Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kertyvät todisteet osoittavat, että pieni populaatio syövän kantasoluja (CSCS) on mukana luontainen resistenssi syövän hoitoon. Hypoksia microenvironment on tärkeä kantasolu kapealla joka edistää pysyvyys CSCS kasvaimissa. Meidän Tavoitteena oli valottaa roolia hypoksia ja CSCS vastuksessa gefitinibin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) kanssa aktivoivan epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) mutaatio. NSCLC solulinjat, PC9 ja HCC827, jotka ilmentävät

EGFR

eksoni 19 deleetiomutaatioiden, altistettiin suuren pitoisuuden gefitinibin alle normoxic tai hypoksinen olosuhteet. Seitsemän päivän kuluttua Gefitinibialtistus, pieni osa elinkelpoisten solujen havaittiin, ja nämä olivat kutsutaan ”gefitinibin kestävä persisters” (GRP). CD133, Oct4, Sox2, Nanog, CXCR4 ja ALDH1A1-kaikkien geenien mukana stemness-olivat erittäin ilmaistaan ​​bruttopeittoon vuonna PC9 ja HCC827 soluja, ja PC9 bruttopeittoon näytteillä korkean mahdollisesti tuumoreita

in vivo

. Ilmaisu insuliinin kaltaisen kasvutekijä 1 (IGF1) oli myös voimistunut ja IGF1 reseptori (IGF1 R) oli aktivoitu bruttopeittoon. Tärkeää on, hypoksinen altistuminen huomattavasti pallo muodostumista, mikä itseuudistumisen valmiudet, ja väestö CD133- ja Oct4-positiivisia bruttopeittoon. Lisäksi hypoksia upregulated IGF1- ilmaisun hypoksia-indusoituva tekijä 1α (HIF1α), ja merkittävästi edistänyt aktivoituminen IGF1 R on bruttopeittoon. Knockdovvn IGF1- ilmaisun vähensi merkitsevästi fosforyloitua IGF1 R-ilmentävien bruttopeittoon hypoksisissa olosuhteissa. Lopuksi esto HIF1α tai IGF1 R erityisiä estäjät merkittävästi vähentynyt väestön CD133- ja Oct4-positiivisia bruttopeittoon, jotka kasvoivat hypoksia PC9 ja HCC827 soluja. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että hypoksia lisäsi väestö keuhkojen CSCS vastustuskykyisiä gefitinibin

EGFR

mutaatio-positiivisia NSCLC aktivoimalla IGF1 R. Kohdistaminen IGF1 R reitti voi olla lupaava strategia voittamiseksi gefitinibi resistenssin

EGFR

mutaatio-positiivisia NSCLC aiheuttama keuhkojen CSCS ja mikroympäristölle tekijät, kuten kasvain hypoksiaa.

Citation: Murakami A, Takahashi F , Nurwidya F, Kobayashi I, Minakata K, Hashimoto M, et al. (2014) Hypoksia Lisäykset Gefitinibi hylkivät Lung Cancer Kantasolut kautta aktivointi Insuliini kasvutekijä 1 -reseptorin. PLoS ONE 9 (1): e86459. doi: 10,1371 /journal.pone.0086459

Editor: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 01 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 13 joulukuu 2013; Julkaistu: 28 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Murakami et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Grant-in-aidsin tieteellisen tutkimuksen nro 23591906 (Fumiyuki Takahashi) alkaen opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology of Japan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

osto kestävyys syöpälääkkeiden edelleen keskeinen este parantamiseksi ennustetta syöpäpotilaita. Lääkeaineresistenssi voi tapahtua erilaisia ​​mekanismeja, kuten lääkevuoto- syöpäsoluista, täydennetty lääkeainemetaboliaan, toissijainen mutaatiot lääkkeen kohde, ja sitoutuminen vaihtoehtoisten eloonjäämisreittejä [1]. Nämä mekanismit Hankitun resistenssin johtuvat yleensä geneettisiä muutoksia sisällä kasvainsoluja, jotka jatkuvat aikana syövän hoidossa. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset ovat myös osoittaneet, ei-mutaatiosubstituoimalla mekanismeja lääkeresistenssi, mukaan lukien olemassa pieni populaatio syövän kantasoluja (CSCS) [2]. CSCS, joka tunnetaan myös kasvaimen aloittamista solut ja varsi-, kuten syöpäsolujen, express kantasolujen merkkiaineita, kuten CD133, ABCG2, Bmi-1, ja Oct4, ja ne voivat muodostaa kelluvia palloja seerumittomassa väliaineessa, ominaisuus, joka liittyy kantasolujen solut [3] – [5]. Lisääntyvä näyttö osoittaa, että pieni väestö CSCS ovat luonnostaan ​​vaikeammissa erilaisia ​​syöpälääkkeiden ja vastaavat vastustuskykyä syövän hoitoon, joka usein liittyy kasvaimen uusiutumisen [6]. Näin ollen, CSCS voi parantaa hoidon tuloksia ja johtaa kehittää uusia hoitomuotoja syöpäpotilaille.

