligandin sitovia domeeneja [12]. ER-α36 hallussaan ainutlaatuinen 27 aminohapon domeeni C-terminaalista, joka korvaa viime 138 aminohappoa, joita koodaavat eksonit 7 ja 8 ER-α66 geenin. Meidän edellinen raportti osoitti, että 17β-estradioli ja SERM kuten tamoksifeeni saattavat aiheuttaa aktivoitumisen MAPK /ERK-reitin ja stimuloida solujen lisääntymistä kautta kalvoon liittyvä ER-α36 [14]. Meillä on siis oletettu, että ER-α36 voi liittyä agonistivaikutus tamoksifeenin. Esillä olevassa raportissa tutkittiin ER-α36 toiminto ER-positiivisessa MCF-7 rintasyöpäsolujen ja Hec1A kohdun limakalvon syöpä soluja, ja tutki panos MAPK /ERK ja PI3K /Akt teille, joita välittävät ER-α36 agonistin toiminta tamoksifeenin on kohdun limakalvon syöpä.

tulokset

ER-α36 ilmentyy solukalvon MCF-7 ja Hec1A Cells

ER-α36 on uusi muunnelma ER-α66 syntyy promoottorin vaihtoehtoisesta käytöstä vaihtoehtoisen silmukoinnin [12]. Tutkia ER-α36 ekspressiota MCF-7-soluissa ja Hec1A soluja, Western blot-analyysi suoritettiin käyttäen ER-a36 spesifistä vasta-ainetta vastaan, on ainutlaatuinen 20 aminohapon C-terminaalinen ER-α36. ER-α36 ilmentyy molemmissa solulinjoissa (Fig. 1A, vasen). Kuitenkin Western blot -analyysi ei havaita ER-α66 ilmentymisen Hec1A soluissa (Fig. 1A, oikealla), joka on yhdenmukainen Hec1A on ER-negatiivinen syövän solulinja [15]. Tutkia solun lokalisaatio ER-α36, immunofluoresenssi- määritys suoritettiin. Molemmissa solulinjoissa, immunofluoresenssivärjäyksen paljasti voimakkaan solukalvon jakelu kuvio (Fig. 1 B). Kaveoleja ovat riippuvaiseksi mikrorakenteita solukalvon jossa caveolin-1 toimii tukirakenteena proteiinin muodostamiseksi signaloinnin monimutkainen. Kuten on esitetty kuviossa. 1C, caveolin-1 ilmentyvät ensisijaisesti solun pinnalla (punainen). Sulautunut kuvia ER-α36 ja caveolin-1 osoitti merkittävää co-localization signaalit (keltainen) on solukalvon.

A: n ilmentyminen ER-α36 ja ER-α66 proteiinin MCF-7 ja Hec1A solujen . Proteiini uutteet valmistettiin MCF-7 ja Hec1A soluja ja käytettiin Western blot -analyysiä. B, paikallistaminen ER-α36 MCF-7 ja Hec1A soluja. Soluja viljeltiin coverslip kiinnitettiin ja immunofluorescently värjätään erityinen anti-ER-α36 vasta-aine (vihreä). Solut vastavärjättiin Hoechst 33258 (sininen). C, The kolokalisaation ER-α36 ja caveolin-1 solukalvon Hec1A soluja. Vihreä: ER-α36; Red: caveolin-1; sininen: ydinaseiden; keltainen, co-lokalisointi signaaleja. Bar, 10 mikrometriä. D, Time-kurssi analyysi ER-α36 ilmentymistä Hec1A soluissa. Hec1A-soluja käsiteltiin 2 uM Tam ilmoitettuina ajankohtina. Tasot proteiinin ilmentyminen oli normalisoitunut β-aktiinin ilmentymistä tasolla, ja kukin pylväs edustaa keskiarvon ± SEM (n = 3). *, P 0,05 käsittelemättömiin soluihin verrattuna.

Seuraavaksi analysoitiin ligandin indusoiman ER-α36 ilmentymistä. Hec1A solulinjoja käsiteltiin tamoksifeenia eri ajankohtina ja ER-α36 ekspressio arvioitiin Western blotting -analyysi, paljastaa, että ER-α36 ekspressio lisääntyi tamoksifeeni käsitellyissä soluissa (Fig. 1 D).

