Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eritettyä MikroRNA (miRNA) sisälle solunulkoisen rakkulat (EV) on keskeinen rooli solujen välisessä viestinnän säätelemällä vastaanottajasolu geenin ilmentymisen ja vaikuttavat kohde solujen toimintaa. Täällä raportoimme eristäminen kolme erillistä EV alatyyppiä ihmisen koolonkarsinoomasolulinja LIM1863 – irtoa mikrovesikkeleille (sMVs) ja kaksi eksosomi populaatioiden (immunoaffini- eristetty A33-eksosomeiksi ja EpCAM-eksosomeiksi). Syvä sekvensointi miRNA kirjastojen valmistettu vanhempien LIM1863 solua /johdetut EV alatyypin RNA tuotti 254 miRNA tunnistuksiin, joista 63 on selektiivisesti rikastettu EV – miR-19a /b-3p, miR-378a /c /d, ja miR-577 ja jäsenet anna-7 ja miR-8 perheitä on kaikkein näkyvin. Anna-7a-3p *, anna-7f-1-3p *, miR-451a, miR-574-5p *, miR-4454 ja miR-7641 ovat yhteisiä kaikille EV alatyyppejä, ja 6 miRNA (miR-320a /b /c /d, miR-221-3p, ja miR-200c-3p) erottaa LIM1863 eksosomeiksi päässä sMVs; miR-98-5p selektiivisesti edustettuna vain sMVs. Erityisesti, A33-Exos sisälsi suurimman määrän (32) yksinomaan rikastetun miRNA; 14 näistä miRNA ei ole raportoitu yhteydessä CRC kudoksen /biofluid analyysejä ja takaa jatkotutkimuksiin potentiaalisina diagnostisia markkereita CRC. Yllättäen miRNA matkustaja säikeet (tähti miRNA) Mir-3613-3p *, -362-3p *, -625-3p *, -6842-3p * oli hallitseva säie A33-Exos, päinvastainen kuin ihmisellä havaittu vanhempien solut. Tämä havainto viittaa siihen miRNA biogeneesin voidaan sidoksissa endosomaalisiin /exosomal käsittelyä.

Citation: Ji H, Chen M, Greening DW, hän W, Rai A, Zhang W, et al. (2014) Deep sekvensointi RNA Kolme eri Solunulkoisilla Vesirakkuloiden (EV) Alatyypit Vapautettu Human LIM1863 koolonisyöpäsolulinja Paljastukset Distinct Mirna-Väkevöiminen allekirjoitukset. PLoS ONE 9 (10): e110314. doi: 10,1371 /journal.pone.0110314

Editor: Clark Chen, University of California, San Diego, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 29, 2014; Hyväksytty: 11 syyskuu 2014; Julkaistu 17. lokakuuta 2014

Copyright: © 2014 Ji et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. FASTQ tiedostoja kaikkien neljän pientä RNA kirjastot (LIM1863 soluja, ja johdettu sMVs, A33-Exos ja EpCAM-Exos) on toimitettu Sequence Lue Archive (SRA) on NCBI tulonumerolla SRA106214.

Rahoitus: tätä työtä tukivat National Health ja Medical Research Council of Australia (NHMRC) ohjelma avustus # 487922. MC ja AR tukena on La Trobe University Research Scholarship. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ekstrasellulaarinen vesikkelit (EV) on nano-kalvo hiukkasten välillä 30-2,000 nm halkaisijaltaan, jotka on vapautettu useimmissa solutyypeissä solunulkoiseen ympäristöön [1]. EV arvellaan kuuluttava kolme luokkaa riippuen niiden alkuperästä – eksosomeiksi (Exos, 50-150 nm), irtoa mikrorakkulat (sMVs, 400-1,500 nm), ja apoptoottiset kappaleet (400-2,500 nm). Vaikka on olemassa jatkuva poleeminen tutkijoiden koskien nimikkeistön, biogeneesiä, biokemialliset ja toiminnallisia ominaisuuksia EV alatyyppejä, käytettävissä olevat todisteet viittaavat siihen, että eksosomeiksi lähtöisin jonka sisäänpäin orastava endosomaalisesta osastojen kutsutaan monivesikkeliset elimet (MVBs) ja vapautuvat solusta microenvironment seuraavat fuusio MVBs solukalvon kanssa, sMVs (ectosomes, mikrorakkulat, mikropartikkelit, oncosomes) ulkoisen Analysis /kupliminen plasmamembraanista, ja apoptoottisten elinten läpi apoptoosin /solun kutistuminen /ydin- pirstoutuminen [2]. Sekä toiminnallisia ja biokemiallisten tasolla, eksosomeiksi ovat olleet laajimmin tutkittu ja EV. Eksosomeiksi on osoitettu sisältävän erilaisia ​​proteiineja (mukaan lukien onkoproteiineja, tuumorisuppressorin proteiineja, transkription säätimet, silmukoinnin tekijät [1], [3], [4], [5], [6], lipidien [7], ja RNA: t (mRNA: t , MikroRNA (miRNA) ja muut ei-koodaavat RNA: t) [8] – exosomal molekyyli lastitietoja pääsee julkisesti-tietokantoja kuten ExoCarta [9] ja EVPedia [10]. Vaikka pitkään pidetty solujen roskia, viimeaikaiset eksosomi tutkimukset osoittamaan, että niillä on tärkeitä biologisia rooleja immuuni, sydän-ja hermoston ja patogeneesissä sairauksien kuten syövän [11], [12], [13]. viime vuosikymmenen se on todettu, että sähköajoneuvojen on keskeinen rooli syövän etenemiseen ja ennalta metastasoitunut kapealla esikäsittely kasvaimen siirteen [14], [15], [16], [17].

