Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

Suun levyepiteelisyöpä (OSCC) on vallalla syöpä, erityisesti kehitysmaissa. Antrasykliinit ja niiden antrakinonijohdannaisten, kuten doksorubisiini, osoittavat solun kasvua estävä vaikutus ja niitä on käytetty, kuten syöpälääkkeet monta vuotta. Kuitenkin kardiotoksisuuden antrasykliiniantibioottien on suuri huolenaihe niiden kliinisen käytön. NSC745885 on uusi yhdiste syntetisoitiin 1,2-diaminoanthraquinone, joka sen jälkeen reagoi tionyylikloridin kanssa ja trietyyliamiinia. Esillä Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia anti-suusyövän mahdollisuuksia ja turvallisuutta NSC745885.

Methods

Tutkimme syövän potentiaalia NSC745885 suun levyepiteelikarsinoomasolu linjat ja käytettäessä

in vivo

suusyövän ksenografti- hiirimallissa. Ilmentymisen apoptoottisten liittyvien geenien arvioitiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä ja western bloting, ja

in vivo

arviointi apoptoottisten markkerin mitattiin immunohistokemiallisella värjäyksellä. Anti-kasvain tehokkuuden ja turvallisuuden välillä doksorubisiinin ja NSC745885 verrattiin myös.

Tulokset

tulokset osoittivat, että NSC745885 on anti-suusyövän aktiivisuus indusoimalla apoptoosin syöpäsoluissa ja kasvaimen -pitoista hiiret, ja tämä hoito ei aiheuttanut huomattavaa toksisuutta kokeellinen hiirillä. Tämä yhdiste osoittaa myös vertailukelpoinen kasvaimen vastaisen tehokkuuden ja korkeampaa turvallisuutta kokeellinen hiirillä verrattuna doksorubisiiniin.

Johtopäätökset

Aineisto Tämän tutkimuksen saada näyttöä NSC745885 mahdollisena uusien terapeuttisten huumeiden hoitoon ihmisen OSCC.

Citation: Chen YW, Huang HS, Shieh YS, Ma KH, Huang SH, Hueng DY, et ai. (2014) uuden yhdisteen NSC745885 Kiinnostavuus Anti-Tumor Vaikutus Kielen Cancer SAS Cells In vitro ja in vivo. PLoS ONE 9 (8): e104703. doi: 10,1371 /journal.pone.0104703

Editor: Arianna L. Kim, Columbia University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 tammikuu 2014; Hyväksytty: 16 heinäkuu 2014; Julkaistu: 15 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat tutkimusmäärärahat National Science neuvosto, Taiwan, ROC (NSC101-2320-B-016-016 ja G.-J. Lin ja NSC102-2314-B-016-018-MY3 jotta Y.-W. Chen), Tri-Service General Hospital, Kiina (Grant nro . TSGH-C102-019, TSGH-C100-034 ja TSGH- C101-009-S06) ja osittain CY Foundation for Advancement of Education, Science and Medicine. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

joukossa suun okasolusyöpää (OSCCs), suurin enemmistö maligniteettien ovat pään ja kaulan okasolusyöpää (HNSCCs). OSCC on kuudes yleisin syöpä maailmassa [1], ja kolmanneksi yleisin syöpä kehitysmaissa [2] – [4]. Perinteinen hoitomuotojen OSCC kuuluvat leikkaus, sädehoito ja kemoterapia. Kuitenkin korjaavan vaikutuksen tällaisten hoitomuotojen loppuvaiheen suun syöpä on tasaisen huono. Lisäksi vaikka onnistuneen tuumoriresektion, noin 20%: lla potilaista voi olla uusiutumisen kasvaimia muiden sivuston [5]. Siksi kehittää uusia terapeuttisia strategioita pahanlaatuisen suun kasvaimia on kiireellinen asia.

antrasykliinit ja niiden antrakinonijohdannaisten näyttelytila ​​solujen kasvua estäviä vaikutuksia ja on käytetty syöpälääkkeet yli 30 vuoden ajan [6]. Daunorubisiini ja doksorubisiini, kaksi antrasykliini antibotics, käytetään usein akuutin myelooisen leukemian sekä eri kiinteitä kasvaimia [7]. Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet, että nämä lääkkeet aiheuttavat apoptoosia tuumorisoluissa [8], [9]. Sytostaattinen ja sytotoksinen vaikutus näitä lääkkeitä on havaittu kautta estämällä topoisomeraasi II ja myöhemmin aloittamista DNA-vaurioiden [10]. Hapettumista on pidetty kriittisen mekanismin antituumorivaikutuksen antrasykliinin [11]. Antrasykliiniantibiootit osoittavat myös kyky vähentää telomeraasiaktiivisuudelle ja hTERT ilme. Doksorubisiini hoito indusoi vanhenemista rinnassa MCF-7 cell lisäämällä aktiivisuutta p53, ja vähentää aktiivisuutta telomeraasiaktiivisuuden tähän syöpäsolujen [12]. Aiemmassa tutkimuksessa on todettu, että telomeraasiaktiivisuus ja hTERT mRNA ilmentyminen estyy doksorubisiinilla hoitoa vanhemman mahan sinoomasolulinjoja muttei doksorubisiiniresistenttejä solulinjat [13]. Tulokset näistä tutkimuksista ehdotti vaikutus antrasykliinien inhibitioon telomeraasiaktiivisuuden, ja tämä vaikutus osaltaan antituumorivaikutuksen näiden lääkkeiden.

