Krooninen sairaus

tiivistelmä

Johdanto

Haimasyöpä (PCA) on aggressiivinen kasvain, joka assosioituu korkea kuolleisuus. Valtaosa PCA potilaat diagnosoidaan yleensä myöhään kasvain vaiheessa kun terapeuttiset vaihtoehdot ovat rajalliset. MikroRNA (miRNA) osallistuvat kasvainten kehittymiseen ja ovat yleisesti väärin säädellystä PCA. Koska proof-of-periaatteen tutkimuksessa pyrittiin arvioimaan mahdollisten ulosteen miRNA biomarkkereina haimasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Yhteensä RNA uutettiin ulostetta käyttämällä Qiagen n miRNA Mini Kit . Sillä miRNA ilme analyysien valitsimme osajoukko 7 miRNA jotka ovat usein väärin säädellystä PCA (miR-21, -143, -155, -196a, -210, -216a, -375). Myöhemmin ekspressiotasot näistä miRNA määritettiin ulostenäytteistä kontrolleista (n = 15), krooninen haimatulehdus (n = 15) ja PCA potilailla (n = 15) käyttäen kvantitatiivista TaqMan-PCR-määrityksissä.

Tulokset

Kaikki valitut miRNA olivat havaittavissa ulostenäytteistä korkea toistettavuus. Neljä seitsemän miRNA (miR-216a, -196a, -143 und -155) havaittiin pienemmillä pitoisuuksilla ulosteeseen PCA potilaista verrattuna kontrolleihin (p 0,05). Analyysi ulosteen miRNA ilmaisun kontrolleissa ja potilailla, joilla on krooninen haimatulehdus ja PCA osoitti, että ilmentyminen miR-216a, -196a, -143 und -155 olivat korkeimmat valvonnan ja pienin PCA. Ilmaisu jäljellä kolme miRNA (miR-21, -210 ja -375) määrä pysyi ennallaan keskuudessa valvontaa ja potilaille, joilla on krooninen haimatulehdus tai PCA.

Johtopäätös

Tuloksemme aikaan uusia todisteita että ero ilmentymistä miRNA ulosteissa potilailla, joilla on PCA. Jos validoitu suurten tulevaisuutta koskevia tutkimuksia, ulosteen miRNA biomarkkerit voivat tarjota uusia työkaluja PCA seulontatutkimus-.

Citation: Link A, Becker V Goel A, Wex T, Malfertheiner P (2012) toteutettavuus ulosteen MikroRNA kuten uusien biomarkkereiden varten Haimasyöpä. PLoS ONE 7 (8): e42933. doi: 10,1371 /journal.pone.0042933

Editor: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Saksa

vastaanotettu: 9. tammikuuta 2012 Hyväksytty: 16 heinäkuu 2012; Julkaistu: 08 elokuu 2012

Copyright: © Link et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä (PCA) on toiseksi suurin syy ruoansulatuskanavan syöpään liittyvien kuolemien Euroopassa ja USA: ssa [1], [2]. Huolimatta intensiivistä perus- ja kliininen tutkimus mediaanielossaolosta potilaiden PCA pysyy noin 6-10 kuukautta diagnoosin jälkeen, jossa korostetaan aggressiivinen tuumoribiologiassa tämän taudin [3]. Suurin osa potilaista PCA ( 80%) läsnä alueellisiin tai kaukana kasvaimen levittämistä diagnoosin, joka tekee ne kelpaa kirurginen kasvaimen poisto, joka on tällä hetkellä ainoa potentiaalinen parantavaa hoitoa tähän maligniteetin [1], [3]. Lisäksi mahdollisia syöpää ennaltaehkäisevä elämäntapa muutokset (ruokavalion, liikunnan, tupakoinnin lopettamisen jne.), Seulonnan ja varhaisten PCA pidetään lupaavin strategia vähentää PCA-liittyvä kuolleisuus [4] – [6]. Nykyinen kliininen seulontaa ja diagnostisia hallinta PCA potilaiden hoidossa perustuu kuvantamisen tekniikoita, kuten endoluminaalinen ultraääni (EUS) tai varjoainetehosteisiin multi-ilmaisin CT. Kuitenkin, koska niiden invasiivisia luonteen, säteilyn käytön, ja matala herkkyys /spesifisyys, tällaisia ​​tekniikoita parhaimmillaankin saa käyttää seulontaan korkean riskin potilailla (esim perinnöllinen PCA, Peutz-Jeghersin oireyhtymä jne.) [6], [7]. Sen vuoksi on olemassa välitön tarve tunnistamiseen ja kehittämiseen uusien biomarkkereiden, mieluiten ei-invasiivisia diagnostisia tekniikoita, jotka voivat ennustaa kehitystä PCA tai sen diagnoosi varhaisessa vaiheessa.