Kantasolujen ”markkinaraon” määritellään tiettyihin paikkoihin tai mikroympäristöihin joka ylläpitää ominaisuudet kantasolun itseuudistumisen ja multipotenttisuus [ ,,,0],7], [8]. Kiinteät kasvaimet sisältävät usein alueita, joissa on riittämätön hapensaanti, edellytys tunnetaan hypoksia, ja useat viimeaikaiset raportit ovat osoittaneet, että hypoksia edistää pysyvyys CSCS kasvaimissa [9]. Tämä hypoksinen markkinarako vastaa CSC ylläpitoon ja sillä on rooli terapeuttinen vastus [10]. Näin ollen, hypoksia microenvironment voi olla toinen lupaava strategia tehokkaan valvonnan CSCS [9].

Pitkälle edennyt ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on johtava syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti [11]. Somaattisista mutaatioista on epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) geeni, kuten lukukehyksessä olevan deleetion eksonissa 19, on liitetty myönteistä vastausta EGFR-tyrosiinikinaasi-inhibiittorit (EGFR-TKI:), gefitinibi ja erlotinibi [12]. EGFR kinaasidomeeni mutaatioita esiintyy huomattavasti tiheämmin kasvaimia Itäaasialaiset potilailla verrattuna ei-aasialaiset [13]. Useimmissa raporteissa, ilman taudin etenemistä potilaiden ei enempää kuin 12 kuukautta, ja useimmat potilaat kehittyi hankittu resistenssi [14]. Lisäksi 25-30% potilaista ovat luonnostaan ​​resistenttejä EGFR-TKI niiden kasvaimet ovat diagnosoitu kätkeminen aktivoivia mutaatioita

EGFR

[15], [16]. Tärkeimmät tavat resistenssin tunnistettu tähän mennessä toissijaiset mutaatiot ja ”onkogeeni kinaasi kytkin.”

EGFR

T790M mutaatio osuus 50%: ssa tapauksista, ja

MET

vahvistus voidaan havaita 20 % potilaista, joilla

EGFR

-mutant TKI-resistenttejä NSCLC [17]. Kuitenkin mekanismit vastaava luontainen resistenssi ja muiden kehittynyt resistenssi EGFR-TKI, samoin kuin kysymys siitä, onko CSCS ja hypoksinen kapeampiin edistää EGFR-TKI vastus, ei täysin tunneta.

IGF1 R on transmembraaninen reseptorityrosiinikinaasin vastaa solujen lisääntymistä ja eloonjäämisen [18]. IGF1 R on ilmaistu monenlaisia ​​syöpäsolujen, mukaan lukien NSCLC [18], ja parannettu aktivointi IGF1 R on osallisena vastustuskyvyn kemoterapiaa ja kohdennettuja hoitomuotojen kuten EGFR-TKI: [19], [20]. Useat viimeaikaiset raportit ovat ehdottaneet, että IGF1 R on keskeisessä asemassa selviytymisen joidenkin CSCS [21]. Solunsalpaajaresistentti kolorektaalisyöpä soluja rikastettiin CSCS ja lisääntynyt herkkyys IGF1 R esto [21]. Mukaan Sharma et al., Lääke sietävä subpopulaatio seuraavat tappavaa lääkealtistuksen näytti olevan CSC fenotyyppi ja ilmaisi fosforyloituu IGF1 R useissa testattu solulinjassa malleja, mukaan lukien NSCLC solulinjan PC9. Yhteiskäsittely of PC9 solujen EGFR-TKI plus IGF1 R-estäjän esti syntyminen lääkkeen sietävien CSC fenotyyppi [2]. Collective löydökset viittaavat mahdollinen rooli IGF1 R signaloinnin huumeiden toleranssi CSCS EGFR-TKI. Kuitenkin korrelaatio hypoksia, CSCS, ja IGF1 R signalointia EGFR-TKI vastus ei ole selvitetty.

Tässä tutkimuksessa selvitimme roolia hypoksian pysyvyys keuhkojen CSCS vuonna gefitinibin resistenssin NSCLC on aktivoivia

EGFR

mutaatioita. NSCLC solulinjat PC9 ja HCC827 kantaen aktivoiva

EGFR

mutaatio, altistettiin suuren pitoisuuden gefitinibin alle normoxic tai hypoksinen olosuhteet. Huomasimme, että hypoksia lisäsi gefitinibi kestävä keuhko CSCS in

EGFR

mutaatio-positiivisia NSCLCs aktivoimalla IGF1 R. Biologinen merkitys hypoksia varten pysyvyys gefitinibin vastustuskykyisten CSCS ja parannettu aktivointi IGF1 R tutkittiin.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

