Krooninen sairaus

tiivistelmä

CDKN2A

(koodaa p16

INK4a ja p14

ARF) poisto, joka johtaa sekä Rb ja p53 inaktivaation, on yleisin kromosomiepämuodostuma ihmisen syövissä. Tarkasti kartta poiston raja-arvot on tärkeää ymmärtäminen molekyyli- mekanismi genomista uudelleenjärjestely ja ne voivat myös olla hyödyllisiä kliinisiä sovelluksia. Kuitenkin nykyiset menetelmät määrittämiseksi murtuessa ovat joko alhaisen resoluution tai vaatia eristäminen suhteellisen puhdasta syöpäsoluissa, mikä voi olla vaikeaa kliiniset näytteet, jotka on tyypillisesti kontaminoitunut eri määriä normaalien isäntäsoluissa. Voit voittaa tämän esteen, olemme kehittäneet uuden lähestymistavan, nimetty Primer lähentäminen Multiplex PCR (PAMP), rikastamiseksi breakpoint sekvenssit seuraa genomista laatoitus array hybridisaatio paikantaa raja-arvot. Sarjassa proof-of-concept kokeiluja, pystyimme tunnistamaan syövän johdettuja

CDKN2A

genomista breakpoints kun yli 99,9% villityypin genomin oli läsnä malli järjestelmässä. Tämä muotoilu voidaan skaalata ylös bioinformatiikan tukea ja voidaan vahvistaa muita ehdokas syöpään liittyvän lokuksen että havaittujen muita systeemisiä mutta pienempi tekirjastoja.

Citation: Liu YT, Carson DA (2007) Novel toimintamalli määritetään Cancer Perimän Herkkyysrajat läsnäolossa Normaali DNA. PLoS ONE 2 (4): E380. doi: 10,1371 /journal.pone.0000380

Academic Editor: David Levens, National Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 helmikuu 2007; Hyväksytty: 27 maaliskuu 2007; Julkaistu: 18 huhtikuu 2007

Copyright © 2007 Liu, Carson. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukevat osittain apurahoja UCSD NanoTumor Center of Excellence for Cancer Nanotechnology (CA119335), CA23100 (DAC) ja AI36214-12S1 (YT L.) National Institutes of Health.

Kilpailevat edut: Tällä kirjoittajat (Y.-TL DAC) ovat esittäneet väliaikaisen patenttihakemuksen tämän tutkimuksen perusteella.

Johdanto

Kasvaimet kehittyvät läpi jatkuvan keskittymisen ja valinta satunnaisesti mutatoitujen geenien. Vaikka sarjaa edullisia mutaatiot valitaan kasvaimissa, neutraaleja tai jopa hieman haitallisia mutaatioita saattaa myös johtua genomin epästabiilisuuden ja geneettinen ajautuminen. Viime aikoina paljon vaivaa on nähty tunnistamaan primaarisissa ihmisen syövissä pistemutaatioiden eksoneissa syöpään liittyvien geenien. Kuitenkin systeeminen kartoitus genomista DNA uudelleenjärjestelyjä on jäljessä, teknisten vaikeuksien vuoksi havaitsemaan pienempiä deleetioita, kasvain heterogeenisyys, ja tarve puhdistaa pahanlaatuiset normaaleista soluista [1]. Historiallisesti tällainen työ tehtiin aikaa vievää ja työvoimavaltaista genetiikan ja molekyylitason kloonaus vakiintuneisiin syöpäsolulinjoissa [2], [3], [4]. Yksi parhaita esimerkkejä on homotsygoottinen poisto

CDKN2A

(

INK4a /ARF

) tuumorisuppressoriproteiinia lokuksen, joka löydettiin tämän ja muiden laboratorioiden [3], [4], [5], [6], [7], [8].

CDKN2A

poistot esiintyä varhaisessa vaiheessa kasvainten kehittymiseen [9], [10], [11]. P16

INK4a (yksi

CDKN2A

tuotteita [12]) proteiini rajoittaa solusyklin etenemisen mukaan Rb-reitti, ja ne voivat olla vastuussa laskun replikoituvan potentiaalin kantasolujen ikääntymisen aikana [13] . P14

ARF (toinen vaihtoehtoinen lukukehystä

CDKN2A

[14]) geenituote säätelee ilmentymistä MDM2 liikevaihto p53, ja siten ohjaa soluvastetta stressille (tarkistetaan [6 ], [7], [8], [15], [16], [17]). Koska Rb ja p53 reitit ovat keskeisiä syöpää salpaavan ja Vartiointiyrityksistä [18], [19], vahva valinta paineita olemassa häiriöitä koko

CDKN2A

geenisegmenttiin molemmissa kromosomeissa. Harvat muut poistot samoin ominaista, vaikka on odotettavissa, että enemmän löytyy kun enempää dataa array perustuu vertaileva genominen hybridisaatio (array-CGH) raportoidaan sekä myös Cancer Genome Atlas (TCGA) hanke [20], [21 ], [22], [23], [24]. On tärkeää vahvistaa merkitystä näiden genomisten uudelleenjärjestelyjä syövän kehitystä, sillä monet genomisen rakenteelliset muutokset voivat olla yksinkertaisesti johtuu genomiin epävakautta syöpä. Laajamittaiset tutkimukset kliinisissä näytteissä on luotettavin vahvistuksen.

