Krooninen sairaus

tiivistelmä

maksasolusyövän (HCC) on yksi yleisimmistä ihmisen syöpäsairauksia. Siksi kehittää alussa, herkkä diagnostinen biomarkkerit estää HCC tarvitaan kiireesti. Seerumin a-fetoproteiini (AFP), kliininen biomarkkereiden nykyisin käytössä, on kohonnut vain -60%: lla HCC; Siksi, löytää uusia biomarkkerit odotetaan olevan merkittävä vaikutus kansanterveyteen. Tässä tutkimuksessa käytimme glykaanitähteen mikrosiruanalyysi tutkia mahdollisuuksia diagnostinen arvo on useita syöpään liittyvien hiilihydraattiantigeenit (CACAs) biomarkkereina HCC. Käytimme glykaanin mikrosiruanalyysi 58 eri glykaanin analogeja vertailla kvantitatiivisesti 593 ihmisen seeruminäytteitä (293 HCC näytteet; 133 krooninen hepatiitti B-virus (HBV) infektio näytteissä, 134 krooninen hepatiitti C-virus (HCV) -infektio näytteitä, ja 33 terveen luovuttajan näytteet ) tutkimaan diagnostinen mahdollisuutta seerumin vasta muuttuu biomarkkereita HCC. Pitoisuudet seerumissa anti-disialosyl galaktosyyIi globosidin (DSGG), anti-fukosyyli GM1 ja anti-Gb2 olivat merkittävästi suurempi potilailla, joilla HCC kuin kroonisen HBV-infektion yksilöitä ei kroonista HCV-infektiota potilaalla. Kaiken tutkimuksessamme väestöstä, biomarkkereiden ehdokkaita DSGG, fukosyyli GM1 ja Gb2 of CACAs saavuttaa paremmin ennakoivaa herkkyys kuin AFP. Havaitsimme mahdollisia biomarkkereita sopii varhaista havaitsemista HCC. Glykaanin mikrosiruanalyysi tarjoaa tehokkaan työkalun erittäin herkkä ja suurikapasiteettisten havaitseminen seerumin vasta-aineita CACAs, jotka voivat olla arvokkaita seerumin biomarkkereita varhaiseen toteamiseen henkilöiden suuri riski HCC.

Citation: Wu CS , Yen CJ, Chou RH, Li ST, Huang WC, Ren CT, et al. (2012) Cancer-Associated hiilihydraattiantigeenit mahdollisina biomarkkereita maksasyövän. PLoS ONE 7 (7): e39466. doi: 10,1371 /journal.pone.0039466

Editor: Erica Villa, Modenan yliopisto Reggio Emilia, Italia

vastaanotettu: 16 helmikuu 2012; Hyväksytty: 21 toukokuu 2012; Julkaistu: 13 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Wu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Science neuvoston Taiwanin myöntää NSC99-2320-B-039-030-MY3, NSC99-2632-B-039-001-MY3, NSC100-2321-B-039-004, ja University of Texas MD Anderson ja Kiinan Medical University ja sairaala sisar Institution Fund DMR-101-115. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

maksasolusyövän (HCC) on viidenneksi yleisin syöpä maailmassa, Kiinan ja Pohjois-Amerikassa osoittaa jatkuvaa lisääntymistä ja kuolleisuutta [1]. HCC lähes aina kehittyy ympäristössä krooninen hepatiitti virusinfektion tai maksakirroosin [2] – [4]. Ennuste potilaille, joilla on HCC edelleen heikko, ja 5 vuoden pysyvyys diagnoosin jälkeen tai useimmille potilaille on alle 5%, lähinnä siksi, että tauti diagnosoidaan usein edennyt pitkälle [5]. Potilaille, joilla on diagnosoitu HCC varhaisessa vaiheessa, eloonjäämisaste voidaan parantaa merkittävästi poistettu kirurgisella, maksansiirron, ja muut parantava hoitoja kuten ablatiivi hoitoja [6], [7]. Lisäksi valvonta riskipotilailla parantaa havaitsemista ja mahdollisesti parantava vaikutus hoitoja pieniä kasvaimia. Siksi varhainen ennustetekijöitä markkereita ovat ratkaisevia tehokasta hoitoa ja ehkäisyä HCC.

Yleisimmät HCC biomarkkereiden käyttää seulomaan Maksakirroosipotilaille on seerumi a-fetoproteiini (AFP), joka mitataan 6 kuukauden välein [8]. Kuitenkin AFP tasot ovat usein koholla joillakin potilailla, joilla on krooninen maksasairaus, joilla ei ole syöpää, ja AFP tasot eivät kohonneet 30-40% maksasyöpäpotilailla [9]. Seerumin AFP Testi on alhainen herkkyys, ja noin kolmasosa potilaista, joilla alkuvaiheen HCC ja pieniä kasvaimia ( 3 cm) on sama taso AFP kuin terveillä henkilöillä, mikä tekee AFP testi riittämätön varhaisen havaitseminen HCC riskiryhmään väestön [10]. Lisäksi AFP testi on korkea väärien positiivisten osuus -20% potilailla, joilla on krooninen hepatiitti ja 20-50% joukossa on maksakirroosi [5], [11]. Tässä suhteessa on kiireellinen tarve tunnistaa herkempi ja luotettava seerumin biomarkkereita havaitsemiseksi HCC [12], [13].

