Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kiinteä kasvaimet esiintyä hypoksinen mikroympäristön, ja niillä korkea-glykolyyttisiä aineenvaihduntatuotteiden. Välttää asidoosi, kasvainsolut on näytteille dynaaminen sytosolin pH: n säätelyyn mekanismi (t). Jännite-aidatulla protoni kanava Hv1 sovittelee NADPH oksidaasin toiminto kompensoimalla solun menetys elektronien kanssa protonien. Täällä osoittivat ensimmäistä kertaa, että Hv1 ilmentyminen on lisääntynyt paksusuolen ja peräsuolen kasvaimen kudoksissa ja solulinjoissa, jotka liittyvät huonoon ennusteeseen. Immunohistokemia osoitti, että Hv1 ilmentyy voimakkaasti adenokarsinoomat, mutta ei tai alhainen ilmentyy normaaleissa peräsuolen tai hyperplastisten polyyppien. HV1 ilmentyminen peräsuolen syöpä liittyy merkittävästi kasvaimen koon, kasvain luokitusta, imusolmuke tila, kliinisessä vaiheessa ja p53 tila. Korkea Hv1 ilmentyminen liittyy merkittävästi lyhyempi yleistä ja uusiutumista vapaa elinaika. Lisäksi reaaliaikainen RT-PCR: llä ja immunosytokemialla osoitti, että Hv1 ilmentyy voimakkaasti peräsuolen syövän solulinjoissa, SW620, HT29, LS174T ja Colo205, mutta ei SW480. Estoja Hv1 ilmaisun ja toimintaa erittäin metastaattinen SW620-soluissa Sirna (siRNA) ja Zn

2+ vastaavasti merkittävästi vähentää solujen invaasiota ja muuttoliike, maltillisuutta protoni puristamiseen ja solunsisäinen pH elpymistä. Tuloksemme viittaavat siihen, että Hv1 voidaan käyttää mahdollisena biomarkkeri diagnoosin ja ennusteen peräsuolen syöpä, ja potentiaalinen kohde syöpälääkkeiden peräsuolen syövän hoidossa.

Citation: Wang Y, Wu X, Li Q, Zhang S, Li SJ (2013) Human jänniteohjatun Proton Channel Hv1: uusi Mahdolliset biomarkkeri diagnoosi ja prognoosi peräsuolen syövän. PLoS ONE 8 (8): e70550. doi: 10,1371 /journal.pone.0070550

Toimittaja: Rakesh K. Srivastava, University of Kansas Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 tammikuu 2013; Hyväksytty: 19 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 05 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (31271464). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

jänniteherkkiin protonin kanavan Hv1 tunnistettiin käyttämällä bioinformatiikan hakuja, joka perustuu tunnettujen kationi kanavaa, joka ilmentyy pääasiassa immuunijärjestelmän soluihin, kuten makrofagien, neutrofiilien ja eosinofiilien [1], [2]. HV1 nisäkkäiden phagocytes ehdotettiin olevan vastuussa protoni-kuljetus- reitin, joka säätelee solunsisäinen pH aikana hapen kulutus liittyy fagosytoosia, nimeltään ”respiratorinen purkaus” [3], [4]. HV1 aktivoidaan depolarisoitumisen ja solunsisäinen happamoituminen, joiden toiminta ylläpitää solunsisäinen pH neutraali pitää reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) sukupolvi [5], [6]. HV1 paitsi säätelee pH sytoplasmassa, mutta voi myös tarjota protonien fagosomista, suljettu kalvokotelon tappavat ja ruuansulatuksen taudinaiheuttajan [3]. HV1 on erittäin selektiivinen H

+, ilman havaittavaa läpäisevyyden muita kationeja [7], [8]. Jännite aktivointi suhde Hv1 riippuu voimakkaasti sekä solunsisäinen pH (pH

i) ja solunulkoinen pH (pH

o). Lisääntyvä pH

O tai laskemalla pH

i edistää H

+ kanavan aukko siirtämällä aktivointi kynnys negatiivisempi potentiaali [3]. Lisäksi Hv1 nykyinen estyy submillimolar pitoisuudet Zn

2+ ja Cd

2+ ja muita kahdenarvoisia kationeja [9].

Hv1 sisältää kolme ennustettu domains: n N-terminaalisen hapon ja proline- rikas verkkotunnuksen, transmembraaninen jännite-anturi domain (VSD), ja C-terminaali verkkotunnus. Jänniteherkkiin K

+ kanavat ovat koostuu neljästä alayksiköstä, joista kukin on huokosten domeenin ja VSD. Neljä pore verkkotunnuksia tulevat yhdessä muodostamaan yhden keskeinen pore, ja neljä reuna-taajuusmuuttajat ohjaavat portin huokosten [10]. Toisin kuin jänniteherkkiin K

+ kanavia, Hv1 sisältää VSD mutta siitä puuttuu huokosten verkkotunnuksen. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että Hv1 toimii dimeeri, jossa solunsisäinen C-pään domeeni on vastuussa dimeerisen arkkitehtuurin proteiinin, ja kukin alayksikkö sisältää oman protoni-kuljettava reitti [11] – [14]. Solunsisäinen C-terminaalisen domeenin Hv1 muodostaa dimeerin kautta rinnakkais-

