Krooninen sairaus

tiivistelmä

Käyttäen DNA-siru, me syntyy sekä mRNA ja miRNA ekspressiotietojen 6 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC ) kudoksiin ja niiden vastaavat tavanomaista valvontaa viereisistä kudoksista tunnistaa mahdolliset miRNA merkkiaineita diagnostiikassa. Olemme osoittaneet, että HSA-miR-96 on merkittävästi ja johdonmukaisesti säädellään ylöspäin kaikki 6 NSCLCs. Me validoitu tämä johtaa riippumaton sarja 35 pariksi kasvaimia ja niiden viereisten normaaleissa kudoksissa, sekä niiden seerumit, jotka kerätään ennen kirurgista resektiota tai kemoterapiaa, ja tulokset ehdotti, että HSA-miR-96 voi olla tärkeä rooli NSCLC kehittämisessä ja on paljon potentiaalia käytettäväksi noninvasive markkeri diagnosoimiseksi NSCLC. Me ennusti potentiaali miRNA kohde-mRNA: perustuvat eri menetelmiin (TargetScan ja Miranda). Edelleen luokittelu miRNA geenien perustuu niiden suhde miRNA paljasti, että HSA-miR-96 ja eräiden muiden miRNA yleensä alas-säädellä tavoitteensa mRNA NSCLC kehittämiseen, joilla on ekspressiotasoja salliva suoralle vuorovaikutusta miRNA ja tavoitteensa mRNA: iden. Lisäksi tunnistimme merkittävä korrelaatio miRNA asetuksen geeneillä samaan aikaan korkea tiheys CpG-saarekkeiden, joka viittaa siihen, että miRNA saattavat edustaa ensisijaista sääntelymekanismi koskevat perus- solun toimintoja ja solujen jaotteluihin, ja tällainen mekanismi voi olla komplementaarinen DNA-metylaation tukahduta tai aktivoimatta geeniekspressiota.

Citation: Ma L, Huang Y, Zhu W, Zhou S, Zhou J, Zeng F, et ai. (2011) yhdennetty analyysi miRNA ja mRNA ilmaisujen Non-Small Cell keuhkosyövässä. PLoS ONE 6 (10): e26502. doi: 10,1371 /journal.pone.0026502

Editor: Boris Zhivotovsky, Karolinska Institutet, Ruotsi

vastaanotettu: toukokuu 23, 2011; Hyväksytty: 28 syyskuu 2011; Julkaistu: 27 lokakuu 2011

Copyright: © 2011 Ma et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukee Natural Science Foundation of Zhejiang (Y2110960) ja Bureau of Science and Technology of Zhoushan myönnettiin professori Yongkui Zhang (20081059) ja Research Fund Zhoushan sairaalan myönnetty Dr. Lina Ma, ja National Basic Research Program ( 973 Program, 2011CB944100 ja 2011CB944101) ja National Natural Science Foundation of China (90919024) myönnettiin professori kesäkuu Yu. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tällä hetkellä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on johtava syy syövän kuoleman maailmassa [1]. Kirurginen resektio tehdään pääasiassa aikaisen vaiheen tapauksissa ja on myös tehokas, mutta sen vaikutus on rajoitettu potilaille, joilla on paikallisesti edennyt syövät koska korkea etäinen etäpesäke ja toistumisen. Näin ollen, kemoterapiaa ja sädehoitoa, sekä molempia, ovat aina suoritetaan potilailla, joilla on paikallisesti edennyt syöpä. Kuitenkin 5 vuoden pysyvyys keuhkosyöpäpotilaiden vähenee dramaattisesti kliinisissä vaiheissa taudin, esimerkiksi toiseen arviolta 61% potilailla, joilla vaiheessa IA tauti 38% potilailla, joilla vaiheessa IB tauti. Muut vaiheessa liittyvät 5 vuoden pysyvyys taudin ovat 34% potilailla, joilla IIA sairaus, 13% potilailla, joilla on vaiheen IIIA tauti, 5% potilaista, joilla on vaiheen III B sairaus, ja 1% potilaista, joilla on vaiheen IV [2] , [3], [4], [5]. Useimmat keuhkosyöpäpotilaita vasta diagnosoitu, kun kasvaimet ovat levinneet niiden ensisijainen sivustoja, ja tämä on tärkeä syy heikkoon tulokseen keuhkosyövän hoitoja. Lisäksi vaihtelu analyysi joukossa erilaisia ​​syöpiä, ehdotti, että keuhkosyöpä on suurempi määrä mutatoituja geenejä kuin muiden syöpien [6]. Näin ollen löytö tehokkaita diagnostisia markkereita ja kyselevän mekanismeja keuhkosyöpä kehitystä, ovat molemmat välttämättömiä parantamiseksi eloonjäämisaste keuhkosyöpäpotilaiden.

