Krooninen sairaus

tiivistelmä

Interstitiaalinen keuhkosairaus (ILD) tapahtumia on raportoitu Japanilainen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) potilailla, jotka saavat EGFR-tyrosiinikinaasi-inhibiittorit. Olemme tutkineet proteomic biomarkkereita mekanistinen oivalluksia ja parempi ennustaminen ILD. Veriplasmaa koottiin 43 gefitinibi saaneista NSCLC potilaalle kehittyy akuutti ILD (vahvistettu sokaissut diagnostinen tarkastelu) ja 123 satunnaisesti valitun valvonta Sisäkkäisistä tapauskontrollitutkimuksessa sisällä farmakoepidemiologinen kohorttitutkimuksessa Japanissa. Meillä syntyy noin 7 miljoonaa tandem-massaspektrometriaa (MS /MS) mittausten laaja laadunvalvonta ja validointi, tuottaa yksi suurimmista proteomic keuhkosyöpä aineistoja tasalla, joissa tiukka tutkimuksen suunnittelu, fenotyyppi määrittely, ja arvioinnin näytteen käsittelyä. Sen jälkeen kohdistus, skaalaus, ja mittaus erä säätö tunnistimme 41 peptidi huiput olivat 29 proteiineista parhaiten ennustavat ILD. Monimuuttuja peptidi, proteiini, ja polku mallinnus saavuttaa ILD ennustus verrattavissa aiemmin tunnistettu kliinisissä muuttujia; yhdistämällä kaksi tarjotaan jonkin verran parannusta. Akuutin vaiheen vaste koulutusjakso on vahvasti edustettuna (17 29 proteiinien, p = 1,0 × 10

-25), mikä viittaa avainasemassa potentiaalia hyödyllisyys markkerina lisääntynyt riski akuutin ILD tapahtumia. Validation Western blottauksella osoitti korrelaation tunnistettu proteiineja, joka vahvistaa, että luotettavia tuloksia voidaan synnyttää MS /MS-alustan käyttöön tiukat laadunvalvonta.

Citation: Nyberg F, Ogiwara A, Harbron CG, Kawakami T, Nagasaka K , Takami S, et ai. (2011) proteomiikan biomarkkereita Akuutti interstitiaalinen keuhkosairaus Gefitinibi värjätyille Japani Keuhkosyöpä Potilaat. PLoS ONE 6 (7): e22062. doi: 10,1371 /journal.pone.0022062

Editor: Scott A. Coonrod, Cornell University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 maaliskuu 2011; Hyväksytty: 14 Kesäkuu 2011; Julkaistu: 20 heinäkuu 2011

Copyright: © 2011 Nyberg et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat AstraZeneca ja toteutetaan yhteistyössä tutkijat Academia, AstraZeneca ja Medical Proteoscope Company. Kaikki yhteistyötahoihin Tutkimukseen osallistui suunnitteluun, tietojen keruun ja analysoinnin, päätös julkaista, ja valmistelu käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: FN, CGH, ISP, MCS ja HVK ovat työntekijöitä AstraZeneca ja omien osakkeiden yritys. AO, TK, K. Nagasaka, ST, KW, HKT, MO, Y. Kyono, TD, Y. Komatsu, MK, SA, ja TN ovat /olivat työntekijät Medical Proteoscope Co., Ltd. TH on työntekijä Chiesin Farmaceutici. TH ja GMV ovat entisten työntekijöiden AstraZeneca. MF on saanut palkkioita AstraZeneca. K. Nakata, YO, SK, ja HK ovat ilmoittaneet, että mitään eturistiriitoja olemassa.

Johdanto

Interstitiaalinen keuhkosairaus (ILD) vaikuttaa keuhkojen parenchyma tai alveolaarialueelle [1]. Kun liittyy lääkehoitoa, se voi esittää jyrkästi akuutti diffuusi alveolaarinen vaurio (DAD), joskus kuolemaan johtavia [2]. Potilailla on usein vaikea hengenahdistus ja rintakehän radiologia näyttää ’ground glass ”ulkonäkö. Ei erityistä hoitoa on saatavilla, mutta tukihoito sisältää happea, kortikosteroidit, tai avustaa ilmanvaihto. Akuutti ILD tapahtumat voivat kehittyä

de novo

, mutta olemassa oleva krooninen ILD ehto lisää riskiä huomattavasti [3], jota on havaittu viimeaikaiset tutkimukset potilailla, joilla on idiopaattinen keuhkofibroosi (IPF), yleisin krooninen muoto [4 ].