α

a-kierteinen kiertynyt kierrealue ja on tärkeä proteiinin lokalisaatio [14].

tuumorisolut usein esiintyä hypoksinen microenvironment, ja niillä korkea-glykolyyttisiä aktiivisuus ja tuottaa happamia aineenvaihduntatuotteita [15], [16]. Välttää asidoosi vähentäminen johtaa soluliman pH, kasvainsolujen täytyy suulakepuristaa excessing sytosolin protoneja ylläpitää sytosolin pH: ssa, mikä johtaa happaman kasvaimen mikroympäristössä. Hypoksia ja happamat kasvaimen mikroympäristölle avainasemassa syövän kehittymisessä, eteneminen, ja etäpesäkkeitä [15]. Meidän edellinen työ osoitti, että Hv1 on nimenomaan ilmaistu erittäin metastaattinen ihmisen rinta- kasvain kudosten ja solulinjoissa, ja edistää rintasyövän solujen etenemisen ja etäpesäkkeiden kautta säädellään rintasyöpä solujen intracelular pH [17], [18]. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme ilmentymistä Hv1 peräsuolen kasvain kudosten ja solulinjoissa ja sen mahdollinen yhdessä kliinis-ja post-resectional selviytymistä. Estoja Hv1 ilmaisun ja toimintaa erittäin metastaattinen kolorektaalisyöpä solujen merkittävästi vähentää solujen invaasiota ja muuttoliike, maltillisuutta protoni puristamiseen. Tuloksemme viittaavat siihen, että Hv1 yli-ilmentyminen, voidaan käyttää itsenäisenä biomarkkerina ennustetta ja diagnosointiin potilailla, joilla on paksusuolen ja peräsuolen syövän.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki menettelyjen tehtiin noudattaen Helsingin julistuksen ja toiminnan mukaisia ​​Kiinassa. Olemme saaneet kirjallinen lupa kaikilta osallistujia tutkimuksessamme. Tutkimuksessa saadut etiikka hyväksynnän Tutkimuksellemme eettinen komitea Tonghua Center Hospital.

Potilaat ja näytteet

Paksusuolisyöpä kudosnäytteitä saatiin potilailta, joille tehtiin rutiini parantava leikkaus laitoksella Kirurgian , Tonghua Center Hospital vuosina 2001 ja 2007. potilaita ei esikäsitelty sädehoitoa tai kemoterapiaa ennen leikkausta. 139 peräsuolen syövän kudoksissa ja pariksi viereisen ei-kasvain peräsuolen kudokset kiinnitettiin 10% formaliinilla ja upotettiin parafiiniin immunohistokemiallista analyysia varten. Kliinis piirteitä näistä potilaista on esitetty taulukossa 1. Sen lisäksi, tarkistaa ilmaus Hv1 vuonna premalignien dysplastic vaurioita, 10 normaali peräsuolen, 18 hyperplastic polyyppi ja 20 adenoomia kudoksissa tutkittiin käyttäen immunohistokemiallista määritystä. Jokaisen potilaan kliinisen tilan luokiteltiin mukaan patologisen kasvaimen, kasvaimen koon, imusolmuke tila. Kasvaimen erilaistuminen luokiteltiin jonka Edmondson luokitusjärjestelmä. Tutkimus hyväksyi eettinen komitea Tonghua Center Hospital, ja suostumus saatiin kunkin potilaan.

Generation of anti-Hv1 polyklonaalista vasta

Anti-Hv1 polyklonaalisen vasta-aine on tuotettu vastaan ​​karboksyyliterminaalisen domeenin Hv1 (tähteet 221-273 ja Hv1, KTRSERQLLRLKQMNVQLAAKIQHLEFSCSEKEQEIERLNKLLRQHGLLGEVN). Proteiini puhdistettiin homogeeniseksi ilmentämisen jälkeen

Escherichia coli

[19]. Puhdistettu proteiini injektoidaan hiiriin ja anti-Hv1 polyklonaalista vasta-ainetta puhdistettiin rProtein A-Sepharose (GE Healthcare) sarakkeessa. HRP-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG: t hankittiin Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA).

Ekspressiovektori ja transfektio

Hv1 cDNA kloonattiin pEGFP-N1 (Clontech ) luoda Hv1 ekspressioplasmidin pHv1-EGFP, fuusioitu parannettua vihreää fluoresoivaa proteiinia (EGFP), joka on kiinnittynyt C-terminaaliseen päähän Hv1 [14]. 293 T-soluja viljeltiin DMEM: ssä (Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine, GIBCO), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia plus antibiootteja (100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 g /ml streptomysiiniä, GIBCO) 5% CO

2-inkubaattorissa 37 ° C. Soluja kasvatettiin lasipeitinlevyille 50-70% konfluenssiin kuuden kuoppalevyllä transfektoitiin lyhytaikaisesti pHv1-EGFP-plasmidi käyttämällä lipofektamiinia 2000 (Invitrogen) seuraten valmistajan protokollaa. Solut käytettiin kokeisiin 36-48 h transfektion jälkeen.