Onkogeneesin liittyy usein muutoksia ilmaisua solun pinnan hiilihydraatteja. Joissakin tapauksissa, hiilihydraatti kuvio voi olla erityinen taudin tyypin [14]. Muissa tapauksissa, tasot anti-hiilihydraatti-vasta-aineita voidaan merkittävästi parantaa, puhkeamista taudin [15]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että solujen glykosylaatio profiilit merkittävästi muutu karsinogeneesin [14]. Hiilihydraatit pelata ratkaiseva rooleja eri biologisten tapahtumien kuten solutunnistuksessa [16], kansainväliset ja solunsisäinen signalointi, sikiön kehityksen, soluadheesion [17], ja solu-solu-vuorovaikutuksia [18]. Tällä hetkellä glykaanirakenteessa merkki löytö glykaanitähteen mikrosiruanalyysi asettaa suuria mahdollisuuksia tunnistaa biomarkkereiden merkitystä rintasyövän [19].

Glycan mikrosiruja mahdollistavat suoran luonnehdinta hiilihydraatti-proteiini vuorovaikutusten [20]. Microarray tekniikat ovat tehokkaita ja herkkiä menetelmiä nopean analyysin spesifisyyden proteiini-hiilihydraatti vuorovaikutusten ja karakterisointi erilaistumisprosesseihin liittyvät puhkeamista syövän molekyylitasolla [21]. Lisäksi kiinnitys sokereiden pinnat voivat tehokkaasti jäljitellä esittämistä näiden yhdisteiden kalvon solujen ja siten voidaan käyttää sitomaan vasta-aineita, [20]. Tässä raportissa keskityttiin glykaanien, joiden tiedetään olevan syöpään liittyvien hiilihydraattiantigeenit (CACAs) monissa syövissä, mutta joita ei ole tutkittu HCC. Käytimme glykaanirakenteessa mikrosiruanalyysi tutkimaan diagnostinen mahdollisuutta seerumin vasta muuttuu biomarkkereita HCC. Lisäksi vertasimme tarkkuus biomarkkerit tunnistimme tavanomaiseen AFP biomarkkereiden HCC.

Tulokset

Potilastiedot

yhteensä 593 osallistujaa, mukaan lukien 293 HCC potilaat , 133 krooninen hepatiitti B-virus (HBV) -infektio potilailla, 134 kroonista hepatiitti C -virus (HCV) -infektio potilailla, ja 33 normaalihenkilöihin rekrytoitiin tähän tutkimuksessa (taulukko 1). Ei ollut merkittäviä eroja iän ja sukupuolen tapausten ja kontrollien välillä. Lisäksi HCC ryhmä ja terveillä verrokeilla ryhmässä oli tilastollisesti erilaisia ​​laboratoriotulokset albumiinimäärityksissä, aspartaattiaminotransferaasin (ASAT), alaniiniaminotransferaasin (ALAT) ja kokonaisbilirubiini (BIL-T) (p 0,05). Patologinen lavastus (AJCC) HCC oli luokan I 96 tapauksessa (41,3%), luokan II 80 tapauksessa (34,5%), luokka III 48 tapauksessa (20,7%), ja luokka IV 8 tapauksessa (3,4%).

Detection seerumin vasta-aineiden vasten hiilihydraattiantigeenit kanssa Glycan Microarray Analysis

Testasimme seerumia potilaista, joilla oli HCC vasta-aineet, jotka sitoutuvat glykaanin fragmentteja. Lasilevyille painettu microarray muodossa glykaanin yhdisteiden 1-58 (kuvio S1) inkuboitiin seeruminäytteiden, ja sitoutuneet vasta-aineet todettiin käyttäen Cy3-leimattua vuohen anti-ihmis-IgG sekundääristä vasta-ainetta (kuvio 1). Fluoresoiva skannaukset käsiteltiin määrällisesti intensiteetti kunkin täplän. Tuloksena tiedot olivat edustettuina keskimääräinen suhteellinen fluoresenssin intensiteetti rinnakkaista kunkin näytteen. Totesimme, että tausta-intensiteetti hiilihydraatti antigeeniä sitovan terveistä yksilöistä voi olla seurausta ei-spesifinen sitoutuminen; Näin ollen, keskimääräinen fluoresenssin 35000 poistettiin analyysistä. Tämä lähestymistapa tarjonneet järjellisen kehittää glykaani microarray havaitsemaan 47 eri glykaanin vasta-aineita sellaisten potilaiden seerumista (poiston jälkeen näytteen numerot 2, 3, 5, 7, 16, 20, 23, 24, 30, 31, ja 47).