ILD, erityisesti IPF, on tunnettu kaksoisdiagnoosipotilaille potilailla, joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [5]. Akuutti ILD tapahtumia on raportoitu monia keuhkosyöpään hoitojen hinnat jopa -10% [6] – [11]. ILD on tunnustettu yleisempää Japanissa kuin muualla, sekä väestön ja potilaiden keskuudessa NSCLC [5], [6], [12], [13], vaikka on epäselvää, miksi.

EGFR tyrosiinikinaasin estäjät (TKI) ovat vakiintunut hoito kehittynyt NSCLC. Toisin kuin suuri kemoterapia, ne ovat yleensä hyvin siedettyjä ja ilman sytotoksisia sivuvaikutuksia. EGFR-TKI gefitinibin (IRESSA) hyväksyttiin vuonna 2002 Japanissa edenneen NSCLC. Vaikka jotkut ILD-tyyppinen tapahtumia kliinisissä tutkimuksissa ja compassionate kliiniseen käyttöön, vasta hyväksynnän jälkeen teki yhä enemmän spontaaneja raportteja ILD näkyvät Japanissa lääke tuli laajalti saatavilla.

Tässä vaiheessa parempi ymmärtäminen ILD oli pikaisesti: lähtötilanteessa esiintyvyys eri hoidoista, riskitekijät, ja mahdolliset yhdistyksen gefitinibin kanssa ILD riski. Riippumaton akateeminen joukkue yhdessä AstraZenecan tutkijoiden siis suunnitellut ja toteutetut kohortin ja sisäkkäisiä tapaus-control farmakoepidemiologinen tutkimuksessa ILD Japani pienisoluista keuhkosyöpää hoidettiin joko gefitinibin tai kemoterapiaa, kliinisiä tuloksia on raportoitu aiemmin [3]. Yhtenä valmisteleva osatutkimuksessa komponentti, saavilla potilailla gefitinibin (molemmat myöhemmin ILD tapauksissa ja verrokeilla) otettiin näytteet plasma proteiinitutkimuksen, on kaksi päätehtävää: 1) tunnistaa proteomic ennustavia ILD jotka saattavat lopulta kehittynyt henkilökohtaisen lääketieteen diagnostinen kohteeseen tunnistaa potilaat suurempi riski ILD; 2) lisätä ymmärrystä mekanismeista kehittämistä akuutin ILD tapahtumista.

Käyttämällä useita biomarkkereiden lähestymistapaan, kuten proteomiikka (samanaikainen tutkimus suuren osan ihmisen Proteome antaa yleiskuva erilaiseen ekspressioon proteiineja veressä tai kudoksessa), eikä vain tavanomainen yhden biomarkkereiden, voi lisätä ennusteita sekä lisäämällä kestävyyttä johtuvia useita mittauksia ja mahdollisuus yhdistää tietoja useista biologisista prosesseista. Tukeakseen korkealaatuista tällaisten tietojen, yhdistimme uudella tavalla useita keskeisiä tutkimuksen komponentit: vankka tutkimus suunnittelu, hyvin määritelty fenotyyppisten määritelmiä, huolellinen Näytekokoelmatodistuksen menettelyjä, vakaa kehittynyt nestekromatografia (LC) -tandem massaspektrometriaa (MS /MS) -pohjaisen peptidin erottaminen ja havaitsemismenetelmät, tilastollinen analyysi sisältää proteomic ja kliiniset tiedot, tiukkoja menetelmiä tietokannan proteiinia merkinnästä havaittujen peptidi huippuja, ja biologinen tulkinta kirjallisuuden kaivos- ohjelmistoja sekä laaja laadunvalvonta ja validointi, ilmoitetaan alla.

tulokset

Ominaisuudet tutkimuspopulaation

ei-satunnaistetut ryhmä koostui 3166 japani, joilla on pitkälle /toistuvia NSCLC jotka seurattiin 12 viikkoa hoidon aloittamisen jälkeen gefitinibin (n = 1872 hoitojaksoa ) tai kemoterapiaa (n = 2551). Vuodesta gefitinibin saaneista sub-kohortti, 103 epäillään ILD tapauksista (79 vahvistettiin myöhemmin ja 24 hylättiin Case Review Board [CRB]), sekä 252 valvonta, rekisteröitiin osaksi tapauskontrollitutkimuksessa. Proteomiikka näytteet tämän osatutkimuksessa oli saatavilla 43 vahvisti ILD tapauksissa 123 verrokeilla, ja 15 CRB-hylkäsi aluksi diagnosoidaan ILD tapauksissa (taulukko 1). Kliiniset ominaisuudet tapausten ja kontrollien on kuvattu taulukossa S1.

valmisteleva analyysi LC-MS /MS-tulokset mukaisesti saataviin laatu valvotuissa olosuhteissa paljastaa suuren erän vaihtelua, joka on hallinnassa myöhemmissä tilastollisten analyysien

laadun arviointi näytteen käsittely ja tietojen tuottamista.