Western blotting

Western blottaus suoritettiin anti-Hv1 polyklonaalista vasta-ainetta (1 mg /ml), kuten edellä on kuvattu, jossa on lopullinen laimennos 1 1000. denaturoitu proteiinit erotettiin 12,5% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin sitten PVDF-membraanille (GE Healthcare) kostuttamalla elektroblot laitteita. Epäspesifinen proteiinin imeytyminen estettiin käyttämällä 5% (w /v) kuorittua maitoa fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisälsi 0,1% Tween 20: tä (PBS-T) 1 tunnin ajan. Primaarisen vasta-aineen inkubaatio PBS-T suoritettiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. HRP-kytketyn anti-hiiri-vasta-ainetta käytettiin, jonka lopullisena laimennoksena 1 15000 PBS-T, ja HRP paljastettiin kemiluminoivan havaitsemisjärjestelmä (Millipore).

immunohistokemia

Histologinen diagnoosit kasvaintilojen ja ei-kasvaimia formaliinilla kiinnitetyt ja parafinoidut kudokset vahvistettiin hematoksyliinillä ja eosiinilla leikkeitä. Immunohistokemia suoritettiin anti-Hv1 polyklonaalista vasta-ainetta. Anti-Hv1 vasta-ainetta (1,0 mg /ml) laimennettiin 100-kertaisesti PBST (fosfaattipuskuroitua suolaliuosta, joka sisälsi 0,1% Tween-20), joka sisälsi 1% (paino /tilavuus) BSA: ta. Parafiini upotettujen leikkeiden täytetty 10 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappo (EDTA) (pH 8,0), kuumennettiin mikroaaltouunissa 12 min. Jäähdytyksen jälkeen leikkeet käsiteltiin 0,5% Triton X-100 PBS: ssa 10 min, altistettiin 3% (v /v) vetyperoksidia (H

2O

2) 10 minuutin ajan estämään endogeenisen peroksidaasin . Sen jälkeen leikkeitä inkuboitiin PBST: llä, joka sisälsi 5% naudan sikiön seerumia ja 2% BSA: ssa 30 minuuttia epäspesifisen sitoutumisen vähentämiseksi. Inkubaatio primaarisen vasta-aineen tehtiin yön yli 4 ° C: ssa kostutetussa kammiossa. HRP-kytketyn anti-hiiri-vasta-ainetta käytettiin, jonka lopullisena laimennoksena 1 400 1 h. Lopuksi visualisointi signaali kehitettiin diaminobentsidiinillä (DAB) ja objektilasit vastavärjättiin hematoksyliinillä. Negatiivinen kontrolli suoritettiin hoitoon ei-immuuni hiiren seerumin ensisijaisena vasta-sijasta anti-Hv1 vasta-aine.

värjätyt leikkeet arvioitiin sokkona tavalla ilman aiempaa tietoa kliinisten tietojen avulla Saksan immunoreaktiiviset pisteet, Immuno-reaktiivinen-Score (IRS). Lyhyesti, IRS määrittää osa-pisteet immunoreaktiivisia jakelu (0-4) ja voimakkuus (0-3), kertoo sitten ne saadaan IRS pisteet. Prosentuaalinen positiivisuus pisteytettiin ”0” (alle 5%), ”1” (5-25%), ”2” (25-50%), ”3” (50-75%), ”4” ( 75%). Värjäytymisintensiteettiä oli pisteet mukaisen alueen Hv1-positiivista värjäytymistä soluissa, kuten ”0, -” (negatiivinen, alle 5%), ”1, +” (heikosti positiivinen, 5-25%), ”2, ++ ”(positiivinen, 25-50%), ja” 3, +++ ”(voimakkaasti positiivinen, 50%). Lopullinen Hv1 lauseke pisteet laskettiin arvoista prosentin positiivisuuden pisteet ja värjäyksen voimakkuuden pisteet, joka vaihteli 0 12. Arvioimme IRS ottamalla keskiarvo kahdeksan kentät × 500 suurennus kunkin näytteen. HV1 ekspressiotasoja määriteltiin seuraavasti: pieni lauseke (pistemäärä ≤3) ja korkea ilmaisun (pisteet 3). Immunohistokemiallista analyysiä ja pisteytys suoritettiin kaksi riippumatonta kokenutta patologia.