Niiden tärkeys ei-invasiivisia biomarkkerit on pitkään tunnustettu. Niinpä veri, ulosteesta tai muiden kehon nesteiden tällä hetkellä uskotaan olevan paras keinoja biomarker tutkimusta, joka sisältää laajan kirjon geneettisten ja /tai epigeneettiset muutokset liittyvät syöpään [6], [8]. Perustuen tämän paradigman, useita biomarkkerit kuten hTERT, CA72-4, Osteopontin, REG4, MIC-1,

K-ras

,

p-53

tai poikkeava metylaatio CpG saaret kasvaimen synnyssä niitä arvioidaan parhaillaan [3], [9] – [11]. Kuitenkin asti mennessä vain hiilihydraattiantigeeniä 19-9 (CA19-9) on löytänyt kliinistä käyttökelpoisuutta varhaiseen toteamiseen uusiutuva sairaus, leikkaushaavan hoito PCA potilaista [12]. Kuitenkin käyttö CA19-9 varten PCA-seulonta ei suositella, koska alhainen herkkyys ja spesifisyys [13].

MikroRNA (miRNA), pienet ei-koodaavan selostukset ~22 nukleotidin, äskettäin todettu uuden luokan solujen molekyylien merkittäviä diagnostisia, prognostisia ja terapeuttisia vaikutuksia [14]. MiRNA tärkeä rooli monenlaisia ​​fysiologisia ja patologisia prosesseja [15]. Nojalla geenin ilmentymisen säätelemiseksi, miRNA osallistuvat aikaisintaan vaiheet syövän synnyssä useiden ihmisen syövissä [15], [16]. Lisäksi on olemassa ainutlaatuinen miRNA ilmentymismalleja voidaan tunnistaa eri tyyppien ja alatyyppien syöpien [17] – [19]. Yksi mielenkiintoisimmista piirteistä miRNA on niiden biologinen pysyvyys verrattuna DNA: n tai mRNA: ta. MiRNA ovat huomattavan suojattu endogeenisen ja eksogeenisen hajoaminen johtuu niiden pienen koon ja exosomal läsnäolo kehon nesteissä [20], [21]. Tämän perusteella paradigman, useat tutkimusryhmät ovat itsenäisesti osoittaneet potentiaalia miRNA kuin veripohjaisten biomarkkereita PCA [21] – [23]. Vaikka veren perustuva lähestymistapa on edelleen kysymys intensiivisen tutkimuksen, se on myös ehdotettu, että maha syöpään liittyvien geneettisten ja epigeneettiset muutokset voivat mahdollisesti havaita ulosteet [8], [24]. Ottaen huomioon suuri määrä (~1.5 l) haiman mehu tuotanto ja erittymistä suolen, on oletettu, että precancerous tai varhain syöpään liittyvien molekyylitason muutokset voivat olla havaittavissa ulosteissa ja veren haimasyövän potilaille, luodaan vahva perusta ulosteen biomarkkereiden tutkimus [8].

Kun otetaan huomioon, että PCA liittyy ainutlaatuinen muutos rakenteessa miRNA ilmaisun, me arveltu, että miRNA ilmaus allekirjoitus voi olla tunnistettavissa ulosteet kärsivien potilaiden haiman kasvain. Näin ollen esillä olevassa tutkimuksessa, arvioimme mahdollisuuksia ulosteen miRNA ilmaisun analyysit tunnistamiseksi PCA. Osoituksena pääasiallisen osoitamme, että useat ulosteen miRNA ilmentyvät eri potilailla, joilla haiman sairaus. Pilot analyysit ulostenäytteitä potilailta, joilla on krooninen haimatulehdus ja PCA viittaavat mahdollinen rooli ulosteen miRNA kuten uusien biomarkkereiden varhaisessa havaitsemisessa PCA.