on hyvin tunnettua, että kasvain microenvironment on kriittinen rooli syövän aloittamisen , etenemisen ja etäpesäkkeiden [18]. Intercellular välistä viestintää kasvain-strooman voidaan välittävät liukoiset tekijät, kuten sytokiinit, kemokiinit, ja kasvutekijät [19]. Syntymässä käsite on se, että kasvaimeen stroomavuorovaikutuksiin voi myös sisältyä suora vaihto geneettistä informaatiota, lähinnä muodossa miRNA, luokan ei-koodaavaa RNA: iden (18-25 nukleotidiä), jotka säätelevät ilmentymistä useiden kohdegeenien sitoutumalla niiden koodattu mRNA: t [13], [20], [21]. Tämä geneettisen materiaalin voi tapahtua, kun EV sisältäviä miRNA lasti vapautuu luovuttajalta solusta solunulkoiseen ympäristöön ja toiminnallisesti siirretään vastaanottajalle soluihin. Siirretty miRNA voi olla toimiva sekä

in vitro

[8], [22], [23], [24], [25], ja

in vivo

[26], [27] , [28]. Tutkimukset ovat alkaneet tutkia yhdistys mikroRNA liittyvien polymorfismien ja niiden yhdessä syövän esiintyvyys ja ennuste sekä mahdollisia kierrättämiseksi MikroRNA tai ulosteen microRNA ilmaisu kuin ei-invasiivisia varhaisen havaitsemisen biomarkkereita ja peräsuolen syöpään [29], ja hyödyllisyys miRNA uusiutumiseen, etäpesäkkeitä ja hoitotulosten [30]. Merkittävä edistysaskel ymmärrystämme exosomal miRNA biologian oli havainto, että sumoylated hnRNPA2B1 ohjaa lastaus tiettyjen miRNA osaksi eksosomeiksi kautta tunnustetaan erityisten lyhyitä motiiveja läsnä miRNA [31].

Viime aikoina olemme kuvattu eristämisen kaksi populaatiot eksosomeiksi sekä sMVs samasta ihmisen koolonkarsinoomasolulinja LIM1863 [4]. SMVs valmistettiin erotussentrifugoinnilla ja eksosomeiksi puhdistetaan peräkkäisellä Immunocapture käyttäen anti-A33- ja anti-EpCAM kytketty magneettinen helmiä. Vaikka eksosomi populaatioiden (A33-Exos ja EpCAM-Exos) ei voitu erottaa käyttäen elektronimikroskoopilla, tiheyteen tai stereotyyppistä eksosomeiksi markkereita (TSG101, Alix ja HSP70), proteiini kirjoittamalla käyttäen GeLC-MS /MS [3], [6] paljasti, että niiden proteiinikokoomukset olivat täysin erillisiä – EpCAM-Exos sisältävän klassisen apikaalisella kaupan komponentteja ja A33-Exos, rikastettu basolateraalisessa kaupan molekyylejä. Proteomiin profiilit Molempien eksosomi väestön puolestaan ​​olivat selkeästi erillään ensimmäisessä raportissa sMVs julkaistiin samaan elatusaineeseen. Jotta edelleen määritellä nämä EV alatyypeistä, tutkimme niiden molekyylitason koostumus toisella

omiikka

lähestymistapa, RNA kirjoittamista.

Tässä tutkimuksessa osoitamme käyttäen syvä sekvensointia että on olemassa kaikkiaan 254 miRNA tunnistettu neljässä miRNA valmistetuista kirjastoista (A33-Exos, EpCAM-Exos, sMVs ja vanhemman LIM1863 soluja), joista 63 on hyvin rikastettu EV. Kolmen LIM1863 johdettuja EV alatyyppejä on rikastunut erityisiä miRNA allekirjoitukset, verrattuna emosolulinjassa LIM1863. Erityisesti, me raportoimme, että 32, 2 ja 4 miRNA, jotka ovat yksinomaan rikastettu A33-Exos, EpCAM-Exos, ja sMVs, vastaavasti – jotkut, jotka mahdollistavat eksosomeiksi voidaan erottaa sMVs. Niistä 32 miRNA valikoivasti rikastettu A33-Exos, 13 ei ole aiemmin liitetty kanssa peräsuolen syöpä (CRC) ja keskustellaan siitä, miten tätä tietoa voidaan hyödyntää kohti mahdollisuuksia CRC diagnostiikka. Merkittävä havainto tutkimuksessamme oli toteamus ”matkustaja säikeen” miRNA (miRNA tähti) sekvenssit rikastunut EV verrattuna vanhemman LIM1863 soluihin.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja eristäminen solunulkoisen rakkulat

