Krooninen sairaus

tiivistelmä

Somaattiset mutaatiot kasvutekijän reseptorin (EGFR) geeni liittyvät hoitovastetta EGFR tyrosiinikinaasin estäjät (TKI), kuten gefitinibi, potilailla, joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Kuitenkin humoraalisia immuunivasteita EGFR NSCLC potilailla ei ole hyvin tutkittu. Tässä tutkimuksessa selvitimme kliininen merkitys immunoglobuliini G (IgG) vasteita EGFR-peptidejä NSCLC saavilla potilailla gefitinibin. Plasma IgG-tiitterit kuhunkin 60 eri EGFR-johdettu 20-meeri-peptidien mitattiin Luminex-järjestelmän 42 NSCLC saavilla potilailla gefitinibiä. Väliset suhteet peptidi-spesifisten IgG-tiitterit ja läsnä EGFR mutaatioiden tai potilaan eloonjäämisen arvioitiin tilastollisesti.

IgG-tiitterit vastaan ​​egfr_481-500, egfr_721-740, ja egfr_741-760 peptidit olivat merkittävästi suuremmat potilailla, joilla on eksoni 21 mutaatio kuin näissä ilman sitä. Toisaalta, IgG-tiitterit vastaan ​​egfr_841-860 ja egfr_1001-1020 peptidit olivat huomattavasti alempia ja ylempiä, vastaavasti, potilailla, joilla on deleetio eksonista 19 Multivariate Coxin analyysi osoitti, että IgG-vasteita egfr_41_ 60, egfr_61_80 ja egfr_481_500 olivat merkittävästi ennustetekijöitä varten ilman taudin etenemistä riippumaton muista kliinis ominaisuuksia, kun taas että egfr_41_60 ja egfr_481_500 peptidit olivat merkitsevästi ennustetekijöitä yleisen eloonjäämisen. Detection of IgG vasteita EGFR-peptidit voivat olla lupaava menetelmä ennustus ei-pienisoluisen keuhkosyövän saavilla potilailla gefitinibin. Tuloksemme saattaa tarjota uusia oivalluksia parempi käsitys humoraalisia vasteita EGFR pienisoluista keuhkosyöpää.

Citation: Azuma K, Komatsu N, Hattori S, Matsueda S, Kawahara A, Sasada T, et al. (2014) Humoraaliset Immuunivasteet EGFR peptidien Veikkaa etenemisestä vapaa ja eloonjääneiden kokonaismäärästä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä käyttävillä potilailla Gefitinibi. PLoS ONE 9 (1): e86667. doi: 10,1371 /journal.pone.0086667

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 29., 2013 Hyväksytty: 12 joulukuu 2013; Julkaistu: 31 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Azuma et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology of Japan: Grant-in-Aid nuorten tutkijoiden (B), JSPS KAKENHI Grant numero 19790571. rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpäkuolemien maailmanlaajuisesti [1]. Epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR), joka on yksi eniten tutkituista tyrosiinikinaasireseptorit, on prototyyppinen solun pinnan reseptoriin, joka voidaan kohdistaa lääkkeitä vastaan ​​keuhkosyöpä. EGFR perhe tiedetään olevan tärkeä rooli sääntelyn solujen lisääntymisen, erilaistumisen, ja muuttoliike [2]. Somaattiset mutaatiot EGFR geenissä on havaittu olevan merkittävä tekijä kliinisen hoitovasteen EGFR tyrosiinikinaasin estäjät (TKI), kuten gefitinibi ja erlotinibi, potilailla, joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Useimmat EGFR mutaatiot eksoneissa 19-21, jotka koodaavat tyrosiinikinaasidomeeniin reseptorin. Poistot eksonissa 19 (kuten delE746-A750) ja L858R pistemutaatio eksonissa 21 ovat yleisin mutaatiot löytyy NSCLC, noin 90% kaikista EGFR mutaatioita. Nämä mutaatiot löytyvät useammin naispotilailla, henkilöillä, jotka eivät ole koskaan tupakoinut, ja potilailla Itäaasialaisen etnisyyden [3] – [5]. Prospektiivisessa kliinisessä tutkimuksessa EGFR-TKI hoito NSCLC potilaalla on

EGFR

mutaatiot ovat osoittaneet huomattavaa hoitovasteen luokkaa 80% [6] – [8].