miRNA ovat lyhyitä ei-koodaavat RNA: t (~22 nt pitkä), jotka sitoutuvat komplementaariset sekvenssit kohde-mRNA: iden, jolloin niiden selektiivinen hajoaminen tai estävät selektiivisesti käännös. Siksi kautta säätelevät niiden kohdegeenien, miRNA tiedetään olevan mukana monenlaisia ​​biologisia toimintoja, kuten solujen proliferaatiota, erilaistumista ja apoptoosia [7], [8]. Poikkeava miRNA ilmentyminen on raportoitu aiheuttavan sairauksia, kuten syöpä [9], Alzheimerin tauti [10], sydänsairaudet [11], selkäytimen motorisiin neuroneihin poikkeavuuksia [12], ja jne .. NSCLC, on ehdotettu, että miR -31 voi toimia kasvaimia synnyttävää miRNA jonka tukahduttaa tuumorisuppressoreilla: LATS2 ja PPP2R2A [13], ja ilmentyminen HSA-miR-205 on ehdotettu pystyä erottamaan squamous peräisin nonsquamous ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [14]. Lisäksi todisteet osoittavat, että korkea HSA-mir-155 ja matalan HSA-let-7a-2 ilmaisun korreloi huonon säilymisen keuhkosyöpäpotilaiden [15], ja on-miRNA-126 voidaan edistää NSCLC-solujen indusoiman apoptoosin säteilytys kautta PI3K-Akt-reitin [16]. miRNA nyt nousemassa erittäin kudosspesifisiä biomarkkereita syrjiä syövät peräisin noncancerous kudoksesta, ja erilaisia ​​syöpätyyppejä, sekä erilaisia ​​ennustetekijöiden tulokset [15], [17].

mRNA profilointia ovat paljastaneet, että transkription poikkeavuus monet geenit ovat vastuussa kehittämisestä NSCLC [18], [19], ja differentiaalisen ekspression miRNA on myös havaittu välillä keuhkosyövän kudosten ja viereisen normaaleissa kudoksissa [15], [20]. Tässä tutkimuksessa käytimme mikrosiruja mitata ekspressiotasoja miRNA ja mRNA: iden samanaikaisesti pariksi NSCLC ja niiden vieressä normaaleissa kudoksissa tutkimaan mahdollisia rooleja miRNA. Analyysien sekä integroituja ja melko syvä etsimään mahdollinen ehdokas miRNA ja niiden mRNA tavoitteet lisätutkimuksia ja kliinisissä sovelluksissa.

Tulokset

Differentially ilmaistu mRNA NSCLC kudoksissa verrattuna niiden pariksi normaaleissa kudoksissa

