Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

vuorovaikutus tukikudosten ja kasvainsolujen näyttelee dynaaminen rooli käynnistämisessä ja parantaa syövän syntymistä. Tässä tutkimuksessa tutkimme välinen ylikuuluminen peräsuolen syöpä (CRC) soluja strooman fibroblastien ja syövän vaikutukset kurkuma ja 5-fluorourasiilin (5-FU), erityisesti syövän kantasoluja (CSC) eloonjäämisen 3D-co -Kulttuuri malli, joka jäljittelee

in vivo

kasvain mikroympäristön.

Methods

Koolonkarsinoomasolut HCT116 ja MRC-5-fibroblastit viljellään yhdessä yksikerroksinen tai HD kasvain microenvironment malli

in vitro

kanssa /ilman curcumin ja /tai 5-FU.

tulokset

Yksikerroksinen kasvain mikroympäristölle yhteistyössä kulttuureissa tuettu intensiivinen välistä ylikuulumista syöpäsoluja ja fibroblastit ja parannettu ylös -regulation metastasoituneen aktiivisen adheesiomolekyylien (β1-integriinin, ICAM-1), transformoiva kasvutekijä-β molekyylejä (TGF-β3, p-Smad2), leviämisen liittyviä proteiineja (sykliini D1, Ki-67) ja epiteelin-to mesenkymaalitransitioon (EMT) tekijä (vimentiinista) in HCT116 verrattuna kasvaimen Monoviljelmiä. Tiheä kasvain mikroympäristölle yhteistyössä kulttuureissa synergistisesti lisääntynyt kasvain-edistävät tekijät (NF-KB, MMP-13), TGF-β3, suosi CSC selviytyminen (ominaista säätely ylöspäin CD133, CD44, ALDH1) ja EMT-tekijät (lisääntynyt vimentiinista ja Slug, väheni E-kadheriinin) in HCT116 verrattuna high density HCT116 Monoviljelmiä. Mielenkiintoista on, että tämä synergistinen ylikuuluminen oli vieläkin suurempi, kun läsnä on 5-FU, mutta laski jyrkästi, kun läsnä on curcumin, indusoimaan biokemiallisia muutoksia mesenkymaalisten-epiteelin siirtymistä (MET), jolloin herkistävät CSCS 5-FU hoitoon.

Johtopäätös

rikastaminen CSCS, merkittävää aktivoitumista kasvain edistäviä tekijöitä ja EMT korkean tiheyden rinnakkaisviljelmätilanteessa korostetaan, että ylikuulumista kasvaimen mikroympäristössä on keskeinen rooli kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen, ja tämä vuorovaikutus näyttää välittävän ainakin osittain TGF-β ja EMT. Modulaatio tämän synergistinen ylikuulumisen by curcumin voisi olla mahdollinen hoito CRC ja tukahduttaa etäpesäkkeitä.

Citation: Buhrmann C, Kraehe P, Lueders C, Shayan P, Goel A Shakibaei M (2014) Curcumin vaimentaa välinen läpikuuluvuus Colon Cancer Kantasolut ja stroomakasvaimet fibroblastien kasvain mikroympäristössä: Mahdolliset rooli EMT. PLoS ONE 9 (9): e107514. doi: 10,1371 /journal.pone.0107514

Editor: Gautam Sethi, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, Singapore

vastaanotettu: 26 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 13 elokuu 2014; Julkaistu: 19 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Buhrmann et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki oleelliset tiedot sisältyvät paperin.

Rahoitus: Kirjoittajat saanut mitään erityistä rahoitusta tähän työhön.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin syöpä maailmassa ja aiheuttaa suuria kliinisiä ongelmia, koska sen korkea etäpesäke ja toistumisen määrä [1], [2]. Kertyvät viittaavat siihen, että kehittymistä ja etenemistä peräsuolen syövän johtuu geneettisestä ja epigeneettiset muutokset, jotka ovat seurausta monimutkaisesta vuorovaikutuksesta transformoitujen solujen kanssa mikroympäristön [1], [3]. Kasvain microenvironment pidetään kasvainalueelle, joka koostuu kotimaisten komponenttien, kuten strooman solut ja tekijät, jotka ovat vakaat miljöö strooman, ja ulkomaisten komponenttien kuten erilaisten immuunisolujen populaatioita, jotka vaikuttavat kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden [4]. Synergistinen vaikutus microenvironment on tulehdusreaktioita ja syövän etenemistä on nyt pidetään olennainen piirre syövän [1], ja on olemassa kasvavaa kiinnostusta tunnistamisessa aineita, jotka kohdistuvat erityisesti polku vuorovaikutusta kasvain ja stroomasoluissa [5 ].