LIM1863 soluihin [32] oli aluksi viljeltiin -80% konfluenssiin 175 cm:

2: n pullo, RPMI-1640-alustassa (Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 5% vasikan sikiön seerumia ( FCS), 0,1% insuliinia-transferriini-seleeni (ITS, Invitrogen), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä, 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. LIM1863 solut (~ 3 x 10

7-solut) kerättiin talteen (140

g

, 3 min), suspendoitiin 15 ml fenolipunaista RPMI-1640-alustassa (joka sisälsi 0,5% ITS, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä) ja siirretään viljely kammion CELLine CL-1000 BIOREAKTORITEKNIIKKA klassinen pulloon (Integra Biosciences); ravinneviranomaisten Supply kammion sisälsi 500 ml RPMI-1640, jota oli täydennetty 5% FCS: ää, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2-ilmakehässä. Viljelyalustassa ravinteiden saanti kammiossa korvattiin kahdesti viikossa ja solususpensio päässä Viljely kammiosta kerättiin joka 48. h. Jokaisen kokoelma, solususpensiota sentrifugoitiin 140

g

3 min sedimenttiin LIM1863 soluun organoids, joka suspendoitiin uudelleen 15 ml: aan viljely- keskipitkän ja uudelleen kylvetään takaisin viljely kammioon. Supernatantti sentrifugoitiin 2000

g

10 min poistamiseksi kelluva solua /solujätettä ja sitten sentrifugoitiin edelleen 10000

g

30 minuutin ajan 4 ° C: ssa kerätä irtoa mikrovesikkelit (sMVs) . Saatu supernatantti sentrifugoitiin edelleen (100000

g

, 1 h) kerätä raakaa eksosomeiksi. Raa’at eksosomeiksi fraktioitiin kahteen erilliseen eksosomi alapopulaatiot (A33-Exos ja EpCAM-Exos) peräkkäisellä Immunocapture käyttämällä Dynabeads (Invitrogen) ladattu anti-ihmisen-A33 monoklonaalisia vasta-aineita [33] yhdessä anti-EpCAM (CD326) vasta-aine-sitoutuneen magneettiset mikrohelmet (Miltenyi Biotec), kuten on kuvattu [4].

Protein kvantitoimiseksi

proteiinipitoisuus arvioitiin 1D-SDS-PAGE /SYPRO Ruby proteiinivärjäys densitometria, kuten aiemmin on kuvattu [5] .

Transmission (TEM) B

A33-Exos ja EpCAM-Exos eluoitiin niiden magneettisten helmien kanssa 0,2 M glysiini, pH 2,5 ja kerättiin sentrifugoimalla (100000

g

, 1 h). TEM, näytteet (sMVs, A33- ja EpCAM-Exos, 1 ug /10 ui PBS) levitettiin 2 min 400 mesh kupari verkkojen päällystetty ohuella kerroksella hiiltä. Ylimääräinen materiaali poistettiin imeyttämällä suodatinpaperilla, ja näytteet värjättiin negatiivisesti kahdesti 10 ul: aan 2%: uranyyliasetaatilla liuokseen 10 min ajan (ProSciTech, Queensland, Australia). Ristikot ilmakuivattiin ja kuvattiin käyttäen JEOL JEM-2010 transmissioelektronimikroskoopilla toimi 80 kV.

Western blot -analyysi

Näytteet proteiinin pitoisuudet määritettiin käyttäen yksiulotteista SDS-PAGE /SYPRO Ruby proteiinivärjäys /densitometria, kuten on kuvattu [5], [6]. Lyhyesti, näytteet lyysattiin SDS-näytepuskurissa 20 min huoneen lämpötilassa, ja proteiineja (10 ug /näyte) SDS-PAGE, siirrettiin sähkön nitroselluloosakalvoille käyttäen iBlot Dry Blotting System (Life Technologies), ja kalvot estettiin 5 % (w /v) rasvaton maitojauhe Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisälsi 0,05% (v /v) Tween-20 (TTBS) 30 minuutin ajan. Kalvot tutkittiin yön yli TTBS kanssa ensisijaisen hiiren anti-CD9 (at 1:1000) ja hiiren anti-TSG101 (at 1:1,000) BD Biosciences, hiiren anti-Alix (at 1:1,000) Cell Signalling, tai hiiren anti -A33 (1 ug /ml) (lahja Dr. Scott, Ludwig Institute for Cancer Research, Melbourne). Kun oli pesty TTBS (3 x 10 min) kalvoja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasiin (HRP) konjugoitua anti-hiiri-IgG: tä (Sigma) tai IRDye 800 anti-hiiri-IgG: tä (Li-COR Biosciences). Proteiinit tehtiin näkyviksi inkuboimalla kalvoja Länsi HRP-substraattia (Merck-Millipore), jota seuraa kuvantamisen ChemiDocMP System (Bio-Rad) tai kuvantamisen suoraan Odyssey Infrared Imaging System (v3).