Materiaalit ja menetelmät

Kliiniset näytteet

tutkimus suoritettiin arkistoidut ulostenäytteistä peräkkäisinä potilaista, jotka on kerätty kliinisten analyysien ja takautuvasti kerättyjen ulosteiden terveistä kohteista. Kaikki takautuvasti palvelukseen terveillä vapaaehtoisilla kunhan kirjallinen lupa ja protokolla hyväksyi Institutional Review Board Baylor University Medical Center [24]. Arkistoidut ulostenäytteet poistui identifioitu, koska kirjallinen suostumus ei saatu johtuen potilaan muuttoliikettä tai kuoleman, ja protokolla hyväksyi Institutional Review Board of Otto-von-Guericke University Magdeburg (Magdeburgin, Saksa). Kaikkiaan 45 ulostenäytteitä, mukaan lukien 15 ohjaa, 15 potilasta, joilla on krooninen haimatulehdus ja 15 PCA potilasta osallistui tutkimukseen. Ohjaus näytteitä satunnaisesti valittu ulostenäytteitä kerättiin havaitsemiseksi

helikobakteeri

sisään ulostetta joilla on ei-pahanlaatuinen GI-häiriöitä, kuten refluksi tai gastriitti. Näytteitä potilaista, joilla on krooninen haimatulehdus ja PCA valittiin peräkkäisen potilaalla, joiden jäädytetty ulostenäytteitä, jotka kerättiin analysointia varten ulosteen

elastaasi

tasot rutiini diagnostinen testi haimassa vajaatoiminta. Kliiniset ja demografiset tiedot potilaista on esitetty taulukossa 1.

Ulostenäytteitä kokoelma

Kaikki näytteet kerätään ja käsitellään yhdenmukaisesti käyttämällä ulosteet Näytekokoelmatodistuksen putket (Sarstedt AG, Nümbrechtin Saksa) harjoitetaan rutiini hoitopaikassa. Avohoitopotilaita pyydettiin keräämään ulosteet kotona ja tuoda ulosteet aikana seuraava esitys osastolla. Ulostenäyte Kiinteiden potilaista on kerätty samalla tavalla. Ennen kuin se laboratoriossa näytteet joko säilytettiin + 4 ° C: ssa tai huoneenlämmössä. Kun näytteet saavutetaan laboratoriossa, näytteet eriin ja varastoitiin jatkuvasti -30 ° C: ssa myöhempään käyttöön saakka.

RNA: n eristämistä

Kokonais-RNA (mukaan lukien miRNA) uutettiin ulostenäytteitä käyttämällä Qiagenin miRNAeasy Mini Kits (Qiagen) kuten aiemmin on kuvattu [24]. Lyhyesti, noin 30-50 ui jäädytettyä eriin ulosteesta homogenoitiin RNaasi-vapaata vettä, yhteensä 150 ui ja nopeasti hajotettiin 800 ul: QIAzol hajotusreagenssia (Qiagen, Hilden, Saksa). Saostus suoritettiin kloroformilla ja vesifaasi sekoitettiin 1,5 tilavuutta 100% etanolia. Eluoinnin jälkeen, RNA laatu arvioitiin käyttäen A260 /A280-suhteet käyttäen UV-spektroskopiaa ja näytteitä säilytettiin -80 ° C: ssa lisäanalyyseihin saakka.

MicroRNA määrän reaaliaikaisella PCR

Quantitative miRNA ilmentymisen analyysit suoritettiin käyttäen joko TaqMan miRNA-määritykset (Applied Biosystems, CA, USA) tai SYBRgreen mukainen menetelmä valmistajan ohjeiden kuten aiemmin on kuvattu [24]. Sen jälkeen, kun käänteisen transkription, näytteet ajettiin käyttäen iCycler IQ® tunnistusjärjestelmä (Bio-Rad, CA, USA). Välttää inter-levy bias /vaihtelun, miRNA ilmaisu analyysit suoritettiin käyttämällä yhtä 96-kuoppaisen levyn kaksoiskappaleet. Erot ryhmien välillä esitetään ACt, joka edustaa erot keskimääräisen Ct arvo miRNA kiinnostava ja keskimääräinen Ct-arvo normalisoija miRNA. Käytimme miR-16 ulosteen miRNA normalisoinnin kaikissa näytteissä, koska sen on osoitettu olevan kaikkein johdonmukaisesti ilmaistaan ​​eri ulostenäytteistä, mukaan lukien näytteet, kolorektaalisyövän potilaiden kuten aiemmin on kuvattu [24]. Valinta MikroRNA suoritettiin käyttäen seuraavia kriteerejä: a) raportoidaan haima erityisiä microRNA (miR-375) [25]; b) aiemmin raportoituihin mahdolliset vaikutukset haiman syövän synnyn (miR-21, -196a, -210, -143, -155, -375, -216a) [26] – [28]; c) differentiaali ilmentymisen miRNA on raportoitu verta (miR-21, -155, -196a, -210) [21] – [23] ja /tai haiman nesteen (miR-21, -155, taulukko 2) [29 ]. Alukesekvenssit RT-PCR määritykset on lueteltu taulukossa S1.