Aiemmin olemme kehittäneet henkilökohtainen peptidi rokotus (PPV) uutena toimintatavat syövän hoidossa, jossa rokote antigeenit valitaan sen perusteella, jo olemassa olevien immuunivasteiden kasvaimeen liittyviä antigeenejä (TAA) [9] – [13]. Me kertoi, että immunoglobuliini G (IgG) vasteet TAA johdetut CTL-epitoopin peptidejä hyvin korreloi yleistä (OS) potilailla, joilla on edennyt syöpä joille PPV [14], [15]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että humoraalisia immuunivasteita vastaan ​​TAA-peptidejä voi vaikuttaa merkittävästi kliinistä syöpäpotilailla. On kuitenkin vain vähän tietoa kliinistä merkitystä humoraalisten immuunivasteiden EGFR-peptidejä vastaan ​​pienisoluista keuhkosyöpää.

Äskettäin uusi suurikapasiteettisia tekniikoita on kehitetty löytää biomarkkerit, jotka osoittavat selvästi, hoitotuloksia ja /tai hoitovaste syöpäpotilailla [16] – [21]. Esillä olevassa tutkimuksessa käytimme suurikapasiteettisten Luminex jousitus array järjestelmä mitata IgG vastauksia EGFR-peptidejä potilailla, joilla on NSCLC. Kirjoittajat raportoivat ensimmäistä kertaa, että IgG vastauksia joitakin EGFR-johdetut peptidit ovat havaittavissa pienisoluista keuhkosyöpää, ja että ne voisivat olla mahdollisesti käyttökelpoisia ennustavat etenemisestä vapaan (PFS) ja OS NSCLC saavilla potilailla gefitinibin.

Materiaalit ja menetelmät

potilaat, hoidot ja näytteen kerääminen

otettiin 42 NSCLC hoidetuilla potilailla gefitinibin välillä 2006 tammi-joulukuu 2008 at yhden toimielimen (Kurume University Hospital, Kurume, Japani) . Tiedot potilaiden kliinisiä piirteitä, kuten ikä, sukupuoli, histologia, tupakointi, suorituskyky (PS), vaihe, hoitovasteen, ja tyyppi

EGFR

mutaatiot saatiin kaavion arviot riippumaton arvioija, joka tiennyt kliinisen kurssien (taulukko 1). Kaikki potilaat oli edennyt NSCLC ja sai gefitinibin (250 mg) suun kautta kerran päivässä. Kasvaimen vastetta tutkittiin tietokonetomografia (CT) ja arvioitiin mukaisesti Response arviointiperusteet kiinteitä kasvaimia (RECIST). Response vahvistettiin vähintään 4 viikkoa (täydellinen tai osittainen vaste) tai 6 viikon ajan (vakaan sairaus), kun se oli ensin dokumentoitu. Plasma kerättiin potilailta ennen gefitinibin hoitoa ja pakastettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Plasma kerättiin myös terveiltä luovuttajilta (HD) (n = 20, 59 +/- 11 vuotta, Male = 8, Nainen n = 12). Tämä tutkimus noudattaa määräyksiä Helsingin julistuksen, ja hyväksyi Institutional Review Board of Kurume yliopistosta. Kirjallinen suostumus saatiin kaikissa aineissa.

EGFR-mutaatio analyysi

mutaatiot EGFR-geenin tutkittiin eksonit 19 (E746-A750del) ja 21 (L858R) peptidi nukleiinihapon happo-lukittu (PNA-LNA) PCR puristin, kuten aiemmin on kuvattu [22]. Lyhyesti, genomista DNA: ta puhdistettiin parafinoidut kudoksissa käyttäen QIAamp DNA Micro (Qiagen, Inc., Valencia, CA). PCR-alukkeet syntetisoitiin Invitrogen (Carlsbad, CA). PNA puristin alukkeita ja LNA mutantti koettimet ostettiin FASMEC (Kanagawa, Japani) ja IDT (Coralville, IA), tässä järjestyksessä. PNA-LNA PCR puristin suoritettiin käyttäen SDS-7500-järjestelmä (Applied Biosystems, Foster City, CA).