Yhteensä RNA: n eristys

Kokonais-RNA LIM1863 soluja, sMVs, A33- ja EpCAM-Exos eristettiin TRIzol (Life Technology), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, näytteet hajotettiin 1 ml: ssa TRIzol-reagenssia toistuvia pipetoimalla 5 min huoneen lämpötilassa (RT). Kloroformissa (0,2 ml /ml TRIzol Reagent) lisättiin liukoiseksi näytteet ja seoksia vorteksoitiin voimakkaasti 15 s, inkuboitiin huoneenlämpötilassa 2-3 minuuttia ja sitten sentrifugoitiin (12000

g

, 15 min, 4 ° C) . Vesipitoinen faasi kerättiin, sekoitettiin 5 ug glykogeenia (20 mg /ml vesiliuosta glykogeenin, Invitrogen) ja isopropyylialkoholia (0,5 ml isopropyylialkoholia /1 ml vesifaasia) ja inkuboitiin 10 minuuttia huoneenlämpötilassa. Kokonais-RNA otettiin talteen sentrifugoimalla 12000 g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Saatu RNA-pelletit pestiin kerran 75%: isella etanolilla, kuivattiin ilmassa 5 min ja liuotettiin uudelleen RNaasi-vapaaseen veteen. Määrä, laatu ja koostumus RNA-näytteet arvioitiin käyttäen Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, USA).

Small RNA kirjasto rakentaminen ja sekvensointi

Neljä pientä RNA kirjastot (vanhempien LIM1863 soluista ja johdettu sMVs, A33- ja EpCAM-Exos) rakennettiin ja sekvensoitiin Illumina TruSeq syvä sekvensointitekniikan (Sample valmistautumisopas, Par # 15004197 Rev.A, Illumina, San Diego, CA). Lyhyesti, kokonais-RNA-näytteet fraktioitiin 15% Tris-boraatti-EDTA (TBE) polyakryyliamidigeelillä (Invitrogen) ja vastaavat vyöhykkeet pieniä RNA: ita (18~30 nt) leikattiin irti ja pieniä RNA: t uutettiin sentrifugoimalla. Ligaation jälkeen 5 ’(5′-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3’) ja 3 ’(5′-UGGAAUUCUCGGGUGCCAAGG-3’) adapterit, pieniä RNA-molekyylejä käänteistranskriptio cDNA: ksi, monistetaan sitten käyttäen sovittimen alukkeita 14 syklin ja fragmentit ( ~150 bps) eristettiin 6% TBE PAGE-geelillä. Puhdistettu cDNA käytettiin suoraan klusterin sukupolven ja sekvensoitiin käyttäen Illumina HiSeq 2000 alusta. Image tiedostoja syntyy sekvensserin käsiteltiin tuottaa digitaalisen laatutiedot (raaka FASTQ tiedostot). FASTQ tiedostoja kaikkien neljän pientä RNA kirjastot (LIM1863 soluja, ja johdettu sMVs, A33-Exos ja EpCAM-Exos) on toimitettu Sequence Lue Archive (SRA) on NCBI tulonumerolla SRA106214.

Quantitative real -Aika PCR

Yhteensä-RNA (3 ui, joka sisälsi 12 ng RNA /ul) valmistettu LIM1863 soluista ja johdetut EV käänteiskopioitiin käyttäen TaqMan miRNA Reverse Transcription (RT) Kit Applied Biosystems /Life Technologies Megaplex RT alukkeita (Human Lohko A ja Lohko B, Applied Biosystems). RT reaktio-olosuhteet, jotka perustuvat valmistajan ohjeita, olivat: 40 sykliä, joissa 16 ° C 2 min, 42 ° C 1 min ja 50 ° C: ssa 1 s. Tuloksena Megaplex RT tuotteet (2,5 ui) sekoitettiin sitten 22,5 ui Megaplex Esivahvistustaso Reaction Mix, joka sisälsi 2,5 ul Megaplex Esivahvistustaso Alukkeet Lohko A ja B (Applied Biosystems). Pre-monistussyklimenetelmän olosuhteet olivat: 95 ° C 10 min, 55 ° C 2 min, 75 ° C: ssa 2 min, jota seurasi 12 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C: ssa 4 minuutin ajan. Laimentamisen jälkeen pre-monistettu cDNA (25 ui) kanssa 75 ui Tris-EDTA-puskuria (1 mM Tris-puskuria, joka sisälsi 0,1 mM EDTA: ta, pH 8,0), 15 ui laimennettua cDNA tuote sekoitettiin 450 ui TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) ja 435 ui nukleaasitonta vettä. Validoida syvä sekvenointitulosten seos alistettiin kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) analyysi käyttäen TaqMan alhaisen tiheyden array (TLDA) kortit (set v3.0), jotka edustavat yhteensä 754 määritysten erityisiä ihmisen miRNA (läsnä Sanger miRBase V14). qRT-PCR suoritettiin 7900 HT Thermocyclerissä (Applied Biosystems) käyttäen valmistajan suosittelemaa sykliolosuhteita: 50 ° C 2 min, 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C: ssa 1 minuutti. qRT-PCR kerättiin lopussa jokaisen syklin. Cycle kynnys (Ct) arvot laskettiin käyttäen SDS-ohjelmisto v2.4; automaattinen perustason asetukset jaettiin vähintään Ct kynnysarvo 0,2. Ct-arvoja 35 katsottiin olevan alle määritysrajan tunnistustason ja jätetty tietojen analysointi. Tulokset analysoitiin käyttäen ΔΔCt menetelmällä LIM1863 solun RNA ohjearvon ja maailmanlaajuinen normalisoinnin U6 snRNA ja MaMMU6 ehdokkaana ohjauksista Expression Suit Software v1.0.3 (Applied Biosystems).