(A) edustava dian saatu fluoresenssi skannaus havaitsemisen jälkeen IgG seeruminäytteistä. Jokainen ruudukko painettiin glykaanin numerot 1-20 ylärivissä, 21-40 keskirivin, ja 41-58 alarivissä. (B) keskiarvo ± keskihajonta sitoutumisen spesifisyyden vasta glykaanin numerot 1-58 seeruminäytteistä sairastavista potilaista HCC. Suhteellinen fluoresenssi-intensiteetti laskettiin kunkin täplän (sisälsi 100 uM glykaanin) on glykaanin microarray.

tutkittiin seeruminäytteistä 155 potilailla, joilla on HCC ja 33 terveiden yksilöiden vasta-aineiden, jotka sitovat hiilihydraatteja antigeenejä glykaanin mikrosirun. Fluoresenssin data kuvastaa vasta-aineen reaktiivisuus kunkin glykaanin normalisoitiin FI5 kullekin näytteelle, ja suhteellinen fluoresenssin intensiteetit IgG vasta-aineita potilailla, joilla on HCC ja terveillä henkilöillä esitetään keskiarvona glykaanin: FI5 IgG-suhteet (kuvio 2). Vasta-aineet, jotka sidottu FI5 havaittiin potilailla, joilla oli HCC ja terveillä luovuttajilla. Havaitsimme, että IgG vastaan ​​glykaani numerot 4 (SLacNAc 6SO

3), 15 (disialosyl galaktosyyli-globosidin, DSGG), 18 (fukosyyli GM1), 35 (Gb3), 36 (Gb2), 42 (B19) ja 56 (Man7) olivat merkittävästi suuremmat potilailla, joilla oli HCC kuin terveillä henkilöillä.

suhteellinen fluoresenssi-suhteet laskettiin suhteellinen fluoresenssin voimakkuus kunkin glykaani analogisen jaettuna suhteellinen fluoresenssin voimakkuus FI5, ja ne ovat ilmaistaan ​​prosentteina kuvassa. Kuvassa keskiarvo suhde ± keskihajonta kussakin glykaania. Asteriskit osoittavat glykaanien, jossa keskimääräinen glykaanin: FI5 IgG-suhde oli merkitsevästi korkeampi seerumin potilailla, joilla on HCC (n = 155) kuin seerumin terveiltä yksilöiltä (n = 33).

p

arvot laskettiin Studentin

t

-testi (*

p

0,05; **

p

0,01).

vertailu tasot Seitsemän Anti-glykaanitähteen Vasta joukossa Nainen ja mies Potilaat, joilla on HCC ja terveillä henkilöillä

aikaisemmassa tutkimuksessa [22], miehillä oli korkeampi esiintyvyys HCC kuin naiset. Meidän nykyisessä tutkimuksessa lisäsimme HCC näytteiden numerot jopa 293 potilasta ja ositettiin tuloksemme sukupuolen, onko anti-glykaanitähteen vasta-ainetasot vaihteli sukupuolen. Naisten keskuudessa, IgG vastaan ​​glykaani numerot 15, 18, ja 35 oli merkitsevästi suurempi potilailla, joilla HCC kuin terveillä henkilöillä (

P

0,01) (kuvio 3A). Miehillä, IgG vastaan ​​glykaani numerot 15, 18, 35, 36, ja 42 olivat merkittävästi suurempi potilailla, joilla HCC kuin terveillä henkilöillä (

P

0,05) (kuvio 3B). Mielenkiintoista on, havaitsimme samanlaisia ​​tuloksia glykaani numerot 15, 18 ja 35 kahden ryhmän välillä.

Suhteellinen fluoresenssin suhde laskettiin fluoresenssin intensiteetti kunkin glykaanin analogisen jaettuna fluoresenssin intensiteetti FI5, ja ne ilmaistaan prosenttiosuudet kuvioissa. Kuvassa keskiarvo suhde ± keskihajonta kussakin glykaania. (A) glykaanirakenteeseen: FI5 IgG tunnusluvut glykaani numerot 15, 18, ja 35 olivat merkittävästi korkeammat seerumin naisten potilaalla on HCC (n = 70) kuin seerumin terveistä naisilla (n = 11). (B) glykaanirakenteeseen: FI5 IgG tunnusluvut glykaani numerot 15, 18, 35, 36 ja 42 olivat merkittävästi korkeammat seerumin sairastavien miesten HCC (n = 223) kuin seerumin Terveiden miesten (n = 22). Asteriskit osoittavat glykaanien, jossa keskimääräinen glykaanin: FI5 IgG-suhde oli merkitsevästi korkeampi seerumin potilailla, joilla on HCC kuin seerumin terveiltä yksilöiltä.