Suoritimme geeniekspressioprofilointi varten pariksi kasvain-normaali kudosnäytteitä 6 pienisoluista keuhkosyöpää ja tutkittiin 34694 geenejä /selostukset. Me määritelty 581 up-geenien ja 1, 297 alas geenien jotka olivat johdonmukaisesti ylös- tai alaspäin-säänneltyjä kaikissa 6 tuumorikudoksissa verrattuna viereisiin normaaleissa kudoksissa (taulukko S2 ja taulukko S3). Niistä differentiaalisesti ilmentyvien geenien tunnistimme 2 merkittävästi säädelty ja 22 merkittävästi alas geenien at False Discovery Rate (FDR) 0,1 (taulukko S2 ja taulukko S3). Olemme ryhtyneet harjoittamaan GO rikastukseen analyysin avulla hypergeometrisen testi ja useita testi säätömenetelmä BH kautta WebGestalt2 [21] ja määritelty rikastetun reittejä osoitteessa

p

arvo 0,001. Hypergeometrisessa jakauma on diskreetti todennäköisyysjakauma, joka kuvaa määrä onnistumisten jono

n

kiinnittää äärellisestä väestö ilman vaihtoa, kuten binomijakauman kuvaa onnistumisten lukumäärä varten nostetut korvaamisesta. Hypergeometrinen testi auttaa löytämään joka GO termejä yliedustettuna suuressa geenin lista. Mukaan hypergeometrisen testitulokset, solusyklin M-vaiheen ja DNA aineenvaihduntaa olivat pääasiassa aktivoitu, kun taas reittejä mukana immuunijärjestelmän toimintoja merkittävästi tukahdutettu NSCLC (taulukko 1). Lisäksi säädelty geenejä pääasiassa rikastuneet ”kromosomi” vastakohtana alas geenien, jotka pääasiallisesti rikastuneet ”solukalvon” (taulukko 2).

ilmentyvät eri miRNA NSCLC kudoksissa verrattuna niiden pariksi normaaleissa kudoksissa

Suoritimme miRNA ilmaisun profilointi käyttäen samoja 6 pariksi näytteitä primaarikasvaimen ja sen vieressä normaalia kudosta. Saimme 25 säädelty ja 24 alassäädetty miRNA jotka olivat johdonmukaisesti ylös- tai alaspäin-säänneltyjä kaikissa 6 tuumorikudoksissa verrattuna viereisiin normaaleissa kudoksissa ennen merkitsevyystestillä (taulukko S4 ja taulukko S5). Perustuen tiukempi analyysi, saimme yhden merkittävästi säädelty miRNA, HSA-miR-96, at False Discovery Rate (FDR) 0,1. Olemme edelleen tutki ilmentymistason sen mahdollinen mRNA kohteet (Nämä tavoitteet ovat konservoituneet miRNA sitoutumiskohdista joukossa selkärankaisten tai nisäkkäiden ja ennustettiin käyttämällä TargetScan): 13 pois 728 koko ehdokas kohdegeenien (taulukko S2 ja taulukko S6) (osuus 2,24% n 581 ylös geenien) on säädelty ja 48 niistä yhteensä (taulukko S3 ja taulukko S6) (osuus 3,70%: a 1, 297 alas geenien) on alassäädetty (kuvio 1A). Sitten validoitu HSA-miR-96 ilme perustuu kvantitatiivinen RT-PCR riippumaton sarja 35 NSCLC ja niiden seeruminäytteiden (varten seerumit, ilmaisu arvot normalisoituivat normaalien ihmisten ilman syövän historia tai muu sairaus tuolloin), ja löydetty HSA-miR-96 oli merkitsevästi säädellään ylöspäin sekä kudos- ja seeruminäytteistä pienisoluista keuhkosyöpää (kuva 2). Siksi HSA-miR-96 voi olla tärkeä tekijä edistää NSCLC kehitykseen ja saattaa olla suuret mahdollisuudet käyttää diagnosoinnissa.

(A) Microarray tulokset alassäädetty tavoite ehdokkaita HSA-miR -96 in NSCLC. Me analysoitiin 6 pariksi NSCLC vs. normaalia kudosta. C ja N seistä syövän ja viereisen normaalia kudosta, vastaavasti. Tähti merkkien geenit kuuluvat korreloi ryhmän ja loput geenit ryhmitelty anti-korreloi ryhmän mukaan ilmaisun suhdetta näiden geenien kanssa niiden sääntelyyn miRNA. (B) validointi microarray tuloksia qRT-PCR. Valitsimme 10 alassäädetty tavoite ehdokkaita HSA-miR-96 ja suoritetaan qRT-PCR kokeiden validointia suhteellisen mRNA ilmaisun viitaten glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH). Suhteellinen ilmentyminen arvot ovat keskiarvo ± SE. *,

P

0,05

t

testi; **,

P

0.001

t

testiä.