Kun immunoaffiniteetti- ehtyminen, loput seerumialbumiini oli 8% kaikista 181 perustason näytteet (taulukko S2). Myöhemmin tryptinen hydrolyysi johti jäljellä sulamatonta proteiinin osan vaihtelevat 3,0%: sta 32,3% (keskiarvo 15,3%) (taulukko S2). Vaihtelu näissä käsittelyvaiheissa oli riippumaton tapaus /valvonta-asema (tuloksia ei ole esitetty).

LC-MS /MS-mittauksia varten 181 yksilön perustason näytteet tehtiin 11 erissä, 19 ja 20 näytteitä eristä 1 ja 3 toistettiin erissä 10 ja 11, vastaavasti (taulukko 1), mikä johtaa 220 diskreetti proteomiikka mittauksia. Neljä 11 erien aluksi epäonnistunut laadunvalvontakriteerit (variaatiokerroin [CoV] 20% mille tahansa kuudesta kontrollipeptidejä kolmesta kuluessa erän vertailunäytteet) ensimmäisellä mittauskerralla, mutta läpäissyt kriteerit toistuva mittaus. Laadunvarmistussuunnitelma Yhteenveto hyväksyttävää erän ajojen on kuvassa 1A.

(A) toistettavuus 6 ohjaus piikit 3 standardin laadunvalvonta näytteet, piirrettiin ”+”, kussakin analyysierässä (piikin intensiteetti, vasen akseli). Variaatiokertoi- (%, oikea akseli) välinen 3 kontrollinäytteistä kunkin erän piirretään pisteiden liittyi linja. (B) toistettavuus peptidin intensiteetit 39 näytteiden kaksinkertainen määritys eri analyysisarjoihin. Osittainen korrelaatio poistamisen jälkeen välillä erän eroja, piirrettiin keskimääräiseksi intensiteetti kunkin peptidin. Korkeampi intensiteetti peptidit osoittavat korkea toistettavuus niiden intensiteetin välillä toistetaan erissä.

Kuvio 1B esittää käyrä osittaisen korrelaatioita kaksoisnäytteillä erissä 1 ja 10, 3 ja 11, ja josta mahdollisesti erän vaikutus vastaan ​​keskimääräiseksi intensiteetti ulottuu koko näyte kullekin signaalia. Peptidit, joilla on korkeampi keskimääräinen Intensiteeteissä suurempi toistettavuus erien välillä on osoituksena yleensä korkea osittainen korrelaatio.

valmisteleva analysointi MS signaalin intensiteettiä.

Sitten käytimme pääkomponenttianalyysiin (PCA) tutkia tiedot voidakseen tunnistaa suurimmat lähteet vaihtelua. Kuvio 2A esittää käyrää Tämän analyysin, jossa kukin näyte väriltään erän. Mittaukset samasta erästä taipumus keskittyä yhteen, erillään muista eristä, mikä tarkoittaa, että suurimmat erot näytteiden syntyvät panosmaiseen käsittely.

(A) Plot kahden ensimmäisen pääkomponentit PCA analyysi täysi proteomic tiedot kaikista 11 analyysisarjoihin (numeroitu 1-11 aikajärjestyksessä). Jokainen näyte edustaa yksi piste, jossa eri kohdilla kunkin erän ollessa esitetty monikulmion liittymällä kärkiä kyseisessä erässä. (B) Pinta-kahden ensimmäisen pääkomponentit toistuvan näyte-erien (1 ja 10, 3 ja 11). Yksittäiset näytteet edustaa viiva, joka yhdistää kaksi rinnakkaisnäytettä eri erissä. (C) toistettavuus esimerkin ilmentyvät eri peptidi kahden kahtena erän ajojen proteomiikka-analyysi. Intensiteetit ensimmäisen ja toisen kulkee kunkin toistettu näyte on merkitty toisiaan vasten. Näytteet värittää erän (erä 1 toistetaan niin erä 10 – blue; erä 3, toistetaan erä 11 – punainen). Mahdollistaa välinen-sekvenssin eroja on hyvä korrelaatio toistetun ajon.