peptidit ja mittaus IgG-tiitterit peptidejä vastaan, jotka ovat peräisin EGFR

Kuusikymmentä eri ei- päällekkäiset 20-mer peptidit suunniteltiin sekvenssin EGFR-proteiinin ja syntetisoi Sigma Aldrich (St. Louis, MO), kuten on esitetty kuviossa 1E. Peptidit liuotettiin DMSO: hon, kuten on raportoitu aiemmin [23]. IgG-tiitterit kunkin peptidien mitattiin käyttäen multiplex helmisuspensiota array Luminex-järjestelmä, kuten on raportoitu aiemmin [24]. Lyhyesti, 100 ui laimennettua plasmaa inkuboitiin xMAP helmiä (Luminex Corp., Austin, TX), jotka oli päällystetty EGFR-peptidiä, 96-kuoppaiselle suodatinlevylle (MABVN1250, Millipore Corp., Bedford, MA ) 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa levyravistajassa. Sen jälkeen levy pestiin ja inkuboitiin 100 ui biotiini-konjugoitu vuohen anti-ihmisen IgG: tä (BA-3080; Vector Laboratories, Burlingame, CA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa levyravistajassa. Pesun jälkeen 100 ui streptavidiini-PE: tä lisättiin kuoppiin, ja levyä inkuboitiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa levyravistajassa. Helmet pestiin kolme kertaa, jonka jälkeen lisättiin 100 ui PBS: ää kuhunkin kuoppaan. Fluoresenssin intensiteetti 50 ui kutakin näytettä tutkittiin käyttäen Luminex-järjestelmän. Peptidi-IgG-tiitterit arvioitiin kannalta fluoresenssin intensiteetin ja ilmaistaan ​​fluoresenssi-intensiteetin yksikköä (FIU), kuten on raportoitu aiemmin [24]. Cut-off asetettiin arvoon 10 FIU koska FIU käyrät saatu näytelaimennuksen määritykset olivat lineaarisia välillä 10 10000 FIU (tuloksia ei ole esitetty).

Log-rank testi paljasti, että gefitinibi pidensi merkitsevästi PFS (A), mutta ei OS (B), NSCLC potilailla, joilla on EGFR mutaatioita. Merkittävät erot PFS (C), mutta ei OS (D), potilaiden välillä ja ilman EGFR mutaatioita olivat myös ilmeistä mutaatioita sekä EGFR eksonissa 19 (E746-A750del) ja eksonin 21 (L858R). (E) Kuusikymmentä eri 20-meeri peptidit suunniteltiin aminohapposekvenssin EGFR-proteiinin. Sekvenssit punaisella (egfr_481-500, egfr_721-740, egfr_741-760, egfr_841-860, ja egfr_1001-1020) ovat peptidit, joilla IgG-vasteita, jotka korreloivat EGFR mutaatioita. Sekvenssit esitetään sinisellä (egfr_41_ 60, egfr_61_80, ja egfr_481_500) edustavat peptidit näytteille IgG vasteita, jotka korreloivat PFS.

Tilastollinen

tutkia IgG ainetittereinä kukin 60 eri peptidejä liittyy EGFR mutaatio asema, niiden mediaani verrattiin potilailla, joilla on EGFR mutaatioita (delE746-A750 ja L858R) sekä villityypin EGFR käyttäen Wilcoxonin-sum test. PFS laskettiin alkaen aloittamisesta gefitinibin hoito, kunnes joko ajankohta sairauden etenemisen tai viimeisimmän yhteystiedot. OS määriteltiin ajaksi, jona aloittamisesta gefitinibin hoidon saakka kuolinpäivä johtuu tahansa syystä, tai viimeisimmän yhteystiedot. Sen tutkimiseksi, IgG tiitterit kutakin 60 eri peptidejä liittyy PFS tai OS, haimme Coxin suhteellisten riskien mallia anti-peptidi IgG-tiitterit, mutaatio tila, tupakointi asema, sukupuoli, ja PS selittävinä muuttujia. Olemme tutki myös ne, jotka liittyvät tuumorivaste logistisen regressiomallin, jossa CR ja PR pidettiin vastauksia. Koska 60 eri peptidejä tutkittiin, vakava moninaisuus kysymys ollut tässä tutkimuksessa. Siksi tunnistimme peptidejä, jotka liittyivät merkittävästi PFS, OS tai tuumorivastetta ohjaamalla vääriä löytö määrä (FDR) on 5%: n tasolla.