ER-α36 välittää estrogeeni ja Tamoxifen- stimuloidun ERK Activation

koetin taustalla oleva mekanismi agonisti vaikutus tamoksifeenin endometriumin syöpäsoluissa, päätimme tutkia toimintaa ER-A36 in tamoksifeenia käsitellään Hec1A soluja. Ensin tarkasteltiin fosforylaation tasoja MAPK /ERK, seriini-treoniinikinaasi osallisena solujen lisääntymisen [16]. Kuten on esitetty kuviossa. 2A ja Fig. 2B, E2 tai tamoksifeenin hoidot johtaa nopeaan fosforylaatioon ERK1 /2. Reprobing kalvon yhteensä ERK1 /2-vasta osoitti, että koko ERK1 /2 pitoisuus ei muuttunut, mikä viittaa siihen, että lisääntynyt ERK1 /2 fosforylaatio ei aiheuttama lisääntynyt ERK1 /2: n ilmentymisen.

A ja B, Hec1A soluja käsiteltiin 10 nM E2 tai 2 uM Tam varten ilmoitettuina ajankohtina. Tasot ERK1 /2 fosforylaatio mitattiin uutteissa kanssa Western blot-analyysi. Yhteensä ERK1 /2 käytettiin latauskontrollina. Kukin pylväs edustaa keskiarvon ± SEM (n = 3). *, P 0,05 käsittelemättömiin soluihin verrattuna. C ja D, ER-α36 ilmentymisen Hec1A /V ja Hec1A /RNAi soluja. Kukin pylväs edustaa keskiarvon ± SEM (n = 3). *, P 0,05 verrattuna Hec1A /V soluja. E, Hec1A /V ja Hec1A /RNAi-soluja käsiteltiin 10 nM E2 tai 2 uM Tam analysoitiin tasojen ERK1 /2-fosforylaation kanssa Western blot. Yhteensä ERK1 /2 käytettiin latauskontrollina, ja kukin pylväs edustaa keskiarvon ± SEM (n = 3). *, P 0,05 käsittelemättömiin soluihin verrattuna (-) vs. hoitoja. F, Lysaatit Hec1A soluja käsiteltiin DMSO: ssa (kaistat 1, 2 ja 3), 10 nM E2 (kaistat 2 ja 5), ​​2 uM Tam (kaistat 3 ja 6) tai esikäsiteltiin 10 uM U0126 (kaistat 4, 5 ja 6 ) 30 minuuttia analysoitiin Western blot-analyysi.

Voit testata osallistumisen ER-α36 että aktiviteetti E2 ja tamoksifeenin havaittiin Hec1A soluissa, joilta puuttuu ER-α66 ilme, päätimme lyödä down ER-α36 ilmaisun kanssa siRNA lähestymistapaa. Olemme luoneet vakaat solulinjat, jotka ilmentävät shRNA ekspressiovektori vastaan ​​ER-α36 (Hec1A /RNAi-solut) ja tutkittiin ER-α36 ilmentymisen (Fig. 2C ja 2D). Kuten on esitetty kuviossa. 2E, E2 ja tamoksifeenin jättänyt stimuloida fosforylaation ERK1 /2 Hec1A solujen ER-A36 tippuu alas, mikä viittaa siihen, että ER-A36 on reseptorin, joka välittää toimintaa estrogeenin ja tamoksifeenin.

Solunulkoisilla säännelty kinaasia kinaasi (MEK) toimii ylävirtaan ERK1 /2 ja saattaa fosforyloivat ja aktivoi ERK1 /2 [17]. MEK erityinen estäjä U0126 esti tehokkaasti ERK1 /2 aktivointi kannustanut E2 ja tamoksifeeni (Fig. 2F).

Meillä on myös vakaa solulinjoja ER-positiivisia MCF-7 rintasyöpäsolujen ja joka ilmentää yhdistelmä-ER -α36 (MCF-7 /ER36 solut) (Fig. 3A). Ohjauksessa MCF-7-solut transfektoitiin tyhjällä vektorilla, E2 indusoi fosforylaation ERK1 /2 (Fig. 3B), jotka voitaisiin poistaa tamoksifeenihoidon (Fig. 3C). Kuitenkin tamoksifeeni indusoi fosforylaation ERK1 /2 MCF-7 /ER36 soluja (Fig. 3d). MEK erityisiä estäjä U0126 esti tehokkaasti ERK1 /2 aktivointi kannustanut E2 ja tamoksifeeni (Fig. 3E). Näin ollen, nämä tulokset osoittivat, että ER-α36 välittää Ras /MEK /ERK-reitin indusoi sekä estrogeeni- ja tamoksifeeni ja ehdotti, että ER-A36 voi olla osallisena tamoksifeeni kestävyys ja jopa edistää agonistivaikutus tamoksifeenin.