Kuvio 2B esittää tuloksia PCA parien toistuvien erien (1 ja 10, 3 ja 11), jossa on päällekkäisiä näytteitä liittyi linja, piirretty kaksi ensimmäistä pääkomponenttien. Linjat ovat yleensä vaakasuorassa ja jälleen viittaa siihen, että suurin lähde vaihtelua tai suurinta yleisiä eroja profiilien näytteiden välillä (ensimmäinen tärkein ainesosa) liittyy välisen erän vaihtelu, ja että tilaus näytteiden toisessa pääkomponentti eli seuraavassa suurin lähde vaihtelua tai yleinen eroja näytteiden, on vahva välisen toistuvan erissä. Sen jälkeen mahdollistaa johdonmukaisen eroja erien, nämä tulokset vahvistavat siten, että kansainvälistä näyte erot ovat toistettavissa käytetty menetelmä.

katsoo Kuva 2B vertaa tuloksia yhteenvetona kaikkien mitattu peptidejä, kuvio 2C esittää toistuvan ajon tulokset varten esimerkiksi peptidi. Vaikka suuria välillä erän eroja, kunkin erän on korkea korrelaatio intensiteetit samasta aiheesta toistetun ajon. 41: ilmentyvät eri peptidiä piikkejä käytetään tunnistamaan proteiineja, jotka on lueteltu taulukossa 2, 25 (61%) osoittavat, osittainen korrelaatio poistamisen jälkeen erän vaikutus on suurempi kuin 0,8, ja kaikki osoittavat osittainen korrelaatio on yli 0,35.

Tyhjennä erot peptidin ja geelikuvioihin välillä ILD tapausten ja kontrollien

myöhempi analyysejä, joilla pyritään tunnistamaan peptidejä ja proteiineja, jotka tehokkaasti syrjinyt tapausten ja kontrollien välillä, joten hylkäsi tapausta nyt ulkopuolelle. Toistuva näytteet erissä 10 ja 11 suljettiin, ja koska suuri välinen-erä eroja havaittu valmistelevassa analyysien, valvonnan kohteena mitattiin erän 10 oli myös suljettu pois, jättäen 43 vahvisti ILD tapauksissa ja 122 säätimet yksi näyte mittauksen kutakin.

tunnistaminen erotteleva peptidit ja proteiinit.

Kuvio 3 esittää tulokset yhden muuttujan (yksittäinen peptidi) analyysit käyttäen analyysi kovarianssi (ANCOVA), näytetään histogrammit p-arvot vertailun tapausten ja kontrollien välillä. Mahdollistaa erän osalta analyysin kovariaattina, poistaa välisen erän vaihtelu, merkittävästi lisää valtaa analyysi, tunnistaa suunnilleen kaksi kertaa niin monta peptidit osoittavat tilastollisesti merkitsevä ero lauseke on 5%: n tasolla. Kuviot S1 ja S2 tutkia ja selittää tätä suhdetta tarkemmin. Edelleen osuus within-erän järjestys vain hieman vähentää useita merkittäviä peptidien, mikä viittaa siihen, että mikä tahansa sisäinen erän järjestys vaikutus on marginaalinen ja yrittää mallintaa se ei lisää voimaa.

Kuvassa vaikutus jakauma p-arvojen ero ilmentymistä lukien analyysi käsittelee tietoja ja kliinisistä muuttujista.

Toisaalta, mikä mahdollistaa keskeisten kliinisten muuttujien (WHO suorituskykyluokan [PS], tupakointi historia, laajuus normaali keuhko lähetyksenä CT, ja vakavuudesta ennestään ILD) analysoinnissa johdonmukaisesti vähentänyt peptidien ratsioissa kuin differentiaalisesti ilmaisi, mikä että suuri osa tiedoista kuljettaa merkittävin peptidit on päällekkäistä välitettyä tietoa kliinisen muuttujat ( kuvio 3). Kuvio S3 on esimerkki tästä, jossa korkeampi peptidin, paremman suorituskyvyn tila pisteet ja tapauksen tila ovat kaikki liittyvät toisiinsa, ja paljon lisääntynyt peptidin intensiteetti tapauksista kontrolleihin verrattuna voidaan selittää niiden yhdessä parempaa suorituskykyä tila pisteet, niin peptidi intensiteetti lisäämällä paljon vähemmän tietoja, kun sitä tarkastellaan yhdessä tämän kliinisen muuttujan.

Perustuu p-arvo, top 100 huiput sekä analyysien mukaan lukien että ilman kliinisiä muuttujat olivat tunnistettu. Nämä huiput sittemmin rajoitettu 41 seuraavin perustein: 1) normalisoitu LC-retentioaika välillä 5 ja 75 min, ja 2) täysi tarkistus

m /z

arvo esiasteen ionin välillä 450 ja 1500. Seuraavaksi peptidi tunnisteiden sisältyy 41 peptidi piikit valittiin seuraavien kriteerien: 1) Mascot ioni pisteet yli henkilöllisyyden kynnysarvo annetaan yksittäisten aminohapposekvenssin peptidin; ja 2) 3 näytettä vastaavan peptidin tunnistamista. Tämä johti 45 voimassa peptidi tunnistuksiin alkaen 28 41 huiput, joista kaksi peptidejä Piikitin lysotsyymi (taulukko S3). Plasmasta saadun 43 peptidit olivat 27 erillistä tunnisteiden kanssa 2 dual tunnistettujen läheisesti liittyvien proteiinien, yhteensä 29 proteiineja. Näitä on lueteltu taulukossa 2, jossa yksityiskohtaisemmin paneudutaan niiden tunnistamisen Taulukossa S3.