NSCLC solulinjat PC9 ja HCC827, jotka ilmentävät

EGFR

eksoni 19 deleetiomutaatioiden (ΔE746-A750), käytettiin tässä tutkimuksessa. PC9 solut perustettiin Tokiossa Medical University (Tokio, Japani), kuten aiemmin on kuvattu [22], ja ystävällisesti Dr. Kazuto Nishio (Department of Genome Biology, School of Medicine, Kinki University, Osaka). HCC827-solut saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Solulinjat varmistettiin olevan mycoplasma-vapaa. Soluja viljeltiin RPMI-1640-alustassa (Wako, Osaka, Japani), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), penisilliiniä ja streptomysiiniä (100 U /ml ja 100 ug /ml, vastaavasti), ja kasvatettiin kosteutetussa 5% CO

2 ilmakehässä 37 ° C: ssa inkubaattorissa, jossa happi jännitys pidettiin joko 21% (normoksia) tai 1% (hypoksia). Gefitinibi ostettiin JS Research Chemicals Trading (Wedel, Saksa). YC-1 ja AEW541 ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) ja Selleck Chemicals (Houston, TX, USA), vastaavasti.

Generation Gefitinibin kestävä Persisters (GRP)

yhteensä 2 x 10

5 solua maljattiin kymmenen 10-cm: n maljoilla ja annettiin kiinnittyä 24 tunnin ajan. Soluja käsiteltiin sitten gefitinibin pitoisuudessa 1 uM, joka on 30-50 kertaa vakiintunut IC

50-arvot, ja inkuboitiin normoksia (21% O

2) tai hypoksian (1% O

2). Media korvattiin tuoreella väliaineella, joka sisälsi gefitinibiä joka 3 päivä. Elävät solut että pysyi kiinni lautasen päivänä 7 alle normoxic tai hypoksinen olosuhteet katsottiin gefitinibin kestäviä persisters (bruttopeittoon) tai hypoksinen gefitinibi kestävä persisters (hypoksinen bruttopeittoon), vastaavasti, ja kerättiin analyysiä varten. Geneettistä identiteettiä bruttopeittoon kanssa vanhempien soluihin varmistettiin käyttämällä GenomeLab Human STR Primer asettaa Beckman Coulter (Fullerton, CA, USA), mukaan valmistajan ohjeiden.

Quantitative Reaaliaikainen PCR

Yhteensä-RNA: t uutettiin solulinjoista käyttämällä Mirvana miRNA Isolation kit (Ambion, Austin, TX, USA). cDNA tuotettiin 1 tai 2 ug RNA: ta käyttäen First-Strand cDNA Synthesis Kit (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) mukaan valmistajan protokollaa. Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (qPCR) suoritettiin käyttäen Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), kuten aiemmin on kuvattu [22]. Seuraava ohjelma ajettiin: tilalla 95 ° C: ssa 20 sekuntia, vahvistus kautta 40 sykliä (denaturaatio 95 ° C 3 s, hehkutus, ja pidennys 60 ° C: ssa 30 sekuntia), jossa on samanaikainen sulana käyräanalyysi. Arvioimme yksitoista taloudenhoito geenejä (

ACTB, GAPDH, UBC, B2M, YWHAZ, SF3A1, 28S rRNA, EIF4A2, SDHA, TOP1,

ja

ATP5B

) kokeellisissa näytteissä tunnistaa eniten vakaasti ilmaisi ohjaus geenien avulla geNorm ohjelmistoa (https://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/). Aktiini beeta (

ACTB

) ja sukkinaattidehydrogenaasi monimutkainen, alayksikkö flavoproteiinista (

SDHA

) tunnistettiin vakain taloudenhoito geenit meidän solussa mallien qPCR analyysi; Näin ollen,

ACTB

tai

SDHA

käytettiin sisäiset kontrollit.

alukkeita, jotka olivat spesifisiä geenejä olivat seuraavat:

CD133

Forward, 5′-GGCCCAGTACAACACTACCAA-3 ’

Käänteinen, 5′-CGCCTCCTAGCACTGAATTGATA-3′

Oct4

Forward, 5′-GAGTGAGAGGCAACCTGGAG-3 ”

Käänteinen, 5′-GCCGGTTACAGAACCACACT-3 ’

Sox2

Forward, 5′-TACAGCATGTCCTACTCGCAG-3′

Käänteinen, 5′-GAGGAAGAGGTAACCACAGGG -3 ’

Nanog

Forward, 5′-TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT-3′

Käänteinen, 5′-AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG-3 ’

CXCR4

Forward, 5′-ACGCCACCAACAGTCAGAG-3 ’

Käänteinen, 5′-AGTCGGGAATAGTCAGCAGGA-3′

ALDH1A1

Forward, 5′-GCACGCCAGACTTACCTGTC-3 ’

Käänteinen, 5′-CCTCCTCAGTTGCAGGATTAAAG-3 ’

IGF1-

Forward, 5′-GCTCTTCAGTTCGTGTGTGGA-3′

Käänteinen, 5′-CGACTGCTGGAGCCATACC-3 ”