Soluviljely

paksu- ja peräsuolisyövän solulinjoissa SW620, HT29, LS174T, Colo205 ja SW480 viljeltiin 37 ° C: ssa ilmakehässä 95% ilmaa ja 5% CO

2 DMEM: llä, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, ja 20 mM L-glutamiinia.

immunosytokemia

SW620, HT29, LS174T, Colo205 ja SW480-soluja kasvatettiin lasipeitinlevyille on konfluenssiin kuuden kuopan kudosviljelylevyille fiksattiin 4% (w /v) paraformaldehydillä PBS: ssä huoneen lämpötilassa 30 minuutin ajan, pestiin PBS: llä, käsiteltiin 0,5% Triton X-100 PBS: ssa 20 minuutin ajan, altistettiin 3% (v /v) vetyperoksidia (H

2O

2) 15 min, ja pysäytettiin 5% sikiön naudan seerumia ja 2% BSA: ta PBST 20 min huoneen lämpötilassa. Estetty Peitinlasit inkuboitiin anti-Hv1 vasta-ainetta (1,0 mg /ml) laimennoksena 1 200 PBST: llä, joka sisälsi 1% (w /v) BSA: ta 37 ° C: ssa 1 h. Pesun jälkeen PBS: ssä kolme kertaa, peitinlasit inkuboitiin edelleen HRP-kytketyn anti-hiiri-vasta-ainetta lopullisena laimennoksena 1 400 1 h. Signaalit visualisoitiin HRP /DAB-järjestelmässä. Soluytimien värjättiin hematoksyliinillä.

Quantitative real-time PCR

mRNA: n ilmentymisen tasot Hv1 vuonna SW620, HT29, LS174T, Colo205 ja SW480-solut, arvioitiin kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR käyttäen ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Yhteensä RNA: t uutettiin käyttäen RNAiso Reagent (Takara), ja käänteistranskriptoidaan by MMLV Super transcriptase (Takara). Reaaliaikainen kvantitatiivinen käänteistranskriptio PCR suoritettiin SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit (Takara) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Alukkeet olivat seuraavat: Hv1, 5′-CAGGTCATCATCATCTGCTTG-3 ’(eteenpäin) ja 5′-CCGTTCTGAACGTGTCTTAAC-3′ (taaksepäin); GAPDH, 5’-CCAAGGTCATCCATGACAAC-3 ’(eteenpäin) ja 5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCT-3’ (reverse). PCR lämpö kunto käytettiin: 94 ° C 30 s; hehkutus, 52 ° C: ssa 30 s; laajennus, 72 ° C: ssa 30 s. Suhteellinen mRNA: n ilmentymisen tasot proteiinien laskettiin yhtälön mukaisesti: 2

-ΔΔCT, jossa ΔΔCT = (CT

Hv1 – CT

GAPDH) – (CT

Hv1 – CT

GAPDH )

SW620. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Immunofluoresenssi

SW620 ja SW480-soluja kasvatettiin lasipeitinlevyjä kiinnitettiin 4% (v /v) paraformaldehydillä fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), huoneenlämpötilassa 30 min, pestiin PBS: llä, käsiteltiin 0,5% Triton X-100 PBS: ssa 20 min, ja pysäytettiin 5% naudan sikiön seerumia ja 2% BSA PBST: ssa 1 tunnin ajan. Estetty Peitinlasit inkuboitiin anti-Hv1 vasta-ainetta (1,0 mg /ml) laimennoksena 1 200 2% BSA: ta 4 ° C: ssa yön yli. Kun oli pesty PBS: llä 5 minuutin ajan neljä kertaa, peitinlasit inkuboitiin edelleen 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa FITC-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG laimennussuhteella 1 400 2% BSA: ta, jota seurasi toinen pesu edellä kuvatulla tavalla . Konfokaaliset kuvia FITC fluoresenssin SW620 ja SW480-solut tallennettiin Leica TCS SP5 konfokaalimikroskopia (LEICA, Saksa) ja FITC-suodatin asetettu Hv1 ja DAPI suodatin asettaa ydin- DAPI väriaine. Kuvat myöhemmin käsitellä Adobe Photoshop ohjelmisto.

piilotus Hv1 mRNA: n ilmentymisen

sekvenssi siRNA kohdistaminen Hv1 geeni oli 5′-CTACAAGAAATGGGAGAAT-3 ’, ja satunnainen sense-sekvenssin oli 5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ’, jotka molemmat saatiin Ribobio (Guangzhou, Kiina) [17]. SW620-soluja kasvatettiin konfluenssiin siirrettiin 6-kuoppalevyille 30% konfluenssiin ja inkuboitiin yön yli, sitten transfektoitiin siRNA ja negatiivinen kontrolli, vastaavasti, käyttäen lipofektamiini 2000 (Invitrogen), mukaisesti valmistajan protokollaa. Lopullinen pitoisuus siRNA oli 100 nM. Hiljentäminen tutkittiin 48 tuntia transfektion jälkeen. Tehokkuutta siRNA tukahduttamaan Hv1 ilmentyminen määritettiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä, immunosytokemia ja western-blottauksella käyttämällä anti-Hv1-vasta-ainetta, kuten edellä on kuvattu.