Akuutin vaiheen vaste merkittäväksi koulutusjakson todennäköisesti osallistuvat akuuttiin ILD tapahtumiin

Tämä joukko proteiineja käytettiin sitten biologisen tulkinnan analyysit, käyttäen kekseliäisyyttä Pathway Analysis (IPA) järjestelmä. Merkittävin polku löysi päällekkäin proteiinien päälle Ingenuity-kuratoinut kanonisen reittejä oli akuutti vaihevaste signalointireitin, jonka kanssa 17 29 proteiineista voisi liittyä (p = 1,0 x 10

-25). Muita reittejä osoittaa korkea päällekkäisiä luettelon proteiinien mukana komplementin ja hyytymistä polkuja, mutta p-arvot olivat pienempiä johtuen pienempi määrä osallistuvien proteiinien (kuva 4).

merkittävimmät reitit peräisin analyysi yhdistää tunnistettu 29 proteiinit tutkimuksen kuratoituja reittejä nerokkuus Pathway Analysis järjestelmä esitetään, tilataan mukaan suhde määrää proteiinimarkkereita jotka voivat liittyä reitin ja määrä proteiinien kautta.

syöttäminen 29 proteiineja IPA, 5 verkostoja muodostettiin. Merkittävin verkko sisältää 24 29 proteiineista (kuvio 5). Proteiinit lisätty verkkoon työkalun liittää merkin proteiineja ovat IL1 ja NF-KB, mikä viittaa siihen, että nämä proteiinit voivat myös olla mukana tuottavan Havaittu. Yhdistämällä kaksi verkkoa kanssa korkeimmat pisteet lisää, IL1-beeta, HNF1A, HNF4A, HNF6 (ONECUT1), ja CEBPB: lle kuin keskeisten komponenttien (kuva S4).

Korkein pisteytys verkko syntyy pääsemästä tunnistettu 29 proteiinit nerokkuus Pathway Analysis järjestelmä, jossa proteiinit tunnistettiin tutkimuksessa harmaat ja yhdistävät proteiinit tunnistetaan Ingenuity Pathway Analyysi ei-tummennetut. Tummansininen muodot ja linjat = proteiinit tunnistettiin ennustajia tässä tutkimuksessa ja niiden väliset riippuvuudet. Harmaa muodot ja linjat = proteiinit tunnistetaan kekseliäisyyttä tuottaa verkkoon ja vuorovaikutusta niiden välillä. Vaaleansininen viivat = vuorovaikutukset proteiinien tunnistettiin kekseliäisyyttä tuottaa verkkoon ja proteiinit tunnistettu tutkimuksessa. Kuvio S4A esittää tätä lukua vuorovaikutussuhteita merkitty. Proteiinit tunnistettiin tutkimuksessa ja sisällytetään verkkoon: SERPINA1 = alfa-1-antitrypsiini; SERPINA3 = alfa-1-antikymotrypsiini; SERPINC1 = antitrombiini III APOA1 = apolipoproteiini A-I; APOB = apolipoproteiini B-100; APOC3 = apolipoproteiini C-III; C3 = täydennys C3; C4A, C4B = täydennys C4-A; täydentävät C4-B; C9 = komplementtikomponentin C9; GSN = gelsoliini; HBA2 = hemoglobiini-alfa; HBB, HBD = hemoglobiini beeta /delta; HP = haptoglobiini; HPR = haptoglobiini kaltainen proteiini; HRG = histidiini-rikas glykoproteiiniin; KLKB1 = plasman kallikreiinin; IGKC = Ig kappa-ketjun V-III alue Ti; RBP4, RBP = retinolia sitovan proteiinin 4; APCS = seerumin amyloidi P-komponentin TF = serotransferrin; TTR = transtyretiini. Proteiinit tunnistettiin tutkimuksessa eivät sisälly verkossa: ORM1 = alfa-1-glykoproteiiniin 1; A1BG = alfa-1B-glykoproteiiniin; LRG1 = leusiinirikkaita alfa-2-glykoproteiini; ARMC2 = Armadillo toista sisältävä proteiini 2; AHSG = alfa-2-HS-glykoproteiini; ITIH4 = inter-alfa-trypsiini-inhibiittorin raskaan ketjun H4.

validointi MS /MS-tulokset osoittavat hyvää toistettavuutta ja kohtuullinen kanssa Western blot