Vaikka pistemutaatioita ja hyvin pieniä lisäyksiä tai deleetioita genomista DNA voidaan havaita eksoni uudelleenjärjestely-, se voi olla vaikeampaa havaita geeni annostus muutokset suurempien genomisten fragmenttien, erityisesti poistot [1]. Nykyinen perustettu tekniikat poistamista kartoitusta, kuten Southern blotting [25], loisteputki

in situ

-hybridisaatio (FISH) [26], kvantitatiivinen PCR [26], [27], [28], [29], [ ,,,0],30], ja array-CGH [31] perustuvat puuttuminen havaittavan villityypin signaali [1]. Tämä on ongelmallista silloin, kun merkittävä määrä normaaleja soluja on läsnä kasvaimen näytteestä. Array-CGH on mahdollisuudet analysoida muutoksia DNA kappalemäärinä genomin laajuisesti suhteellisen korkea resoluutio, riippuen siitä BAC: ien PCR-tuotteet tai oligonukleotideja käytetään array elementtejä. Kuitenkin, nämä tekniikat eivät useinkaan jossa on heterogeeninen solupopulaatio tai näytteitä huonolaatuista [31]. FISH on vähemmän altis läsnäolo heterogeeninen solupopulaatioiden, mutta on suhteellisen alhainen resoluutio ja on vaikea skaalata ylöspäin. Paitsi FISH, muut mainitut tekniikat eivät ole käytännöllisiä kartoittamisen genomista translokaatioita ja käännellen. End-sekvensointi profilointi on kehitetty tätä asiaa, mutta lähestymistapa oli kallista ja vaikeaa skaalata [32]. Siksi on tarpeen kehittää skaalautuva lähestymistapa havaitsemiseksi tällaisesta genomisesta rakenteellisia muutoksia kiinteiden kasvainten jossa heterogeeninen solupopulaatioiden ovat läsnä.

Kirjoittajat raportoivat uusi lähestymistapa, joka on nimetty Primer lähentäminen Multiplex PCR (PAMP), rikastuttaa pieniä määriä poistetaan genomisia DNA-sekvenssejä on läsnä villityypin DNA: ta. Genominen sijainnit rikastetun sekvenssit myöhemmin dekoodataan genomista laatoitus array ja varmistettiin sekvensoimalla.

Tulokset

CDKN2A

locus

CDKN2A

sijaitsee kromosomissa 9p21 (kuvio 1). Se koodaa kahta proteiinia eri lukukehykset: p16

INK4a ja p14

ARF, joilla molemmilla on 3 eksonia ja jaa eksonit 2 ja 3.

CDKN2B

(p15

INK4B) ja

MTAP

(metyylitioadenosiinifosforylaasi) (ei esitetty) ovat sentromeerisen ja telomeerisesti viereisen geenien vastaavasti [3], [17], [33], [34]. BAC klooni RP11-149I2 sisältää koko

CDKN2A

genomifragmenttiin ja sitä käytettiin templaattina koettimien (pois lukien toistuvat alueet) tulostukseen minigenomisen laatoitus array. Taajuus toistuvat sekvenssit ennustaa RepeatMasker on esitetty alaosassa kuvassa.

genominen kartta kattaa noin 55 kb noin

CDKN2A

mukainen Ensemble [59].

CDKN2A

/B sijaitsee kromosomissa 9p21 ja niiden RNA-tuotteet koodaavat käänteinen lohkon.

CDKN2A

koodaa 2-proteiinien (p16

INK4a ja p14

ARF), jotka jakavat saman eksonit 2 ja 3. Ensimmäinen eksonien

INK4a

ja

ARF

noin 20 kb toisistaan.

CDKN2B

koodaa p15

INK4B joka on homologinen p16

INK4a. Lisäksi selostukset, kartta näyttää myös toistuvat sekvenssit (Repeat) ja käytettävissä BAC klooni (Human tilepath kloonit), RP11-149I2.