Kaksi ryhmää vertailuja tehtiin: (1) kasvain vs. viereisten normaali keuhkojen kudoksia, ja (2) syöpä seerumin vs. muu syöpä seerumia. Suhteellinen HSA-miR-96 ilmentyminen määritettiin suhteessa sisäiseen U6 snRNA valvonnan. Suhteellinen ilmentyminen arvot ovat normalisoitu keskiarvo ± SE.

Kuten miRNA aina tukahduttavat ilmentymisen kohdegeenien, 48 alassäädetty tavoitteita HSA-miR-96 voi olla todennäköisimmin edistää NSCLC kehitystä HSA-miR-96 asetusta. Valitsimme 10 alassäädetty tavoitteita HSA-miR-96 vahvistamaan niiden mRNA: n ilmentymisen suhteen käyttäen qRT-PCR 20 NSCLC ja totesi, että ne kaikki olivat merkitsevästi alassäädetty kasvainkudoksissa verrattuna viereisen normaaleissa kudoksissa (kuvio 1 B ). Tutkimaan, miten nämä 48 alassäädetty potentiaali mRNA tavoitteet voivat vaikuttaa kehitykseen NSCLC, me luokitellaan ne perustuvat GO ehdoin, ja havaitsi, että nämä geenit olivat mukana erilaisissa perus biologisen prosessin, kuten aineenvaihdunta, biologiset sääntely, cell viestintä, kehitysprosessiin, immuunijärjestelmää, ja jne. (kuva S2).

luokittelu mRNA perustuu niiden suhde miRNA asetuksen

luonnehtia miten miRNA voivat säännellä niiden kohde-mRNA: iden, suoritimme laajan analyysi vastaaviin ilmaus miRNA ja niiden kohde-mRNA: iden. miRNA ilmaistaan ​​pitkän esiaste-RNA: t, jotka prosessoidaan solun nukleaasilla, Drosha, ennen niiden kuljettamista jota Exportin-5-riippuvaisen mekanismin sytoplasmaan [22], [23]. Kun sytoplasmassa, miRNA lohkaistaan ​​edelleen entsyymin Dicer [24], [25], ja tämä johtaa 17-24 nt miRNA, jotka liittyvät solun kompleksi, joka on samanlainen RNA aiheuttama hiljentäminen kompleksi, joka osallistuu RNA-interferenssi. Kuitenkin miRNA lähinnä säädellä mRNA käännös, kun taas siRNA suora RNA tuhon kautta RNA-interferenssi (RNAi) reitin [8], [26]. Siksi runsaasti miRNA voi riippuu lähinnä alkuperäistä ilmaisua eikä tuotu ulkoisesti. Lisäksi useat tekijät osoittavat, että nousu miRNA ilmaisun lukemiin alassäätöä kohdegeenien, ja vähentäminen miRNA ilmaisun lukemiin säätely ylöspäin kohdegeenien [13], [27]. Siksi hypothesize että vaikutus miRNA niiden kohde-mRNA: on ekspressiotaso riippuvaista. Käytimme uutta toimenpidettä arvioida miRNA sääntelyä, kutsutaan

asetuksen arvo

. Ensin oletetaan, että asetus arvo miRNA korreloi positiivisesti sen ekspressiotason. Koska miRNA on aina enemmän kuin yksi kohdegeenien [28], me sitten olettaa, että asetus arvo tietyn miRNA korreloi negatiivisesti määrää tavoitteensa. Siksi me määrittelemme asetuksen arvo miRNA kuin poikkeama ilmentymistaso tietyn miRNA jaettuna useissa ilmaisi mRNA tavoitteita.