Sisällä MS /MS-alustan siellä oli vahva välinen toistetun ajon saman näytteen sallimisen jälkeen erän vaikutuksia, kuten edellä on kuvattu (kuvio 2C).

validointi muulla menetelmällä, Taulukko 2 esittää korrelaatio-intensiteetit, jotka ovat peräisin MS /MS: n ja Western blotting (WB) ja valikoima 9 proteiineja. Ottaen huomioon, että WB kohdistuu ehjä proteiini, kun taas tässä MS /MS voi havaita johdettujen peptidien proteiineille, nämä 9 proteiinit osoittavat melko voimakkaan tason välisen teknologioita, jossa 6 9 proteiinien näytteille korrelaatio on yli 0,7 . Scatterplots verrataan MS /MS ja WB proteiinin voimakkuudet on esitetty kuvassa S5 ja WB kuvien kuvassa S6.

ennustaminen ILD käyttää proteiinien ja kliiniset tiedot

Modeling fenotyyppi perustuu useisiin peptidimerkkiaineita .

Kuva 6A esittää ennusteita perustuu loman-one-out ristivalidointi malleissa rakennettu käyttäen erilaisia ​​määriä peptidejä yhdistelmänä. Huomattavia parannuksia satunnainen ennustus saatiin vain muutamia peptidejä, ja lukumäärä kasvaa peptidien lisäksi ei olennaisesti parantanut mallia ennusteita. Ennustavan voiman mallin jopa väheni, kun käytetään hyvin paljon peptidejä.

(A) peptidejä, eri määrä peptidejä sisältyvät proteomic ennustemallin, ja (B) kliiniset tiedot, proteomic tiedot, ja yhdistelmä kliinisten ja proteomiikka tiedot.

kestävyys, vaihtoehtoisia monimuuttuja mallintaminen lähestymistapoja verrattiin. Käyttämällä satunnainen metsät sijaan osittaisen pienimmän neliösumman erotteluanalyysi (PLS-DA) ja logistinen regressio sisällä mallinnus puitteissa tuotti suunnilleen saman ennakoivaa taso on osoituksena AUC (yksityiskohtia ei esitetty).

alaryhmä analyysi rajoitetaan joukko tapauksia omaavilla DAD akuutti ILD rakenteessa (20 43 tapausta) haittasi pieni otoskoko ja voinut parantaa yleistä ennusteita.

Modeling fenotyyppi perustuu useisiin peptidimerkkiaineita ja kliiniset tiedot.

Kuva 6B vertaa ennusteita, jotka perustuvat jätettävissä one-out cross validointi, malleissa rakennettu kliinisten /radiologisia tiedoilla käyttäen logistinen regressio, peptidi tiedoilla, ja yhdistelmä. Molemmat tietotyyppejä yksin aikaan samanlaiset ennustus. Joitakin parannuksia on saatu yhdistämällä nämä kaksi tietotyypit, mutta se oli paljon vähemmän kuin lisäaine. Tämä on sopusoinnussa tulosten analyysin yksittäisten peptidien, mikä viittaa siihen, että erotteleva peptidit osittain kuljettavat tietoa myös saatavilla kliinisistä /radiologisten muuttujia.

Modeling fenotyypit perustuu proteiinien ja kliinisten tietojen.

Kuva 7 esittää p-arvojen erottamiseksi tapauksissa ja valvonta saadaan proteiineista (ts yhdistetty osatekijä peptidi pisteet), niiden olennaisille peptidejä, ja yhdistetty akuutin vaiheen koulutusjakson intensiteetin mitta (eli yhdistetyn pisteet 16 mukana osatekijä proteiinit) . Useimmat proteiinit, arvioitu proteiini intensiteetti on suurempi merkitys kuin useimmat mitattuna peptidin intensiteetit, jotka liittyvät kyseiseen proteiiniin, mutta vain parantaa merkityksestä parhaat peptidin muutaman proteiineja. Koska nämä tulokset saatiin saman aineisto, jota käytettiin tunnistaa ja valita osatekijän peptidejä, jotkut yli istuva voi olla esiintyviä, ja proteiini ilmaisun intensiteetin sisältää tietoa monista peptidit voivat olla vakaampi toimenpidettä soveltaa laajemmassa yhteydessä . Yhdistetty akuutin vaiheen koulutusjakson intensiteetti toimenpide osoittaa merkittävämpi vasteen kuin mikään muodostavien proteiinien. Samanlainen kuva saadaan, kun ajatellaan toimittamien lisätietojen peptidi, proteiini ja polku toimenpiteitä päälle tunnetun kliinisen muuttujat ennustavat ILD tila (kuvio S7).