Western blot-analyysi ER-α36 ekspressiota MCF-7 /V ja MCF-7 /ER36 soluja. Ekspressiotasot normalisoitiin tasot β-aktiini, ja kukin pylväs edustaa keskiarvon ± SEM (n = 3). *, P 0,05 verrattuna MCF-7 /V-soluissa. B ja C, MCF-7 /V-solut käsiteltiin 10 nM E2 yksin tai 2 uM Tam toisiaan, ilmoitettuina ajankohtina. Proteiini uutteet analysoitiin Western blot-analyysi. Yhteensä ERK1 /2 käytettiin latauskontrollina. Kukin pylväs edustaa keskiarvon ± SEM (n = 3). *, P 0,05 verrattuna kontrollisoluihin. D, MCF-7 /ER36 soluja käsiteltiin 2 uM Tam eri ajankohtina analysoitiin ERK1 /2-fosforylaation kanssa Western blot. Ekspressiotasot normalisoitiin tasoilla koko ERK1 /2, ja kukin pylväs edustaa keskiarvon ± SEM (n = 3). *, P 0,05 verrattuna käsittelemättömien solujen. E, Lysaatit valmistettiin MCF-7 /ER36 soluja käsiteltiin DMSO: ssa (kaistat 1, 2 ja 3), 10 nM E2 (kaistat 2 ja 5), ​​2 uM Tam (kaistat 3 ja 6) tai esikäsiteltiin 10 uM U0126 (kaistat 4, 5 ja 6) 30 minuutin ajan ja immunoblotattu vasta-aineiden pERK1 /2 tai koko ERK1 /2.

ER-α36 välittää estrogeeni ja tamoksifeenin stimuloidun PI3K /Akt aktivointi

on hyvin tunnettua, että seriini /treoniini-kinaasi Akt tai proteiinikinaasi B, on tärkeä rooli solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen estämällä apoptoosin [18]. Testasimme jos E2 ja tamoksifeenihoidon myös indusoi aktivoitumisen Akt väylän Hec1A soluissa. Treatment of E2 ja tamoksifeenin johti nopeaan fosforylaatioon Akt (Fig. 4A ja 4B), kun taas sekä E2: n ja tamoksifeenin ei onnistunut indusoimaan Akt-fosforylaation Hec1A /RNAi-solut (Fig. 4C). Tamoxifen indusoi myös Akt fosfory- MCF-7-soluissa, jotka suuresti nimenomaista yhdistelmä-ER-α36 (Fig. 4E). Esikäsittely PI3K-inhibiittori LY294002 kumosi Akt-fosforylaation kannustanut E2 tai tamoksifeeni sekä solulinjoissa (Fig. 4D ja 4F), mikä osoittaa, että ER-α36 välittää tamoksifeeni indusoi Akt-fosforylaation kautta PI3K reitin näissä soluissa. Näin ollen meidän tiedot osoittivat, että ER-α36-välitteisen activaton että PI3K /Akt-reitti voi myös olla mukana kestävyys ja agonistivaikutus tamoksifeenin.