p

arvot laskettiin Studentin

t

-testi (*

P

0,01).

vertailu Level Select Anti-glykaanitähteen vasta-aineet HCC ja krooninen maksasairaus (CLD) sukupuolen

maailmanlaajuisesti yli 52% HCC tapauksista liittyy krooninen HBV-infektio, ja 25% HCC tapauksista liittyy HCV-infektio [23]. Tunnetut HBV tai HCV-infektio voi lisätä riskiä sairastua HCC [7]. Erojen tutkimiseen HCC potilailla, joilla on HBV-tai HCV-infektio, jaoimme potilaita HBV-positiiviset HCC (HBV-HCC; n = 132) tai HCV- positiivisia HCC (HCV-HCC; n = 65) verrata krooninen maksasairaus ( HBV-CLD; n = 133 ja HCV-CLD; n = 134). Molemmilla sukupuolilla, IgG vastaan ​​glykaanien 15, 18, ja 36 naisilla ja miehillä oli suurempi HBV potilailla, joilla on HCC näistä potilaista ilman HCC (

P

0,05) (kuvio 4A ja B). Ei ollut merkittäviä eroja anti-glykaanitähteen tasojen välillä potilailla, joilla HCV-HCC ja krooninen HCV potilasta (kuvio 5A ja B).

Suhteellinen fluoresenssin suhteet laskettiin fluoresenssin voimakkuutta kunkin glykaanitähteen analogisen jaettuna fluoresenssin intensiteetti FI5, ja ne ilmaistaan ​​prosentteina kuvioissa. Kuvassa keskiarvo suhde ± keskihajonta kussakin glykaania. Suhdeluvut glykaani numerot 15, 18, ja 36 olivat huomattavasti korkeammat HBV: hen liittyvään HCC kuin CLD (HBV) naisilla (n = 30 ja 44, erikseen) (A) ja miehillä (n = 102 ja 89, erikseen) ( B).

p

arvot laskettiin Studentin

t

-testi (*

P

0,05, **

P

0,01, * **

P

0,001).

Suhteellinen fluoresenssin suhteet laskettiin fluoresenssin voimakkuutta kunkin glykaanitähteen analogisen jaettuna fluoresenssin intensiteetti FI5, ja ne ilmaistaan ​​prosentteina kuvioissa. Kuvassa keskiarvo suhde ± keskihajonta kussakin glykaania. Suhdeluvut glykaani numerot 15, 18, 35, 36 ja 42 ei ollut merkittävää eroa HCV-liittyvän HCC ja CLD (HCV) naisilla (n = 18 ja 61, erikseen) (A) ja miehillä (n = 47 ja 73 , erikseen) (B). (

P

0,05).

seuraava verrattuna havaitseminen glykanista analogeja ja AFP niiden diagnostisen herkkyyden HCC peräisin CLD ja Terve. Potilaalle, joilla on ollut maksasairaus, konsensus diagnosoimiseksi HCC voidaan saavuttaa kohonnut AFP taso (≥200 ng /dl), sekä dynaaminen kuvantaminen tutkimus osoittaa maksan kasvain. Taiwanissa, kynnysarvon seerumin AFP taso HCC diagnoosi on vahvistettu 200 ng /ml, ja ohjeiden mukaisesti kliinisen diagnoosin ja lavastus kriteerit HCC. Siksi meidän muuttaa raja-arvo AFP. Kun AFP

200 (AFP at sulku arvoon 200 ng /ml) käytettiin ennustamaan HCC vaiheessa herkkyys on 33,33% (10 30) saatiin naisilla, ja 24,51% (25 102 ) saatiin miehillä (taulukko 2). Havaitsimme, että herkkyys 3 anti-glykaanitähteen numeroita (15, 18, ja 36) olivat paremmat kuin AFP 63.33% (19 30) /42.16% (43 102), 56,67% (17 30) /35.29% (36 102), ja 43,33% (13 30) /45.1% (46 102), vastaavasti, nainen /mies. (Taulukko 2). Voit testata, onko herkkyys luokittelu voitaisiin lisätä luettuna kliininen data, AFP arvot mukaan analyysiin. Kuten taulukosta 2, sisällyttäminen AFP arvojen ja 3 anti-glykaanitähteen markkereita lisääntynyt herkkyys oikean luokittelun HCC valtiot 80% (24 30) ja 74,5% (76 102), vastaavasti, naisten ja miesten.