Primer lähentäminen Multiplex PCR (PAMP) B

se on vaikea havaita pieni osa poistetaan mutantti genomisen DNA: n läsnä ollessa suuri ylimäärä villityypin DNA array CGH tai muita suosittuja molekyylibiologian välineet [26], [27], [35]. Vuonna tyypillisesti saastunut kasvain näytteet, genomista DNA koostuu eri suhteissa WT ja

CDKN2A

puutteellinen DNA. Pyrittiin hyödyntämään sitä, että lyhyempi poistettu genomin tulisi edullisesti monistettiin verrattuna paljon pidempi WT-sekvenssi käyttäen ”approksimoida” reunustavat alukkeet (kuvio 2A) [36].

tehokkuus PCR-monistus on kääntäen verrannollinen etäisyyden tuotantoketjun alukkeita. Tässä esimerkissä monistamaan geenisekvenssejä ympäri uran edun (LOI) on jaettu 20 ryhmään: 10 kukin eteenpäin (F1-F10) ja reverse (R1-R10) ryhmät (A). Vaikka kaikki mahdolliset eteen ja taakse alukepareja ovat liian kaukana toisistaan ​​PCR-monistamiseen villin tyypin perimän, tietyt alukeparia, tuodaan lähemmäksi ( ”arviolta”) takia poisto (F3 ja R3) on mutatoitunut genomissa. Multiplex PCR-reaktiot asetetaan ja edustettuina matriisi sisältää yhden eteenpäin ja yhden käänteisen alukkeen ryhmää. Odotetut PCR Tulokset näkyvät harmaasävy varjot matriisissa (B). Tämä esimerkki osoittaa, että ainoa ryhmä paria lähellä raja-arvot, jolloin saatiin PCR-tuotteiden (F3-R3, F3-R4, F4-R3).

lähestymistapa on esitetty kuviossa 2. Tässä esimerkissä suhteellisen tasainen -spaced alukkeita (keskimäärin 1 kb välein) ympäröivän uran edun jaetaan 20 ryhmään PCR. On 10, jotka kukin eteenpäin-alukkeita, F1, F2 …, F10 ja reverse-aluketta R1, R2, …, R10, vastaavasti (kuvio 2A). Näin ollen, on olemassa 100 paria (F1-R1, F1-R2, …, F1-R10; F2-R1, F2-R2, …, F2-R10, …, F10-R1, F10-R2, …., F10- R10) PCR-reaktiot (kuvio 2B). On odotettavissa, että vain yksi tai kaksi paria PCR-reaktiot tuottavat erityisiä PCR-tuotteita, jotka kattavat poistetaan rajan, koska muut alukeparia tulisi olla liian kaukana murtuessa tehokkaan monistuksen. Sitten erät kustakin reaktiosta voidaan sekoittaa hybridisoitumaan yhteen genominen laatoitus array. Toisin kuin perinteiset array-CGH, ​​on odotettavissa, että vain täplät edustavat geenisekvenssejä lähellä raja-arvot otetaan teoreettisesti palaa, joka vahvistettiin seuraavissa kokeissa.

Jotta lisätä läpäisyä ja vähentää kustannuksia reagenssien jokainen eteenpäin (F1-10) ja reverse (R1-10) pohjamaali ryhmä voi olla useita alukkeita. Siksi jokainen PCR ryhmä (esimerkiksi F1-R1) pari tulee multiplex-PCR. Siksi meidän on nimetty tätä menettelyä Primer lähentäminen Multiplex PCR (PAMP).

Poisto breakpoint kloonaus PAMP ja minigenomisen laatoitus array

raportoitu aikaisemmin, että Detroit 562 solulinja on noin 20 kb (mukaan lukien

INK4a

eksonit 1 ja 2) poisto kromosomissa 9p21 [3]. Käytimme tätä solulinjaa testata poisto skannaus lähestymistapaa. Neljä ryhmää (F

A, F

B, R

Y ja R

Z) alukkeita käytettiin neljää PAMP reaktiot (kuvio 3A) käyttämällä genomista DNA templaattina joko Detroit 562 (

CDKN2A

puutteellista) tai HEK293 (

CDKN2A

villityypin) solulinjat. Alikvootit kaikista 4 PAMP reaktiotuotteet yhdistettiin ja merkitään hybridisaatio koskevasta

INK4a

minigenomisen laatoitus array, joka kattaa noin 25 kb, mukaan lukien kaikki eksonia

INK4a

. Kuten on ennustettu kuviossa 2, vain täplien koettimina lähellä raja-arvot hybridisoitui amplikonien kun Detroit 562 genomista DNA: ta käytettiin templaattina (kuvio 3B). Lähes mitään signaalia ei havaittu, kun HEK293-genomista DNA: ta käytettiin templaattina. Ohjaus HEK293 näyte oli merkittävästi korkeampi signaalin Cot-1 DNA täplät huolimatta yleinen absoluuttinen signaalin intensiteettiä on alhainen.