Migration kinetiikka

vaikutuksen tutkimiseksi Hv1 muuttavaa kykyyn paksusuolen syövän soluja, muuttoliikkeet SW620, SW480 ja SW620-solut alassäädetty Hv1 ilmaisun ja esti Hv1 aktiivisuutta siRNA ja Zn

2+ vastaavasti arvioitiin haavoittuneen yksikerroksisiin mallissa. Alas-säädellä Hv1 ilmentymistä, SW620-soluja kasvatettiin konfluenssiin ja transfektoitiin siRNA: lla ja negatiivisen kontrollin 24 tuntia, vastaavasti. Estävän Hv1 aktiivisuutta, 1 M ZnCl liuosta lisättiin DMEM-väliaineeseen lopulliseen konsentraatioon 100 uM [1], [2]. SW620 ja SW480-soluja istutettiin 24-kuoppalevylle (1,5 x 10

5 per kuoppa) ja viljeltiin 24vh konfluenssiin ja sen jälkeen haavoittui kärjellä. Solujen liike havaittiin alle faasikontrastimikroskopiaan, ja vangittiin digitaalikameralla 12 tunnin välein.

Invasion ja muuttoliike määritykset

In vitro

hyökkäyksen ja muuttoliike määritykset olivat suoritetaan vaikutusten arvioimiseksi Hv1 invasiivisista ja muuttavien kyvyt SW620 ja SW480-soluissa. SW620 ja SW480-soluja viljeltiin kuuden kuoppalevyllä DMEM, jossa oli 10% FBS: llä yhtymäkohdassa, transfektoitiin siRNA ja negatiivisena kontrollina vastaavasti 24 tuntia, ja sitten ne trypsinoitiin, pestiin ja laskettiin. Solujen invaasiota, siirtoaltaat 8 mm: n huokoskoon suodattimien (Millipore) peitettiin matrigeelin (Becton Dickinson) ja insertoitiin 24-kuoppaisille levyille. Ja solun muuttoliikkeen, siirtoaltaat ei päällystetty matrigeeliä. DMEM-elatusainetta (500 ui), joka sisälsi 10% FBS: ää lisättiin alempaan kammioon, ja 200 ui solususpensiota (5 x 10

4-solut) asetettiin ylempään kammioon. Levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2: ssa 24 tuntia. Estävän Hv1 aktiivisuutta, 1 M ZnCl liuosta lisättiin DMEM-väliaineeseen lopulliseen konsentraatioon 100 uM [1], [2]. Lävistetyn solut vahvistetaan paraformaldehydillä, värjättiin kristalliviolettiliuoksella, ja valokuvataan. Jokainen koe suoritettiin neljä kertaa. Siirtyminen ja hyökkäys laskettiin kuten [muuttoliike solujen määrä testi /kulkeutuminen solu- lukumäärä ohjaus

SW620] x 100% ja [hyökkäys solun määrä testi /invaasion solu nro valvonnan

SW620] × 100%: lla.

aktiivisuus Hv1 kanavan

aktiivisuus Hv1 kolorektaalisyövässä soluissa arvioitiin muutos solunsisäisen pH: n (pH

i) vastauksena solukalvon depolarisaatio by BCECF fluoresenssi [11]. Soluja inkuboitiin 3,0 uM BCECF-AM (Molecular Probe) seerumivapaassa DMEM-alustassa 30 min, vastaavasti, ja pestiin PSS-liuoksella (140 mM NaCl, 5 mM KCI, 5 mM glukoosi, 1 mM CaCl

2, 1 mM MgCI

2, 20 mM Tris, pH 7,5) ja 3 kertaa. Soluja inkuboitiin NH

4CL /NMDG (N-metyyli-D-glukamiini) liuosta (100 mM NMDG, 40 mM NH

4CL, 5 mM KCI, 5 mM glukoosi, 1 mM CaCl

2, 1 mM MgCl

2, 20 mM Tris, pH 7,3) 20 minuutin ajan ja pestiin ammonium- vapaassa liuoksessa (140 mM NMDG, 5 mM KCI, 5 mM glukoosi, 1 mM CaCl

2, 1 mM MgCI

2, 20 mM Tris, pH 7,4), nopeasti indusoimalla intrasellulaarista happamoitumisen [5]. Kalvon depolarisaation saatiin aikaan lataamalla korkea K

+ liuosta (145 mM KCI, 5 mM glukoosi, 1 mM CaCl

2, 1 mM MgCI

2, 20 mM Tris, pH 7,5). Solunsisäinen pH muuttuu happoa sisältävistä soluista havaittiin fluoresoiva koetin BCECF viritysaallonpituuksilla 490 nm ja 440 nm ja emissio aallonpituudella 525 nm alle kalvon depolarisoivan ehto käyttäen RF-5301PC Spectrofluorophotometer (Shimadzu, Japani).

mittaukset solunsisäisen pH:

solunsisäinen pH mitattiin käyttäen pH-herkällä fluoresoiva koetin BCECF-AM. Viljeltyjen solujen yksisolukerrokset inkuboitiin 3,0 uM BCECF-AM (Molecular Probe) bikarbonaatti- vapaata DMEM-väliaineessa 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Lataamisen jälkeen solut pestiin kolme kertaa HEPES-puskuria poistamiseksi solunulkoisen väriaine, ja tehdään edelleen sama puskuriin. HEPES puskuri sisälsi 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 1 mM MgSO