aikana syövän kehitystä, asetus voi vaihdella tapaus ohjata tietyn miRNA ja näin ollen sääntelyn arvo tietyn miRNA yhtä kuin vaihtelu miRNA ilmaisun jaettuna useissa ilmaisi tavoitteita. Kun ilmaus miRNA säätyy alas syövät, sen sääntely arvo muuttuu negatiiviseksi jos määrä sen ilmaisi tavoitteita ei ole merkittävästi muuttunut. Jotta kohde-mRNA, sen sääntely arvo on summa kaikkien asetuksen arvot sääntely- miRNA. Perustuen Näiden määritelmien luokitellaan kaikki ilmentyvät eri geenien syövissä eri ryhmään niiden korrelaatiot-korreloivat tai anti-korreloi miRNA sääntelyä. Tätä ennen, ennustimme potentiaalia kohdegeenien näiden johdonmukaisesti ylä- tai alassäädetty miRNA.

käyttää kolmea menetelmää ennustaa mahdollisia kohteita miRNA. Ohjelmisto TargetScan keskittyy enemmän miRNA siemeniä (2-8nt 5’alue kypsä miRNA), koska on näyttöä siitä, että on tärkeää tämän alueen miRNA tavoite tunnustamisesta [29], [30], [31], [32]. Lisäksi sekvenssikonservoinnista kohdesivustoluetteloon on pidetty tärkeänä tekijänä vähentää väärien positiivisten määrä [30]. Siksi ennustaa mahdollisia miRNA tavoitteet käyttäen TargetScan ja konservoituneita kohdesivustot joukossa selkärankaisten tai nisäkkäiden käyttämällä

P

CT menetelmä TargetScan [33]. Kuitenkin siemeniä sivustot eivät aina anna tukahduttaminen, ja ohjelmisto Miranda otetaan huomioon myös muiden alueen miRNA lisäksi siemen sivustoja [34]. Sitten käytimme Miranda kuin toinen vaihtoehtoinen menetelmä ennustaa miRNA tavoitteita. Molemmat ohjelmistot olivat usein käyttää ennustamaan miRNA tavoitteita, ja lisäksi molemmat voidaan käyttää ennustamaan tavoitteet uudenlaisten miRNA kuin illuminia miRNA mikrosiru ”humanMI_V2” sisältää monia uusia miRNA jotka syntyvät seuraavan sukupolven sekvensointi ponnisteluja maailmanlaajuisesti. Saimme 16160 säilytetty miRNA-kohde paria joukossa selkärankaisten tai nisäkkäiden käyttämällä

P

CT menetelmä TargetScan (taulukko S6), 70320 miRNA-kohde paria käyttämällä TargetScan ottamatta huomioon säilyttämisen ehdon (taulukko S8), ja 77988 miRNA-kohde paria käyttäen Miranda (taulukko S10). Havaitsimme, että 48841 miRNA-kohde paria olivat läsnä sekä TargetScan ja Miranda tulokset (69.46% of TargetScan tuloksia, 62,63% Miranda tuloksia), ja 12403 miRNA-kohde paria säilyneitä TargetScan tulokset olivat yhteistä Miranda tuloksiin (76,75% konservoituneiden TargetScan tulokset). Siksi oli noin 70% ennustuksen tulokset olivat yleisiä kahdella eri menetelmällä, ja niitä ylläpidetään ennustetulokset TargetScan exhibite suurempi osa jaettu geenien.