bioinformatiikka- analysoi

bioinformatiikan putki kehitetty BGI-Shenzhen käytettiin tunnistamaan miRNA ja muita pieniä RNA luokkiin. Lyhyesti, huonolaatuisia lukee (pieni RNA: iden, jotka sisältävät base ”N” (määrittämätön jonka sekvensseri), tai yli 6 emästä laadukkaita pienempi kuin 13 tai enemmän kuin 4 tukiasemaa laadukkaita pienempi kuin 10), sovittimet ja lukee pienempi kuin 18 nt jätettiin raakadatasta tuottaa puhdasta lukee (18-30 nt). Puhdista lukee linjattu miRBase (V20, https://www.mirbase.org) käyttäen BLAST-ohjelmistoa NCBI tunnistaa tunnettuja miRNA ja tuottaa ilmaisun profiileja. Kertamuutoksia ilmennystasoissa (näyte ryhmä vs. kontrolli) laskettiin kullekin miRNA log

2 suhdeluvut käyttämällä normalisoitua TPM (selostukset miljoonasosaa lukee) arvot kaavan mukaan: fold muutos = log

2 (näyte ryhmä /kontrolli). P-arvo kullekin miRNA yhdessä pareittain Vertailu suoritettiin perustuu Poisson testi [34]. Puhdista lukee linjattu Human Reference Genome (hg19, https://hgdownload.soe.ucsc.edu/) saippualla 2 [35] luokitella toista osakkuusyrityksen pieniä RNA: ita ja mRNA hajonnut palasia. rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, srpRNA tunnistettiin kartoittamalla puhdas lukee GenBank (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ja Rfam (https://rfam.sanger.ac.uk/) tietokannat.

Gene ontologia ja Kegg Pathway Analysis

TargetScan 6,0 (https://www.targetscan.org) käytettiin ennustamaan kohdegeenien varten miRNA ehdokkaita. Mahdollinen toiminnot miRNA kohde- geenejä selityksin Gene ontologia ja Kegg reitin tietokantaa. WEGO menetelmä [36] käytettiin merkittäviä GO termejä. Kaksi tilastollisia arvoja,

P-arvo

(Fisherin tarkka testi) ja

q-arvo

[37], laskettiin saamiseksi polkuja, jotka olivat merkittävästi rikastettu ja hallita vääriä löytö määrä.

tulokset

Olotila RNA EV vapautuu ihmisen koolonkarsinoomasolulinja LIM1863

Aikaisemmin on raportoitu, että LIM1863 solut vapauttavat kaksi EV alatyyppiä – eksosomeiksi ja irtoa mikrovesikkeleille [4] , ja että sisällä eksosomi alatyyppi on kaksi erillistä eksosomi populaatioita, yksi rikastettiin apikaalisella pinnalla lajitteluun proteiinit (EpCAM-Exos), toinen, basolateraalisessa pinta lajittelu proteiini (A33-Exos); kaikki kolme EV populaatiot ovat eri proteomiin profiilit [4]. Sen arvioimiseksi, RNA: t ovat nimenomaan lajitellaan sähköajoneuvojen ja onko valikoimia miRNA (Mirs) kolmessa populaatioiden me eristetty eroavat, ryhdyimme laajamittainen puhdistus sähköajoneuvojen peräisin LIM1863 alustaa (CM). Tuottamaan riittävästi EV täydellistä RNA-analyysi käytimme jatkuvan soluviljelmässä lähestymistapaa käyttäen CELLine CL-1000 BIOREAKTORITEKNIIKKA pulloihin ~1200 ml LIM1863 CM. sMVs puhdistettiin käyttämällä differentiaalisentrifugointia ja A33-Exos ja EpCAM-Exos peräkkäisillä immunoaffiniteettikromatografialla talteenotto, katso kuva. 1A. Eksosomi väestö (A33-Exos ja EpCAM-Exos) ei voida erottaa elektronimikroskoopilla (50-150 nm halkaisijaltaan), kun taas sMVs olivat heterogeenisiä kooltaan (100-1,500 nm halkaisijaltaan) ja yhdenmukaisia ​​tunnetun morfologia (kuvio 1 ILMOITUS); kaikki kolme EV osapopulaatioiden sisälsivät stereotyyppisiä eksosomi markkereita (TSG101, Alix, CD9) (kuvio 1 E). Tämä lähestymistapa tuotti -20 mg sMVs ja ~ 3 mg A33- ja EpCAM-Exos. Sen määrittämiseksi, LIM1863 solu EV sisältävät RNA, puhdistettua EV poimittiin varten kokonais-RNA mukaan lukien pienet RNA osa käyttäen normaaleja RNA menetelmiä. Laatu ja määrä eristetty RNA määritettiin käyttäen Agilent 2100 Bioanalyzer (kuvio 1 F). RNA saanto: A33-Exos 8,8 ug RNA /~ 3 mg proteiinia, EpCAM-Exos 9.2 ug RNA /~ 3 mg proteiinia, ja SMV: 72 ug RNA /-20 mg proteiinia. Kokonais-RNA bioanalysaattorin profiilit osoitti, että LIM1863-soluista peräisin sMVs sisälsi 18S ja 28S ribosomaalinen RNA: ta (rRNA), kun taas A33- ja EpCAM-Exos ei ole havaittavia määriä näiden lajien RNA kanssa eksosomeiksi peräisin muut solulinjat [22], [38 ], [39], [40].