4, 1 mM CaCl

2, 1 mM NaH

2PO

4, 5,5 mM glukoosia, ja 20 mM HEPES, pH 7.4. Fluoresenssi viritysaallonpituuksia 490 nm ja 440 nm kirjattiin emissioaallonpituutena 525 nm käyttäen RF-5301PC Spectrofluorophotometer (Shimadzu, Japani). Kalibrointi fluoresenssin pH suoritettiin tasapainotus- sisäinen ja ulkoinen pH nigerisiiniä (10 uM) korkean K

+ puskurin kanssa pH 5,5-8,0. Korkea K

+ puskuri sisälsi 145 mM KCI, 5 mM glukoosi, 1 mM CaCI

2, 1 mM MgCI

2, ja 20 mM HEPES (tai MES). Suhteellinen fluorenssisuhteessa arvot piirrettiin pH vastaa

i-arvot, jotka sallitaan määrittäminen tuntemattoman pH

i.

Tilastollinen

Kaikki tilastotiedot suoritettiin käyttäen SPSS16.0 ohjelmisto. Mittaustietoja edusti keskiarvona ± SD. Vertailu keskimääräisestä ryhmien välillä suoritettiin

t

testi.

P

arvojen 0,05 pidettiin merkittävinä. Survival analyysi arvioitiin käyttämällä Kaplan-Meier menetelmä ja eloonjäämisaste verrattiin log-rank-testi.

Tulokset

ennusteeseen viittaavia havaintoja

ennusteeseen viittaavia profiileja 139 tapauksessa valittu tätä tutkimuksessa tarkasteltiin taulukossa 1. keskimääräinen ikä potilaiden oli 62,4 vuotta (vaihteluväli 36-76), mukaan lukien 68 urosta ja 71 naarasta. Sijainnit niiden syöpiä olivat 29 vasemman puoleinen ja 43 oikeanpuoleinen paksusuoli, ja 47 peräsuolen tapauksissa vastaavasti. Niistä 139 resekoitu tapauksissa primaarikasvaimen koko vaihteli seuraavasti: 5 cm 72 tapauksessa, ja ≥5 cm 67 tapauksissa. Kaksikymmentä 139 kasvaimia oli huono sytologinen erilaistumista. Kasvain laajuus rajoittui (T1 tai T2) 45 tapauksessa ja kehittynyt (T3 tai T4) 94 tapauksissa. Kasvaimen metastaasin imusolmukkeisiin havaittiin 59 139 tapausta.

lisääntynyt ilmentyminen Hv1 kolorektaalisyövässä

Hv1 ilmaistuna immuunisolujen liittyy ”respiratorinen purkaus” [3], [ ,,,0],4], mutta sen toiminta kasvainten synnyssä ei ole tunnistettu. Tutkimaan Hv1 käytettäväksi mahdollisena biomarkkereiden ja terapeuttinen kohde paksusuolisyövän, Hv1 ilmentyminen 139 peräsuolen syövän kudoksissa ja pariksi normaaleissa kudoksissa, 10 normaali peräsuolen, 20 suolen kasvainten ja 18 hyperplastic polyyppi kudoksia, havaittiin käyttäen immunohistokemiallista määritystä anti-Hv1 polyklonaalinen vasta-aine, syntyi talossa. Tutkia spesifisyyden vasta-aineen, 293-T-soluja transfektoitiin pHv1-EGFP-ekspressioplasmidin. Ja ilmaus Hv1-EGFP havaittiin immunosolukemiallisella ja western blotting vasta-aineen kanssa, ja EGFP fluoresenssi. Tulokset osoittivat, että vasta-aine tunnistaa spesifisesti Hv1 ja EGFP on merkkiaine Hv1 ilmentymistä (Fig. 1A ja B).

A, 293-T-soluja transfektoitiin pHv1-EGFP-plasmidi ja havainneet Leica TCS SP5 polttoväli mikroskoopilla. a, tarkkailemalla EGFP fluoresenssi. HV1-EGFP fluoresenssi on edustettuna vihreänä. b, anti-Hv1 immunofluoresenssilla (TRITC aallonpituuksilla) (punainen). c, DAPI tahra visualisoida ytimet (sininen). d, kuva yhdistettiin on kooste EGFP fluoresenssi, anti-Hv1 immunofluoresenssimenetelmällä, ja DAPI tahra. B, 293 T-soluja transfektoitiin pcDNA3.1-vektoriin ja pcDNA-Hv1 plasmidi, vastaavasti. Ja Hv1 havainnoitiin Western-blottauksella. C, Hv1 ilmentyy peräsuolen syövän kudoksissa. a kappale (100 x) ja b (500 x), c (100 x) ja d (500 x), normaali peräsuolen kudosten e (100 x) ja f (500 x), adenooma kudoksia; g (100 x) ja h (500 x), i (100 x) ja j (500 x), k (100 x) ja l (500 x), peräsuolen syöpä kudoksiin. Normaalissa peräsuolen kudoksissa, hyperplastic polyypit ja suolen kasvainten kudokset, värjäytyminen oli negatiivinen tai heikosti positiivinen. Kasvainkudoksissa, voimakas immunoreaktiivisuus on Hv1 havaittiin. HV1 on pääasiassa havaittu solukalvon (h, j ja l) (kuten on esitetty nuolenpäät). Hv1 värjätään ruskea, kun taas taustan ytimet ovat sinisiä.