(A) Viisi ryhmää Alukkeiden (F

A, F

B, R

x, R

Y ja R

Z, pienet nuolet ja nuoli päätä) lähellä potentiaalia raja-arvot olivat tuotettu PAMP perustuvat aiempien kartoitus [3]. Kartoitettu

CDKN2A

keskeytyskohdat Detroit 562 solulinjassa (kuva 5) on merkitty selvennystä. ”E1”, ”E2” ja ”E3” nimitykset (sininen fontit) ovat suhteelliset asemat

INK4a

eksonit. Ensimmäinen eksonia

ARF

on edelleen oikea tämän kaavion eikä kuulu tämän array. Laatoitus koettimia array on merkitty kaksi vuorottelevat värit (lyhyt musta ja oranssi riviä) tunnistuksen helpottamiseksi. (B) ensimmäinen rivi

INK4a

minigenomisen array bongattiin kanssa laatoitus koettimet esitetty paneelissa A. Cot-1 DNA (toistuva sekvenssi genomista DNA) täplät on merkitty tähän array. Loput täplät ovat sillin sperman DNA: ta. Sekä Cot-1 ja sillin sperman DNA: ta epäspesifinen valvontaa. Tämä joukko hybridisoitiin leimatun näytteitä peräisin kahdesta solulinjoista. Samaa sarjaa alukkeita (F

A, F

B, R

Y ja R

Z) käytettiin PAMP reaktioita Detroit 562 (mutantti) ja HEK293 (villityypin) genomista DNA: kartoittamaan mahdollisia

CDKN2A

breakpoints. Amplikoneista leimattiin eri väreillä, jolloin saatiin vihreä signaali (Cy-3) ja mutantti näytteen ja punainen merkkivalo (Cy-5) villityyppisen näyte, voidaan samanaikaisesti hybridisoitiin array (kaksivärinen array). Kaksi vihreitä pisteitä ensimmäisellä rivillä paljasti murtuessa paikkaan käsitelty kuviossa 2.

Lisäksi neljä erillistä paneelit käytettiin hybridisoitumaan yksittäisten PAMP edellä kuvatut. Yksinkertainen juoni signaalin voimakkuuden suhde mutantti /WT PCR tuotteita laatoitus array paljasti genominen sijainti breakpoint (kuva 4). Tämä analyysi osoittaa hyvin suoraviivainen lukema-sijainnin poisto rajautuu kaksi piikkiä. Vain F

B-R

Y (array 27) ja kaikki tuotteet yhdistämällä (array 29) tuottaa saman tuloksen kuin kuviossa 3. Sen sijaan muut kolme paria tuotti vain heikko tausta signaalien paneelit. Tämä tulos osoittaa, että PAMP tuote yhdistämällä yhdellä erilaisia ​​analyysi antaa saman murtuessa tiedot kuin neljää eri paneelit. Tulokset tukevat alkuperäistä kokeellisia ennusteita, ja viittaavat siihen, että menettely olisi yleisesti sovellettavissa poistettavaksi ja translokaatio skannaus.

Neljä ryhmää (F

A, F

B, R

Y ja R

Z) alukkeita käytettiin neljää PAMP reaktioita kunkin parikytkemällä kaikki mahdolliset eteen ja käänteisaluketta ryhmät käyttävät Detroit 562 (mutantti) ja HEK293 (valvonta) templaatteina. Menettely on lyhyesti kuvattu kuvassa 3. tuotteet leimattiin ja käytettiin array hybridisaatio: F

A-R

Y array 25; F

A-R

Z array 26; F

BR

Y array 27 ja F

AR

Z array 28. määräosat yksittäisten PAMP näytteet myös yhdistettiin ja merkitään array hybridisaation (array 29, on lukuisia kuva näytetään kuviossa 3B). Tulokset esitetään suhde signaalin voimakkuus (Y-akseli) näytteiden Detroit 562 (mutantti) ja HEK293 (valvonta) vastaan ​​anturin sijainti (X-akseli). Raja-arvot voidaan tunnistaa tontille löytää kahden huipun, jotka ovat analogisia kirkkaan vihreitä pisteitä kuviossa 3B.

Jotta paikantaa tarkemmin alueen poisto, sisäkkäisiä PCR paria spesifisiä alukkeita suunniteltiin mukaisesti aikaisemman PAMP tuloksia. PCR-tuote leimattiin array hybridisaatio, jolloin saatiin tuloksena hyvin samanlainen kuin kuviossa 4, ja on esitetty kuviossa 5A. Lisäksi yksi päätuote PCR-reaktioiden erotettiin agaroosigeelielektroforeesilla, leikattiin, uutettiin ja sekvensoitiin (kuvio 5B). Murtuessa kloonattu hyväksyy kahden muun raportit (kuvio 5B) [37], [38].

kartta tarkka keskeytyskohdan, sisäkkäinen PCR-alukkeet suunniteltiin varten Uniplex PCR perustuu edellisen PAMP tulokset (kuviot 3 ja 4). PCR-tuotteet, joita käytetään merkintää ja hybridisoitiin array ja myös agaroosigeelielektroforeesilla. Array data näytetään samalle tontille kuviossa 4. Yksi tärkeä vyöhykkeen agaroosigeelissä leikattiin irti ja puhdistettiin sekvensointia (B). Keskeytyskohta näytetään (välillä # 21975226 to # 21960809 mukaan NCBI ihmisen genomin rakentaa 36).