p-arvot proteiinit näkyvät punainen tähdet, p-arvoja yksittäisten peptidien esitetään pisteiden ja jakelu näiden jokaisen proteiinin, jota esitetään boxplot. Kussakin boxplot, ylempi ja alempi laatikon sivut ovat suuremmat ja alakvartiili arvot (Q3 ja Q1), vastaavasti. Musta palkki jokaiseen laatikkoon edustaa mediaania. P-arvo akuutin vaiheen reitin edustaa katkoviiva; boxplots proteiineja akuutissa vaiheessa vastereitissä varjostetaan. A1AG1 = alfa-1-glykoproteiiniin 1; A1AT = alfa-1-antitrypsiini; A1BG = alfa-1B-glykoproteiiniin; A2GL = leusiinirikkaita alfa-2-glykoproteiini; AACT = alfa-1-antikymotrypsiini; ANT3 = antitrombiini III APOA1 = apolipoproteiini A-I; APOB = apolipoproteiini B-100; APOC3 = apolipoproteiini C-III; ARMC2 = Armadillo toista sisältävä proteiini 2; CO3 = täydennys C3; CO4 = täydentää C4-A; täydentävät C4-B; CO9 = komplementtikomponentin C9; FETUA = alfa-2-HS-glykoproteiini; GELS = gelsoliini; HBA = hemoglobiini-alfa; HBB, HBD = hemoglobiini beeta /delta; HPT = haptoglobiini; HPTR = haptoglobiini-related protein; HRG = histidiini-rikas glykoproteiiniin; ITIH4 = inter-alfa-trypsiini-inhibiittorin raskaan ketjun H4; KLKB1 = plasman kallikreiinin; KV3 = Ig kappa-ketjun V-III alue Ti; RETBP = retinolia sitovan proteiinin 4; SAMP = seerumin amyloidi P-komponentin TrFE = serotransferrin; TTHY = transtyretiini.

Kuva 8A esittää akuutin vaiheen vasteen koulutusjakson intensiteetti funktiona yhdistetty kliininen muuttuja pisteet mittaamalla todennäköisyys aihe ollessa kyseessä lasketaan logistinen regressio tapaus-verrokki asema vastaan kliininen muuttujat WHO PS, tupakointi historia, laajuus normaali keuhko lähetyksenä CT, ja vakavuudesta ennestään ILD. Tämä näkyy sekä tietolähteitä vaikuttavat ennustavat ILD lopputulokseen, vaikka molemmat kuuluvat melko korreloivat voimakkaasti, niin että suuri osa tiedoista on kahdennettu. Kuva 8B katsoo vaikutuksia ennustamiseen ILD näyttämällä vastaanottimen toiminta-ominaisuudet (ROC) käyrät kliinisen muuttujia, akuutin vaiheen koulutusjakson intensiteettiä, ja näiden kahden yhdistelmä tietolähteitä. Tämä osoittaa vertailukelpoiset ennusteita kliinisestä muuttujat ja akuutin vaiheen polku intensiteettiä, ja joitakin mahdollisia hyötyä yhdistämällä ne yhteen, jotka on kuitenkin rajallinen, mikä niiden korrelaatio.

(A) Plot akuutin vaiheen vasteen intensiteetti vastaan ​​kliinisten muuttuja pisteet mittaamalla todennäköisyys aihe on tapaus lasketaan mallin ennustamiseen tapaus-verrokki asema perustuu vain kliinisen muuttujista WHO PS, tupakointi historia, laajuus normaali keuhko lähetyksenä CT, ja vakavuus ennestään ILD, jossa boxplots vertaamalla jakelu näiden toimenpiteiden tapauksissa ja valvontaa. Kussakin boxplot, ylä- /oikea ja alempi /vasemmalle laatikon sivut ovat suurempia ja alakvartiili arvot (Q3 ja Q1), tässä järjestyksessä. Musta palkki jokaiseen laatikkoon edustaa mediaania. (B) Vastaanotin käyttöominaisuudet käyrä rajat validoitu ennusteita kliinisiä tietoja, akuutin vaiheen vaste intensiteetti ja yhdistelmä kliiniset tiedot ja akuutin vaiheen vasteen voimakkuutta.

Keskustelu

Esitämme tässä johtuu Proteomisten analyysin soveltaa laajamittaisen farmakoepidemiologinen tutkimus ja osoittavat, että paljon huomiota tukeva rakenne ja kokeellisia menettelyjä koko prosessin tuottamiseksi vaaditaan korkealaatuista data on mahdollista saada arvokasta tietämystä sekä tieteellinen ja diagnostinen näkökulmasta. On kuitenkin olemassa lukuisia mahdollisia tietolähteitä vaihtelua ja bias tässä prosessissa. Eheyden kaikki vaiheet prosessin on kriittinen tuottaa hyödyllistä tietoa ja epäonnistuminen varmistaa korkean laadun jokin niistä saattaa vaarantaa pätevyyttä ja arvoa koko tutkimuksen.