Kuten kuviossa. 1C ja taulukko 2, Hv1 värjäytyminen oli pääasiassa kohtalaista tai voimakasta positiivinen kolorektaalisyövässä kudoksissa, mutta ei normaalissa peräsuolen ja hyperplastic polyyppi kudoksiin. HV1 pääasiassa havaittu solukalvon kasvainsolujen peräsuolen kudoksiin, kuten on esitetty kuviossa. 1C (h, j ja l) (kuten on esitetty nuolenpäät). Vuonna suolen kasvainten kudoksissa, värjäytyminen oli negatiivinen tai heikosti positiivinen (Fig. 1 C, e ja f, taulukko 2). HV1 kolorektaalisyövässä kudoksissa oli merkittävästi ilmaistuna verrattuna normaalissa peräsuolen, hyperplastic polyyppien ja adenooma kudoksissa, mikä viittaa siihen, että HV1 voi olla mukana peräsuolen kasvaimien syntyyn. Kaiken kaikkiaan 106 139 (76,3%) tapauksista osoitti korkea ilmentymisen Hv1 kasvainkudoksessa (IRS yli 3), kun taas 33 (23,7%) tapauksista oli pieni lauseke (IRS 0-3). Yleensä Hv1 tiheys oli merkittävästi korkeampi syövän kudoksissa kuin adenooma kudoksissa (7,20 ± 3,25 vs. 2,20 ± 2,12) (taulukko 2).

korkea Hv1 ilmentyminen liittyy huonoon ennusteeseen

väliset korrelaatiot Hv1 ilmaisun ja ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia on esitetty yhteenvetona taulukossa 3. oli merkittävää yhdistysten syvyys kasvaimen luokittelu (

P

= 0,007), ikä (

P

= 0,021) , kasvaimen koko (

P

= 0,000), imusolmukkeesta tila (

P

= 0,000), kliinisessä vaiheessa (

P

= 0,000) ja p53: (

P

= 0,014) potilailla, joilla oli korkea Hv1 ilmaisu verrattuna potilaisiin, joilla oli alhainen Hv1 ilme. Ei ollut merkittävää yhdistyksen välillä Hv1 ilmaisun ja muut kliiniset piirteet, kuten sukupuoli, erilaistumista ja Ki-67 ilme. Lisäksi väliset korrelaatiot ekspressiotasot p53, Ki-67, TopoII, GST-π ja P-gp: n ja ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia olivat osoittivat taulukossa 4. p53: liittyvät kasvaimen luokittelu (

P

= 0,011 ), Ki-67 erilaistumiseen (

P

= 0.010), TopoII erilaistumiseen (

P

= 0.010), ja GST-π kasvaimen koon (

P

= 0,007) ja erilaistumista (

P

= 0,000). Kuitenkin P-gp eivät osoittaneet tilastollisesti merkitsevä ennusteeseen viittaavia parametreja.

Kaplan-Meier selviytymisen käyrät osoittivat, että potilailla, joilla oli korkea Hv1 ilme olivat todennäköisesti lyhyempi kokonaiselinaikaa (

P

= 0,008, Fig. 2A) ja toistuminen elinaika (

P

= 0,008, Fig. 2B) verrattuna potilaisiin, joilla oli alhainen Hv1 ilmaisua, mikä viittaa siihen, että Hv1 yli-ilmentyminen voi olla liittyvä huono kliininen ennuste. Potilaat, joilla oli korkea Hv1 ilme oli huono uusiutumista vapaan elinajan (

P

= 0,008) verrattuna potilaisiin, joilla oli matala Hv1 lauseke (yhden muuttujan analyysi) (taulukko 5). Kokonaiselossaoloaika tutkittiin Coxin yhden muuttujan analyysi osoitti myös, että korkea ilmentyminen Hv1 oli merkitsevästi yhteydessä lyhyempi elinaika (

P

= 0,008). Univariate Coxin regressio analyysit osoittivat, että Hv1 ilmentymistaso oli merkitsevästi yhteydessä uusiutumista vapaan ja kokonaiselossaolo, kun taas muut kliiniset ominaisuudet menettäneet ennakoivaa merkitystä. Lisäksi Coxin monimuuttuja regressio analyysit paljastivat, että korkea ilmentyminen Hv1 oli itsenäinen riskitekijä kokonaiselinaikaa (suhteellinen riski [RR] = 0,443,

P

= 0,015) ja toistuminen elinaika (RR = 0,427,

P

= 0,026) (taulukko 6). Potilaat, joilla oli korkea ilmentymä Hv1 olivat alttiita saamaan varhainen uusiutuminen verrattuna potilaisiin, joilla oli alhainen ilmentyminen Hv1 (37,4 ± 3,0 vs. 47,2 ± 10,7,