Ensinnäkin käytetään säilytetyn tulosennusteita luokitella mRNA: iden perustuvat heidän suhteensa miRNA sääntelyä. Erityisesti olemme määritelty 197 ja 190 geenejä kuin anti-korreloivat ja korreloivat vastaavasti ja 1491 ”toisiksi”, jonka miRNA sääntely arvot ovat nolla (taulukko S7). Tutkimme lisäksi jakautumista miRNA asetuksen arvon, geenien ilmentymisen taso ja mahdollinen suhde näiden kahden parametrin. Vuonna 197 anti-korreloi geenien, 171 (osuus 13,18% 1, 297 alas geenien) on alassäädetty ja 26 (osuus 4,48% 581 up-geenien) kasvoi säädelty. Gene, joka perustui asetukseen arvon ehdotti myös, että anti-korreloitu ryhmä oli aina alas-säädellä miRNA (kuvio 3A). Vuonna 190 korreloi geenien, 140 (osuus 10,79% 1, 297 alas geenien) laski-säänneltyjen ja 50 (osuus 8,61% 581 up-geenien) kasvoi säädelty. Gene, joka perustui asetukseen arvo ehdotti, että korreloivat ryhmä oli aina alassäädetty (kuvio 3A). Sillä 1491 geenit ”muut”, 986 (osuus 76,02% of 1297 alas geenien) on alassäädetty ja 505 (osuus 86,92% 581 up-geenien) oli säädelty (taulukko 3). Yhteenvetona nämä tulokset osoittavat, että miRNA yleensä alas-säädellä geeniekspressiota, erityisesti niille, anti-korreloidun ryhmän. Tutkimme myös mahdollisia toimintoja anti-korreloivat ryhmään, jotka oli tarkoitus säädellä miRNA, ja löysi ne olivat mukana erilaisissa biologisissa prosesseissa, kuten aineenvaihdunta, immuunijärjestelmä, solun tappaminen, monisoluisista organismin kehitys, ja solujen viestintä ( Kuva S3).

luokiteltu kaikki ilmaisu muuttujan mRNA: t aikana keuhkosyöpää kehittäminen perustuu niiden suhdetta miRNA. Tulokset on luokiteltu vastaaviin, anti-korreloivat, ja muut (ei korrelaatiota). Korreloitua mRNA: t osoittavat vastaaviin ilmaisuja niiden sääntelyyn miRNA ilmaisuja ja anti-korreloivat mRNA: ita ei ole. Kolme eri menetelmiä käytettiin ennustamaan potentiaalisten miRNA tavoitteet: ”konservoituneet” ovat ne geenit, jotka ovat konservoituneet miRNA sitoutumiskohdat selkärankaisissa tai nisäkkäiden, ja nämä geenit ennustettiin käyttämällä

P

CT menetelmä TargetScan ; ”TargetScan” ovat ne geenit, jotka ennustetaan käyttämällä Perl-skripti on TargetScan ottamatta huomioon säilyttäminen. ”Miranda” ovat ne geenit, jotka ennustetaan mahdollisia kohteita perustuen Miranda v3.3a Linux-alustalla. (A) Gene jakautuminen korreloi ja anti-korreloivat mRNA: t piirrettiin perustuu niiden miRNA sääntelyä arvoja. (B) Gene jakautuminen kolmeen ryhmään mRNA piirrettiin perustuu niiden ilmentymisen arvoihin. Ilmaisu arvo määritetään viittaamalla, että viereisen normaalin kudoksen (log2). (C) välinen suhde geenien ilmentymisen ja miRNA sääntelyä.

lisäksi vahvistanut tämän tuloksen käyttämällä ennusteita TargetScan ottamatta huomioon sekvenssi säilyttäminen ja ennusteita Miranda. Käyttämällä Miranda meillä on 482 ja 294 geenejä kuin anti-korreloivat ja korreloivat vastaavasti ja 1102 ”toisiksi”. Käyttämällä TargetScan ottamatta huomioon säilyttäminen, meillä on 472 ja 285 geenien anti-korreloi ja korreloivat vastaavasti ja 1121 ”toisiksi”. Tutkimme lisäksi leikkauspisteessä TargetScan ja Miranda ja totesi, että kolme menetelmää jaettu noin 80% anti-korreloitu ryhmä; TargetScan ja Miranda jakoi noin 70% geenit korreloivat ryhmään, kun taas

P

CT menetelmä jaetaan vain noin 50% geeneistä ja loput kaksi menetelmiä vastaaviin ryhmässä. Yhdenmukainen tulosten säilytetyn ennusteita, miRNA anti-korreloivat ryhmä näyttää säännellä suurempi osuus alassäädetty mRNA: t verrattuna jäljellä olevat ryhmät määritellään perustuen seuraavaa kahta menetelmää (taulukko 3), ja anti-korreloivat ryhmä näytteillä silmiinpistävän eri jakautuminen asetuksen arvon verrattuna vastaaviin ryhmään (kuvio 3A).