(A) LIM1863 soluja kasvatettiin RPMI-1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 5% FCS: ää (eksosomi-köyhdytettyä), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä in CELLine Bioreactor klassinen pulloihin ja viljelyalustaan ​​(CM) kerätään. sMVs ensin eristettiin CM (saanto: ~ 20 mg proteiinia, 72 ug RNA: ta). Seuraavaksi A33-Exos eristettiin SMV-free CM kautta anti-A33-vasta-aineen talteenotto (saanto: ~ 3 mg proteiinia, 8,8 ug RNA: ta) ja EpCAM-Exos eristettiin A33-Exos-köyhdytettyä CM käyttäen EpCAM kytketty magneettinen helmet (saanto: ~ 3 mg proteiinia, 9,2 ug RNA: ta). (BD) Elektronimikroskopia kuvia sMVs (B), A33-Exos (C) ja EpCAM-Exos (D) esittää koko 150-300 nm: n halkaisija ja 40-100 nm halkaisijaltaan sMVs ja A33- /EpCAM-Exos, vastaavasti. Mitta-asteikko: 100 nm (n = 3). (E) Western blot sähköajoneuvojen (10 ug proteiinia) ja A33, Alix (PDCD6IP), TSG101, ja CD9. (F) Kokonais-RNA elektroferogrammi analyysi (Agilent Bioanalyzer) päässä LIM1863 soluista ja johdettu EV. Y-akseli on elektroferogrammi on mielivaltainen fluoresenssi yksikkö intensiteetti (FU) ja x-akseli on muuttoliike aika sekunneissa (t) ja nukleotidit (nt).

Katsaus pienten RNA sekvenointitulosten

luonnehtia pieniä RNA: iden LIM1863 johdettuja EV, Illumina HiSeq 2000 suurikapasiteettisten menetelmää käytettiin sekvensoida neljä pientä RNA kirjastot (LIM1863 solut (CL), sMVs, A33-Exos ja EpCAM-Exos). Aluksi, 20330356, 25388242, 22512338 ja 24096270 raaka lukee tuotettu. Sen jälkeen viimeistely huonolaatuisia lukee, adapteri sekvenssit ja lukee jossa pituudet olivat pienempiä kuin 18 nt (BGI in-house ohjelmistojen), mikä vastaa 18850584, 22762038, 16407260 ja 18195289 koko puhdas lukee saatiin. Me seuraavaksi kartoitettu kaikki puhtaita lukee miRBase (V.20) käsinkirjoittaa tunnettu miRNA kussakin kirjastossa. Tulokset osoittivat 15367876, 152815949, 12771308 ja 13611284 selityksin puhdas lukee vastaava CL, sMVs, A33-Exos, ja EpCAM-Exos, vastaavasti; puhdas lukee tunnistettu muita pieniä RNA-luokat (rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, srpRNA, toista liittyvän RNA: t, mRNA: n hajoamisen) ja annotoimaton RNA: t on esitetty taulukossa 1. prosenttiosuus miRNA, että kokonais-RNA eristettiin kustakin näytteestä vastasi 77,84, 74,81, 67,14 ja 81,52 ja A33-Exos, EpCAM-Exos, sMVs, ja CL, vastaavasti.

tarkastellaan seuraavaksi neljän LIM1863-soluista peräisin miRNA kirjastojen selvittää, miten monta 2578 tunnettu miRNA in miRBase v20 olivat havaittavissa. Ilman cut-off 891, 863, 770, ja 759 miRNA olivat edustettuina CL, sMVs, A33-Exos ja EpCAM-Exos, vastaavasti. Kuitenkin tässä tutkimuksessa, päätimme käyttää tiukemmat raja ( 5 TPM cut-off), jotta voimme keskittyä hyvin edustettuna miRNA. Tämä johti yhteensä 254 miRNA tarkempaa analysointia (taulukko S1), mukaan lukien hierarkkinen klusterointi ekspressiotasoja (kuva S1).