Immunofluoresenssikoe

PC9 tai HCC827 soluja kasvatettiin Lab-Tek kammio II dioja (Nunc, Rochester, NY, USA) kanssa tai ilman 1 uM tai 2 uM gefitinibin ja alle normoxic tai hypoksinen olosuhteissa 72 tuntia, kiinteä 8% paraformaldehydillä 20 min ajan, ja läpäiseviksi 0,1% Triton X-100: ssa 3 min. Kun oli salvattu 10% vuohen seerumia fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, soluja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli seuraavien primaaristen vasta-aineiden: CD133 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Saksa), Oct4 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), IGF1- (Abcam, Cambridge, UK), ja pIGF1R (Sigma-Aldrich). Proteiinit visualisoitiin inkuboimalla sekundaarisella vasta-aineella leimattu Alexa Fluor 488 vuohen anti-kani-IgG- tai Alexa Fluor 594 vuohen anti-hiiri-IgG: tä (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Objektilasit kiinnitettiin käyttämällä Vectashield Mounting Medium DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Kuvat saatiin Axioplan 2 kuvantamisen (ZEISS, Oberkochen, Saksa), jossa AxioVision ohjelmistot (ZEISS). Kuvat käytetään vertailuja eri solujen ja /tai hoitoja hankittiin samoilla laitteen asetukset ja valotusaika ja käsiteltiin samalla tavalla. Määrä CD133-, Oct4-, ja fosforyloitu IGF1 R-positiiviset solut laskettiin; suhde positiivisten solujen laskettiin viidellä kutakin koetta.

Sphere Muotoilu Pitoisuus

Single-solususpensio viljelmiä valmistettiin tiheydet 2,5 × 10

3 solua kuoppaa seerumittomassa DMEM /F12 (Gibco, Grand Island, NY, USA) täydennettynä kaupallisten hormonin sekoitus B27 (Gibco), EGF (20 ng /ml; Gibco), FGF (20 ng /ml; Invitrogen), ja hepariinia ( 2 ug /ml), ja ympättiin 6-kuoppaisille ultra-low kiinnityslevyt (Corning, Corning, NY, USA). PC9 vanhempien solut ja bruttopeittoon inkuboitiin alla happiolosuhteissa, kun taas PC9 hypoksinen bruttopeittoon inkuboitiin hypoksisissa olosuhteissa. Viljelyalusta korvattiin 3 päivän välein; määrän ja koon pallojen tallennettiin ja immunofluoresenssilla analyysit tehtiin 7 päivää alkamisen kulttuurin jakson [23].

RNA Häiriöitä

Pieni häiritsevät RNA: t (siRNA: t) kohdistaminen IGF1 ( Stealth Valitse RNAi siRNA) syntetisoi Invitrogen. Negatiivinen kontrolli myös Invitrogen. PC9 tai HCC827 solut transfektoitiin 2 eri erityisiä siRNA: t ja 1 epäspesifinen kontrolli käyttämällä Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solut irrotettiin ja laimennettiin täydelliseen kasvualustaan ​​ilman antibiootteja ja sitten maljattiin kuhunkin kuoppiin. RNAi-duplex ja Lipofectamine RNAiMAX sekoitettiin Opti-MEM®I (Gibco) see- väliaineessa ja inkuboitiin 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. RNAi duplex-Lipofectamine ™ RNAiMAX kompleksit lisättiin kuoppiin, jotka sisältävät soluja. Sitten soluja inkuboitiin 48 tunnin ajan 37 ° C: ssa.

sekvenssit siRNA vastaan ​​IGF1 olivat seuraavat:

IGF1 # 1:5′-ACACCAUGUCCUCCUCGCAUCUCUU-3 ’

IGF1 # 2:5′-UGCUGCUUCCGGAGCUGUGAUCUAA-3 ’

Colony Inhibitiomääritvs

PC9 soluja (2 x 10

5) tai HCC827 soluja (4 x 10

5) maljattiin 10 cm: n levyille ja annettiin tarttua 24 h. Sitten soluja inkuboitiin 1 uM tai 2 uM gefitinibin, ja tai ilman 0,01 uM, 0,1 uM, tai 1 uM AEW541 hypoksisissa olosuhteissa 18 päivää PC9 soluja tai 11 päivää varten HCC827 soluja. Inkuboinnin jälkeen pesäkkeiden lukumäärät laskettiin.

In vivo

tuumorigeenisyyden Study

NOD /Shi-scid /IL-2Rcnull (NOG) hiiriä (7-viikko- ikäiset, naaraat) hankittiin Central Institute for Experimental Animals (Kanagawa, Japani). Kaikki hiiret kuljetetaan Juntendo yliopiston ja ylläpidettiin patogeenivapaissa olosuhteissa. Hiiret pidettiin huoneen valvotuissa lämpötila (25 ° C), kosteutta, ja valaistus (12 tunnin valo /pimeä sykli).