Vaikka antrasykliiniantibiootit on käytetty syöpälääkkeiden monille vuotta, niiden kardiotoksisuutta herättää kliinisessä huolenaihe [14]. Piirteet antrasykliinin aiheuttamasta kardiomyopatian koepaloja hoidetuista potilaista kuuluu myofibrilli menetys, sarkoplasmakalvostosta laajentuma, soluliman vakuolisaatiota, määrä on lisääntynyt lysosomeihin, ja turvotus mitokondrioiden sydänlihassolujen [15]. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että kehitystä kardiomyopatian doksorubisiinin hoitoon liittyy annoksesta [16]. Tämä haittavaikutus ilmenee yleensä 1 vuoden kuluessa; se voi kuitenkin tapahtua myös useita vuosia myöhemmin lääkkeen antamista. Lisäksi antrasykliinit voivat myös aiheuttaa harvoin (alle 1%) akuutti kardiotoksisuudesta (yleensä esiintyviä 1 viikossa) [17]. Siksi kehitetään uusi lääke kohdistaa tehokas anti kasvain vaikutus, mutta jolla vähäinen sivuvaikutus kuten sydäntoksisuutta, on edelleen etsittävä syöpähoidon.

NSC745885 on uusi yhdiste kehitettiin vuonna 2009. Tämä yhdiste syntetisoitiin 1,2-diaminoanthraquinone, joka sen jälkeen reagoi tionyylikloridin ja trietyyliamiini [18]. Aiemmassa tutkimuksessa on havaittu, että NSC745885 osoittaa syövän vastaisen vaikutuksen, kun 60 solulinjan ensiölajittimesta National Cancer Institute (NCI) käytettiin. Tulokset osoittivat, että leukemia, melanooma, ja munasarjasyöpä linjat olivat erittäin herkkiä NSC745885. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, paksusuolen syöpä, neuroblastooma, eturauhassyöpä, ja rintasyövän solulinjat ovat myös herkkiä tätä yhdistettä. Lisäksi tämä edellisessä tutkimuksessa myös raportoitu, että NSC745885 on tehokas tukahduttaa solujen kasvua erilaisissa syöpäsolulinjoissa, jotka on osittain saavuttaa inhiboivan kyky telomeraasiaktiivisuus näihin soluihin [18]. Kuitenkin

in vitro

syöpälääkkeen potentiaali ja

in vivo

aktiivisuus tämän uuden yhdisteen suun syöpä ei ole tutkittu.

Tässä tutkimuksessa selvitettiin syövän potentiaalia NSC745885 suun levyepiteelikarsinoomasolu linjat ja käytettäessä

in vivo

suusyövän ksenografti- hiirimallissa. Lisäksi olemme myös arvioineet toksisuus NSC745885 muissa elimissä käsiteltyjen hiirten. Tuloksemme osoittivat, että tämä uusi yhdiste indusoi apoptoosin suun syöpäsolujen joko

in vitro

soluviljelmässä tai

in vivo

ksenografti- kasvain hiirimallissa. Lisäksi olemme myös havainneet, että

in vivo

hoidossa NSC745885 esiin mitään sytotoksisuutta pernassa, keuhko-, maksa- tai sydän koe-eläimille. Havainto Meidän tutkimuksessa todettiin, että NSC745885 voitaisiin käyttää tehokkaana lääkkeenä suun kautta syöpähoidon, ja tämä hoito voi esiintyä korkeampaa turvallisuuden kuin perinteiset antrasykliiniantibiootit tehdä.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja kemikaalit

SAS saatiin huonosti eriytetty ihmisen okasolusyöpä [19]. Tämä solulinja saatiin tohtori Jeng-Fan Lo Institute of Oral Biology, Department of Dentistry, National Yang-Ming University, Taiwan [20]. OECM-1 saatiin ienten epidermoidikarsinooman taiwanilaisen potilaalle. SCC4 ja SCC25 saatiin kielen squamous syöpäsoluja. Kaikkia solulinjoja pidettiin yllä RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 2 mM L-glutamiinia, 25 mM HEPES ja 1% penisilliini /streptomysiiniä. MRC-5-solu on normaali ihmisen sikiön keuhkojen fibroblastisolulinja (ATCC nro: CCL-171) ylläpidetään Minimum Essential Medium (MEM), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia, 2 mM L-glutamiinia, 25 mM HEPES, ja 1% penisilliini /streptomysiiniä. NSC745885 [18] saatiin tohtori Hsu-Shan Huang, Department of Pharmacy, National Defense Medical Center, Taiwan.