Voit jäljitellä heterogeeninen populaatio syövän ja isäntäsolujen tavataan tyypillisesti kiinteitä kasvaimia, eri määriä genomista DNA johdettu Detroit 562 (mutantti) ja HEK293 (villityypin) sekoitettiin PAMP ja array hybridisaatio. Jotta herkkyyden testaamiseksi lähestymistapamme, teimme titraus kokeessa. Yhteenlaskettu genomista DNA kutakin määritystä varten pidettiin vakiona (100 ng). Tämä vastaa noin 28000 kappaletta haploidisia genomin (perustuu arvioon 2,8 × 10

5 molekyyliä /ug haploidisia genomin).

CDKN2A

poistetaan solulinja Detroit 562 sarjalaimennettiin

CDKN2A

villityypin HEK293, kuten on esitetty taulukossa 1. määritys kykeni havaitsemaan noin 1 keskeytyskohta sekvenssin läsnä ollessa noin 2000-kertainen ylimäärä villin tyypin perimän kanssa herkkyyttä 5-16 tällaisia ​​molekyylejä (taulukko 1). Siten PAMP lähestymistapa tarjoaa menetelmän havaita genomisen DNA: n deleetioita, kun läsnä on enemmän kuin 99,9% villityypin DNA.

PAMP keskeytyskohta kloonausstrategia vahvistettiin toisessa solulinjassa. Koska meidän array kattaa vain 25 kb genomista, me skannattu meidän edellinen kartoitus tietoja 100 solulinjoissa löytää joka voisi olla raja-arvot tämän alueen [3], [33]. Hs578T rintasyöpä solulinjassa on deleetio p16

INK4a eksonit 1-3. Alukkeilla sisällä ja telomeerisesti (F

A ja R

X-ryhmää, taulukko 2), joka genomipalasen teimme PAMP ja array hybridisaatio, ja tunnistettiin yksi täplä array (esitetty yhtenä piikkinä kuvassa 6A). Sekvenssi Tämän anturi on 69971-71219 vuonna RP11-149I2 BAC-sekvenssi (GenBank AL449423). Siksi sentromeerisesti pää murtuessa tulisi sijaita lähellä tätä aluetta. Uniplex PCR: llä alukkeilla päässä kaksi ryhmää PAMP suoritettiin sekvensointi. PCR-tuote noin 2 kb: n tuottamista alukkeiden parin ja tehtiin suoralla sekvensoinnilla (kuvio 6B). Sentromeerisen pää breakpoint tunnistaa PAMP on yhdenmukainen aiemman raportin [37]. Telomeerisiä pää breakpoint oli päätellyt alukkeista käytetään PAMP ja vahvistivat myös suoralla sekvensoinnilla, vaikka ei ollut genomista koetin lähelle murtuessa joka sisältyi jono.

Kaksi ryhmää alukkeita: F

A (F

A1-F

A4) ja R

X (R

X1-R

X5) käytettiin PAMP perustuu aiempiin kartoitus. Tuote merkitty array hybridisaatio (A). Vain yksi piikki on ilmeistä juoni. Se ilmaisee sijainnin muiden keskeytyskohtaan eivät kuulu tämän minigenomisen array. Kahta aluketta (R

X3 ja R

X4) lähellä genominen sijainti anturin (ihmisen kromosomin 9, 21969229-21970477, NCBI rakentaa 36), joka hybridisoitiin ja kaksi aluketta (F

A1 ja F

A2) ulkopuolella jono kattavuus valittiin Uniplex PCR. F

A2-R

X3 pari odotetaan lyhimmän kun poisto tapahtuu. Nauha on noin 2 kb agaroosigeelillä, leikattiin irti geelistä, puhdistettiin ja sekvensoitiin (B). Katkaisupisteen ja sijainti näytetään (välillä # 21955827 to # 21968338 mukaan NCBI ihmisen genomin rakentaa 36).

Keskustelu

Olemme kehittäneet yleinen strategia, joka voi sovellettava paikantamisessa genomiseen keskeytyskohtia puhdistamattoman primaarisyöpien. Vahvistuksen ja laatoitus protokolla Tässä kuvatut mahdollistaa yksinkertaisen ja tarkan

CDKN2A

murtuessa kloonaus, käyttäen saastunutta DNA: ta templaattina. Toisin kuin nykyinen käytettävissä olevan tekniikan poistettaviksi kartoitus (mukaan lukien Southern blotting, loisteputki

in situ

-hybridisaatio, reaaliaikainen PCR, ja array CGH), jotka tukeutuvat puuttuminen havaittavan villityypin signaali, PAMP suoraan mittaa Poistetaan DNA. Näin ollen tämä lähestymistapa on paljon vähemmän altis ongelmia, jotka liittyvät normaalin solun kontaminaation. Koemenettely on riittävän vahva havaita deleetioita, kun läsnä on vähintään 99,9%: villityypin sekvenssi saastuminen, jota ei voida saavuttaa muilla menettelyillä, [3], [5], [26], [27], [28], [33], [35], [39].