LIM1863 johdettuja EV sisältävät 254 erillistä miRNA

tarkastusta Taulukko S1 osoittaa, että 254 miRNA ovat edustettuina kaikissa neljässä kirjastoissa, joskin eriasteisesti rikastamiseen. On merkittävää, yli 75% näistä 254 miRNA ovat erittäin edustettuina kussakin kirjastossa ( 10 TPM) (kuvio 2A), ja näistä 20 miRNA että A33-Exos, EpCAM-Exos, sMVs ja CL kirjastojen edustaa 91,02%, 90,72%, 91,02%, ja 91,42% vastaavasta koko luettu miRNA. Mielenkiintoista, kolme parasta eniten edustettuina miRNA tunnistettu LIM1863 johdetut EV – miR-192-5p, miR-10a-5p, ja miR-191-5p – on raportoitu aikaisemmin kudoksessa ja seerumin CRC potilaiden mahdollisina diagnostisia biomarkkerit. Esimerkiksi, miR-192 on havaittu kudoksen [41] ja seerumin /plasman [42] CRC-potilailla, miR-191 kudoksessa [41], [43] ja seerumin /plasman [44], ja miR-10a kudos [45] ja seerumi /plasma [42] CRC: tä potilasta. Lisäksi miR-192 on raportoitu tukahduttaa etäpesäkkeiden CRC [46] ja sen synteesiä, yhdessä, että Mir-215 (myös erittäin edustettuna meidän 254 miRNA aineisto), indusoidaan p53 ja osoitettu olevan tärkeä sääntelyn rooli geenit osallistuvat TGF-β signalointireitin [47], [48].

(A) jakelu tunnetaan miRNA sekvenssien CL, sMVs, A33- ja EpCAM-Exos perustuvat normalisoidut ilmaisun arvoihin (selostukset per miljoonaa lukee, TPM). (B) Top 10 miRNA ryppäitä analyysiin 254 miRNA tunnistettu suhteessa niiden sijainti ihmisen viite genomin (hg19). (C) jakautuminen ryhmittyneet miRNA eri ihmisen kromosomeja. Klusteroitu miRNA (mukaan lukien miRNA numero) olivat eritellään niiden sijainnit kromosomissa, joka voi olla enintään 10 k bp kromosomissa; miRNA samasta esiaste (-5p, -3p) tarkasteltiin ainoastaan ​​kerran. (D) Kolmitie Venn-kaavio, joka kuvaa 63 miRNA rikastunut sMVs, A33- ja EpCAM-Exos suhteessa CL. 6 miRNA ovat yhteisiä kaikille EV, kun taas 22 miRNA ovat yhteisiä molemmille exosomal aineistoja. miRNA selektiivisesti rikastettu kussakin EV miRNA aineisto: A33-Exos 32/56, EpCAM-Exos 2/25, ja sMVs 4/13.

seuraavaksi suoritetaan yksityiskohtainen miRNA klusterin analyysi (ts tunnistaminen ryhmiä miRNA koodaamien polykistroninen selostukset, arvellaan koekspressoitu [49]) on 254 miRNA aineistot. Niistä 153 tunnetaan miRNA klusterit sijaitsevat 10 K emäsparin matkan ihmisen genomin 34 tunnistettiin. Useat näistä klusterit tilastollisesti rikastunut (kuvio 2B, taulukko S2). Mukaan

p

-arvot laskettiin Fisherin testiä viisi miRNA klusterit tunnistamiseen

klusterin 6

(6/6 jäsenistä tunnistaa; miR-17, -18a, -19a, -19b -1, -20a, ja -92a-1),

klusteri 4

(6/8 jäsenistä tunnistaa; miR-532, -188, -500a, -362, -501, -500b, -660, ja -502),

klusterin 16

(4/4, miR-941-1, -941-+2, -941-+3, ja 941-4),

klusterin 21

(3 /3 jäsentä tunnistaa; miR-200a /200b /429), ja

klusterin 28

(3/3 jäsenistä tunnistaa; miR-23a, -27a, ja 24-2). Näiden,

klusterin 6

miRNA (miR-17~92a perhe) on raportoitu olevan erittäin edustettuna useita kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien rinta-, keuhko-, paksusuoli-, eturauhas- ja vatsa [50]. Expression of

klusteri 4

miRNA säädellään E2F1 [50], voidaan suoraan kohdistaa BCL2 /11 /Bim tukahduttaa Myc-indusoidun B-solujen lymfooma genesis [51] ja säädellä useita geenejä, että TGF-β-reitin [ ,,,0],52]. Kromosomaalinen jakelu Näiden klustereiden (kuvio 2C) osoitti kromosomeja-X (8 klusterit), -1 (5 klusterit), ja -9 (3 klusterit) on merkittävin.

vieressä tutki edustus eri miRNA perheenjäsenten 254 miRNA aineisto (taulukko S3). Tämä analyysi paljasti näkyvyyttä kaikissa kolmessa EV jäseniä seuraavista perheiden: let-7 (12/12 jäsentä havaittu, let-7a /b /c /d /e /f /g /i, miR-98-5p) , miR-181 (6/6, miR-181-1 /a-2 /b-1 /b-2 /c /d), miR-30 (6/6, miR-30a /b /c-1 /c-2 /d /e), miR-320 (7/8, miR-320a /b-1 /b-2 /c-1 /c-2 /d-1 /d-2), miR-8 ( 5/5, miR-141, miR-200a /b /c ja miR-429), miR-17 (6/8, miR-106a /b, miR-17, miR-18a, miR-20a ja miR-93 ), miR-192 (2/2, miR-192 ja miR-215) ja miR-25 (3/4, mir-25 ja mir-92 a /b).