MicroRNA microarray ilmaisun profiloinnin ja tietojen analysointi

MicroRNA microarray ilmaisun profilointi suoritettiin tarkoituksena arvioida läsnäolo valittujen miRNA ulosteeseen aikaisemmin kuvatulla [24]. Lyhyesti, kokonais-RNA uutettiin yhdestä ulosteesta näyte terveelle kohteelle käyttämällä Qiagenin miRNAeasy Mini Kit kuten edellä on kuvattu. Monistaminen ja hybridisaatio suoritettiin valmistajan ohjeiden (Illumina, Inc., San Diego, CA). Microarray tietojenkäsittely- ja analyysi suoritettiin käyttäen Illumina n BeadStudio ohjelmisto. Normalisointi on suoritettu käyttäen Lumi Bioconductor ohjelmistopaketti luoda log miRNA ilme arvoja [30]. Sen jälkeen konservatiivinen koetin suodatus vaiheessa, mikä jättää koettimet, jotka eivät päästä havaitseminen arvo P 0,05 analyysien johti luotettavasti havaita 630 antureista.

Tilastollinen

Data-analyysit suoritettiin GraphPad Prism 4.0 ohjelmisto (San Diego, CA, USA) tai SPSS 17.0 (IBM Deutschland GmbH, Munich, Saksa). Erot kahden ryhmän välillä analysoitiin käyttäen Studentin t-testiä. Erot enemmän kuin kaksi ryhmää analysoitiin Kruskal-Wallis, jossa on tarvittavat Dunnin monivertailu

post hoc

testi. Korrelaatio analyysit suoritettiin käyttäen Pearsonin testiä. Aina tarvittaessa, logaritminen regressio käytettiin laskemiseen R

2 ja luoda yhtälön kulmakerroin. Kaksipuolinen p-arvo 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Valinta ulosteen miRNA

Sen tutkimiseksi, PCA potilailla on havaittavissa ulosteen miRNA ilmaisun muutoksia, ensin suoritetaan järjestelmällinen analyysin kirjallisuudesta, jonka tarkoituksena on valita useita miRNA korkeimmalla todisteita miRNA sääntelyn PCA potilailla. Joka perustuu ero miRNA ilmentymisen haimakasvaimesta kudoksissa [18], [26] – [28], muutokset haimanesteessä [29] ja veren [21] – [23], kuten edellä on kuvattu. Olemme myöhemmin valittujen 5 voimistunut (miR-21, -210, -143, -155, -196a) ja 2 vaimentua miRNA (miR-216a ja -375) jatkotutkimuksiin. Taulukossa 2 on yleiskatsaus PCA liittyvien miRNA ilme muutoksia. Saadaksemme yleiskäsityksen varten havaittavuutta valitun miRNA ulosteissa terveillä vapaaehtoisilla, ulosteen miRNA ilmentymisen profilointi tehtiin käyttämällä miRNA mikrosiruja yhdellä jakkara näyte Terveillä vapaaehtoisilla. Kuten kuviossa 1A on esitetty, kaikki valitut miRNA oli läsnä ulosteissa on havaittavina pitoisuuksina.

(A) miRNA mikrosiru ilmentymisen analyysit suoritettiin käyttäen Illumina microarray arvioida läsnä valittu miRNA (miR-16, – 375, -196a, -216a, -21, -143, -155 ja -210) yhtenä ulosteesta näyte terveillä henkilöillä. Ulosteen miRNA ilme muutettiin log-ilmentymisen arvot seuraavat Lumi Bioconductor normalisointi. (B 0,1). (D) Normalized miR-196a ilmentyminen on vertailukelpoista pitkä- ja lyhytaikaisiin säilytettyjä näytteitä (p = 0,441). (E) Koska miR-216a oli läsnä ulosteissa alhaisin pitoisuuksina, ja sen ilmentyminen analysoitiin kaksi riippumatonta kvantitatiivinen RT-PCR juoksee arvioida toistettavuus analyysin (p 0,0001). Normalisointi suoritettiin käyttämällä miR-16 sisäisinä normalisoija.