Ad libitum

pääsy ruokaan ja vesijohtovettä annettiin koko tutkimuksen ajan. Arvioidaan

in vivo

Tuumorigeenisuustutkimuksissa, 1 x 10 solua tai 1 x 10

2 solua PC9 vanhempien solujen ja normoxic ja hypoksinen PC9 bruttopeittoon sekoitettiin matrigeelin (BD Biosciences, San Jose, CA) ja ruiskutetaan molempiin kylkiin on NOG hiirillä. Kasvaimen muodostuminen arvioitiin 22-50 päivää injektion jälkeen.

Ethics

Kaikki eläinkokeet suoritettiin mukaisesti Fundamental suuntaviivojen asianmukaisesta suorittamisesta Animal Experiment ja siihen liittyvä toiminta akateemisten tutkimuslaitosten alla toimivalta opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede ja teknologia (Ilmoitus nro 71, 2006) ja hyväksyttiin komitean koe-eläintoiminnasta Juntendo yliopiston kanssa hyväksynnän nro 240182.

tilastollinen analyysi

Arvot verrattiin käyttäen kaksisuuntaista Studentin

t

-testi. Verrata useita ryhmiä, yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) sovellettiin. Tilastollinen analyysi pallo koko suoritettiin käyttäen Kruskal-Wallisin testiä. Erot keinot katsottiin tilastollisesti merkittäviksi, kun p 0,05.

Tulokset

eristäminen ja geeniekspressioanalyysiä Gefitinibin vastustuskykyisten Persisters (bruttopeittoon) Johdettu NSCLC Cell Lines kätkeminen aktivoiva

EGFR

mutaatio

NSCLC solulinja PC9 kantaen aktivoiva

EGFR

mutaatio, käsiteltiin 1 uM gefitinibin. Kuten kuvattu aiemmassa raportissa [2], pieni osa eläviä soluja voisi selviytyä ja pysyä 7 päivää myöhemmin, kun taas useimmat solut olivat kuolleet muutamassa päivässä (kuvio 1 B). Me viitataan näihin soluihin kuin gefitinibi kestävä persisters (bruttopeittoon). Vaikka bruttopeittoon olivat erittäin lepotilassa, bruttopeittoon uudelleen lisääntyvissä alle runsaasti gefitinibin (kuvio 1 C) ja lopulta osoitti normaalia leviämisen (kuvio 1 D). Vastaava populaatio bruttopeittoon havaittiin muissa NSCLC solulinjan testattu, HCC827 kätkeminen herkkä

EGFR

mutaatio käsittelemällä 1 uM gefitinibin (tuloksia ei ole esitetty).

Ensimmäinen, 2 × 10

5 PC9 solua maljattiin 10 cm: n levyille ja annettiin tarttua 24 h (A). Sitten solut käsiteltiin 1 uM gefitinibin. Tuoretta väliainetta sisältävä gefitinibin korvattiin joka 3 päivä. Seitsemän päivän kuluttua Gefitinibialtistus, pieni murto elävien solujen pysyi (B), uudelleen lisääntyvien 18 päivää myöhemmin (C), ja edelleen lisääntyä jopa 30 päivää myöhemmin (D). A. Edustavia mikroskooppikuva vanhempien PC9 soluja. B, C, D edustavat kuvat PC9 bruttopeittoon altistuu 1 uM gefitinibin 7, 18, ja 30 päivää valokuvattiin, vastaavasti.

geneettistä identiteettiä bruttopeittoon kanssa emosoluilta vahvistettiin käyttäen PCR-analyysi (GenomeLab Human STR Primer asettaa Beckman Coulter), joka kuulustelee sarja 12 lyhyitä peräkkäiset toistot. Analyysi genomisia DNA: ita vanhempien solujen ja bruttopeittoon sekä PC9 ja HCC827 solut on esitetty kuviossa S1 Information S1. STR profiilit vanhempien solujen ja bruttopeittoon ovat samat. Lisäksi, bruttopeittoon on PC9 ja HCC827 solut säilyttivät

EGFR

eksonin 19 deleetio mutaatio (ΔE746-A750), kuten määritettiin suoralla sekvensoinnilla (tuloksia ei ole esitetty). Yhdessä nämä havainnot vahvistavat, että bruttopeittoon ei syntynyt saastuttamaan soluista. Kumpikaan

EGFR

T790M mutaatio eikä

MET

geenin monistaminen havaittiin GRP sekä PC9 ja HCC827 soluja (tietoja ei esitetty). Tyrosiinikinaasiperheen Src ei aktivoida bruttopeittoon sekä PC9 ja HCC827 soluja verrattuna niihin vanhempien soluja (kuvio S2 Information S1). EGFR ja HER3- aktivoituivat vanhempien PC9 ja HCC827 soluja, mutta ilmaisut tukahdutettiin selvästi sen bruttopeittoon molempien solulinjojen (kuva S2 Information S1).