diagnostinen arvo Kolme anti-glykaanitähteen vasta-HCC

sen arvioimiseksi, seerumin anti-glykaanitähteen tasoja voidaan käyttää mahdollisena diagnostinen markkeri HCC, vastaanotin toimii ominaisuudet (ROC) käyrä analyysit suoritettiin. Kävi ilmi, että seerumin 3 anti-glykaanitähteen markkereita plus AFP tasot oli mahdollinen merkkiaine erotteleva HBV-positiiviset HCC potilaita terveisiin kontrolleihin AUC (kuuluvilla alueilla ROC käyrä) ja 0,6843 (95% CI: 0,5882-+0,7805) ( Kuvio 6A). Tällä raja-arvo 0,4974, herkkyys ja spesifisyys tämä merkki oli 46,21% ja 84,85%. AUC seerumin 3 anti-glykaanitähteen markkereita plus AFP tasot erotteleva HBV-positiiviset HCC kroonisesta HBV oli 0,6923 (95% CI: 0,6215-,7631) (kuvio 6B). Tällä raja-arvo 0,5268, herkkyys ja spesifisyys tämä merkki oli 57,58% ja 82,43%. Tämä tulos viittaa siihen, että nämä 3 anti-glykaanitähteen markkereita plus AFP voidaan soveltaa diagnosointiin HBV liittyvien HCC.

Nämä 3 anti-glykaanitähteen vasta tuotti AUC (kuuluvilla alueilla ROC käyrä) ja 0,6843 ( 95% CI: 0,5882-0,7805) kanssa 46.21% herkkyys ja 84,85% tarkkuus erotteleva HCC potilaiden terveiden verrokkien (A), ja AUC 0,6923 (95% CI: ,6215-+0,7631) kanssa 57.58% herkkyys ja 82,43% spesifisyys erotteleva HCC HBV-CLD potilasta (B).

keskustelu

kasvainmarkkereiden seerumissa potilailla, joilla on HCC voidaan käyttää diagnostisina työkaluina, ennustetekijöitä, ja käsittelyn parametrit [ ,,,0],24]. Käyttämällä glykaanin microarray, tutkimme seerumi etsiä vasta-aineiden voisi erottaa potilaalla on HCC ja terveillä henkilöillä. Tämä tutkimus on osoittanut potentiaalia glykaanitähteen microarray tunnistamiseksi CACAs biomarkkereiden ehdokkaita seerumissa potilailta, joilla on HCC. Meidän nykyisessä tutkimuksessa erot seerumin vasta-ainetasot sairastavien potilaiden välillä HCC ja terveet yksilöt olivat merkittäviä, jossa on vasta-tasot 7 58 glykaanien erilaisesti runsas (p 0,01). Nämä glykaanien olivat SLacNAc 6SO

3, DSGG, fukosyyli GM1, Gb3, Gb2, B19, ja Man7. Muutokset glykosylaatio syövän, samoin kuin muut sairaudet, ovat herättäneet paljon kiinnostusta ja ovat osoittaneet mahdollisia sekä lähteenä sairauden merkkejä ja kohteina immunoterapiassa kasvainten [15]. Muutokset glykosyylitransferaasia ekspressiotasot yleisesti johtaa kasvuun koko ja haaroitus N-kytkeytyneisiin glykaaneihin, mikä luo uusia kohtia päätteen siaalihappotähdettä [25]. Vastaava lisäys sialyylitransferaasi- ilmaisun lopulta johtaa yleiseen kasvuun sialyloituminen [26]. Yliekspressio glykosyylitransferaaseja, jotka ovat mukana yhdistää päätelaitteen tähteitä glykaanien johtaa yliekspressio tietyn päätelaitteen glykaani epitooppeja, kuten SLacNAc 6SO

3, DSGG, ja fukosyyli GM1 kasvaimiin [27] – [29].

Olemme havainneet, että anti-DSGG tasojen eron potilaalla on HCC ja CLD. DSGG on disialyl glykosfingolipidin kanssa Globo-sarjan ydin rakenne [27]. Aiemmassa tutkimuksessa DSGG todettiin adheesiomolekyylistä ilmentyy munuaissolukarsinooma, ja sen suhde metastaattinen osoitettiin [27]. Tuloksemme ovat ensimmäisiä viittaa siihen, että DSGG ilmenee vahvasti HCC.