on ehdotettu, että CRC muodostumisen taustalla on pieni osa-väestö itseuudistuvien kasvain kantasolujen sijaitsevat paksusuolen crypt [6], [7]. Todellakin, CRC kantasolut (CSC) osoittavat samanlaisia ​​ominaisuuksia kuin fysiologista kantasoluja ja ovat vastuussa syövän etenemistä [7], [8]. Viime aikoina on ehdotettu, että CSCS ovat ainutlaatuisia solutyyppi kasvaimen mikroympäristössä, jotka ylläpitävät mikroympäristössä ja parantaa syövän metastaasi ja invaasio [4], [9]. Edelleen on osoitettu, että CSC voi suoraan tai epäsuorasti vuorovaikutuksessa useiden immuunijärjestelmän solujen populaatiot kasvaimen mikroympäristössä, joiden uskotaan merkittävästi vaikuttaa kasvaimen etenemistä [4].

tunnistaminen aineita, jotka pystyvät tukahduttamaan ylikuulumisen syövän ja strooman solujen kasvaimen mikroympäristössä voisi olla tärkeä terapeuttinen kohde tukahduttaa metastaattisen potentiaalin CSCS. Jotta voitaisiin kehittää uusia hoitoon strategioita CRC, on siis välttämätöntä tutkia tarkemmin vuorovaikutusta CSCS kanssa

asukas

ja

ulkomailla asuvan

komponentteja niiden mikroympäristön valaista yksityiskohtaiset mekanismeja, joilla CRC kehittymistä ja etenemistä ohjataan.

koska suuri osa CRC liittyy ympäristötekijöihin [1], Nutraceuticals tarjoavat itseään ihanteellisia ehdokkaita moduloimiseksi kasvain microenvironment avulla tukea kemoterapiaa. Itse asiassa, tämä on tärkeää, koska yli 15% potilaista kehittää resistenssin tavanomaiseen /nykyinen kemoterapia, jossa 5-fluorourasiili (5-FU) ja yli 50%: lla potilaista kehittyy uusiutumisen [10]. Me ja muut ovat aiemmin osoittaneet, että Nutraceuticals, kuten kurkumiini, voivat suoraan vaikuttaa CRC kantasoluja korottamalla niiden kemosensitiivisyys ja kemoterapian, mikä merkittävästi lisäämällä terapeuttisten tulos [11] – [13]. Johdettu juurakot kasvin

kurkumaa longa

, kurkumiini (diferuloylmethane) on luonnossa esiintyvä keltainen polyfenolien joka välittää sen vaikutuksia moduloimalla useita tärkeitä molekyylikohteista lukien transkriptiotekijöitä (NF-KB, AP-1, β kateniinin), entsyymit (esim Cox-2, MMP), pro-inflammatoristen sytokiinien (esim TNF-α, IL-1β, ja IL-6), ja solun pinnan adheesiomolekyylien (esim kadheriinien, Integriinit) [14] – [ ,,,0],16]. Modulation of matrix metalloproteinase (MMP) ilmentyminen kasvaimen (mikro) -ympäristössä on tärkeää, koska MMP: t ovat tunnettuja markkereita CRC etenemisen [17] – [19]. Tuumorimetastaasin ja invaasio edelleen vaikuttaa kasvainsolujen vuorovaikutus ja endoteelisoluihin. Tartunta ja molekyylejä, kuten integriinit tärkeä rooli aikana CRC etenemisen ja etäpesäkkeiden [20], [21]. Edelleen, solunsisäinen adheesiomolekyyli-1 (ICAM-1) on todettu lisäävän kasvainsolujen proliferaatiota ja invaasion ja on todettu olevan vastuussa endoteelisolujen syöpäsolujen tarttumista, mikä voimakkaasti vaikuttaa metastaattisen potentiaalin [22], [23]. Kasvain microenvironment lisäksi indusoi NF-KB, jonka tiedetään säännellä useita geenejä mukana kasvain aloittamista edistäminen, ja etäpesäkkeiden [24], [25], ja aiheuttaa Wnt toimintaa, joka on keskeisessä asemassa biologiassa CRC kantasolujen [ ,,,0],26].