toistettavuus tulokset miRNA alhaisen ilme

Kaikista analysoitiin miRNA, miR-216a oli läsnä ulosteet alhaisimmalla pitoisuus (kuvio 1 C). Tutkia, vaikka miRNA alhaisen ilme voi olla luotettavasti ja toistettavasti analysoida ulostetta, teimme kaksi riippumatonta ekspressiomittaukset. Kuten on osoitettu kuviossa 2E, miR-216a ilmentymistä toistettavasti havaittu ulosteiden kaikista näytteistä huolimatta alhainen pitoisuus (R

2 = 0,761, p 0,0001).

Differential ilmentymistä ulosteen miRNA PCA-potilailla

Sen arvioimiseksi, ulosteen miRNA ilmentymisanalyysiä lähestymistapa voisi olla hyödyllinen PCA diagnosointiin, 45 ulostenäytteet arvioitiin. Kliininen potilaiden ominaisuuksiin on esitetty taulukossa 1. Viisitoista ulostenäytteet tarkastuksissa vertailtiin viisitoista kunkin potilailta PCA ja krooninen haimatulehdus. Kaikki 7 testattu miRNA jotka runsaasti väärin säädellystä haimasyövän, oli läsnä ulosteissa, vaikka erityisiä vaihtelut miRNA ilme. Neljä 7 miRNA (miR-196a, -216a, -143 ja -155) ilmaistiin huomattavasti pienemmässä määrin ulostenäytteissä potilailta PCA verrattuna kontrolleihin (Kruskal-Wallisin kanssa Dunnin kokeen p 0,05 miR-196a ja miR-216A ja p 0,001 miR-143 ja -155). Näistä vain miR-143 ja -155 ilmenee merkittäviä eroja potilaiden krooninen haimatulehdus ja valvontaa. Mielenkiintoista, alaryhmäanalyyseissa kolmesta ryhmästä paljasti asteittainen lasku

mediaani

ACt varten miRNA ilmentymisen ulostenäytteistä tarkastuksissa alentaa ilmentymisen potilailla, joilla on krooninen haimatulehdus ja alin potilailla, joilla PCA (miR-196a: -2,50 vs. -3,00 vs. -3,65; miR-216a: -5,30 vs. -9,10 vs. -10,80; miR-143: -5,20 vs. -6,00 vs. -7,35 ja miR-155: 0,15 vs. -1,95 vs. -2,55 valvontaa vs. krooninen haimatulehdus vs. PCA, vastaavasti) kuten kuvassa 3. on syytä mainita, että huolimatta alemman miRNA ilmaisun ulosteet potilaiden PCA ja krooninen haimatulehdus, miRNA ilmaisu erot eivät olleet tilastollisesti merkitseviä. Varsinkin miR-21, -375 ja -210, joita usein väärin säädellystä haiman syöpiä, todettiin olevan ennallaan ulostetta valvonnan ja potilailla, joilla on PCA ja krooninen haimatulehdus (kuva 3).

Luvut (A ) ja (G) edustavat eri miRNA jotka valittiin tutkimukseen perustuen muutoksiin PCA kudoksissa. * Edustaa p 0,05, *** – p 0,001. Lyhenteet: N-verrokeilla, CP- krooninen haimatulehdus, PCA- haimasyöpä. Tiedot ovat läsnä Rasia ja viikset tonttien: ylä- ja alarajat ruudut ilmaisevat 75

th ja 25

th persentiilit, linjat sisällä laatikot – keskilinjan ja ylemmän ja alemman vaakasuoran palkit ilmaisevat 90

th ja 10

th prosenttipisteet, vastaavasti.