Primer lähentäminen PCR seulonta on ollut hyödyllinen työkalu eristämiseksi häviämämutantteja in

C. elegans

[36]. Menetelmä perustuu tunnistetaan yksi vyöhyke, joka on tuote onnistuneen PCR-reaktion, kun pari spesifisiä alukkeita on tuonut yhteen deleetiolla, agaroosigeelillä. Menettely voi vain tunnistaa poistot joka tapahtuu hyvin pieni genomifragmenttiin (3 kb) suhteellisen alhainen suoritusteho muoti. Se kärsii myös suhteellisen suuren määrän vääriä positiivisia, koska henkilöllisyys bändejä agaroosigeelillä on vaikea tietää. Kuitenkin soveltamalla multiplex PCR yhdessä genomisen laatoitus array, voidaan samanaikaisesti seuloa useampia genomi- alueiden [40]. Lisäksi edullinen monistuminen sekvenssien lähellä raja-arvot tuottaa suhteellisen yksinkertainen lukema on laatoitus array. Signaali-kohina-suhde on hybridisoitunut paikkoja on ilmeinen verrattuna lukeman alkaen array CGH (katso kuvio 4). Risteyksestä voidaan tunnistaa helposti niin kauan kuin toinen pää lähellä genomisen sijainnin raja-arvot kuuluu laatoitus array, kuten on esitetty tapauksessa Hs578T rintasyöpä solujen (kuvio 6). Koska high-density genomista laatoitus paneelit ovat kaupallisesti saatavilla, tämä lähestymistapa voidaan helposti hyväksytään. Lisäksi suuren suoritustehon Genomikartoituksen teknologia voi myös paikantaa tarkka murtuessa sekvenssin jälkeen PAMP ohittaen tarve array hybridisaatio [41], [42], [43].

käytetään multiplex PCR vähentämään työmäärä ja kustannukset PAMP. Pystyimme multiplex 28 alukkeiden helposti yhdessä PCR-reaktiossa. Teoreettisesti voidaan kattaa yli 90% 0,5 Mb genomifragmentin noin

CDKN2A

lokuksessa, joissa on yhteensä 500 alukkeiden yhteen PCR-reaktiossa kautta laskennallisen simuloinnin, jotka kuvataan toisaalla (käsikirjoitus toimitettu). Tuore paperi raportoitu onnistunut multiplex PCR yli 1000 alukepareilla tuen avulla laskennallisen suunnittelu [44]. PAMP lähestymistapa kohdistuu poisto koot välillä 10 kb ja 1 Mb. Pienempi tai suurempi poistot voidaan havaita uudelleensekvensointipuskurista ja FISH vastaavasti.

Kuten muutkin PCR tekniikoita, PAMP voidaan helposti hyväksytään jotta robotti järjestelmän kliinisen ja tutkimustarkoituksiin. Eräs esimerkki mahdollisesta kliininen sovellus on käyttää ainutlaatuista keskeytyskohdan sekvenssin henkilökohtaisen syöpäspesifisessä biomarkkereiden tautien seurantaan hoidon jälkeen, kun tarkka murtuessa on kartoitettu. Esimerkiksi, toisin kuin monet nykyiset kasvainmerkkiaineet, kuten CA19-9, CA125 ja PSA, jotka eivät ole todella syöpä-spesifinen,

CDKN2A

raja-arvot ovat erityisiä ja ainutlaatuisia kullekin syövän tämän lokuksen poistettu. Hyvin herkkä menetelmä, kuten reaaliaikaisia ​​PCR, voidaan suunnitella tarkkailla syövän etenemisen veressä tai muiden kehon nesteiden. Määritys olisi hyvin erityinen, koska vahvistusta odotetaan esiintyvän vain poisto-DNA: ta sisältäviä johtuen erittäin pitkä välimatka alukkeiden villityypin genomin (katso kuva 2). Tämä on analoginen havaitseminen ulkomaisen viruksen sekvenssi, jota on sovellettu hyödyllisenä biomarkkeri Epstein-Barrin virus liittyy nenänielusyöpä [45], [46].

lähestymistapa voi myös helpottaa perinteisiä labor- intensiivinen kokeissa, joiden tavoitteena on ymmärtää, miten genomista herkkyysrajoja syntyvää syövän kehitystä, erityisesti ensisijainen kasvaimia. Vaikka laittoman V (D) J rekombinaatio voi olla vastuussa luoda