Transforming kasvutekijä-β (TGF-β) on monitoiminen polypeptidi, joka on keskeinen rooli erilaistumista, lisääntymistä ja sikiön kehityksen normaaleissa kudoksissa. Kudosten solut syntetisoitua ja erittävät TGF-β osaksi mikroympäristön, jossa se sitoutuu spesifisiin TGF-β-reseptoreihin parakriininen ja autokriininen signalointia. Tämä ligandi ja reseptori monimutkainen kiihdyttää solunsisäistä signalointikaskadien jotka sisältävät kanoninen Smad2 signalointireitin [27], jotka muodostavat komplekseja Smad4 ja kertyy ja translokoituu tumaan. Tumaan, aktivoitu Smad kompleksit säätelevät spesifisten geenien transkriptio ja lopulta säätelevät solusyklin ja kudosten korjaamiseen [27]. On tunnettua, että TGF-β on tuumorisuppressori normaalin kudoksen soluissa ja alkuvaiheessa syövän etenemisen. Kasvainsoluissa kasvua estävä vaikutus TGF-β signalointi on säädeltyyn ja se siirtyy tuumorisuppressorigeenin kasvaimen edistäjänä eri elimissä [27], [28]. Lisäksi on raportoitu, että stimulaatio TGF-β on stroomasolujen aiheuttaa eritystä IL-11 ja lisää kykyä etäpesäkkeiden CRC soluissa, kun taas eläimillä, joita hoidettiin spesifinen inhibiittori TGF-β-reseptorin 1 joustavan etäpesäkkeiden muodostumista [ ,,,0],29]. Mielenkiintoista on, että on raportoitu, että sytokiinien ja kasvutekijöiden stroomasolut kasvaimeen mikroympäristön laukaisee epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT), joka tukee lääkeresistenssi, kasvaimen uusiutumisen, invaasio ja metastaasi neoplastisten solujen [30]. Lisäksi E-kadheriinin ilmentyminen säätyy alas aikana EMT ja tämä voidaan estää sinkkisormipolypeptidiin transkription vaimentimet, kuten Slug ja tämä prosessi on palautuva [31] – [34].

Characterization of molekyylitason mekanismeja kasvaimen edistämisessä rooli TGF-β signalointi ja EMT kasvaimen mikroympäris- välillä fibroblasteja ja kasvaimen solut voivat auttaa kehittämään hoitostrategioita vastaan ​​kasvainten kehittymiseen kuten CRC. Siksi tavoitteena esitetty oli tutkia tarkemmin vuorovaikutusta CRC solujen strooman fibroblastien aktivoitumista syöpää edistää tulehdusta proteiineja, paracrine välittäjiä ja moduloivan vaikutuksia kurkumiinin ja 5-FU, erityisesti CRC kantasoluja ja EMT käytettäessä

in vitro

syöpää mikroympäristölle yhdessä viljelemisen, joka simuloi

in vivo

kasvain mikroympäristön.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta

Monoklonaalinen anti-ALDH1 saatiin acris Antibodies GmbH (Herold, Saksa). Monoklonaalisia anti-CD133 ja anti-CD44 ostettiin Abcam PLC (Cambridge, UK). Anti-β-aktiini, anti-sykliini-D1, anti-ICAM-1, anti-vimentiinin, anti-E-kadheriinin, anti-Slug, anti-TGF-β3, anti-TGF-β3R ja anti-p-Smad2 oli saatu Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Anti-MMP-1, anti-MMP-9 ja anti-MMP-13 hankittiin yhtiöstä R Pierce, Rockford, IL, USA) substraatteina alkalisella fosfataasilla.

tilastollinen analyysi

Numeeriset tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina (+/- SD) on edustava koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Välineet verrattiin Studentin

t

testiä olettaen yhtä suuri varianssit. Erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä, jos

p

arvo oli alle 0,05.