Growth Inhibitiomääritvs

Solut logaritmisessa kasvuvaiheessa viljeltiin tiheys 5000 solua /kuoppa 96-kuoppaisille levyille. Solut altistettiin eri pitoisuuksia NSC745885 24, 48, tai 72 tuntia. 3- (4,5-di- metyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) (Sigma, St Louis, MO, USA) käytettiin vaikutuksen arvioimiseksi NSC745885 solujen kasvuun, kuten on kuvattu aikaisemmin. IC

50 arvo johtui 50% solujen kasvun esto, joka graafisesti laskettiin vertaamalla kontrolli kasvua.

anneksiini V värjäystä

Solut pestiin PBS: llä ja resuspendoitiin 1 X Binding Buffer (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA). Uudelleensuspendoitiin solut värjättiin FITC-konjugoidulla anneksiini V (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) ja prosenttiosuus anneksiini V-positiivisia soluja analysoitiin virtaussytometrialla.

Quantitative Real-Time PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol-menetelmää (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja homogenisoinnin syöpäsolujen Trizol hajotuspuskuria seurasi kloroformilla uutto (Life Technologies). CDNA-synteesiä varten, 5 ug kokonais-RNA: ta, tehtiin käänteistranskriptio 50 ° C: ssa 60 minuutin ajan käyttämällä 200 yksikköä Superscript III käänteistranskriptaasia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Alukeparia kaspaasi-3 (sense 5′-CTG GAC TGT GGC ATT GAG AC-3 ’; antisense 5′-ACA AAG CGA CTG GAT GAA CC-3′), XIAP (sense 5’-GAC AGT ATG CAA GAT GAG TCA AGT CA-3 ’; antisense 5′-GCA AAG CTT CTC CTC TTG CAG-3′), ja GAPDH (sense 5’-GGA AGG TGA AGG TCG GAG TCA-3 ’; antisense 5’-GTC ATT GAT GGC AAC AAT ATC CAC T-3 ’) käytettiin geenien monistuminen. SYBR Green /ROX qPCR Master Mix Kit (Fermentas, Glen Burnie, Maryland, USA) käytettiin kaikkiin reaktioihin reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (PCR). Lyhyesti, PCR suoritettiin seuraavasti: yksi sykli 50 ° C: ssa 2 minuutin ajan, yksi sykli 95 ° C: ssa 10 minuuttia, minkä jälkeen 40 sykliä 15 sekunnin ajan 95 ° C: ssa, ja 1 minuutti 60 ° C: ssa. Tiedot kerättiin kolmena kappaleena ja normalisoitu GAPDH ilme.

Protein Extraction ja Western blot -analyysi

Proteiini uutettiin viljelty solu (SAS) hajotettiin solujen hajoamista, joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita (50 mmol /L Tris (pH 7,5), 30 mmol /l MgSO

4, 8 mmol /l EDTA: a, 2 mmol /l DTT: tä, ja 2% Triton X-100). Solulysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla 13000 rpm, 4 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Proteiinipitoisuudet solulysaatteja mitattiin käyttäen BCA-määrityksellä (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Western blot-analyysi suoritettiin käyttäen 50 ug proteiinia uutteet valvonnan syöpäsoluja, ja soluja käsiteltiin NSC745885 ladattiin ja erotettiin käyttäen 8% natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi. Elektroforeesin jälkeen, proteiinit siirrettiin sähköllä päälle polyvinyylifluoridista (PVDF) (Millipore, Bedford, MA, USA), joka sitten blokattiin blokkausliuosta, joka sisälsi 5% rasvatonta maitojauhetta PBS: ssä plus 0,2% Tween 20: tä (PBST) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sulkemisen jälkeen oli saatu päätökseen, kalvo pestiin 3 kertaa PBST: llä. PVDF kalvo blotattiin seuraavin ensisijainen vasta PBS: anti-XIAP; kaspaasi-3 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA); ja anti-aktiini (Sigma, St Louis, MO, USA). 2 tunnin kuluttua huoneen lämpötilassa, kalvo pestiin jälleen PBST: ssä. PVDF-kalvo inkuboitiin sitten peroksidaasiin kytkettyä anti-hiiri- tai anti-kani-lgG-vasta-aineita 1 tunti, kehitettiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssidetektiolla kit (Millipore, Billerica, MA, USA), ja analysoitiin Las-3000 kuvantamisjärjestelmä ( Fujifilm, Tokio, Japani).