Tässä tutkimuksessa se oli huomattavasti haastavaa tunnistaa anti -peptidillä IgG vastauksia, jotka olisivat hyödyllisiä ennustus kuin yksinkertaisesti käyttämällä kliinis ominaisuudet yksin. Koska määrä peptidien ylitti määrä potilaita, standardin Coxin monimuuttuja regressio (moninkertainen regressio) ei voida käyttää. Välttämiseksi vaikutusvaltainen havaintoja, anti-peptidi-lgG oli log-transformoitiin (anti-peptidi-lgG + 1), ja myös vakioitu nollakeskiarvoista ja yksikön keskihajonta. Olemme soveltaneet Coxin kanssa suopunki-tyypin rangaistus [25], [26], joka on viime aikoina raportoitu olevan käyttökelpoinen analyysi korkean ulotteinen data. Koska merkittävä piirre suopunki menetelmä on sen niukkuus, regressiokertoimia anti-peptidi IgG vasteet eivät liittyneet PFS (OS) voitiin arvioida nollaksi. Perustuen tämän ominaisuuden, tunnistimme muutamia peptidejä, jotka saattavat olla hyödyllisiä ennustettavuutta. Sen tutkimiseksi, onko vai ei IgG ratkaista havaittuja peptidit, itse asiassa hyödyllinen ennustus, haimme Coxin regressioanalyysi ja ajasta riippuvia ROC-analyysi [27]. Alaan kuuluvat ROC-käyrän (AUC) arvioitiin riskien partituureja Coxin kanssa kliinis ominaisuudet yksinään ja myös sekä anti-peptidi IgG vasteet ja kliinis ominaisuudet. Niitä verrattiin testaamalla yhdenvertaisuutta AUC laskemalla bootstrap p-arvo 1000 rinnakkaisnäytteiden. Tilastollinen analyysi suoritettiin R-versiossa 2.13 ja SAS version 9.3 ohjelmisto (SAS Institute, Cary, NC).

Tulokset

Potilaan ominaisuuksista ja eloonjääminen analyysi

kliininen ominaisuudet 42 potilasta on esitetty taulukossa 1. Kaksikymmentäviisi potilasta (60%) oli naisia ​​ja 24 (57%) ei ollut koskaan tupakoinut; mediaani-ikä potilaista oli 63,5 vuotta (vaihteluväli, 38-82 vuotta). Kolmekymmentä kahdeksan potilasta (90%) oli adenokarsinooma, 34 (81%) oli hyvä suorituskyky tila (Eastern Cooperative Oncology Group 0), ja 15 (36%) sai gefitinibi ensilinjan kemoterapiaa. Mitä tyypin

EGFR

mutaatio, 8 potilasta (19%) oli deleetioita eksonissa 19, 13 (31%) oli L858R missensemutaatio eksonissa 21, ja 21 (50%) oli villi tyyppinen

EGFR

.

Tuolloin analyysin mediaani seuranta-aika oli 418 päivää (vaihteluväli 16-1532 päivää). Mediaani PFS oli 201 päivää (vaihteluväli 11-1379 päivää), ja mediaani oli 418 päivää (vaihteluväli 16-1532 päivää). Kaplan-Meier analyysi PFS ja OS aloittamisen jälkeen gefitinibin hoidon on esitetty kuvassa 1. log-rank-testi paljasti, että gefitinibi käsittely johti huomattavasti pidempi elinaikaan ilman taudin etenemistä EGFR mutaatioita kuin niissä ilman niitä (mediaani 347 vs. 54 päivää,

P

= 0,0029) (Fig. 1A), kun taas ei ollut merkittävää eroa OS kahden potilasryhmissä (mediaani 575 vs. 368 päivää, vastaavasti,