Tulokset

Ymmärtää joitakin keskeisiä biologisen käyttäytymisen tukikudosten ja kasvainsolujen ja simuloida

in vivo

kasvain microenvironment,

in vitro

yhdessä viljelemisen järjestelmiä perustettiin. Tänä oli tutkia vuorovaikutusta HCT116-peräsuolen syövän solut ihmisen fibroblasti MRC-5-solujen korkean tiheyden yhdessä viljelemisen mikroympäristölle malli tai ilman curcumin ja /tai 5-FU kasvainsoluproliferaation, kasvain edistäviä tekijöitä , invaasio, EMT ja peräsuolen CSCS.

intensiivinen ylikuulumisen HCT116 ja MRC-5-solujen yksikerroksisten yhteistyössä kulttuuri microenvironment vaikutteita molekyylien ekspressiota osallisena tarttuvuus, invaasio ja /tai leviämisen

HCT116 ja MRC-5-soluja viljeltiin yh- suhteessa 1:01 kolme päivää yksikerroksisessa ja arvioitiin valomikroskoopilla. HCT116-solut kirjaimellisesti kerääntynyt ja ryhmitellään MRC-5-solujen etsiminen ja tiiviiden solu-solu kosketukseen MRC-5-solujen kasvain yhdessä viljelemisen (Fig. 1, PC). Seuraavaksi suoritimme immunofluoresenssivärjäyksen yksikerroksisen yhteistyön kulttuureissa tutkia, onko havaittu solujen vuorovaikutuksia johtaa toiminnallisia muutoksia soluissa. HCT116-solujen yksikerrosviljelmässä tai HCT116 ja MRC-5-solut yksikerroksisessa co-viljelmät leimattiin β1-integriini, ICAM-1, Ki-67, sykliini D1: n, TGF-β3, p-Smad2 ja vimentiinin (Fig. 1, IF ). Havaitsimme vahvan adheesiomolekyylien ja metastaattisen molekyylit β1-integriini, ICAM-1, aktiivisen solukierron proteiinit Ki-67, sykliini D1, TGF-β3, p-Smad2 ja EMT markkerin vimentiinista in HCT116 yhteisviljelmissä verrattuna HCT116 mono-kulttuuri (Fig. 1). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että stroomasolulinja vuorovaikutus on ratkaisevaa kasvaimen edistäminen, luoden siten solujen mikroympäristön, joka säätelee syövän etenemistä.

HCT116-solut (nuolet) olivat joko viljeltiin yksinään tai olivat viljeltiin yhdessä MRC-5 soluja (*) suhteessa 1:01 kolme päivää lasilevyille yksikerroksisessa ja fixated metanolilla. Sillä immunoleimaus soluja inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineiden β1-integriini, ICAM-1, Ki-67, sykliini D1: n, TGF-β3, p-Smad2 ja vimentiinin), jota seurasi inkubointi rodamiini-kytketty sekundääriset vasta-aineet ja counterstaining DAPI havainnollistaa solun ytimeksi. Kuvissa edustavat kolmea eri kokeita. PC: vaihekontrasti; IF: immunofluoresenssi; Suurennus 400 ×; bar = 30 nm.

Curcumin ja /tai 5-FU voimakkaasti vaikuttaa solujen eheyden korkean tiheyden kasvainten mikroympäristölle yhteistyössä kulttuureissa

Seuraavaksi arvioimme tiheän kasvain mikroympäristölle co-kulttuureissa HCT116 korkean tiheyden viljeltiin yhdessä MRC-5 yksikerrosviljelmässä, jotka jäljittelevät

in vivo

tilanteessa tutkia vaikutteita paracrine terapeuttisia aineita on ylikuulumisen solujen ja kasvainsolujen proliferaation, kasvainsolujen edistäviä tekijät, invaasio ja muodostumista kasvain palloja, piirre syövän kantasoluja. Itse asiassa on raportoitu, että normaali fibroblasti-solut kykenevät indusoimaan erilaistumista kasvainsolujen, kuten ihmisen koolonkarsinoomasolulinja [38], [39]. Vaikutukset 5-FU: n ja /tai kurkumiinista solujen eheyden ja colonosphere muodostumiseen kasvaimen mikroympäristössä viljelmät arvioitiin vuonna HCT116-soluissa sen jälkeen, kun 10 päivää. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla kurkuma tai 5-FU (0, 0,1, 1, 5 ja 10 uM), ja colonosphere muodostumiseen arvioitiin valomikroskoopilla, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Yksittäiset IC