yhdistelmä miRNA kuin diagnostiikkatyökaluna PCA

aiemmin raportoitu, että ekspressiokuviota useita miRNA sijaan yhden miRNA johtaisi todennäköisesti suurempi herkkyys ja tunnistamiseksi ihmisen syövistä [28]. Tämän olettamuksen perusteella me arveltu, että yhdistelmä 4 ilmentyvät eri miRNA antaisi paremmat syrjinnästä kärsivien potilaiden PCA verrattuna kontrolleihin. Koska kaikki 4 miRNA osoitti vähentää asteittain miRNA ilmaisua, me tiivistää ACt-arvot miR-196a, -216a, -143 ja -155 jokaisesta näytteestä. Kuten kuviossa 4,

mediaani

ΣΔCt-arvot olivat: kontrollille -12,78 vs. -21,45 kroonisen haimatulehduksen vs. -23,25 PCA (Kruskal-Wallisin testi p 0,0002, Dunnin kokeen valvonta vs. krooninen haimatulehdus tai PCA p 0,05 ja 0,001, tässä järjestyksessä). Käyttämällä tätä yhdistelmää, saavutimme

mediaani

ACt-arvo ero 10,47 (tai 1418-kertainen) välillä PCA ja valvontaa, vaikka ACt-arvon eron miR-143 yksinään 2,15 (eli 4,4-kertainen).

summattu ACt-arvot miR-196a, -216a, -143 ja -155 tehtiin laskea Σ ACt-arvoa. * – P 0,05, *** – p 0,001. Lyhenteet: N-verrokeilla, CP- krooninen haimatulehdus, PCA- haimasyöpä. Tiedot ovat läsnä Rasia ja viikset tonttien: ylä- ja alarajat ruudut ilmaisevat 75

th ja 25

th persentiilit, linjat sisällä laatikot – keskilinjan ja ylemmän ja alemman vaakasuoran palkit ilmaisevat 90

th ja 10

th prosenttipisteet, vastaavasti.

keskustelu

tässä proof-of-periaatteen tutkimuksessa arvioimme toteutettavuus ulosteen miRNA kuin potentiaali biomarkkereita havaitsemiseksi PCA. Käyttäen osajoukko miRNA jotka ovat usein väärin säädellystä PCA, huomasimme, että miR-196a, -216a, -143 ja -155 ovat läsnä alemmilla tasoilla ulostenäytteistä potilailta PCA verrattuna kontrolleihin. Lisäksi osoitamme, että muutoksia ulosteen miRNA ilmentyminen voidaan myös havaita potilailla, joilla on krooninen haimatulehdus. Lopuksi osoitamme, että yhdistelmän osajoukko miRNA voi tarjota erinomaisen diagnostinen arvo on suurempi herkkyys ja spesifisyys tunnistamiseksi haiman kasvainten.

lisäksi kuvantamismenetelmiä, on olemassa selkeä tarve vaihtoehtoisille säännöt varhaiseksi havaitsemiseksi PCA. Esimerkiksi invasiivisia kokoelma haiman mehua tai haiman kanavaan harjaus voi tuntua mahdollisesti lupaavien; Tämä voidaan tehdä ainoastaan ​​rajoitettu määrä potilaita, koska sen invasiivisuus ja puute soveltuvuuden Seulonnassa. Veripohjaisten biomarkkereiden tutkimus on aina ollut keskittyä, koska se on valtavat mahdollisuudet kehittää ei-invasiivisen seulonta lähestymistapoja. Kuitenkin ulosteet on myös ehdotettu lupaavan vaihtoehdon, erityisesti GI-malignien, johtuen jatkuvasta irtoaminen kuorituista solujen ja tuotanto haiman nesteen [8], [24]. Uskotaan, että ulosteen markkereita voi olla jopa suurempi diagnostinen saanto, koska molekyyli syöpään liittyviä muutoksia DNA, mRNA ja miRNA voidaan havaita paljon aikaisemmin ulostetta. Viime aikoina olemme ja muut ovat osoittaneet, että havaitseminen ulosteen miRNA on toteutettavissa lähestymistapa, joka on korkea toistettavuus, ja että potilaat, joilla paksusuolen neoplasia on usein suurempi ekspressio miR-21 ja -106a verrattuna kontrolleihin [24], [31 ].