P

= 0,1095) (Fig. 1 B). Erot PFS, mutta ei OS, välillä potilailla, joilla on mutaatioita, ja ne, joilla on villityypin EGFR oli nähtävissä molempien EGFR-mutaatio (Fig. 1 C ja 1 D).

korrelaatio IgG-tiitterit EGFR- peptidien ja EGFR mutaatioita NSCLC hoidetuilla potilailla gefitinibin

Tutkimme IgG ainetittereinä kukin 60 eri peptidien plasmanäytteistä pienisoluista keuhkosyöpää käyttäen Luminex järjestelmää. Analysoimme, onko peptidi-spesifisten IgG-tiitterit korreloivat läsnäolon EGFR mutaatioita, ja havaittiin, että IgG-tiitterit nimenomaan egfr_481-500, egfr_721-740, ja egfr_741-760 peptidit olivat merkittävästi suurempi potilailla, joilla exon21 mutaatio kuin niissä ilman sitä (P = 0,017 varten egfr_481-500; P = 0,036 varten egfr_721-740; P = 0,007 varten egfr_741-760) (taulukko S1). Näiden kolmen peptidejä, mediaaniarvot peptidi-spesifisten IgG-tiitterit, jos potilaalla on eksonissa 21 mutaatio oli noin kaksinkertainen, kuin potilailla ilman eksonissa 21 mutaatio (taulukko S1). Toisaalta, tiitteri IgG nimenomaan egfr_841-860 peptidi oli merkitsevästi pienempi potilailla, joiden deleetion eksonissa 19 kuin ne, ilman sitä (P = 0,047), kun taas tiitteri IgG nimenomaan egfr_1001-1020 peptidi oli merkitsevästi suurempi niillä, joilla poistetaan eksonissa 19 (taulukko S1). IgG vasteet muita peptidejä ei todettu merkitsevää korrelaatiota EGFR mutaatioita.

väliset tiitterit IgG vastaan ​​EGFR-peptidejä ja selviytymisen NSCLC hoidetuilla potilailla gefitinibin

Tutkimme lisäksi, onko peptidi- IgG tiitterit hyvin korreloi PFS tai OS NSCLC saavilla potilailla gefitinibin hoitoa. Coxin regressio, IgG-vasteita 38 ja 32 EGFR-johdetut peptidit osoittivat p-arvot alle 5% PFS ja OS, vastaavasti. Kun FDR säädettiin 5% tasolla, IgG-vasteita 35 ja 20 peptidit nimetty merkittäviksi PFS ja OS (taulukko S2). Me tarkasteltiin myös IgG ainetittereinä kunkin peptidin liittyivät kasvaimen vaste (CR tai PR). Logistinen regressioanalyysi osoitti, että ei ollut peptidiä IgG vasteita, jotka liittyvät kasvaimen vaste (tuloksia ei ole esitetty).

tunnistaminen peptidi-spesifisten IgG-vasteet ovat käyttökelpoisia ennustus

Kuten edellä on esitetty, IgG vastauksia moniin EGFR-peptidit liittyivät merkittävästi PFS ja /tai käyttöjärjestelmä. Koska monet paria peptidejä kohtalaisesti tai korreloivat voimakkaasti (tietoja ei ole esitetty), ehdotettiin, että mittaus IgG-tiitterit vastaan ​​suhteellisen pieniä määriä peptidejä voi olla riittävän prognostisia. Coxin regressio kanssa lasso rangaistus, IgG tiitterit egfr_41_60, egfr_61_80, ja egfr_481_500 peptidit oli suhteellisen suuri vaikutus PFS (kuva S1A). Käytimme IgG-tiitterit näitä kolmea peptidien rakentamiseksi ennuste sääntö PFS. Kuten taulukossa 2A, Coxin regressio säätämällä mahdollisten häiritsevien tekijöiden kuten PS, ikä, sukupuoli ja tupakointi, osoitti, että kaikki IgG vasteita egfr_41_60, egfr_61_80, ja egfr_481_500 peptidit olivat huomattavasti prognostisia ja riippumattomuuteen kliinis ominaisuuksista ( P = 0,001, P = 0,020 ja P = 0,028, vastaavasti).