50 curcumin tai 5-FU oli noin 5 uM tai 3.5μM, vastaavasti (p 0,05). Vaikutuksen arvioimiseksi yhdistetyn hoidon, HCT116-soluja esikäsiteltiin 5 uM curcumin 4 h, ja sitten yhdessä käsiteltiin eri pitoisuuksilla 5-FU: ta (0, 0,1, 1, 5 ja 10 uM) ja 10 päivää. Mielenkiintoista esikäsittely curcumin pienentää IC

50-arvot 5-FU on 0,1 uM vuonna HCT116 (p 0,05) (Fig. 2A). Tämä viittaa siihen, että kurkuma herkistää HCT116-soluja 5-FU. Edelleen, toluidiinisinivärjäystä kontrolliviljelmissä osoitti, että solut muodostivat hyvin kehittynyt sferoidi pesäkkeet viljelyjakson aikana (Fig. 2B: a). Hoito HCT116 viljelmien 5-FU (5 uM) tai curcumin (5 uM) yksin tai curcumin ja 5-FU (5 uM /0,1 uM) osoitettiin olevan erittäin tehokkaita estämään colonosphere muodostusta sekä lisätään hajoamisen high density kasvain aloilla verrattuna omien ohjaimien (Fig. 2B: a). Tämä vaikutus oli suurempi sisään curcumin tai curcumin /5-FU käsitelty co-viljelmät (Fig. 2B: a). Seuraavaksi tutkimme ottoa solun sisään curcumin mukaan HCT116 kasvaimen mikroympäristössä yhteistyössä kulttuureista fluoresenssimikroskopialla. Tulokset osoittivat selvästi, että curcumin otettiin kaikki HCT116 solut curcumin käsitelty mikroympäristössä co-viljelmät (Fig. 2B: b). Sen tutkimiseksi, onko yksikerroksista MRC-5-solujen mikroympäristössä yhteisviljelmissä hengissä hoito 5-FU, kurkumiinin ja /tai 5-FU, me värjättiin solut toluidiinisinisellä. Kuten on esitetty kuviossa. 2C: a, MRC-5-solut ovat hyvin värjätään joka on merkki elinvoimaa. Lisäksi kurkumiini otettiin kaikki MRC-5-solujen curcumin kasvaimen mikroympäris- co-viljelmät (Fig. 2C: b).

: kvantifiointi määrä colonosheres saatiin aikaan laskemalla pallomainen pesäkettä 10 mikroskooppikentäs- korkean tiheyden microenvironment co-kulttuureissa. Viljelmiä joko jätettiin käsittelemättä (Co) tai käsiteltiin 5-FU: ta (0,1, 1, 5 tai 10 pM), kurkumiini (0,1, 1, 5 tai 10 uM) tai esikäsiteltiin kurkumiini (5 uM), 4 tuntia, ja sitten altistuvat 5-FU: ta (0,1, 1, 5 tai 10 pM) ja 10 päivää, ja arvioitiin valomikroskoopilla. Verrattiin kontrolliin ja tilastollisesti merkitsevä arvot

p

0,05 nimettiin tähdellä (*) ja

p

0,01 nimettiin tähdellä (**). Toluidiinisinivärjäystä profiilin (2B /C, a) ja solun curcumin sisäänoton (2B /C, b) on HCT116 (B) suuren tiheyden ja MRC-5 (C) yksikerroksisessa yhteistyössä kulttuuri. Kasvaimen mikroympäris- co-viljelmiä joko jätettiin käsittelemättä (Co) tai käsiteltiin 5-FU (5 uM) (5-FU), kurkumiini (5 uM) (Cur) tai esikäsiteltiin kurkumiini (5 uM), 4 tuntia, ja sitten altistuvat 5-FU: ta (0,1 uM) (Cur + 5-FU) ja 10 päivää, ja arvioitiin alla valoa tai fluoresenssimikroskoopilla. Kuvissa edustavat kolmen erillisen kokeen. F = Suodatin. (*) = HCT116 colonosheres. Suurennus 4B, 4ca: 200x, 4CB: 400x; bar = 30 nm.