On kiinnostavaa, että sukupuoliero on kuvattu HCC lähes kaikissa tutkimuksessa populaatiot, jossa mies: nainen suhde ilmaantuvuuden HCC keskimäärin välillä 02:01 ja 04:01 [30]. Yksi mekanismi, joka voi selittää sukupuolten erot havaittiin esiintyvyys HCC on lisääntynyt aktiivisuus estrogeenien naispotilailla, jotka voivat tarjota suojaa hepatokarsinogeneesin [22]. Lisäksi on luultavasti muita solua sääteleviä molekyylejä mukana sukupuolten epätasa ilmaantuvuuden HCC. Meidän nykyisessä tutkimuksessa havaitsimme sukupuolten epätasa tasot hieman eri anti-hiilihydraatti-vasta-aineita. Tasot anti-fukosyylitransferaasin GM1 erosivat potilailla, joilla on HCC ja kroonista HBV tai terveillä henkilöillä. Fukosyyli GM1 kuuluu yksi sellainen gangliosidien [28]. Aikaisemmassa tutkimuksessa, fukosyyli GM1 oli voimakkaasti yhteydessä pienisoluinen keuhkosyövän, ja tämä kasvaimeen liittyvä antigeeni havaittiin suuri herkkyys ja spesifisyys käyttäen immunofluoresenssilla menetelmällä [28]. Rooli tämän glykaani syöpään on epäselvä. Glykosylaation hormonin reseptorien on ehdotettu selitys sukupuolten välisiä eroja sepelvaltimotaudin ja eturauhassyöpää [31], [32]. Vaikka kuinka yleisiä nämä havainnot ovat väestölle entistä heterogeeninen sairaus etiologiaa vielä tutkittava, tässä esitetyt tulokset mahdollisista glykaanitähteen biomarkkereita näytä aivan rohkaisevia. Viime aikoina suuren mittakaavan analyyttisiä menetelmiä on kehitetty ihmisen seerumin glycoproteome, joka on myös tehokas työkalu löytämisen diagnostisten ja terapeuttisten kohteiden. Käyttämällä lektiini-pohjainen glycoproteomic analyysi, glykoproteiini (GP) 73 havaittiin olevan uusi tuumorimarkkeri HCC [33]. Seerumin GP73 tasot lisääntyivät merkitsevästi potilailla, joilla HCC, vaikka HCC potilailla, joiden seerumin AFP tasot alle 20 ng /ml [24]. Fukosyloitu- of GP73 on raportoitu lisääntynyt potilailla, joilla HCC [33]. Aiemmassa tutkimuksessa todettiin, että fukosyloitu- on tärkeä rooli vuorovaikutuksen interleukiini-8 ja sen reseptorin, aiheuttaen siten siirtyminen syöpäsolujen HCC [34]. Nykyinen tulokset viittaavat siihen, että fukosyyli GM1 on ehdokkaana maksan CACAs biomarkkereita.

HCC liittyy HBV-infektio noin 50% tapauksista [35]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että viittä anti-glykaani vasta-aineet lisääntynyt potilailla, joilla HCC ja HBV-infektio. Siksi me yleistää, että lisäys vasta-aineiden ja HBV-infektio liittyy. Metsämurmelit käytetään edullisessa eläinmallissa kroonisen HBV-infektion [36]. Tämä malli esitetään yhteenveto taudin etenemistä HBV infektion HCC ja on dokumentoitu yhtäläisyyksiä proteiinin glykosylaatio ihmisen HCC [36]. Kuten HCC yleensä kestää vuosia kehittyä seurauksena krooninen HBV-infektio, tutkimus varhaisen tapahtumien metsämurmeli malli HBV-infektio voi antaa hyödyllisiä tietoja mahdollisista biomarkkereita ennustetta HCC. Biologinen vaikutteet ajo nämä muutokset vaativat lisätutkimusta.

AFP on ainoa serologinen markkeri käytetään tällä hetkellä kliinisessä havaitsemiseen HCC. Vaikka AFP parantaa havaitsemista HCC, huomattava määrä potilaita, joilla HCC ei ole kohonnut AFP tasot, ja siten, ylimääräisiä biomarkkerit tarvitaan herkkyyden lisäämiseksi HCC havaitsemisen [37], [38]. Menneinä tutkimus, AFP on osoittanut rajoitettu herkkyys (41-65%) diagnosoinnissa HCC [39]. Siksi on kiireesti löytää uusia biomarkkereita seulontaan ja diagnosointiin HCC. Tutkimuksemme verrattiin potilaita, joilla HCC ja CLD plus terve, ja nämä 3 glykaanitähteen oli parempi herkkyys kuin AFP. Lisäksi herkkyys 3 anti-hiilihydraatti-vasta-aineiden sekä AFP oli parempi diagnoosin herkkyyttä.