Coxin kanssa lasso rangaistus, IgG tiitterit egfr_41_60, egfr_481_500, ja egfr_881_900 peptidit osoitettu olevan suhteellisen suuri vaikutukset OS (kuva S1B). Koska IgG tiitterit egfr_41_60 ja egfr_881_900 peptidit olivat yhteydessä (spearmanin järjestyskorrelaatiokerroin 0,71; P 0,001), käytimme vain tiitterit IgG vastaan ​​egfr_41_60 ja egfr_481_500 rakentamiseksi ennuste sääntö OS. Kuten on esitetty taulukossa 2B, Coxin osoitti, että IgG-vasteet molemmat peptidit olivat huomattavasti prognoosi-, riippumaton kliinis ominaisuudet (P = 0,018 ja egfr_41_60 ja P = 0,027 ja egfr_481_500).

Kaplan-Meier-kuvaajat PFS ja OS stratifikaatiolaskelmista kanssa IgG-tiitterit valittuun peptidejä esitetään kuviossa 2A ja kuviossa 2B, jotta ymmärtää niiden vähäisiä vaikutuksia säätämättä varten kliinis ominaisuuksia. Käyttämällä aikariippuvainen ROC analyysi, tutkimme myös, ovatko lisäämistä peptidi-IgG-ainetitterit kliinis ominaisuuksia parannetaan tarkkuutta ennustettavuutta. Kuviot 3A ja 3B esittävät ROC käyrät 1 vuoden ja 2 vuoden diabetesriskitestiin arvioiman Coxin taulukossa 2A (PFS) ja taulukossa 2B (OS) peptidi-IgG-tiittereitä ja kliinis characteristcs ja ne, joilla jälkimmäinen yksin. ROC käyrät osoittivat, että peptidin lisäämisen IgG titterit kliinis ominaisuudet johti merkittävää parannusta kyky ennustaa PFS 1 vuosi ja 2 vuotta (P 0,001 vertaamalla AUC). AUC ajasta riippuva ROC varten 1 vuoden ja 2 vuoden OS olivat myös merkittävästi parantaa lisäämällä peptidi-spesifisten IgG-tiitterit verrattuna kliinis ominaisuudet yksinään (P 0,001) (kuvio 3C ja 3D). Nämä havainnot ehdottivat, että lisäämällä peptidi-IgG titterit kliinis ominaisuuksia voisi johtaa tarkempaan ennustettavuutta sekä PFS ja OS.

Kaplan-Meier kuvaajia PFS (A) ja OS (B) potilailla osoittavat korkeampi ja alempi IgG-tiitterit vastaan ​​valittujen peptidien, egfr_41_ 60, egfr_61_80, ja egfr_481_500, on esitetty. Alempia ja ylempiä IgG-tiitterit määritelty niiden mediaaniarvot.

ROC käyrät 1 vuoden (A) ja 2-vuotta (B) PFS riskin pisteet arvioitiin Coxin osoittavat oleellisesti parantunut korrelaatio 1 vuoden ja 2 vuoden PFS. ROC käyrät 1 vuoden (C) ja 2-vuotta (D) OS on myös esitetty.