Methodological näkökohtia

Tutkimusasetelma ja näytteen valmistelu.

sovellettu huolellista fenotyyppaus kanssa sokaisi diagnostinen tarkastelu varmistaa tarkka ILD diagnoosi, ja sisällytetty toimenpiteitä, joilla varmistetaan, että kaikki tapaukset ILD esiintyviä lähde kohortin olisi kiinni. Kontrollit valittiin varsinaisen väestöstä tuottavan tapauksissa vertailukelpoisuuden varmistamiseksi tapausten ja kontrollien välillä, jotta kontrastit nähnyt voi johtua tapauksen tila. Osallistuminen oli korkea ( 90%) ja vastaavia tapauksia varten ja valvontaa [3], joten valinta bias epätodennäköistä. Proteomiikka näytteet saatiin sen jälkeen, kun erillinen tietoisen suostumuksen noin puolet kaikista gefitinibin käsiteltyjen tapausten ja kontrollien. Toimiin varmistaakseen laadukkaan proteomic data meidän laajamittaista epidemiologinen tutkimus sisältyi satunnaistaminen prosessoidun näytteen, huolellinen laadun arviointi näytevalmisteita ja optimoitu valmistelu protokollien varmistaa vakaa kaikkiin menettelyjä suuri määrä näytteitä. Olemme aikaisemmin kuvattu yleisen strategian, päätimme käyttää tutkimukseen perustuvan useisiin kokeellisen pilottivaiheen kierrosta [14].

Kokeellinen mittaus erän vaikutuksia.

Kaksiulotteinen polyakryyliamidigeelissä elektroforeesi on yksi yhteinen tavanomainen teknologia käyttää proteiinien analyysissä seerumin /plasman [15], [16]. Tällä hetkellä LC-MS /MS on tullut laajalti hyväksytty korkean resoluution proteomiin laajuinen profilointi monimutkaisesta peptidiseoksesta [17]. Viimeaikaiset edistysaskeleet tämän menetelmän mukaan luettuna parantunut vakaus peptidin erottaminen ja tunnistus on mahdollistanut vertailun ionin intensiteetti välillä LC-MS /MS-profiilit [18]. Meidän proteomiikka analysointijärjestelmä sovelletaan LC-MS /MS jälkeen immunoaffini- ehtyminen runsaimmin esiintynyt veriplasmassa olevista proteiineista, ja proteolyyttinen entsyymi käsittely köyhdytetyn plasma näyte.

Havaitsimme, että LC-MS /MS mittaus prosessi on systemaattinen mittausvirheitä, kuten voisi olettaa, jonka olemme ottaneet toimenpiteisiin poistaakseen tuomalla erän käsittely laadunvalvonta, suunnittelu järjestystä näytteen käsittelyn vaikutusten minimoimiseksi mitään systemaattisia virheitä ja sitten poistamalla erä vaikutuksia tilastollisessa analyysissä. Vastike erän vaikutuksia tilastollinen analyysi näytti parantaa prosessin havaitsemaan harkitseva huiput, ja siksi perustuu meidän lopullinen proteiini tunnistamisen vaihe Tämän analyysin lähestymistavasta.

Tasaus algoritmeja – sisäinen standardi-ohjattu Optimaalinen Profile Tasaus ( i-OPAL).

jotta vertailevan kvantifiointiin näytteiden välillä, näyte mittaukset on kohdistettu – toisin sanoen vastaavuus ionin signaalit on tunnistettava. Erilaisia ​​menetelmiä on ehdotettu tähän, esim. perustuva vakaa isotooppi merkinnöistä [19] – [21], hyödyntäen vertaileva tunnistaminen [22], [23], tai suora vertailu vastaava peptidi-ioni signaalit [18]. I-OPAL menetelmä kuuluu viimeiseen ryhmään. Huolimatta suhteellisen alhainen tarkkuus ja massa päätöslauselman

m /z

mittaus, MS väline ioni-ansa tyyppinen mahdollistaa pitkäaikainen ja vakaa mittaus ilman kalibrointia toimintaa [24], [25]. Näin ollen

m /z

arvot ovat suoraan verrattavissa suuri joukko näytteitä ilman muunnoksia.

Biologiset havainnot ja vaikutukset

Mahdolliset biologiset mekanismit akuutti ILD tapahtumia.

meidän IPA kartoitus kanoninen biologisia polkuja, akuutin vaiheen proteiinit tuli ulos vahvin signaali, jota seuraa komplementin ja hyytymisen polkuja.