Hec1A soluja käsiteltiin 10 nM E2 (A) tai 2 uM Tam (B) osoitetaan ajankohtina ja lysaatit immunoblotattiin vastaisen vasta-aineen fosforyloidun Akt. Tasot fosforylaation normalisoitiin kokonaismäärään Akt-proteiinia, ja kukin pylväs edustaa keskiarvon ± SEM (n = 3). *, P 0,05 käsittelemättömiin soluihin verrattuna. C, Western blot-analyysi Akt-fosforylaation Hec1A /V ja Hec1A /RNAi ER36 soluja käsiteltiin 10 nM E2 tai 2 uM Tam 10 min. Tasot fosforylaation normalisoitiin kokonaismäärään Akt-proteiinia, ja kukin pylväs edustaa keskiarvon ± SEM (n = 3). *, P 0,05 käsittelemättömiin soluihin verrattuna. # P 0,05 verrattuna E2- tai Tam saaneista Hec1A /V soluja. D, Hec1A soluja esikäsiteltiin 50 uM PI3K-inhibiittori LY294002 (LY, kaistat 4, 5 ja 6), 2 tuntia ja käsiteltiin sitten 10 nM E2 (kaistat 2 ja 5) tai 2 uM Tam (kaistat 3 ja 6) 10 min . E, Western blot-analyysi Akt-fosforylaation MCF-7 /ER36 soluja käsiteltiin 2 uM Tam varten ilmoitettuina ajankohtina. Expression normalisoitiin yhteensä Akt, ja kukin pylväs edustaa keskiarvon ± SEM (n = 3). *, P 0,05 verrattuna käsittelemättömien solujen. F, Lysaatit valmistettiin MCF-7 /ER36 soluja käsiteltiin DMSO (kaistat 1 ja 2), 2 uM Tam (kaistat 2 ja 4) tai esikäsiteltiin 50 uM PI3K-inhibiittori LY294002 (LY, kaistat 3 ja 4) 2 h, ja immunoblotattu vasta-aineita fosforyloidun Akt tai koko Akt.

ER-α36 osallistuu asetukseen c-Myc Protein Expression in Hec1A Solut

onkogeeni c-Myc on syvällinen mitogeenisiä vaikutuksia syöpäsolujen kautta sen kyky aiheuttaa solusyklin etenemisen [19]. Antisense-oligonukleotidit c-Myc voivat estää rintasyöpäsolujen lisääntymistä [20]. Tamoksifeeni estää estrogeenin aiheuttama c-Myc ilmentymistä ER-α66 rintasyöpä soluja. Kuitenkin, c-Myc: llä on tärkeä rooli tamoksifeeni agonistivaikutus [21]. Mittasimme ekspressiotasot c-Myc in Hec1A käsitellyissä soluissa E2 tai tamoksifeenin. Kuten on esitetty kuviossa. 5A, käsittelemällä E2 tai tamoksifeeni indusoi c-Myc ilmentymisen Hec1A /V-soluissa, mutta ei Hec1A /RNAi ER-α36 soluja, jotka voidaan tehokkaasti kumottu MEK estäjä U0126 (Fig. 5B) ja PI3K-inhibiittori LY294002 (Fig. 5C).

A, Western blot-analyysi c-Myc ilmentymisen Hec1A /V ja Hec1A /RNAi-soluja käsiteltiin 10 nM E2 tai 2 uM Tam 12 tuntia. Ekspressiotasot normalisoitiin tasot β-aktiini, ja kukin pylväs edustaa keskiarvon ± SEM (n = 3). *, P 0,05 käsittelemättömiin soluihin verrattuna (-) vs. hoitoja. # P 0,05 verrattuna Tam saaneista Hec1A /V soluja. B ja C, Hec1A soluja käsiteltiin 12 tuntia 10 nM E2 tai 2 uM Tam tai yhdessä 10 uM MEK inhibiittorin U0126 tai 50 uM PI3K-inhibiittori LY294002. Tasot c-Myc ilmentymisen normalisoitiin tasot β-aktiini, ja kukin pylväs edustaa keskiarvon ± SEM (n = 3). *, P 0,05 käsittelemättömiin soluihin verrattuna (-) vs. hoitoja. # P 0,05 verrattuna E2- ja Tam-käsitelty Hec1A /V soluja.

ER-α36 välittää tamoksifeenin stimuloimaa soluproliferaatiota Hec1A Solut

n roolin edelleen tutkimiseksi ER-α36 in tamoksifeeni agonistivaikutus kohdun limakalvon syövän soluissa, Hec1A /V ja Hec1A /RNAi-soluja käsiteltiin tamoksifeeni ja niiden prolifaration mitattiin MTT-määrityksellä. MTT-analyysi osoitti, että tamoksifeenin stimuloi kasvua Hec1A /V soluja. Kuitenkin, tamoksifeenin kykeni inhiboimaan kasvua Hec1A /RNAi-solujen annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 6A). Soluproliferaatioon aiheuttama tamoksifeeni estyi MEK-estäjä U0126 ja PI3K-inhibiittori LY294002 (Fig. 6B), mikä viittaa siihen, että sekä MAPK /ERK ja PI3K /Akt reittejä olivat mukana E2 ja tamoksifeeni stimuloi solujen kasvua kohdun limakalvon syövän soluissa.