Keskustelu

Viimeaikaiset edistysaskeleet molekyyli- onkologian ovat merkittävästi parantaneet ymmärrystä kasvuun ja selviytymisreittejä NSCLC. Esimerkiksi EGFR, jäsen HER tai Erb-B perheen reseptorityrosiinikinaaseissa on sekaantunut kehittymistä ja etenemistä NSCLC. EGFR koostuu ekstrasellulaarisen ligandia sitovan domeenin, transmembraanialueen ja monitoiminen sytoplasminen häntä kiinteä kinaasiaktiivisuutta [2], [28] – [30]. EGF on erittyvä kasvutekijä, joiden sitoutuminen EGFR aiheuttaa rakenteellisia muutoksia, jotka johtavat reseptorin homodimeeri muodostumista, jota seuraa lisäys EGFR-kinaasiaktiivisuuden ja sen jälkeen fosforylaation solunsisäisen domeenin [2], [28] – [30]. Yleisimmin havaitut mutaatio EGFR on korvata L858R on aktivoiva silmukka (A-loop), tai poistaminen kahdeksan tähteistä alueella, joka kattaa tähteet 746-759, joka ulottuu beta3 lohkon on alphaC kierteen N-koru kinaasidomeenin [2] – [5], [28] – [30]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että IgG-vasteet peptideille egfr_481-500, egfr_721-740, ja egfr_741-760 olivat merkittävästi suuremmat potilailla, joilla oli eksonin 21 mutaatio. Toisaalta, IgG vastaukset egfr_841-860 ja egfr_1001-1020 peptidit olivat huomattavasti alempia ja ylempiä, vastaavasti, potilailla, joilla on deleetio eksonista 19. Kiinnostavaa egfr_721-740, egfr_741-760, ja egfr_841-860 sijaitsevat ATP-sitova domeeni, joka koodaa tyrosiinikinaasidomeeniin reseptorin, ja humoraalisia immuunivasteita näille sekvensseille korreloivat läsnä aktivoivia EGFR mutaatioita, kuten L858R tai 746DEL. Toisaalta, egfr_1001-1020 sijaitsee sääntelyyn liittyvät C-terminaalinen häntä, joka voi lisätä autofosforyloinnin EGFR [31]. Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet, että tällä alalla on vuorovaikutuksessa laajasti sekä C-lohko ja N-lobe kinaasidomeenin [32] – [33]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että sekvenssit liittyvät tyrosiinikinaasiaktiivisuu- EGFR saattaa olla immunogeenisiä potilailla, joilla EGFR mutaatioita, vaikka lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään mekanismien lisääntynyt IgG vastaukset näihin sekvensseihin.

nopeiden ja tarkat diagnostiset menetelmät, joilla havaitaan EGFR mutaatioita on erityisen tärkeää suunnitella yksilöllisiä terapeuttisia pienisoluista keuhkosyöpää on aktivoivia EGFR mutaatioita. Useita erittäin herkkä havaitsemismenetelmät EGFR mutaatioita kudosnäytteet on raportoitu [22], [37], mutta näytteiden keräämistä varten näiden menetelmien vaatii invasiivisia toimenpiteitä, kuten transbronchial biopsia tai keuhkopussin reikä. Sitä vastoin, esillä olevat tulokset osoittavat, että seulonta IgG vastausten EGFR-peptidejä perifeerisessä veressä voi olla mahdollista havaita EGFR mutaatioita. Detection Humoraalivasteiden vastaan ​​EGFR peptidejä käyttäen Luminex jousitus array järjestelmä on yksinkertainen ja ei-invasiivisia. Erityisesti tämä menetelmä voi olla hyödyllinen potilaille, joilla on NSCLC, joiden kasvain kudokset on vaikea saada yksityiskohtaista patologinen ja molekulaarinen.

lisäksi tutkittiin, IgG-vasteita EGFR-peptidejä voitaisiin ennustaa PFS ja OS NSCLC saavilla potilailla gefitinibin. Huomasimme, että IgG-vasteita peptidien egfr_41_ 60, egfr_61_80 ja egfr_481_500 oli suuri vaikutus PFS, ja että nämä vastaan ​​egfr_41_60 ja egfr_481_500 oli suuri vaikutus OS. Mielenkiintoista on, että kaikki nämä sekvenssit sijaitsevat solunulkoisen domeenin. Sitova EGF tapahtuu aminopään 622 aminohapon solunulkoinen domeeni, joka koostuu neljästä domeenista, I-IV, EGFR. Viime aikoina rakenteelliset tiedot ovat osoittaneet, miten anti-EGFR-vasta-aineiden estävät signaalinvälityksessä EGFR. Esimerkiksi egfr_481_500 sekvenssi kuuluu solunulkoinen domeeni III, jossa anti-EGFR vasta-aineita, kuten setuksimabi, Nimotutsumabi, ja matuzumab, tiedetään sitoutuvan ja estää EGF: n sitoutumista EGFR: [34] – [36]. Vaikka syitä, miksi IgG vastauksia näihin peptideihin saattaa vaikuttaa eloonjäämiseen ei täysin tunneta, yksi mahdollinen selitys on, että IgG solunulkoista domeenia vastaan ​​saattaa vaikuttaa signaalinvälityksessä EGFR.