tällä hetkellä vakuuttavia todisteita olemassa kudosspesifisiä muutoksia miRNA ilmaisun PCA [21], [26] – [28]. Ne miRNA painopiste on ollut useiden tutkimusten osoittavat monimutkaista vuorovaikutusta keskeisten reittejä ja kohteita haiman syövän synnyn. Perustuen olemassa olevan tiedon ja miRNA ilmentymismalleja PCA, esillä olevassa tutkimuksessa valitsimme 7 PCA liittyvä miRNA jotka ovat joko ylä- (miR-21, -155, -143, -210 ja – 196a) tai alassäädetty (miR -375, -216a) ja miRNA ilmaisun analyysien ulostetta. Keskeisessä tutkimuksessa Bloomston et al. osoitti, että PCA ovat eri miRNA ekspressiokuviota erityisiä korjauksilla 25 miRNA vs. hyvänlaatuinen haiman kudoksista ja 21 miRNA verrattaessa krooninen haimatulehdus kudoksiin. Käyttämällä tätä miRNA ekspressiokuviota kirjoittajat voisi erottaa PCA kudokset hyvänlaatuinen ja krooninen haimatulehdus kudoksia tarkkuudella yli 90% [26]. Myöhemmin osoitettiin, että ilmentyminen miR-21 ja -196a liittyi korkea leviämisen (Ki67-indeksi), läsnäolo maksan etäpesäke ja ennustaminen huono selviytymisen /ennusteen [19], [26]. Tuloksemme vahvistavat aiemmat raportit osoittavat hämmästyttävää vakautta ulosteen miRNA ulosteeseen, sekä niiden korkeat pitoisuudet läsnä ulostenäytteistä [24], [32], [33]. Käyttämällä kohde perustuva lähestymistapa, löysimme ero miRNA ilmaus 4 ulos 7 miRNA (miR-196a, -216a, -143 ja -155) ulosteeseen potilaista PCA verrattuna kontrolleihin, kun taas 3 miRNA (miR-21, -375 ja -210) ilmaistiin samalla tasolla useissa eri terveillä koehenkilöillä ja potilailla. Tässä proof-of-periaatteen tutkimuksessa se oli jokseenkin yllättävää huomata, että neljä ilmentyvät eri miRNA tutkimuksessamme osoitti väheni miRNA ilmaisun ulosteet potilaiden PCA, vaikka aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet ylössäätely miR-196a, -143 ja – 155 haiman kasvain potilaiden kudosten haimasyöpä ja alas-säätely miR-216a [26] – [28]. Oletimme, että syy muutokseen ulosteen vs. kudokset ilmentymistä näiden miRNA voi johtua muutoksista haiman neste vuotaa, joka on usein patologinen potilailla, joilla on haimasyöpä ja ehkä osittain vastuussa tästä discrepant havainnon. Koska takautuva luonteesta tutkimuksessa olemme pystyneet keräämään tietoja tilan bile /haiman hormin tai suorittaa pariksi kasvain ja ulosteen miRNA analyysejä. Kuitenkin meidän hypoteesi voitot tukea useilta toisesta tutkimuksista. Ensinnäkin, se oli aiemmin osoittaneet, että valitut miRNA (miR-21, -210, -155, -196a) on yliaktiivista plasmassa potilailla, joilla PCA, mikä viittaa niiden mekanistinen osallistumista haimasyöpä [21], [22]. Toiseksi riippumaton tutkimus on osoittanut voimistunutta ilmentymistä miR-155 haiman nesteen PCA potilaista [29], mikä edelleen tukee havaintomme. Kolmanneksi, oma havainto asteittaisen asteittainen väheneminen ilmentymisen valittujen miRNA ulosteissa potilailla, joilla on krooninen haimatulehdus verrattuna kontrolleihin ja PCA potilaat tue tätä väitettä. Silti emme löytäneet merkittäviä eroja ulosteen miRNA ilmaisun välillä PCA ja potilailla, joilla on krooninen haimatulehdus, joka voi heijastaa joko suuri riski PCA kehityksen potilailla, joilla on CP yhdeltä puolelta tai saattavat ehdottaa suhde exocrine tai hormonitoimintaa haiman vajaatoiminta .