A, Hec1A solut transfektoitiin tyhjällä ekspressiovektorilla (Hec1A /V) tai Hec1A solulinjoja, joissa ERα36 oli stabiilisti tippuu alas shRNA lauseke (Hec1A /RNAi) maljattiin 96-kuoppaisille levyille (3 x 10

3 solua /kuoppa). Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla Tam väliaineessa, joka sisälsi 2,5% dekstraani hiilellä erotettua FBS: ää 72 tuntia. MTT-analyysi suoritettiin, kuten on kuvattu

materiaaleja ja menetelmiä

. Tulokset kolmen erillisen kokeen laskettiin keskiarvo ja keskiarvo ± SEM on esitetty. *, P 0,05 verrattuna Tam saaneista Hec1A /V-soluissa. B, Hec1A soluja käsiteltiin 10 nM E2 tai 2 uM Tam yhdessä 10 uM MEK: n estäjä U0126 tai 50 uM PI3K-inhibiittori LY294002 vastaavasti 72 tuntia, ja analysoitiin MTT-määrityksellä. Tulokset kolmen erillisen kokeen laskettiin keskiarvo ja keskiarvo ± SEM on esitetty. *, P 0,05 verrattuna kontrollisoluihin. C, Tyhjä ekspressiovektori transfektoitiin MCF-7-soluissa (MCF-7 /V) tai MCF-7-soluissa, jotka on transfektoitu ERα36 ekspressiovektorilla (MCF-7 /ER36 solua) maljattiin 96-kuoppalevyille (5 x 10

3 solua /kuoppa). Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla tamoksifeenin elatusaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää 72 tuntia. MTT-analyysi suoritettiin. Tulokset kolmen erillisen kokeen laskettiin keskiarvo ja keskiarvo ± SEM on esitetty. *, P 0,05 verrattuna Tam-käsitellyn MCF-7 /ER36 soluissa. D, MCF-7 /V ja MCF-7 /ER36-soluja käsiteltiin 2 uM Tam yhdessä 10 uM U0126 tai 50 uM PI3K-inhibiittori LY294002 vastaavasti 72 tuntia ja analysoitiin MTT-määrityksellä. Tulokset kolmen erillisen kokeen laskettiin keskiarvo ja keskiarvo ± SEM on esitetty. *, P 0,05 verrattuna kontrolliin MCF-7 /V-soluissa.

Havaitsimme, että tamoksifeenin esti voimakkaasti soluproliferaation MCF-7 /V-soluissa, yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien että tamoksifeeni toimii voimakas antagonisti ER-positiivisessa rintasyövässä MCF-7-solujen [22]. Kuitenkin, MCF-7 /ER36 soluja, jotka konstitutiivisesti ilmentävät korkeita rekombinantti ER-α36 esillä ali tamoksifeenihoidon (Fig. 6C). MEK-estäjää U0126 ja PI3K estäjä LY294002 lisäksi esti kasvun molemmissa solulinjoissa (Fig. 6D). Nämä tulokset jälleen osoittavat, että korkean tason ER-α36 ilmentyminen voi resistenssiä tamoksifeenin.

Keskustelu

Tamoksifeeni on SERM, joka on laajalti käytetään pitkälle edenneen ER-positiivista rintasyöpää ja estää rintasyövän korkean riskin ennen ja jälkeen vaihdevuodet ohittaneilla naisilla kuin chemopreventive agentti [23], [24]. Kuitenkin tamoksifeenin on myös osittainen estrogeenista aktiivisuutta kohdussa, joka voi johtaa kohdun limakalvon liikakasvun [25]. Pitkäaikainen tamoksifeenia käyttö liittyy lisääntynyt kohdun limakalvon syövän [26]. Tässä me raportoitu, että uusi variantti ER-α, ER-α36, joka ilmentyy voimakkaasti solukalvon Hec1A kohdun limakalvon syövän solujen ja kohdun limakalvon syöpä näytteitä potilaista, joita oli hoidettu tamoksifeenilla vähintään kolme vuotta. Sekä E2 ja tamoksifeeni indusoi soluproliferaatiota Hec1A solujen oletettavasti kautta ER-α36 välittämä ei-genomista signalointireitteihin.