CDKN2A

deleetioita akuutti lymfaattinen leukemia, lisää keskeytyskohta sekvenssi tietoja tarvitaan muiden syöpien rajaamiseksi molekyylitason mekanismeja [37], [38] , [47], [48]. Lisäksi tekniikka on kuvattu tässä asiakirjassa voidaan käyttää paitsi poistamista kartoitus, mutta sitä voidaan myös soveltaa kartta muun tyyppisiä genomisen uudelleenjärjestelyä, kuten translokaatiot ja käännellen. Samanlainen tapaus genomisen deleetion (katso kuvio 2), vain ”arviolta” alukkeita voidaan tuottaa amplikoneja, kun nämä alukkeet ovat lähellä genomisia fragmentteja, jotka sijoitetaan uudelleen translokaatioita ja inversiot.

käyttäminen keskeytyskohta sekvenssit, kuten syövän-specific biomarkkerit seurata minimaalinen jäljellä tauteja on tutkittu [49], [50], [51], [52], [53]. Tautien seuranta perustuu henkilökohtaisen genomista DNA breakpoint katsotaan olevan erittäin houkutteleva lähestymistapa useista syistä [49]. Ensinnäkin monet genomista DNA uudelleenjärjestelyjä liittyvät suoraan kasvaimia prosessissa siksi, ovat todella syövän erityinen ja ajan kuluessa vakaita. Tämä on päinvastoin kuin helpompaa Ig /TCR uudelleenjärjestelyä määrityksessä. Itse asiassa huomasimme täsmälleen sama

CDKN2A

raja-arvot kahden solulinjojen käytetään tässä tutkimuksessa raportoitiin muut. Toinen DNA on vakaampi kuin RNA, vaikka se on helpompi kartta fuusio transkriptin, jos se on olemassa, kuten

BCR-ABL

. Kolmanneksi genominen keskeytyskohdat ovat hyvin todennäköisesti erilainen kullekin potilaalle ja tulla henkilökohtainen biomarkkereiden siten, vähentää väärien positiivisten tulosten takia ristikontaminaation. Tämä on kuitenkin myös suurin este voittaa. Esimerkiksi monet pyrkimyksiä parantaa PCR-monistusta alue havaitsemiseksi

C-MYC Twitter /immunoglobuliini toiselle siirtäminen on ollut rajoitettu menestys, koska raja-arvot ovat hajallaan yli 300 kb alueella [54], [55], [ ,,,0],56]. Strategiamme voi olla hyödyllinen tällainen sovellus.

lähestymistapa pyrkii tunnistamaan breakpoints sisällä 1 Mb genomista fragmenttia kaloja tai muita sytogeneettistä tekniikoita on saatavilla suurempia genomista uudelleenjärjestelyjä sekä kustannusten ja työvoiman merkittävästi kasvaa, kun kohdealueen laajenee. Pystymme edullisesti tuottamaan laatoitus array kattaa genomifragmenttiin 0,5 Mb ympärillä

CDKN2A

1 kb resoluutio. Olemme parhaillaan menetelmiä lisätä multiplexing ja supistaa kunkin PAMP reaktion laajemman sovelluksia.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja näytteenvalmistus

solulinjat kuvattu paperi saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), ja viljeltiin, kuten suositellaan. Perimän DNA uutettiin DNAzol (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH) seuraten valmistajan ohjeita.

minigenomisen laatoitus array

Loimme

INK4a

minigenomisen laatoitus array kattaa 25 kb fragmentti

CDKN2A

lokus todistamiseksi käsite lähestymistapamme. DNA koettimet muodostettiin PCR: llä BAC klooni RP11-149I2 (saatu BacPac Resources Centerin lastensairaalassa Oakland Research Institute, Oakland, CA) templaattina ja välttämällä toistuvia genomiset sekvenssit, jotka ennustivat RepeatMasker. PCR-tuotteet puhdistettiin DNA Clean-up ja Keskitin-5 (Zymo Research, Orange, CA), resuspendoitiin 3 x SSC ja painettu poly-L-lysiiniä dioja 0,1 mg /ml yhdessä Human Cot-1 DNA ( Invitrogen, Carlsbad, CA), joka on rikastettu toistuvat sekvenssit, ja sillin sperman DNA: ta (Promega, Madison, WI), joka käytettiin epäspesifinen kontrolli. Tulostustavasta on kuvattu ja olennaisesti seurasi käsikirjasta DeRisi ryhmittäjällä piillä microcontact tulostus nastat (Parallel Synthesis Technologies, Inc. Santa Clara, CA) [57], [58]. Arrays oli jälkikäsitelty meripihkahappoanhydridilla perustuva menetelmä estää ennen hybridisaatiota, kuten aikaisemmin on kuvattu [57]. Liittyvistä protokollista array tulostus ja hybridisaatio tässä asiakirjassa yleensä löytyy microarrays.org (https://derisilab.ucsf.edu/microarray/protocols.html).