63 miRNA etusijassa rikastunut LIM1863 johdettuja EV

Sen arvioimiseksi, onko joitakin miRNA ovat erityisesti lajitellaan EV teimme miRNA-rikastus analyysi A33-Exos, EpCAM-Exos ja sMVs. MiRNA 2 kertamuutoksia suhteessa CL miRNA erotettiin suodattamalla, jolloin saatiin 63 miRNA vertailun (taulukko 2). MiRNA edustus oli merkittävintä puhdistetussa A33-Exos (56 miRNA edusti, joista 32 rikastuvat valikoivasti verrattuna muihin EV), jota seurasi EpCAM-Exos (25 miRNA, 2 valikoivasti rikastettu) ja sMVs (13 miRNA, 4 selektiivisesti rikastettu) (taulukko 2, kuvio 2D). On vain 6 miRNA sekvenssit yhteinen kaikille kolmelle EV alatyyppiä, joista kolme ”matkustaja lohkon” miRNA (miRNA * sekvenssit) (miR-451a, miR-4454, miR-7641, anna-7a-3p *, anna-7f-1 -3p * ja miR-574-5p *). Tähän mennessä vain miRNA-451a on aiemmin havaittu EV (kantasolujen johdettu EV, [53]). Merkitys kolme miRNA * sekvenssit ovat yhteisiä kaikille kolmelle EV alatyyppiä ei ole selvää tässä vaiheessa ja on odotettava analyysi tilastollisesti merkittävä määrä EV näytteiden johdettu muista CRC solulinjasta lähteistä. Kaiken rikastetun 63 miRNA aineisto vietämme 12 tiettyjen miRNA * sekvenssit, joista kolme (anna-7a-3p *, anna-7f-1-3p *, miR-574-5p *), ovat erittäin edustettuina kaikissa EV alapopulaatiot (taulukko 2).

vieressä tutki 63 miRNA aineisto (taulukko 2) onko olemassa mitään miRNA että käytössä erottelu eksosomeiksi (A33-Exos ja EpCAM-Exos) ja sMVs. Tämä analyysi paljasti 7 miRNA merkittävästi rikastettu eksosomeiksi (HSA-miR-320a 320b, -320c, -320d 221-3p, -374-5p ja -200c-3p), verrattuna sMVs. Silmiinpistävän, Mirs-320a /b, -221-3p ja -200c-3pc oli yli 1000 TPM kussakin eksosomi kirjastossa 1,18-2,28 log

2 suhde kertamuutoksia verrattuna vastaavien arvojen välillä 500-800 TPM ( -0,33-+1,88 log

2-kertaiseksi muutoksia) vuonna sMVs ja CL kirjastoissa. MiR-320a on sekaantunut CRC koska sen kyky tukahduttaa solujen lisääntymistä kohdistamalla β-kateniinin [54]. Ekspression miR-320a voidaan käyttää arvioimaan riskiä CRC etäpesäkkeiden, koska sen kyky sitoutua suoraan 3′-UTR neurophilin (NRP-1), co-reseptorin verisuonten epiteelisolujen kasvutekijä [55]. Läsnäolo miR-320a plasmassa on raportoitu mahdollisena biomarkkeri varhaiseen toteamiseen CRC [44]. miR-221-3p yhdessä miR-222, joka myös nähdä erittäin ilmaistaan ​​254 miRNA aineisto (taulukko S1), on validoitu kokeellisesti säätelemään solujen lisääntymistä kohdistamalla p27 /Kip1, solusyklikontrollin estäjä ja tuumorisuppressoriproteiinia, edistää tuumorigeneesiä [56], [57]. Mielenkiintoista, kohonneet miR-222, yhdessä miR-17-3p, -135b, -92 ja -95, on raportoitu CRC potilaiden plasman ja kasvainkudoksen [58]. miR-200c, joka yhdessä miR-141 on jäsenenä miR-141~200c klusteri (cluster 59, taulukko S2) sekä miR-8 perhe (taulukko S3) on suunnattu transkription repressori sinkki sormen E-box sitova homeobox 1/2 (ZEB1 /2) [59] ja SIP1 [60] on kriittinen induktori EMT useilla syövän tyypit, mukaan lukien peräsuolen [61]. Kiertävä miR-141 on mahdollinen biomarkkeri CRC etäpesäke [62].

keskeinen piirre 63 miRNA (TPM 5) rikastettu LIM1863 johdettuja EV (taulukko 2) oli havainto, että 38 oli yksinomaan edustettuina

yksi

tai

muut

kolmen EV kirjastot suhteessa CL kirjastoon. Päällimmäisenä, oli havainto, että 32/38 tunnistettu miRNA olivat yksinomaan A33-Exos. Näistä Mirs-19a-3p, -19b-3p, MIR-378 perhe (MIRS-378a-3p, -378c ja -378d), -107 ja miR-320a /b hallitsevia.