Useat hypoteeseja on oletettu selittämään tamoksifeenin n agonistin toimintaa kohdun limakalvon syövän synnyn. On ehdotettu, että reaktiivinen aineenvaihduntatuotteiden tamoksifeenia muotoa DNA-addukteja ja tuottavat mutaatioita kohdun kudoksessa [27]. On myös osoitettu, että AF1 domain ER-α66 sekä solu- ja promoottori-erityisiä koaktivaattorikompleksien rekrytointia osallistuvat tamoksifeenin agonistivaikutus [28], [29]. Rooli tamoksifeenin endometriumin syövän synnyn voi käyttää erillistä genomista toimintaa [30]. Äskettäin, varaamiseen näyttö viittasi siihen, kalvo-aloittanut signalointireitteihin antaa tamoksifeeni kestävyys ja agonistivaikutus erilaisten kinaasireaktiosarjojen ja erillinen toisiolähetit [15].

MAPK Perheeseen kuuluu ERK, JNK ja P38. ERK on keskeinen rooli solujen kasvun ja lisääntymisen. JNK ja P38 ovat mukana solujen erilaistumista ja apoptoosia aiheuttama stressi ärsykkeiden kuten UV-valo [31], γ säteilyn [32], [33], DNA-vahingollista ja chemopreventive lääkkeet [34]. Monet onkogeeniset signalointimolekyylien aktivoida MAPK /ERK-reitin [35]. ERK ilme on yleensä lisääntynyt, ja sen toiminta on säädelty rintasyövässä kudoksissa verrattuna naapurimaihin normaaleissa kudoksissa [36]. Lisäksi tamoksifeeni vastus

in vivo

välittyy pääasiassa ei-genomista mekanismeja. Genominen estrogeeni toiminta näyttää vähemmän aktiivinen [37], [38]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että ER-α36 välittää sekä E2- ja tamoksifeeni-indusoidun aktivoitumisen MAPK /ERK-reitin ja ER-α36 yliekspressio tamoksifeeni herkkä MCF-7-soluissa vähentää herkkyyttä tamoksifeenin. Lisäksi ER-α36 välittää tamoksifeenia aiheuttama aktivoituminen MAPK /ERK-reitin ja alentaa lisäksi agonistivaikutus tamoksifeenin vuonna Hec1A endometriumin syöpäsoluja. Kohdun limakalvon syöpä kudokset erittäin express ER-α36 näytetään myös korkeita tasoja ERK-fosforylaation.

PI3K /Akt-reitin tärkeä rooli solujen kasvua ja selviytymistä [39]. Akt aktivoituu monien signalointireittejä, kuten yliekspressio kasvutekijän reseptorit, [40]. Johdanto konstitutiivisesti aktiivisen Akt osaksi MCF-7-solut voisivat aiheuttaa tamoksifeenin vastus suojaamalla soluja tamoksifeenin aiheuttama apoptoosin [41]. Lisäksi Akt-aktiivisuutta on dramaticaly lisääntynyt tamoxifen- resistenttien MCF7-soluja [18]. In fosforyloitua Akt-positiiviset potilaat, hormonaalisen hoidon on huonompi teho kuin fosforyloidun Akt-negatiivisten potilaiden [42]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, ER-α36 välitteisen tamoksifeeni-stimuloitu aktivointi Akt soluissa, joilla on korkea ER-α36 ilmaisu viittaa siihen, että aktivointi PI3K /Akt-reitin välittämä ER-α36 edistää vastus ja agonistivaikutus tamoksifeenin .

c-Myc-proteiinin on tumatranskriptiotekijä että olennainen rooli solujen kasvuun [43]. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että MAPK /ERK ja PI3K /Akt reitit säädellä c-Myc-proteiinin ilmentymistä [44], [45], [46]. Löydettiin sekä E2: n ja tamoksifeenin indusoi c-Myc-ilmentymisen ER-α36 aktivaatio ERK ja Akt. Inkubointi Hec1A solujen MEK estäjän U0126 ja PI3K estäjä LY294002 tukossa E2- ja tamoxifen- aiheuttama c-Myc ilme. Siksi tamoksifeenin kiinnostavuus agonistivaikutus läpi ER-α36 välittämä ei-genomista reitin.