Vieraslajisiirteen Kasvain Mouse Model

Kahdeksan viikon ikäiset NOD /SCID (NOD.CB17

Prkdc

SCID /J, National Laboratory Animal Center, Taiwan) hiiriä pidettiin mikro-isolaattorit erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa ja ruokitaan steriiliä ruokaa ja kloorattu steriiliä vettä. Kahdeksantoista hiiret jaettiin 2 ryhmään, ja kunkin ryhmän hiiret injektoitiin ihonalaisesti 3 x 10

6 SAS. Yhdeksän hiirtä kussakin ryhmässä käsiteltiin lisäksi NSC745885 tai doksorubisiinin (2,0 mg /kg /d /i.p..), Ja 9 hiirtä kussakin ryhmässä injektoitiin päivittäin ajoneuvon ohjaus. NSC745885 ensimmäisen injektoitiin kunkin ryhmän hiiret päivänä 3, ennen kuin kasvaimen palpoitiin ja jatkuvasti hallinnoi päivään 10 SAS-kantavissa hiirissä. Koko siirrettyjen kasvainten mitattiin joka kolmas päivä käyttäen mitataan jarrusatulat, ja tuumorin tilavuus laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: tilavuus (V) = 1/2 x (pituus x leveys

2). Lopussa hoidon, hiiret lopetettiin, ja kasvaimet poistettiin, punnittiin, ja valokuvattiin.

Ethics selvitys

Kaikki eläinkokeet suoritettiin vakiintuneiden ohjeiden mukaisesti ja hyväksyttiin NDMC Institutional Animal Care ja käyttö komitea. Yritettiin kärsimyksen minimoimiseksi koe-eläinten (hyväksymisnumero: IACUC-11-044).

immunohistokemiallinen värjäys

immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin käyttäen avidiini-biotiini menetelmä kuvataan seuraavasti. Kudosleikkeet vaha ksyleeniin ja niihin lisätään alkoholiin. Antigeeni haku suoritettiin inkuboimalla 0,01 mol /l sitraatti- puskuria (pH 6,0) 95 ° C: ssa 40 minuuttia vesihauteessa. Endogeeninen peroksidaasi estettiin 0,3% vetyperoksidia 30 minuuttia. Sitten leikkeitä inkuboitiin 5% normaalia hevosen seerumia PBS: ssä 30 minuuttia huoneen lämpötilassa estää epäspesifisen vasta-aineen reaktiota. Pesun jälkeen TBS ja 0,1% Tween 20, kalvot inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa anti-ihmisen kaspaasi-3 ja XIAP-vasta-ainetta (DAKO, Osaka, Japani). Sen jälkeen, kun huuhdeltiin TBS: ssä ja 0,1% Tween 20, kudoksen leikkeitä inkuboitiin 40 minuutin ajan huoneenlämpötilassa biotinyloidun anti-hiiri-IgG ja sen jälkeen avidiini-biotiini-peroksidaasi-kompleksin (Vecstatin Elite ABC-kitti, Vector Laboratories, Inc., Burlingame , CA) 40 minuutin ajan. Tämän jälkeen kudosleikkeet värjättiin 0,003% 3,3-diaminobenzide tetrahydrochloride ja 0,005% vetyperoksidia 0,05 mol /L Tris-HCI (pH 7,2), vastavärjättiin Mayerin hematoksyliinillä, kuivattu, ja asennettu.

arviointi immunohistokemiallinen värjäys

immunohistokemiallinen menettely lisäämättä primaarista vasta-ainetta käytettiin negatiivisena kontrollina kussakin tapauksessa. Intensiteetti kaspaasi-3 ja XIAP immunoreaktiivisuus kasvaimen solut sijoitettiin 3 ryhmään, ja standardisoitu värjäys tasolla kuin positiivisen sisäisen valvonnan asteikolla 0 (ei värjäystä), 1 (heikko värjäytyminen), 2 (kohtalainen värjäys) ja 3 (vahvin intensiteetti). Jakelu kaspaasi-3 ja XIAP merkintöjä myös mitattiin mukainen osuus, jotka värjäytyivät positiivisesti kasvaimen soluja (0-100) on kasvaimen kokonaistilavuus kussakin osassa. Arvioidaan jakeluasemilla kaspaasin 3 ja XIAP ilmaisuja helpommin ja tehokkaammin, 50% pidettiin cutoff pisteen. Verrata ohjaus- ja NSC745885-käsitellyssä ryhmässä, prosenttiosuus kaspaasi-3 ja XIAP-positiiviset solut kussakin intensiteetti kerrottuna vastaavalla intensiteetti (0-3), jolloin saatiin immunovärjäyksellä pisteet välillä 0 300.