Primer-lähentäminen Multiplex PCR (PAMP ) ja array hybridisaatio

yksinkertaistettu PAMP järjestelmä on esitetty kuviossa 2. sarja alukkeita (taulukko 2) kohti

INK4a

eksonit 1-2 pitkin

CDKN2A

lokuksen syntetisoitiin Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Ryhmät forward- ja reverse-alukkeita (250 nM kutakin lopullisessa reaktio) käytettiin tuottamaan amplikoneihin 0,1 ug genomista DNA: ta malleja yhteensä 10 ui liuosta sekoittamalla 10 ui Taq 2 x Master Mix (New England Biolabs, ipswich, MA). Reaktio koottiin 4 ° C: ssa PCR-työasema ja siirretään thermocycler lohkoon esikuumennettu 94 ° C: ssa. Pyöräily olosuhteet olivat 3 minuutin denaturaatiovaiheen 94 ° C: ssa seurasi 35 sykliä 92 ° C 30 s, 55 ° C 30 sekuntia ja 68 ° C: ssa 2,5 minuuttia lopuksi jatkamisvaihe 68 ° C: ssa 5 minuutit. Yksi ui puhdistamatonta tuotetta käytettiin myöhemmin malleja toisen kierroksen vahvistus merkitä amplikoneista samalla PCR, paitsi että dTTP korvattiin 04:01 seoksella aminoallyl dUTP (Ambion, Austin, TX) ja dTTP anturin merkitsemistä . Leimatut amplikonit puhdistettiin DNA Clean-up ja keskitin-5 saraketta, eluoitui 9 ui natriumbikarbonaattia (pH 9,0) ja yhdistettynä 1 ui DMSO liuenneen Cy3 tai Cy5 NHS esterit (GE Healthcare, Piscataway, NJ) 30 60 minuuttia. Cy3 ja Cy5 merkitty amplikonien puhdistettiin DNA Clean-up ja keskitin-5 saraketta ja eluoitiin 10 ui 10 mM Tris-HCI (pH 8,0). Pariksi Cy3 ja Cy5-leimattua amplikonien yhdistettiin 3,6 ui 20 x SSC, 0,5 ui Hepes (pH 7,0) ja lopuksi 0,5 ui 10% SDS. Sekoitettua liuosta kuumennettiin 2 minuuttia 95 ° C: ssa, jäähdytettiin huoneen lämpötilaan ja hybridisoidaan minigenomisen laatoitus paneelit 63 ° C: ssa yön yli oleellisesti, kuten aikaisemmin on kuvattu [57], [58]. Hybridisoitunut taulukot pestiin ja skannattiin GenePix 4000B skanneri (Molecular Device, Sunnyvale, CA) ja analysoitiin GenePix Pro 6.0-ohjelmisto.

Laatoitus array data-analyysi

Ihmisen Cot-1 DNA ja sillin sperman DNA: ta oli tarkoitus olla positiivinen ja negatiivinen kontrolli vastaavasti ja täplikäs useita kertoja array (katso kuva 3). Normalisoimaan day-to-day ja näytteen ja näytteen vaihtelu, mediaani intensiteetti kaikki ominaisuudet, jotka edustavat sillin sperman DNA: ta (

I

50% -HS

) käytettiin jakaa intensiteettiä (

I

G

) kunkin ominaisuuden edustaa genomista antureista. Jokainen (

I

G

): (

I

50% -HS

) suhde, normalisoitu genominen koetin signaali, piirrettiin klo Y-akselilla ja niitä vastaavat luotaimen genomista sijainti X-akselilla helpottaa tietojen tulkinta (katso kuva 4).

CDKN2A

murtuessa kloonaus

vahvista

CDKN2A

breakpoint kartoitus by PAMP lähestymistapa, genominen fragmentit reunustavat keskeytyskohdat kloonattiin perinteisin PCR lähestymistavat ohjaavat tulokset PAMP. Kaksi esimerkkiä annetaan tässä asiakirjassa.

Detroit 562 solulinjan

: Tällä sisäkkäisiä lähestymistapaa käytettiin kloonaamaan

CDKN2A

murtuessa Detroit 562 ihmisen epiteelikarsinooman soluja. Alukkeet suunniteltiin vihjeitä siitä PAMP kokeessa (katso kuviot 3 ja 4). Ulkoinen alukkeita (AGGTTTGGTTAAGAGTCGTTC ja AAGATCTATATGGTGGCCTTTAG) käytettiin 35 PCR-sykliä (92 ° C, 30 sekuntia; 55 ° C, 30 sekuntia; 68 ° C, 2 minuuttia).