Yhteenvetona me raportoimme tässä, että ER-α36 ilmentyy solukalvon ja sytoplasmassa kohtukarsinooma soluja. Olemme lisäksi osoittaneet, että sekä E2: n ja tamoksifeeni edisti proliferaatiota kohdun limakalvon syövän soluihin ER-α36-välitteisen MAPK /ERK ja PI3K /Akt reittejä ja ER-α36 yliekspressio johti tamoksifeenin resistanssi MCF-7-soluissa. Tuloksemme antavat tärkeää uusia tietoja edelleen ymmärtää molekyylitason mekanismeja taustalla agonistivaikutus tamoksifeenin.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit ja reagenssit

Kaikki kemikaalit ja reagenssit hankittiin Sigma ellei toisin ole mainittu. Polyklonaalisia anti-ERK1 /2-vasta polyklonaalinen anti-fosfo-ERK1 /2-vasta-aine (Thr

202 /Tyr

204), polyklonaalinen anti-caveolin-1 -TRITC vasta-monoklonaalinen anti-c-Myc-vasta polyklonaaliset anti-Akt-vasta-aine, monoklonaalinen anti-ER-α66 (D-12) vasta-aine ja monoklonaalinen anti-β-aktiini-vasta-aine hankittiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Polyklonaalisia anti-fosfo-Akt (Ser

473) vasta-aine saatiin Signalway Antibody (Pearland, TX). ER-α36 spesifistä vasta-ainetta vastaan ​​20 ainutlaatuisen aminohapon C-terminaalinen ER-α36, ER-α36 ekspressioplasmidin, ER-α36 shRNA ekspressiovektoriin ja tyhjän ekspressiovektori oli edellä on kuvattu [12], [14]. U0126 hankittiin Calbiochem (La Jolla, CA).

Cell Culture and Cell Lines

MCF-7 ihmisen rintasyöpä-solut saatiin ATCC: stä (Manassas, VA), ja ihmisen Hec1A kohdun syöpäsolut saatiin tri Li-Hui Wei (Peking yliopiston kansan sairaalassa, Beijing). Molemmat solulinjat pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 sopivassa kasvualustassa. Perustaa MCF-7-solut, jotka ilmentävät rekombinantti-ER-α36, solut maljattiin tiheyteen 1 x 10

5 solua per 60 mm malja ja transfektoitiin 24 tunnin kuluttua ekspressiovektorilla ohjaa cytomagalovirus (CMV) promoottorin nisäkäsilmentämisvektoriin pCB6 + kuten muualla on kuvattu [14], käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ekspressiovektori sisältää täyspitkän ER-α36 cDNA. Tyhjän ekspressiovektori myös transfektoida soluihin toimimaan kontrollina. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen solut uudelleen päällystetty ja valitaan 500 ug /ml G418: aa kaksi viikkoa. Väliaine vaihdettiin joka kolmas päivä, kunnes pesäkkeitä ilmaantui. Kloonit laajennettiin lisäanalyysiä. Kloonit, joilla on korkea ER-α36 ilme oli sekoitus yli kaksikymmentä klooneja ja kutsutaan MCF-7 /ER-α36. Solulinja, jossa yhdistettiin klooneista transfektoitiin tyhjällä ekspressiovektorilla nimettiin MCF-7 /V ja käytettiin kontrollina.

myös perustettu solulinjoja Hec1A transfektoitujen solujen ER-α36 shRNA ekspressiovektoriin (Hec1A /RNAi) ja tyhjä ekspressiovektori (Hec1A /V). Lyhyesti, ER-α36 shRNA ekspressiovektori pRNAT-U6.1 /Neo-plasmidin, joka sisältää shRNA vastaan ​​ER-a36 (GenScript Corp. TX) ja tyhjä ekspressiovektori transfektoitiin Hec1A solut Lipofectamine 2000 mukaisesti valmistajan ohjeiden. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen solut uudelleen päällystetty ja valita G418: aa (600 ug /ml) kahden viikon ajan. Kloonit laajennettiin lisäanalyysiä.