tilastollinen analyysi

Statistical Package for Social Sciences (SPSS versio 10.0 for Windows, Chicago, IL, USA) käytettiin analyysin suorittamiseksi kerättyjen tietojen.

t

-testin ja yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA), jossa Scheffen post-hoc testiä käytetään määrittämään, onko merkittäviä suhteita olemassa joukossa kvantitatiivisia tuloksia. Arvot

P

0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

kasvua estävä vaikutus NSC745885 on Oral Cancer Cell Lines

vaikutuksen tutkimiseksi NSC745885 hoito suun okasolusyöpä, käsittelimme SAS suun syöpäsolut eri pitoisuuksilla NSC745885 24 tuntia ja havaittu niiden morfologisia muutoksia käyttämällä faasikontrastimikroskoopissa. Hoito NSC745885 pitoisuuksina 3 5 um merkittävästi vähentynyt tiheydet viljeltyjä soluja verrattuna käsittelemättömiin soluihin (kuvio. 1A). Arvioida kasvua estävä vaikutus NSC745885, SAS solut tehtiin eri annoksilla NSC745885, ja numerot eloonjääneiden solujen mitattiin eri ajankohtina, ja verrattuna käsittelemättömien solujen MTT-määrityksellä. Numerot elossa SAS soluja vähensi jälkeen NSC745885 hoidon ajasta ja annoksesta riippuva tavat (Fig. 1B-1D). IC

50 NSC745885 oli 0,85 uM SAS soluihin 72 tunnin hoidon (Fig. 1 D). Nämä tulokset osoittivat, että NSC745885 osoitti kasvua estävä tai kuoleman edistävän vaikutuksen SAS soluihin. Havaitsemiseksi apoptoottisten SAS soluja, teimme anneksiini V-värjäys arvioida suhteessa anneksiini V, positiivinen mukaisesti erilaisten annosten NSC745885 hoidon 24 tunnin kuluttua. Prosenttiosuudet anneksiini V-positiiviset solut kasvoivat annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 2A-2E). On huomattavia eroja, kun hoito annos oli suurempi kuin 0,5 uM (kuvio. 2F). Tämä tulos osoitti, että NSC745885 indusoi aikaista apoptoosin SAS solussa.

(A) Morfologiset muutokset SAS soluissa. -Soluja käsiteltiin osoitetulla annoksilla NSC745885 24 tuntia. Annokset yli 3 μΜ aiheutti solukuolemaa SAS soluissa. Selviytyminen NSC745885 käsiteltyjen SAS soluissa arvioitiin MTT: llä eri aikoina ja annoksia. (B) 24 tunnin kuluttua hoidon, eloonjäämisen SAS-solut osoittivat merkittävää eroa annoksina yli 1 uM. (C) 48 tunnin kohdalla, hoito 1 uM tai suurempi kuin annokset NSC745885 osoittivat merkittävää syövän vaikutusta. (D) 72 tunnin kuluttua hoidon jälkeen IC50 NSC745885 oli 0,85 uM SAS-soluissa. Survival osuus (%) osoitti suhteellinen arvo verrattuna ajoneuvon hallinnan ryhmien SAS (n = 3, *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001, ns. Ei-merkitsevä).

SAS-soluja käsiteltiin (A-E) osoitti annoksia NSC745885 24 tuntia. Kerätyt solut värjättiin FITC-konjugoidulla anneksiini-V: n ja analysoitiin virtaussytometrialla. (F) Prosenttiosuudet anneksiini V-positiivisten solujen alle NSC745885 hoitoa verrattiin vehikkelikontrollit (0 uM) (n = 3, **, P 0,01; ***, P 0,001, ns. Ei-merkitsevä).

lisäksi olemme tutkineet kasvua estävä vaikutus muiden suun kautta syöpäsolulinjoissa, mukaan lukien OECM-1, SCC25, ja SCC4. Olemme havainneet, että NSC745885 oli myös merkittävä kasvua estävä vaikutus OECM-1-soluissa annoksina 1 uM tai enemmän joko 24 tai 48 tunnin kuluttua lääkkeen hoidon (Fig. 3A ja 3B). Tämä yhdiste jopa osoitti korkeampaa estävää tehoa SCC4 soluissa (Kuva. 3C ja 3D). Sitä vastoin on merkittäviä eroja vain 4 uM SCC25 solujen joko 24 tai 48 tuntia (Kuva. 3E ja 3F). Sen tutkimiseksi, vaikutuksen NSC745885 normaaleissa kudoksissa, arvioitiin myös sytotoksista vaikutusta tämän lääkkeen MRC-5-solut (normaali ihmisen sikiön keuhkojen fibroblastisolulinja) [21]. Tuloksemme että vain korkeat pitoisuudet NSC745885 (4 uM) vaikuttavat merkittävästi kasvua MRC-5-soluissa (kuvio. 3G ja 3H), mikä osoittaa, että NSC745885 osoittaa spesifisyyttä syöpäsoluja.