P

0,008) (taulukko 5).

potilaalla on matala ilme on pidentymistä ja taudista vapaan eloonjäämisen kuin potilailla, joilla on korkea ilme.

jakelu Hv1 ihmisen peräsuolen solulinjoissa

tutkia Hv1 ilmentyy myös ihmisen kolorektaalisyövän solulinjat, ilmaus Hv1 ihmisen peräsuolen syövän solulinjoissa, SW620, HT29, LS174T, Colo205 ja SW480, havaittiin immunosolukemiallisella ja reaaliaikainen RT-PCR. Kuten on esitetty kuviossa. 3 ekspressiotasot Hv1 näistä peräsuolen syövän solulinjat on merkittävä ero. HV1 ilmentyy korkealla tasolla SW620, HT29, LS174T, ja Colo205 soluja, mutta ei SW480-soluissa. Lokalisoinnin Hv1 in SW620-soluissa määritettiin konfokaalimikroskopialla. Kuten on esitetty kuviossa. 3C, Hv1 ilmentyy vahvasti SW620-soluja, jotka on paikallistettu sekä solunsisäinen sivustoja ja solukalvon (kuten on esitetty nuolenpäät), kun taas Hv1 tuskin ilmaistaan ​​SW480-soluissa. Jolloin Hv1 ilmentyminen on suurempi SW620-soluissa kuin siinä, SW480-soluissa, on sama kuin tulokset immunosolukemiallinen (Fig. 3A) ja reaaliaikainen RT-PCR: llä (Fig. 3B).

A, HT29 (a , 200 x), LS174T (b, 200 x), Colo205 (c, 200 x), SW480 (d, 200 x), SW620 (e, 200 x) ja SW620 (f, 500 x) havaitsee immunosolukemiallinen. B, mRNA ilmentymisen tasoja Hv1 vuonna SW620, HT29, LS174T, Colo205 ja SW480-soluissa arvioitiin kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR. Arvot ovat keskiarvoja ± SD (

n

= 3). *

P

0,05 verrattuna SW620 soluihin. C, SW620 (a, b ja c) ja SW480 (d, e ja f) soluja kasvatettiin lasipeitinlevyille on konfluenssiin kuuden kuoppaisella kudosviljelylevyllä värjättiin anti-Hv1 vasta-ainetta ja havainneet Leica TCS SP5 konfokaalimikroskopia . a ja d, anti-Hv1 immunofluoresenssilla (FITC, vihreä). b ja e, DAPI tahra visualisoida ytimet (sininen). c ja f, yhdistettyjen kuvien ovat komposiitti anti-Hv1 immunofluoresenssilla ja DAPI tahra. HV1 plasmaan kalvo ja solunsisäisen sivustoja erittäin metastaattinen SW620-solut (kuten nuolenpäin), mutta ei huonosti metastaattisen SW480-soluissa. D, ilmentyminen Hv1 vuonna HT29, SW620 ja SW480-soluissa, havaittiin western blottauksella. Down-regulation Hv1 ilmaisun suoritettiin siRNA kohdentamalla Hv1 (HT29-si, SW620-si ja SW480-si).

esto Hv1 toiminta laskee hyökkäyksen ja muuttoliike erittäin metastasoitunut kolorektaalisyöpä solujen

Invasion ja muuttoliike ovat kaksi merkittävää tunnusmerkkejä kasvaimen pahanlaatuisuuden. Arvioidaan osuus Hv1 invasiivisia ja muuttavien potentiaalia peräsuolen syövän soluja, suoritimme invaasio ja muuttoliike määrityksissä. Ensin tutkimme kinetiikka muuttavien kykyä SW620, SW480 ja HT29. Kuva. 4A, B ja C osoittivat migraation kinetiikka SW620 (Fig. 4A), SW480 (Fig. 4B) ja HT29 (Fig. 4C) soluja. Haavoittunut yksisolukerroksen SW620-solujen sallittu haavan kuluttua 48 h (Fig. 4A, a, b, c, d ja e). SW620 ja HT29 (Fig. 4C, a, b, c, d ja e) solujen suljettu haava dramaattisesti nopeampi kuin SW480-soluja (Fig. 4B, a, b, c, d ja e). Jotta alas-säätely Hv1 ilmaisun ja esto Hv1 toimintaa, siRNA kohdistaminen Hv1 ja loppupitoisuudeksi 100 uM ZnCI

2 [1], [2] käytettiin vastaavasti. Hyötysuhteet of Hv1 knock-alas siRNA SW620, SW480 ja HT29 arvioitiin western blottauksella, joka osoitti vähenemistä Hv1 proteiinin tasot upon siRNA Knockdown vuonna SW620 ja HT29 (Fig. 3d). Suppressioita Hv1 ilmentymisen siRNA (f, g, h, i ja j on esitetty. 4A, B ja C) ja Hv1 aktiivisuutta 100 uM ZnCl

2 (k, l, m, n ja o kuviossa. 4A Kuten on esitetty kuviossa. Kuten on esitetty kuviossa. Kuten on esitetty kuviossa.