Immunofluoresenssi- ja konfokaalimikroskopialla

sijainti solun proteiinin määritettiin epäsuoralla immunofluoresenssilla. Hec1A tai MCF-7-soluja viljeltiin steriilissä lasipeitinlevyjä kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä 10 minuutin ajan. Sen jälkeen, kun oli kyllästetty 0,4% Triton X-100 huoneenlämpötilassa 10 minuutin ajan, solut blokattiin 4% BSA-täydennetty PBS: ssä 1 tunnin ajan ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa anti-ER-α36-spesifistä vasta-ainetta. Kolmen pesun jälkeen PBS: llä, solut leimattiin FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta. DNA väriaine Hoechst 33258 käytettiin tumavärjäystä.

kaksinkertainen värjäys ER-α36 ja caveolin-1, kun ER-α36 värjäys ja pese PBS, solut estettiin 4% BSA-täydennetty PBS 1 h huoneen lämpötilassa. Inkuboinnin jälkeen anti-caveolin-1-TRITC-vasta-aine yön yli, solut pestiin edelleen PBS: ssä ja värjättiin Hoechst 33258. mikroskooppinen analyysit tehtiin käyttäen konfokaali Laser-Scanning Microscope (Zeiss LSM 510 META, Saksa).

Semi-kvantitatiivinen RT-PCR

Yhteensä-RNA uutettiin TRIzol reagenssilla (Invitrogen, Carlsbad, CA) mukaan valmistajan ohjeiden. Kokonais-RNA (1,6 pg) käytettiin tuotantoon ensimmäisen juosteen cDNA: n käänteistranskriptaasin (Takara, Dalian, P.R.China). Seuraavat alukesarjat suunniteltiin monistamiseksi ihmisen ER-α36 (BX640939, 1145-1434 bp): eteenpäin, 5′-CAAGTGGTTTCCTCGTGTCTAAAGC-3 ’ja reverse, 5′-TGTTGAGTGTTGGTTGC CAGG-3′; Ihmisen GAPDH mRNA monistettiin forward-aluketta 5’-ACGGATTTGG TCGTATTGGG-3 ’ja reverse-aluketta 5′-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3’.

MTT-määritys

Soluproliferaatio analysoitiin käyttämällä 3 – (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5- difenyylitetratsoliumbromidin (MTT) [47]. Lyhyesti, solut siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille lopulliseen pitoisuuteen 5 x 10

3 /kuoppa MCF-7 /V ja MCF-7 /ER36 solujen tai 3 x 10

3 /kuoppa Hec1A /V ja Hec1A /RNAi-soluja. MCF-7 /V ja MCF-7 /ER36 soluja inkuboitiin DMEM-alustassa, joka sisälsi 10% FCS: ää, jossa on esitetty hoitoja. Hec1A /V ja Hec1A /RNAi-soluja inkuboitiin fenolipunattomalla väliaineessa, joka sisälsi 2,5% dekstraani hiilellä erotettua FCS: ää (Biochrom AG, Berliini, Saksa), jossa on esitetty hoitoja. Sitten soluja inkuboitiin MTT: tä (0,5 mg /ml) 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Poistamisen jälkeen väliaine, joka sisälsi MTT: reagenssin, 150 ui DMSO: ta lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyt luettiin aallonpituudella 490 nm käyttäen mikrolevylukijaa (Bioteck Powerwave ™, USA).

Western-blottaus-analyysi

Soluja kasvatettiin fenolipunaista-elatusaineessa 2,5% dekstraania charcoal- riisuttu FCS 48-72 tuntia ja sitten siirtynyt keskipitkän ilman seerumia 12 tunnin ajan ennen stimulointia agentit ilmoitettu. Solut kerättiin jääkylmään PBS: ään, ja solu-uutteet valmistettiin RIPA-puskurissa kanssa proteinaasinestäjä cocktail Sigma (St. Louis, MO). Solulysaatit keitettiin geelin latauspuskuria 5 minuutin ajan 100 ° C: ssa, eroteltiin 10% SDS-PAGE, siirrettiin PVDF-kalvoille, tutkittiin sopivilla vasta-aineilla ja visualisoitiin parannetun kemiluminesenssin (ECL) havaitseminen reagenssit (Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ).

tilastollinen analyysi

tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen pariksi-näytteiden

t

-testi tai ANOVA seurasi Student-Newman-Keuls testaus määrittää erot keinoin.

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Kiitokset

Haluamme kiittää tohtori Li-Hui Wei varten ystävällisesti tarjota Hec1A soluja. Kiitämme myös Dr. Yong-Feng Shang Pekingin yliopiston ja tohtori Heide Schatten yliopistossa Missouri varten huolellinen lukeminen käsikirjoituksen ja harkittuja ehdotuksia.