tunnistaa mekanismia taustalla gefitinibi vastus meidän solumallin, ensin analysoidaan geeniekspressiota vanhempien soluissa ja bruttopeittoon käyttäen qPCR. N oletettu keuhko CSC markkeri CD133 oli hyvin ilmaistu bruttopeittoon vuonna PC9 ja HCC827 soluja (kuvio 2A), mikä viittaa stemness fenotyyppi. Edelleen määrittää, onko GRP voi paljastaa ominaisuudet CSCS meidän solun malleja, arvioimme ilmentymistä säätelevien geenien ja ylläpitää kantasolujen fenotyyppiä. Mielenkiintoista, geeni ilmauksia Oct4, Sox2, ja Nanog, jotka tiedetään myös olla mukana uudelleenohjelmointi hiiren tai ihmisen somaattisten solujen eriytymättömiä, pluripotenttien kantasolujen, lisättiin merkittävästi bruttopeittoon in PC9 soluissa, osoittaa nousua 3,4-kertainen, 5,4 kertainen, ja 6,9-kertaiseksi yli vanhempien PC9 solut (kuvio 2A). Lisäksi ilmaus CXCR4 ja ALDH1A1, myös osoitettu liittyvän CSC fenotyyppi, ilmentyivät (kuvio 2A). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin HCC827 GRP (kuvio 2A). Muita tunnettuja kantasolujen geenejä, kuten ABCG2, Bmi-1, ja CD117 (c-Kit), ei yläreguloituja GRP (tuloksia ei ole esitetty).

. Kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin käyttäen alukkeita, jotka ovat spesifisiä CD133, Oct4, Sox2, Nanog, CXCR4 ja ALDH1A1, jotka ovat stemness geenejä PC9 tai HCC827 emosoluista ja GRP. B. Kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin alukkeilla spesifisiä IGF1 ja IGF1 R in PC9 tai HCC827 vanhempien soluja ja bruttopeittoon. Data normalisoitiin aktiinin ilme. * P 0,01, ** p 0,001, *** p 0,0001.

Edellisen raportin osoitti myös, että IGF1 R fosforyloitiin ja aktivoitu EGFR-TKI sietävien solujen PC9 soluissa ja että IGF1 R-estäjä, AEW541, voisi estää näiden sietävien solujen [2]. Tutkimme IGF1 ja IGF1 R ilmaisun käyttämällä qPCR meidän solumallin. IGF1 ilmentyminen dramaattisesti yläreguloituja PC9 GRP verrattuna PC9 emosoluista, jotka osoittavat kasvua 49,8-kertaisesti (kuvio 2B). IGF1 R ekspressio lisääntyi hieman bruttopeittoon (kuvio 2B). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin bruttopeittoon vuonna HCC827 soluissa (kuvio 2B).

Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että pieni väestö NSCLC-solujen, jotka oli erittäin runsaasti geenin ilmentymisen stemness ja IGF1 henkiin ja voi jatkaa lisääntyvissä alla hoito korkea pitoisuus gefitinibin.

Sphere muodostava kyky ja aiheuttavan kasvaimia bruttopeittoon oli voimistunut ja Sphere synty bruttopeittoon Lisääntynyt jälkeen Altistuminen Hypoxic ehdot

edelleen arvioimiseksi stemness of bruttopeittoon, sphere- muodostavat määritykset mikä itseuudistumisen aktiivisuutta ja

in vivo

kasvainten muodostumiseen tutkittu. Kyky muodostaa palloja oli merkittävästi korkeampi PC9 GRP kuin vanhempien soluissa (kuvio 3A). Tärkeää on, hypoksia merkittävästi lisäsi aloilla PC9 GRP (kuvio 3A). Sphere koko PC9 GRP hypoksisissa olosuhteissa oli merkittävästi suurempi kuin vanhempien soluja (kuvio 3B). Immunofluoresenssikoe tulokset osoittivat, että pallojen bruttopeittoon oli positiivinen CD133, Oct4, ja fosforyloitu IGF1 R (kuvio 3C). Lisäksi olemme ruiskutetaan 1 x 10 solua tai 1 x 10

2 soluja vanhempien PC9 solujen ja normoxic ja hypoksinen bruttopeittoon molempiin kylkiin NOG hiirien ja vertasi Tuumorigeenisuustutkimuksissa

in vivo

. Kasvain ilmaantuvuus normoxic ja hypoksinen bruttopeittoon hiirissä olivat korkeammat kuin vanhempien soluissa (taulukko 1). Erityisesti, normoxic ja hypoksinen GRP muodostettu kasvaimia kaksi ja viisi 16 NOG-hiirten 1 x 10 solua /injektio, vastaavasti, vaikka vanhempien solut eivät muodostaa kasvaimia (taulukko 1). Ero kasvaimen muodostuminen emosolulinjassa ryhmä ja hypoksinen bruttopeittoon ryhmä ruiskuttamalla 1 x 10 solua oli tilastollisesti merkitsevä (* p = 0,040). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että bruttopeittoon rikastettiin stemness markkereita ovat ominaispiirteet kantasolujen fenotyyppiä ja että hypoksinen microenvironment voimistunut ja ylläpitää kantasolujen ominaisuuksia bruttopeittoon, kuten palloja muodostavan kyky ja kasvainten muodostumiseen.