Colon CSCS CRC solupopulaatioiden kohdistetaan korkean tiheyden kasvainten mikroympäristölle yhteistyössä viljelmät 5-FU, curcumin ja kombinaatio

On raportoitu että kasvain microenvironment on keskeinen rooli jatkumiseen CSCS edistäminen vaikuttaa strooman, tulehdussolujen, sytokiinien ja kasvutekijöiden erittämä strooman fibroblastit [26], [40]. Siksi tutkimme käyttäytymistä CSCS sisällä CRC solupopulaation, tiheän mono-viljelmiä HCT116-soluja jätetään hoitamatta. Kasvaimen mikroympäris- co-viljelmistä HCT116 /MRC-5-solut jätettiin joko hoitamatta tai hoidettiin 5-FU (5 uM), kurkumiini (5 uM) tai esikäsitelty kurkumiini (5 uM) 4 tuntia ja sitten altistettiin 5-FU: ta (0,1 uM) ja 10 päivää. Viljelmät altistettiin immunofluoresenssimenetelmällä leimausta ensisijainen vasta CSC merkki (CD133). Lievä ekspressio CD133 havaittiin pohjapinta ohjaus Monoviljelmiä (Fig. 3A). Mielenkiintoista on, että vastoin CD133 positiivisia soluja HCT116-solujen mikroympäristössä co-viljelmät suurempi kuin, että valvonta mono-kulttuuri (Fig. 3A), joka osoittaa tärkeää synergististä roolia välinen ylikuuluminen HCT116 ja MRC-5-solut tukevat kasvain edistäminen. Lisäksi CD133 positiivisia soluja HCT116-solulinjaa väestö osoitti merkittävästi lisääntynyt eloonjääminen käsiteltäessä 5-FU verrattuna curcumin tai /ja 5-FU (Fig. 3A). Läsnäollessa curcumin tai /ja 5-FU, he osoittivat merkitty alas-säätely CD133 positiivisia soluja (Fig. 3A ja 3B), mikä osoittaa näkyvä Kemoherkistävien vaikutus kurkumiinista CSCS. Kvantitoimalla, olemme vahvistaneet, että määrä CD133-leimattujen solujen lisääntynyt HCT116-mikroympäristössä co-viljelmiä verrattuna ohjaamaan kasvaimeen mono-kulttuuri (Fig. 3A), ja CD133-positiiviset solut kasvoivat elossa solupopulaation käsittelemällä 5-FU , mutta ei curcumin tai yhdistelmähoidon (Fig. 3B).

V: Tiheä mono-viljelmiä HCT116-soluja jätetään hoitamatta (A, Co.HD-mono-kulttuuri), tiheän kasvain microenvironment co-kulttuuri HCT116 /MRC-5-solut jätettiin joko hoitamatta (A, Co.Microenv-HD-Co-kulttuuri), tai käsiteltiin 5-FU (5 uM) (A, 5-FU-Microenv-HD-Co- kulttuuri), kurkumiini (5 uM) (A, Cur-Microenv-HD-Co-kulttuuri) tai esikäsitellään curcumin (5 uM) 4 h, ja sitten altistettiin 5-FU (0,1 uM) (A, Cur + 5FU -Microenv-HD-Co-kulttuuri) ja 10 päivää. Immunoleimaus suoritettiin primaaristen vasta-aineiden paksusuolen CSC markkeri (CD133), jota seurasi inkubointi rodamiini-kytketty sekundääriset vasta-aineet ja counterstaining DAPI visualisoimiseksi solutumien. Kuvissa edustavat kolmea eri kokeita. Suurennus 400 ×. bar 30 nm. B: n määrän kvantifioimiseksi CD133-positiivisten solujen korkean tiheyden viljelmiä edellä on kuvattu, 100-solut 15 mikroskooppikentästä laskettiin. Tarkastus suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja tulokset esitetään keskiarvoina kanssa S.D. kolmesta itsenäisestä kokeesta. Verrattiin kontrolliin ja tilastollisesti merkitsevä arvot

p

0,05 nimettiin tähdellä (*) ja

p

0,01 nimettiin tähdellä (**).