Suun syöpäsolujen ( OECM-1, SCC4 ja SCC25) ja normaali keuhkojen fibroblasti MRC-5 solu hoidettiin NSC745885 24 tai 48 tuntia ilmoitettuina pitoisuuksina. Elinkelpoisuuden näistä solulinjoista arvioitiin MTT assay.The tulokset osoittivat, että alhaiset mikromolaarisia konsentraatioita NSC745885 indusoidun (A) SAS solukuolemaa, mutta ei vaikuttanut kasvua (G ja H) MRC-5-soluissa (n = 3, * P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001, ns. ei-merkitsevä).

NSC745885 hoito indusoi apoptoosia SAS Cells

jotta voidaan tutkia vaikutus NSC745885 on apoptoosin induktio SAS, solut käsiteltiin erilaisilla annoksilla NSC745885 24 tunnin ajan, ja mRNA: n ilmentymisen kaspaasi-3 mitattiin käyttäen reaaliaikaisen RT-PCR: llä. Tuloksemme osoittivat, että ilmentyminen kaspaasi-3 oli merkittävästi lisääntynyt NSC745885 hoitoon annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 4A). Proteiini kaspaasi-3 ja pilkottiin kaspaasi-3 SAS solut määritettiin myös käyttämällä western blot. Oli merkittävä kasvu kaspaasi-3 ja halkaistut kaspaasi-3-hoidon suurempina pitoisuuksina 1 uM (kuvio. 4B). Suhteellinen proteiinin tasot eri annoksia verrattiin käyttäen tiheysmittari, näytetään yhdenmukaiset tulokset suoralla havainto Western blot (Fig. 4C ja 4D). Nämä tiedot osoittivat, että NSC745885 indusoi apoptoosin SAS soluja.

(A) suhteellinen RNA-ilmentymisen taso kaspaasi-3 SAS käsitelty solu ilmoitetuilla annoksilla NSC745885 24 tunnin ajan arvioitiin käyttäen reaaliaikaista RT-PCR: llä. Ekspressio kaspaasi-3: merkitsevästi lisääntynyt NSC745885 annostusalueella-riippuvaisella tavalla. (B) Kaspaasi-3 ja pilkottiin kaspaasi-3-proteiinin tasot SAS käsitelty solu NSC745885 48 tuntia kvantitoitiin käyttäen western blot. (C) tulokset western blot in kaspaasi-3 arvioitiin 3 itsenäisestä kokeesta ja normalisoitu β-aktiini (*, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001; ns. ei-merkitsevä). Proteiini taso kaspaasi-3-oli korkein 1,5 μΜ on NSC745885 hoitoon. (D) tulokset western blot in lohkaista kaspaasi-3 arvioitiin 3 itsenäisestä kokeesta (*, P 0,05, ns. Ei-merkitsevä).

NSC745885 Vähentää RNA ja Protein Expression of XIAP SAS solut

X-sidottu estäjä apoptoosin proteiinia (XIAP) on todettu antiapoptoottisena proteiinin nisäkässoluissa [22]. Se on ratkaiseva rooli apoptoosin sekä syöttämällä-reseptorivälitteisen ja mitokondriot-välitteisen reittejä [23], [24]. Tuore tutkimus osoitti lisäksi, että XIAP on ennustaja kemoterapian vasteen ja ennusteen kehittyneen pään ja kaulan alueen syöpäpotilasta [25]. Näin ollen, myös vaikutuksen tutkimiseksi NSC745885 on XIAP-geeni ja proteiinin ekspression suun syöpäsoluja, käsittelimme SAS syöpäsolujen eri pitoisuuksien kanssa (0 uM, 0,5 uM, 1,0 uM, 1,5 uM, ja 2,0 uM) 24 tunnin ajan , ja sitten määritettiin niiden muutos geenien ilmentyminen käyttämällä Q-PCR. Kontrolliin verrattuna soluihin, ilmaisu XIAP-geeni laski merkittävästi NSC745885 hoitoon annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 5A). Olemme myös käsitelty SAS syöpäsolujen eri pitoisuuksien kanssa (0 uM, 0,5 uM, 1,0 uM, 1,5 uM, ja 2,0 uM) 48 tunnin ajan, ja sitten määritettiin niiden proteiinin ilmentyminen muuttuu käyttämällä western blot. Merkittävä väheneminen XIAP havaittiin hoidon aikana suurempina pitoisuuksina 1 uM (kuvio. 5B). Suhteellinen proteiinin tasot eri annoksia verrattiin myös käyttämällä tiheysmittari, näytetään yhdenmukaiset tulokset suoralla havainto Western blot (kuvio. 5C). Nämä tulokset osoittivat, että NSC745885 osoitti apoptoosin edistävä vaikutus SAS soluissa.