tässä tutkimuksessa miRNA profilointia käytetään yksinomaan saada yleiskäsityksen tunnistamiseksi miRNA ilmaisun kuviot ulostenäytteistä haiman syöpäpotilaiden. Koska käytettävissä näytteet jälkikäteen kerätä ja tallentaa pitkällä aikavälillä me tarkoituksella välttää profilointi näistä kasvain kudosten, jotta vältetään mahdolliset valinta harhaa käyttäen suuren läpimenon microarray-pohjainen tekniikka. Vaikka valittu miRNA osoitti merkityksetöntä eroja CP ja PCA potilaita, uskomme, että tulokset ajatuksia herättävä PCA biomarker tutkimusta, ja antaa pakottavia ponnahduslautana yrityksen ylimääräisiä tulevaisuudentutkimuksista tulevaisuudessa arvioida järjestelmällisesti mahdolliset erot miRNA jotka ovat ainutlaatuisia näiden potilaiden alaryhmissä suhteen haiman ja sappiteiden tila. Tutkimuksemme tuloksia korostavat tarvetta lisätutkimuksia biologisesta merkityksestä vapautettiin miRNA haiman neoplasia. Kuten on esitetty taulukossa 2, useimmat miRNA analysoitiin tutkimuksessamme on useita, syöpään liittyvien validoitu geenikohteet ihmisen syövissä. Esimerkiksi Gironella et ai. ovat osoittaneet, että miR-155 tavoitteet Kasvain-proteiinin 53-indusoidun tumaproteiini 1 (TP53INP1) häiritsemättä sen antituumoriaktiivisuus haiman syöpäsoluissa [34]. Useat ryhmät ovat osoittaneet, että miR-21 tavoitteet PTEN, RECK, PDCD4, joka voi olla vastuussa onkogeenisiä rooli miR-21 [35], [36]. Samoin miR-143, joka on usein purettu haiman syövät, on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa KRAS [37] ja palauttamista tuumorisuppressorin miRNA voi estää kasvaimen kasvua ksenografti haimasyövän mallilla käyttäen nanovector toimitus miR-143/145 [38 ]. Lisäksi, miR-196a ja miR-210 on osoitettu olevan kasvaimia synnyttävää rooli kohdistamalla useita tuumorisuppressorigeeneille (ANXA1, KRT5, RAD52), jotka vaikuttavat proliferaation ja hypoksinen stressiä [39] – [42], kun taas miR-375 ja -216a , joita usein vaimentua haimasyövän, ovat sekaantuneet insuliinin eritystä ja säätelyyn solujen eloonjäämistä ja proliferaatiota kohdistamalla useita onkogeenien kuten PDK1, JAK2, ATG7 [25], [43] – [46]. Tämä data vetoavat intensiivisen tutkimus- biologisen merkityksen miRNA kuin biologinen vaikutus exosomal miRNA voi olla kuin solu- tai paikallinen kasvaimen vaikutuksia [47], [48].

Tämänhetkiset tiedot sotkea että miRNA ilmentymiskuviot, eikä samalla miRNA saattaa olla tarpeen parantaa hyödyllisyys varten miRNA-pohjainen diagnostinen lähestymistapa. Esimerkiksi tutkimuksessamme teimme yksinkertaisen summattu ACt arvojen joka antoi meille mahdollisuuden saavuttaa parempi erottelukyky mediaani ACt-arvot potilailla, joilla on PCA verrattuna kontrolleihin. Tällainen lähestymistapa saattaa olla tärkeää, jos ulosteen miRNA ekspressiokuvioiden käytetään seulontaan muiden GI syöpäsairauksia. Tämä on erityisen merkityksellistä, koska ulosteen analyysi on laajalti toteutettu kliininen käytäntö esim. ulosteen piilevän veren testit ja peräsuolen syövän seulontaa ja arviointia varten haimaelastaasia ulosteessa kuin biomarkkerina exocrine haiman vajaatoiminta. Jos validoitu Tulevaisuudessa visio ulosteen miRNA perustuva lähestymistapa tunnistamiseen GI kasvaimia voitaisiin helposti käännetään diagnostiikka, lähestymistapaa, joka on epäilemättä ylivoimainen potilaiden hoitomyöntyvyyttä verrattuna nykyisin saatavissa invasiivisia diagnostisia testejä.

Vaikka lupaavia, ulosteen miRNA lähestymistapa on vielä intensiivisen tutkimuksen ennen kliinistä sovellusta. Kuten myönsi aiemmin, koska meidän kyky sisällyttää vain rajallinen määrä näytteitä tässä proof-of-periaatteen tutkimuksen tilastollista merkitystä tuloksemme antaa vähän näyttöä kliinisen sovellettavuutta ja mahdollisuuksia ulosteen miRNA diagnosointiin PCA potilaiden lähitulevaisuudessa. Kuitenkin uskomme, että havainnot ovat uusia ja tulevien tutkimusten mukaan lukien mahdollinen näytteenottopäivä eri kasvain vaiheissa täysin biokemiallisten ja kliinisten huomautus haiman /sappitiehyen tukkeumia tarvitaan, koska mahdolliset vaikutukset haiman kanava tukos ulosteen miRNA ekspressiotasot .