Lisäksi, ei ollut korrelaatiota määriä näitä 3 anti-glykaanin vasta-aineita ja kasvaimen vaiheessa (tuloksia ei ole esitetty). Siksi ehdotamme, että 3 anti-hiilihydraatti-vasta-aineita voi olla biomarkkereita aloittamisen kasvaimen muodostumisen, mutta ei syövän etenemiseen. Lisätutkimuksia käyttäen suurempaa potilasryhmä ja kelpuutusprosessi joka sisältää takautuvasti kerättyjä potilaan näytteitä tarvitaan tarkistaa havaintomme. Nämä uudet CACAs biomarkkereita, yhdessä muiden olemassa olevien serologinen biomarkkerit, voivat olla arvokkaita diagnosoinnissa HCC. Tutkimustulosten perusteella ehdotamme, että yhdistämällä glykaanitähteen mikrosiruanalyysi AFP mittaukset antavat paljon paremman työkalu HCC diagnoosi kuin käyttää AFP yksin.

biomarkkerit ovat jo pitkään etsitty diagnostisia, prognoosi-, ja terapeuttinen käyttää. Kuitenkin, ei ole olemassa luotettavia biomarkkereita useimpien kiinteiden kasvainten, mukaan lukien HCC. Menetelmät kuvattu nykyisessä tutkimuksessa ovat hyödyllisiä löytämisessä biomarkkereita taudin. Kehittäminen glykaanitähteen microarray on mahdollistanut erittäin herkkä ja suurikapasiteettisten analyysi hiilihydraatti-proteiini-vuorovaikutusten ja on osaltaan merkittäviä edistysaskeleita glykomiikan. Tämä lähestymistapa tarjoaa sekä tehokas työkalu perustutkimuksen ja lupaava tekniikka lääketieteellisen diagnoosin ja havaitsemiseen taudinaiheuttajien ja syöpien [20]. Tämä menetelmä vaatii hyvin pieniä määriä materiaalia, ja se on tehokkaampi ja herkempi kuin perinteinen ELISA-menetelmällä; Näin ollen, se on toinen alustan seurata immuunivastetta hiilihydraatti-epitooppeja eri vaiheissa erilaistumisen aikana, etäpesäke, ja hoito [21]. Nykyinen tutkimus tunnistettu viisi CACAs biomarkkereita HCC diagnoosi on arvioitava edelleen tulevaisuudessa. Tunnistaminen CACAs ovat hyödyllisiä uusien syövän hoitomuotoja, kuten sukupolven rokotteiden tai vasta-aineiden kohdistaminen CACAs [14], [19], [40] – [42]. Uskomme, että glykaanirakenteeseen mikrosiru on toteuttamiskelpoinen menetelmä kliininen diagnoosi HCC. Tämä menetelmä olisi parantaa ennustetta ja voivat tarjota oivalluksia kehittää uusia terapeuttisia lähestymistapoja muiden syöpien. Uusi glykaanirakenteessa antigeenejä voi osoittautua hyödylliseksi tavoitteisiin nykyisten hiilihydraattia rokotteiden ja ne kehityksessä.

Yhteenvetona olemme osoittaneet, että glykaanitähteen mikrosiruanalyysi käytetään tunnistamaan uuden ehdokkaan glykaanitähteen biomarkkereita HCC voivat olla käyttökelpoisia seulonnan seerumin biomarkkereita HCC. Biomarkkerin ehdokkaat tunnistimme käyttäen glykaanitähteen mikrosiruanalyysi osoitti hyviä ennusteita herkkyyttä tutkimuksessa väestö, ja yleensä ne olivat parempia kuin AFP. Lisäksi edellä tulokset tavanomaisten maksan toiminnan testit voidaan todellakin parantaa diagnostista tarkkuutta maksasairaudet. Glykaanin mikrosiruanalyysi tarjoaa tehokkaan työkalun erittäin herkkä ja suurikapasiteettisten havaitseminen seerumin vasta-aineita CACAs, ja tunnistettu seerumin biomarkkerit voi olla käyttökelpoinen varhaisen havaitsemisen HCC korkean riskin populaatiot.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tutkimusprotokolla hyväksyi Institutional Review Board of ihmiskoe eettisen komitean Cheng Kung yliopistollisen sairaalan Taiwanissa (nro ER-99-176). Lisäksi kirjallinen suostumus saatiin osallistujien käyttöön niiden verta tässä tutkimuksessa.

seeruminäytteet

seeruminäytteet terveiltä yksilöiltä (n = 33), krooninen HBV (n = 133 ), krooninen HCV (n = 134) ja potilailla, joilla on HCC (n = 293) kerättiin National Cheng Kung yliopistollisessa sairaalassa Tainan, Taiwan. Näytteet salattu suojata potilaan luottamuksellisuuden ja käytettiin alla protokolla hyväksymä Institutional Review Board of ihmiskoe eettisen komitean Cheng Kung yliopistollisessa sairaalassa Tainan, Taiwan. Potilaat oli diagnosoitu yhdistämällä tiedot (kliininen, laboratorio ja kuvantaminen havainnot ja /tai biopsia). Kaikki näytteet säilytettiin -20 ° C: ssa käyttöön asti.