PC9 emosoluista, bruttopeittoon, ja hypoksinen GRP valmistettiin tiheyksinä 2,5 x 10

3 solua 2 ml per kuoppa seerumittomassa alustassa, johon oli lisätty kasvutekijöitä ja ympättiin 6-kuoppaisille ultra-low kiinnityslevyt. PC9 vanhempien solut ja bruttopeittoon inkuboitiin alla happiolosuhteissa, kun taas PC9 hypoksinen bruttopeittoon kasvatettiin hypoksisissa olosuhteissa. Viljelyalusta syötettiin joka 3 päivä. Määrän ja koon palloja kirjattiin ja immunofluoresenssilla tehtiin 7 päivää aloittamisen jälkeen viljelmän aikana. Kuulat kiinnitettiin ja inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineita CD133, Oct4 tai fosforyloitu IGF1 R (pIGF1R), ja sitten johdetun vasta-leimattu Alexa Fluor 594 vuohen anti-hiiri-IgG (punainen) tai Alexa Fluor 488 vuohen anti-kani-IgG (vihreä) . Solujen tumat värjättiin DAPI (sininen). Kuvat saatiin Axioplan 2 kuvantamisen järjestelmä AxioVision ohjelmisto. A. Tiettyjä aloja lisääntyi merkitsevästi PC9 bruttopeittoon verrattuna vanhempien soluihin, ja edelleen lisääntynyt PC9 hypoksinen bruttopeittoon. * P 0,01, # p 0,05. B. Sphere koko PC9 hypoksinen bruttopeittoon oli merkittävästi suurempi kuin vanhempien soluja. # P 0,05. C. Immunofluoresoivat kuvia valvonnan solujen PC9 (vasemmalla) ja aloilla bruttopeittoon (oikealla) ja CD133, Oct4, ja pIGF1R.

populaatiot CD133- ja Oct4-positiiviset bruttopeittoon korotettiin hypoksisissa olosuhteet

roolin tutkimiseksi hypoksia tuottamisesta ja pysyvyys gefitinibin vastustuskykyisten kantasolujen populaatio, arvioimme CD133- ja Oct4-positiivisten bruttopeittoon alle normoxic ja hypoksisissa olosuhteissa käyttämällä immunofluoresenssilla. Kuten kuviossa 4A ja 4B, hypoksia lisäsi merkittävästi väestön CD133- ja Oct4-positiivisia bruttopeittoon in PC9 ja HCC827 soluja.

A, B PC9 tai HCC827 soluja, kasvavat Lab-Tek kammio liukuu tai ilman 1 tai 2 uM gefitinibin ja alle normoxic tai hypoksisissa olosuhteissa 72 tuntia, kiinteä, ja inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineita CD133 (A) ja Oct4 (B), ja sitten johdetun vasta-leimattu Alexa Fluor 594 vuohen anti-hiiri IgG: tä (punainen). Solujen tumat värjättiin DAPI (sininen). Kuvat saatiin Axioplan 2 kuvantamisen järjestelmä AxioVision ohjelmisto. Kuvat käytetään vertaamaan vanhempien soluihin, bruttopeittoon, ja hypoksinen bruttopeittoon hankittiin käyttäen samoja laiteasetuksia ja valotusaika ja käsiteltiin samalla tavalla. Numerot CD133 ja Oct4-positiiviset solut laskettiin, ja suhde näiden solujen laskettiin viidellä kussakin kokeessa. ** P 0,001, * p 0,01, # p 0,05.

IGF1 R oli Aktivoitu bruttopeittoon Hypoksisissa edellytykset, ja knockdovvn IGF1 pienensi väestö CD133- ja Oct4-positiivisia Hypoksinen bruttopeittoon

vaikutuksen tutkimiseksi hypoksia aktivoinnista IGF1 R, tutkimme geenin ilmentymistä IGF1- in bruttopeittoon by qPCR sekä fosforylaatioon IGF1 R on bruttopeittoon käyttäen immunofluoresenssilla alle normoxic ja hypoksinen olosuhteet. Kuten on esitetty kuviossa 5A, IGF1 mRNA: n ekspressio oli paljon korkeampi PC9 GRP kuin vanhempien PC9 soluissa ja sen voimistuvan altistumisen hypoksisissa olosuhteissa. Tärkeää on, fosforyloitu IGF1 R ilmentyi PC9 bruttopeittoon, ja altistuminen hypoksia selvästi voimistunut väestöstä fosforyloidun IGF1 R ilmentävien PC9 bruttopeittoon (kuvio 5B).

. Kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin käyttäen alukkeita, jotka ovat spesifisiä IGF1 in PC9 tai HCC827 emosoluista, bruttopeittoon, ja hypoksinen GRP. Data normalisoitiin aktiinin ilme. ** P 0,001. B. PC9 soluja, kasvatettu Lab-Tek kammio dioja tai ilman 1 uM gefitinibin ja alle normoxic tai hypoksisissa olosuhteissa 72 tuntia, kiinteä, ja inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineita fosforyloidun IGF1 R (pIGF1R) ja sitten toissijainen vasta leimattu Alexa Fluor 488 vuohen anti-kani-IgG (vihreä). Solujen tumat värjättiin DAPI (sininen). Kuvat saatiin käyttäen Axioplan 2 kuvantamiseen kanssa AxioVision ohjelmistoja. Kuvat käytettiin vertaamaan PC9 vanhempien soluja, bruttopeittoon, ja hypoksinen bruttopeittoon hankittiin samoilla laitteen asetukset ja valotusaika, ja käsiteltiin samalla tavalla. Määrä pIGF1R-positiivisten solujen laskettiin, ja suhde näiden solujen laskettiin viidellä kussakin kokeessa. ** P 0,001. C. IGF1- ilmentyminen pudotettiin vuonna PC9 tai HCC827 hypoksinen bruttopeittoon käyttämällä Sirna (siRNA) in Lab-Tek kammio dioja. Immunofluoresenssivärjäystä pIGF1R, CD133, tai Oct4 Sitten suoritettiin. Kaksi erityistä siRNA: t ja yksi epäspesifisiä ohjaus käytettiin. Numerot pIGF1R-, CD133- ja Oct4-positiiviset solut laskettiin, ja suhde näiden solujen laskettiin viidellä kutakin koetta varten. ** P 0,001, * p 0,01.

selkeyttämiseksi biologisen merkityksen IGF1- vuonna gefitinibin vastus meidän hypoksinen solussa malli, me pudotti IGF1- ilmentymisen hypoksinen bruttopeittoon of PC9 ja HCC827 solujen avulla kaksi erilaista erityistä siRNA (# 1 ja # 2, kuva S3 Information S1). Kuten kuviossa 5C knockdovvn IGF1 merkittävästi vähentää fosforyloitua IGF1 R-ilmentävät GRP, ja laski CD133- ja Oct4-positiivisia GRP hypoksisissa olosuhteissa. Nämä havainnot viittaavat siihen, että IGF1 on rooli aktivointi IGF1 R ja ylläpito gefitinibin-resistenttien CSCS.

Hypoksia Säätelee IGF1 Expression kautta HIF1α, ja inhibitio HIF1α tai IGF1 R Vähentynyt CD133- ja Oct4-positiivisia GRP hypoksiaolosuhteissa

tutkimiseksi edelleen hapen niukkuuden vaikutuksilta on säätelyä IGF1 ja aktivoinnin IGF1 R, me vaimentua hypoksia-indusoituva tekijä 1α (HIF1α) ilmentyminen hypoksinen bruttopeittoon käyttämällä erityistä HIF1α estäjä YC-1. Hoito YC-1 inhiboi HIF1α ilmentymisen merkittävästi sekä PC9 ja HCC827 solujen alle hypoksia annoksesta riippuvalla tavalla (kuva S4 Information S1). Kuten on esitetty kuviossa 6A, inhibition HIF1α YC-1 hoito tukahdutti myös IGF1 ilmentymisen hypoksinen bruttopeittoon, ja vähentää merkittävästi IGF1 R fosforylaatio GRP alle hypoksia. Lisäksi YC-1 hoito vähensi merkittävästi väestön CD133- ja Oct4- positiivinen hypoksinen bruttopeittoon. Lopuksi, hoidon IGF1 R inhibiittorin AEW541 merkittävästi vähentynyt väestön CD133- ja Oct4-positiivisia GRP annoksesta riippuvalla tavalla, kun Gefitinibialtistus hypoksisissa olosuhteissa (kuvio 6B). Lisäksi, useita pesäkkeitä, jotka sisälsivät GRP tukahdutettiin merkittävästi AEW541 hypoksisissa olosuhteissa (kuvio 6C). Yhdessä nämä havainnot viittaavat vahvasti siihen, että hypoksia säätelee IGF1- ilmaisun HIF1α, ja että upregulated IGF1 indusoi aktivoinnin IGF1 R ja lisää gefitinibin kestävä CSCS in

EGFR

mutaatio-positiivisten NSCLC-solut alle hypoksia.

. HIF1α ilmentyminen tukahdutetaan PC9 tai HCC827 hypoksinen bruttopeittoon käsittelemällä 50 uM, 100 uM ja 200 uM YC-1 in Lab-Tek kammio dioja. Immunofluoresenssivärjäystä IGF1-, fosforyloidun IGF1 R (pIGF1R), CD133, ja Oct4 Sitten suoritettiin. Kuva S1. Kuva S2. Kuva S3. Kuva S4.