suhteellinen RNA ilmentymisen taso XIAP SAS käsitellyissä soluissa ilmoitetuilla annoksilla NSC745885 arvioitiin 24 tuntia käyttäen reaaliaikaista RT- PCR. Ilmaus XIAP laski merkittävästi NSC745885 hoitoon annoksesta riippuvalla tavalla. (B) ilmentymistä XIAP SAS käsitellyissä soluissa NSC745885 kvantifioitiin käyttämällä western blot 48 tunnin hoidon. (C) Western blot tuloksia arvioitiin 3 itsenäisestä kokeesta ja normalisoitu β-aktiini (*, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001). Proteiini taso XIAP pieneni annoksesta riippuvalla tavalla.

NSC745885 Estää SAS Cell Growth

in vivo

arvioimiseksi anti-kasvain potentiaalin NSC745885 Oraalisia syöpä

in vivo

teimme käsitellä tällä tavoin vierassiirrännänmallissa kasvain hiirimallissa. SAS-solut ympättiin NOD /SCID-hiiriin, ja NSC745885 injektoitiin päivänä 3 kussakin ryhmässä hiirten, ennen kasvaimen palpoitiin, ja annetaan päivittäin päivään 10 hiirillä,. Kasvaimen koko pieneni käsitellyissä hiirissä verrattuna kasvain ohjaus hiirillä, joita hoidettiin pelkällä vehikkelillä (Fig. 6A). SAS -ksenografteja pienentää painoa 23 ± 10,39% kanssa NSC745885 hoitoon (Fig. 6B). Ruumiinpainot ohjaus- ja NSC745885-käsitellyillä hiirillä arvioitiin myös päivänä 1 ja 10 lääkkeen antamisen jälkeen. Mitään merkittäviä eroja olemassa kehon painon ohjaus- tai NSC745885-käsiteltyjen hiirten (Fig. 6C). Nämä tulokset osoittivat, että NSC745885 hoitoa 2 mg /kg osoittivat anti-suusyövän vaikutus, ja tämä hoito ei johtanut selvästi myrkyllisyyden koe hiirillä.

(A) syöpäsolun istutettu NOD /SCID-hiiriin annettiin kanssa NSC745885 (2 mg /kg /d). Siirto tehty kasvaimia eristettiin päivänä 10 lääkkeen antamisen jälkeen. NSC745885 hoito vähensi merkitsevästi kasvaimen kokoa verrattuna ajoneuvon ohjaus. (B) Keskimääräinen kasvaimen paino oli välillä verrattuna NSC745885-käsitellyn ja PBS-kasvaimen kantavien hiirten päivänä 10 (n = 9, *, P 0,01). (C) Kehon paino kokeellinen hiirillä ei merkittävästi supistunut kanssa NSC745885 hoidon verrattuna PBS: llä käsiteltyihin kontrolleihin.

NSC745885 apoptoosin in ksenosiirrettyjä tuumorisoluissa

tarkkailla suoraan apoptoottinen vaikutus NSC745885 tuumorisoluihin

in vivo

teimme immunohistokemiallisella värjäyksellä arvioida tilan apoptoottisen proteiinin kaspaasi-3-ksenografteissa. 10 päivän jälkeen transplantaatiosta ksenograftit poistettiin, mitattiin koko, ja tutkittiin HE ja immunohistokemiallisella värjäyksellä. Kasvainten NSC745885-käsiteltyjen hiirten kudosvaurion kasvaimen osittain (Fig. 7A), ja selvästi suurempi määrä apoptoottisten solujen (kaspaasi-3-positiivinen solu) verrattuna kontrollien tuumoreiden (Fig. 7B). Olemme myös arvioineet ilmaus XIAP että ksenografteissa. Tuloksena paljastui, että NSC745885-käsitellyillä hiirillä osoittivat selvästi hitaampaa määrä anti-apoptoottisten solujen (XIAP positiivinen solu) verrattuna kontrollien tuumoreiden (Fig. 7C). Ilmaisun tulokset kaspaasi-3-positiiviset solut olivat 1,21 ± 0,04 ja 2,87 ± 0,03 kontrolliryhmässä ja NSC745885-käsitellyssä ryhmässä, vastaavasti (Fig. 7D). Ilmaisu tulokset on XIAP positiiviset solut olivat 2,24 ± 0,03 ja 1,16 ± 0,02 kontrolliryhmässä ja NSC745885 hoidetussa ryhmässä, tässä järjestyksessä (Kuva. 7E). Näin ollen meidän tulokset osoittivat, että NSC745885 vähentää leviämisen SAS syöpäsolujen, ja aiheuttivat kasvaimen vastainen vaikutus

in vivo

läpi apoptoosin.