Tutkimme plasmaa 20 terveiltä luovuttajilta (HD ) käyttäen Luminex-järjestelmän havaita vasta-aineita egfr_41_ 60, egfr_61_80 ja egfr_481_500 peptidejä. Olemme havainneet, että tiitterit vasta-aineiden egfr_41_60, egfr_61_80, ja egfr_481_500 plasmassa ei ollut merkitsevää eroa pienisoluista keuhkosyöpää ja HD (tietoja ei ole esitetty). Tämä tulos on yhdenmukainen kanssa aiempaan toteamukseen vastaiset vasta-aineet sytotoksiset T-lymfosyytit (CTL) epitooppi johdetut peptidit monet kasvaimeen liittyvien antigeenien havaittiin positiivisiksi HD, ja että niiden tiitterit eivät eronneet merkittävästi välillä syöpäpotilaiden ja HD [38] . Tämä havainto viittasi siihen, että humoraalisia immuunivasteita EGFR voi olla hyvin havaittavissa, ei ainoastaan ​​syöpäpotilaiden mutta myös HD, koska tämä molekyyli ilmentyy kaikkialla paitsi terveisiin kudoksiin, vaan myös normaaleihin kudoksiin.

Yhteenvetona, esillä tutkimus on osoittanut, että havaitseminen humoraalisten immuunivasteiden EGFR-peptidejä plasmaa käyttämällä Luminex suspension array järjestelmä voi olla lupaava menetelmä ei vain läsnäolon havaitsemiseksi EGFR mutaatioita, vaan myös ennustus NSCLC saavilla potilailla EGFR-TKI. Nämä tulokset voivat tarjota uusia oivalluksia paremmin ymmärtämään humoraalisten immuunivasteiden EGFR pienisoluista keuhkosyöpää. Koska suurin haittapuoli Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli sen pieni otoskoko, vielä ennakoiva tutkimus on käynnissä vahvistaa havainnot suurempi ikäryhmät. Lisäksi on tarpeen selventää kliininen sovellettavuus meidän tuloksista yksilöllisten pienisoluista keuhkosyöpää.

tukeminen Information

Kuva S1.

Ratkaisu polku Cox regresson kanssa suopunki rangaistus PFS (A) ja OS (B). (A) Coxin kanssa lasso rangaistus, IgG tiitterit egfr_41_60, egfr_61_80, ja egfr_481_500 peptidit oli suhteellisen suuri vaikutus PFS. (B) By Coxin kanssa lasso rangaistus, IgG tiitterit egfr_41_60, egfr_481_500, ja egfr_881_900 peptidit osoitettu olevan suhteellisen suuri vaikutus OS.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0086667.s001

( TIF)

Taulukko S1.

korrelaatio EGFR-mutaatio ja ilmentyminen peptidi pienisoluista keuhkosyöpää. Tutkimme IgG ainetittereinä kukin 60 eri peptidien plasmanäytteistä pienisoluista keuhkosyöpää käyttäen Luminex järjestelmää. Olemme havainneet, että IgG-tiitterit nimenomaan egfr_481-500, egfr_721-740, ja egfr_741-760 peptidit olivat merkittävästi suurempi potilailla, joilla exon21 mutaatio kuin näissä ilman sitä. Toisaalta, tiitteri IgG nimenomaan egfr_841-860 peptidi oli merkitsevästi pienempi potilailla, joiden deleetion eksonissa 19 kuin ne, ilman sitä (P = 0,047), kun taas tiitteri IgG nimenomaan egfr_1001-1020 peptidi oli merkitsevästi suurempi niillä, joilla poistetaan eksonissa 19.

doi: 10,1371 /journal.pone.0086667.s002

(XLSX) B Taulukko S2.

Coxin regressioanalyysin PFS ja OS NSCLC potilaille. Coxin regressio, IgG-vasteita 38 ja 32 EGFR-johdetut peptidit osoittivat p-arvot alle 5% PFS ja OS, vastaavasti. Kun FDR säädettiin 5% tasolla, IgG-vasteita 35 ja 20 peptidit nimetty merkittäviksi PFS ja OS, vastaavasti.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0086667.s003

(XLSX)