Yleiset menetelmät

NEXTERION slide H hankittiin SCHOTT Pohjois-Amerikassa. Pinnoite Schott NEXTERION Slide H koostuu silloitetusta, multi-komponentti polymeerikerros aktivoidaan N-hydroksisukkinimidiä (NHS) esterit tarjota kovalenttinen immobilisointi amiiniryhmiä. Yleinen menetelmä synteesin glykaanien suoritettiin kuten on raportoitu [20], [21], [43].

Glycan Microarray Fabrication

mikrosirut painettiin (BioDot, karteesinen Technologies), jossa on robotti pin (SMP3; TeleChem International) ja laskeumien ≈ 0,7 nl eri konsentraatioiden amiinia sisältävien glykaanien tulostus-puskurissa (300 mM fosfaattipuskuri [pH 8,5], joka sisälsi 0,005% Tween-20) 96-kuoppaisen mikrotiitterilevyn päälle NHS-pinnoitettu lasi dioja. Objektilasit täplikäs 50 uM liuos kullekin glykaani, kaksi riviä alhaalta ylös ja viisi pystysuoraan rinnakkaista kussakin alaryhmä. Kukin dia suunniteltiin 14 ristikot. Painetut kalvot annettiin reagoida ilmakehässä 80%: n kosteudessa 1 h, mitä seurasi kuivattaminen yön yli. Levyjä säilytettiin huoneenlämpötilassa eksikkaattorissa ennen käyttöä. Ennen sitoutumismääritys, levyt salvattiin etanoliamiinia (50 mM etanoliamiinia 50 mM boraattipuskurissa [pH 9,2]), ja sitten pestiin kahdesti vedellä ja fosfaattipuskurin suolaliuosta (PBS) (pH 7,4).

Microarray analyysi seerumin näytteet

seeruminäytteitä potilailta, joilla oli HCC ja terveillä henkilöillä laimennettiin 1:20 puskurilla, joka koostuu 0,05% Tween 20: tä ja 3% BSA: ta PBS: ssä (pH 7,4), sovelletaan ruutuja glykaanin mikrosiruja, ja sitten inkuboitiin kosteutetussa kammiossa ravistellen 1 h ajan. Objektilasit sitten pestiin kolme kertaa 0,05% Tween 20 PBS: ssä (pH 7,4), PBS: ää (pH 7,4), ja H

2O. Seuraavaksi Cy3-konjugoitu vuohen anti-ihmisen IgG-vasta-ainetta (Jackson ImmunoResearch) lisättiin kalvot, kuten edellä on kuvattu, ja laseja inkuboitiin alla coverlid kosteutetussa kammiossa ravistellen 1 h ajan. Levyjä pestiin kolme kertaa 0,05% Tween 20 PBS: ssä (pH 7,4), PBS: ää (pH 7,4), ja H

2O, ja kuivattiin sitten. Objektilasit skannattiin 532 nm (for Cy3-konjugoidun sekundaarisen vasta-aine), jossa on mikrosiru fluoresenssi sirun lukijan (arrayWoRx mikrosirun lukija).

Data Analysis

Ohjelmisto GenePix Pro (Axon Instruments) oli käytetään fluoresenssin analyysi uutettiin tietoja. Paikallinen tausta vähennettiin signaalista kunkin vasta-paikka. ”Mediaanit suhteet” rinnakkaiskokeista täplät laskettiin keskiarvot samassa array. Saadakseen suhteellisen sitoutumisen intensiteettejä glykaanien ihmisen seerumeissa, asetamme sitova intensiteetti FI5 100% ja normalisoitu suhteellisen sitoutumisen intensiteetit kunkin glykaanitähteen analogisen jokaista seeruminäytettä. Suhde anti-glykaani: anti-FI5 seerumeista laskettiin jakamalla keskimääräinen suhteellinen sitova intensiteetti glykaanin rinnakkaisnäytteiden, jonka keskimääräinen suhteellinen sitova intensiteetti FI5 replikoituu, ja tulokset ilmaistiin prosentteina. Herkkyys laskettiin suhteena määrän HCC näytteitä, jotka oli luokiteltu oikein HCC (tosi positiivisia) ja kokonaismäärä HCC näytteitä. Lopuksi, tilastollinen analyysi IgG-pitoisuudet potilailla, joilla on HCC ja terveillä henkilöillä suoritettiin käyttäen paritonta Studentin

t

-testi. Vastaanotin toimii (ROC) konstruoitiin ja alue käyrän alla (AUC) laskettiin arvioida spesifisyys ja herkkyys ennustaa tapausten ja kontrollien. Tietojen analysointi tehtiin käyttäen Prism 5 (GraphPad Software, Inc.) ja SigmaPlot 9,0 ohjelmistot (SigmaPlot).

tukeminen Information

Kuva S1.

synteesi glykaanien. Kemia kirjoituskuvaketta menetelmää käytettiin syntetisoimaan 58 hiilihydraattiantigeenit.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0039466.s001

(TIF) B