(A) histologinen muutokset kasvaimen köynnöksen arvioitiin käyttäen HE värjäystä. Vertaamalla puskurivertailusta kanssa NSC745885 saaneissa ryhmissä paljasti selvästi tuumorinekroositekijä vuonna NSC745885 hoidetussa ryhmässä. (B) ekspressiotaso kaspaasi-3 eristetyssä kasvaimen siirteet arvioitiin käyttäen immunohistokemiallista värjäystä. (C) Ilmaisu taso XIAP eristetyissä kasvain köynnöksen arvioitiin myös käyttämällä immunologiseen histokemiallisella. Ilmaisu tulokset kaspaasi-3 (D) ja XIAP (E) kvantitoitiin, paljastaen ekspression lisääntymisen kaspaasi-3 NSC745885 hoitoon (P 0,05). Sitä vastoin ilmaus XIAP kasvainten köynnösten laski tähän hoitoon (P 0,05).

Effects of NSC745885 painon hiirissä

Voit selvittää NSC745885 hoidon syiden laihtuminen, me seurataan muuttaminen painon kokeellisen hiirillä. Merkittävä sytotoksinen vaikutus NSC745885 paljastettiin antaminen päivittäin NOD /SCID annoksena 40 mg /kg /d (Fig. 8A). Kehon paino käsitellyissä hiirissä suurempi annos oli merkittävästi vähentynyt, ja kaikki hiiret kuolivat päivällä 14. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että suurin siedetty annos NSC745885 hiirillä oli 40 mg /kg /d. Sen määrittämiseksi, ovatko NSC745885 hoito luotu sytotoksisuutta elimissä kokeellisen hiirten, pernat, keuhkot, maksa, ja sydämet kerättiin PBS-käsitellyn ja NSC745885 käsitellyillä hiirillä päivänä 14 ja arvioitiin käyttäen histologisia määritystä. Ei ilmeisiä eroja ollut elimissä PBS-käsitellyt tai NSC745885 käsitellyillä hiirillä (kuviot. 8B-8E). Tämä tulos osoitti, että päivittäinen hoito NSC745885 2,0 mg /kg /d i.p. herättänyt ole merkittyjä haittavaikutuksia hiirissä.

(A) NOD /SCID-hiiriä käsiteltiin PBS: lla tai osoitettu päiväannokset NSC745885, ja kehon painot näiden hiirten mitattiin. Vaikutus NSC745885 hoidon elinten kokeellisen hiirten arvioitiin käyttäen histologisia määritystä ja HE värjäämällä päivänä 14. Ei ilmeisiä eroja oli olemassa (B) perna, (C) keuhko, (D) maksa, tai (E) sydämessä PBS-käsitellyn ja NSC745885 käsitellyillä hiirillä.

vertailut turvallisuudesta ja anti-kasvain Tehokkuus välillä NSC745885 ja doksorubisiinin

Jos haluat vertailla turvallisuuden NSC745885 doksorubisiinin, me käsitellyistä NOD /SCID-hiirissä, joilla näiden kahden yhdisteen annoksella 2 mg /kg /d ip 10 päivää. Selviytyminen ja painon kokeellisten hiiriä seurattiin päivittäin. Tuloksemme osoittivat, että 50% Doksorubisiinin hoidetuista hiiristä oli kuollut päivänä 11. (Kuva. 9A). Sitä vastoin kaikki NSC745885-käsitellyistä hiiristä oli elossa päivänä 11 (kuvio. 9A). On huomattava vähentynyt painon doksorubisiinin-käsiteltyjen hiirten verrattuna NSC745885-käsiteltyjen ryhmien (Fig. 9B). Nämä tulokset osoittivat, että NSC745885 näytteillä korkeampaa turvallisuustasoa kuin doksorubisiini. Lisäksi olemme verrattuna anti-kasvain tehokkuutta näiden kahden lääkkeen mittaamalla kasvaimen painot vierassiirrekokeissa kasvain malli. NOD /SCID-hiiriin inokuloitiin SAS soluja ja käsiteltiin 2 mg /kg /d i.p. doksorubisiinin tai NSC745885 päivästä 3 päivää 10 post soluinokulaation. Kasvaimet kerättiin talteen päivänä 11 (kuvio. 9C, n = 9) ja tuumorit punnittiin. Ei ole merkittävää eroa doksorubisiini-käsiteltyjen ja NSC745885-käsiteltyjen ryhmien (Fig. 9D, n = 9), joka osoittaa vastaavan anti-kasvain tehokkuutta näiden kahden lääkkeitä.

syöpäsolun implantoitiin NOD /SCID-hiiriin