Curcumin on voimakas Chemosensiti- vaikutus paksusuolen syövän kantasoluja CRC solupopulaatioiden tiheän kasvainten mikroympäristölle yhteistyössä kulttuureissa

Seuraavaksi CSC markkereita (CD133, CD44 ja ALDH1) ilmentyminen tutkittiin kasvaimen muodostumisen valmiuksia ja Chemosensiti- vaikutus curcumin CSC merkkiaineiden HCT116 3D tiheän kasvain mikroympäristölle co-kulttuureissa. Co-viljelmiä joko jätettiin käsittelemättä, käsiteltiin kurkumiini (5 uM), 5-FU (1, 5, ja 10 uM) yksin tai esikäsiteltiin 4 h kurkumiini (5 uM) ja sen jälkeen käsittelemällä 5-FU: ta (0,1, 1 , 2, 3 uM) ja 10 päivää (Fig. 4). Lisäksi toisessa koesarjassa, HCT116-soluja inkuboitiin high density Monoviljelmiä ilman fibroblasteja perusinsuliinina ohjaus. Ohjattu korkean tiheyden mono-viljelmistä HCT116 osoitti perusilmennystä CSC markkereita (Fig. 4: a, b, c). Vastakohtana tälle, immuuniblottausanalyysi kokosolulysaateista osoitti merkitty säätely ylöspäin CD133, CD44 ja ALDH1 in HCT116 hallinnassa ja 5-FU-käsitellyn korkean tiheyden kasvain mikroympäristölle yhteistyötä kulttuurien pitoisuudesta riippuvalla tavalla (kuvio. 4 a, b, c). Kuitenkin mielenkiintoisesti esikäsittely curcumin seuraa käsittely 5-FU merkitsevästi alassäädetty CSC merkki ilmentymisen pitoisuudesta riippuvalla tavalla HCT116-solujen korkean tiheyden kasvainten co-viljelmät (Fig. 4: a, b, c). Densitometrinen analyysi tyypillisen western blot kokeet osoittavat säätelyä alaspäin CSC merkkiaineiden HCT116-soluissa käsitellyissä viljelmissä joko 5-FU, kurkumiinin ja /tai 5-FU kurkumiini (Fig. 4: a, b, c). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että paracrine vuorovaikutus kasvain ja stroomasolujen on ratkaisevan tärkeää edistää CSCS ja että on olemassa vahva Kemoherkistävien vaikutus curcumin paksusuolen CSC korkean tiheyden kasvainten mikroympäristölle co-kulttuureissa.

HCT116 korkea tiheys mono-viljelmiä joko jätettiin käsittelemättä (HCT, Co.) tai ne olivat viljeltiin yhdessä MRC-5 kasvaimen mikroympäristössä. Kasvaimen mikroympäris- co-viljelmiä joko jätettiin käsittelemättä (Co), käsiteltiin kurkumiini yksinään (5 uM), 5-FU yksinään (1, 5, ja 10 uM) tai esikäsiteltiin 4 h kurkumiini (5 uM), jota seuraa käsittely 5 -FU (0,1, 1, 2, 3 uM). Kun 10 päivän viljelyn kokosoluliuotteista of HCT116 korkean tiheyden viljelmiä valmistettiin ja analysoitiin western-blottauksella ja määrälliset tiheysmittaus CSC merkki ALDH1 (a), CD133 (b) ja CD44 (c). Densitometrinen arviointi proteiinin ekspression, kuten kävi ilmi, western blot-analyysi tehtiin kolmena kappaleena. Siivous proteiini β-aktiini toimi latauskontrollina kaikissa kokeissa. Verrattiin kontrolliin ja tilastollisesti merkitsevä arvot

p

0,05. Merkittävät arvot on merkitty tähdellä (*).

Curcumin ja /tai 5-FU puuttua synergistisen välinen ylikuuluminen CRC /CSC-solujen ja fibroblastien tiheäksi kasvain mikroympäristölle yhteistyössä kulttuureissa

jotta voidaan tutkia vuorovaikutusta CRC /CSC-soluja ja fibroblasteja ja arvioida vaikutusta curcumin ja /tai 5-FU tähän synergistiseen ylikuulumisen, kasvainten solujen lisääntymistä, invaasiota ja kasvaimen edistävät tekijät (MMP, NF -κB) ilmentyminen yksityiskohtaisemmin, teimme western blotting-analyysi korkean tiheyden kasvaimen mikroympäris- co-viljelmissä.