jälkeen tutkittiin kohde ilmentymistaso kolmen asetuksen ryhmää ja totesi, että ilmentymistaso vastaisen korreloi ryhmässä oli suurempi kuin jäljellä olevat ryhmät (Kuvio 3B). Lisätutkimuksia sääntelyn arvojen ilmentymistason osoitti, että korkeasti ilmaistu geenien anti-korreloi ryhmä näyttivät olevan alas-säädellä miRNA, kun taas nöyrä-ilmaisi geenit näyttivät olevan sääteli. Geenien korreloi ryhmän käyttäytyvät vastakkaisella tavalla (kuvio 3C). Tämä tulos viittaa siihen, että erittäin ilmaisi geenit voivat osallistua enemmän alas geenien in anti-korreloivat ryhmässä kuin jopa geenien samassa ryhmässä.

Mahdolliset suhde miRNA metylaatiospesifisiin säätelyssä mRNA ilmaisun

Kuten metylaatio on toinen tärkeä mekanismi säädellä mRNA: n ekspression, olemme edelleen tutkittu, miten se voi vuorovaikutuksessa miRNA sääntelyä. Ensin luokiteltu kohdegeenien osaksi HCG (korkea CpG pitoisuus), LCG (väli CpG sisältö), ja ICG (matala CpG pitoisuus) luokkien (taulukko S2 ja taulukko S3) mukaisen menetelmän aiemmin kuvattu [35]. Olemme havainneet, että konservoituneita ennusteen tulokset, sekä anti-korreloi ja korreloivat ryhmät sisälsivät enemmän HCG geenejä kuin toiset tai kaikki geenit (kuvio 4A), ja tulos viittaa siihen, että HCG geenit ovat todennäköisimmin säädellä miRNA, jotka ovat konservoituneita tavoite sivustoja.

(A) jakautuminen CpG-tiheyden luokiteltu geenejä kussakin ryhmässä. Nämä kohdegeenien ennustettiin käyttämällä kolmea eri menetelmää: ”Konservoitavia ’ovat geenejä, jotka ovat säilytetty miRNA sitoutumiskohdista joukossa selkärankaisten tai nisäkkäiden, ja nämä geenit ennustettiin käyttämällä

P

CT menetelmä TargetScan; ”TargetScan” ovat ne geenit, jotka ennustetaan käyttämällä Perl-skripti on TargetScan ottamatta huomioon säilyttäminen. ”Miranda” ovat ne geenit, jotka ennustetaan mahdollisia kohteita perustuen Miranda v3.3a Linux-alustalla. (B) välinen suhde CpG-saarekkeen tiheyden ja geenien ilmentymisen. Kolme ryhmää luokiteltiin: kaikki ilmaistu geenien NSCLC, Mirna geenien ja muita geenejä, joita ei saa vaikuttaa miRNA.

Koska suuri joukko korkeasti ilmaisi geenit löydettiin anti-korreloivat ryhmä, me edelleen kysytään nämä HCG geenit ovat aina erittäin ilmaistaan ​​ja yleensä miRNA-säännelty. Kaikissa geenit ilmaistaan ​​NSCLC, HCG geenejä ei pidetty hallitseva erittäin ilmaistuna geenejä verrattuna LCG tai ICG geenejä. Huippu ilmaisuja HCG alueella 5-10, kun taas ICG tai LCG geenit ovat alueella 2 7. miRNA yleensä säädellä enemmän geenien suhteellisen ilmentymistason 5-10, siis silloin, kun säädellään miRNA, huippu ICG tai LCG geeniekspressioiden pitäisi olla tällä alueella, ja havaitsimme, että oli vähemmän LCG geenit tällä ilmaisulla alueella verrattuna HCG tai ICG geenejä. Kuitenkin ”muut” (geenit ilman sääntelyä arvoa vaihtelu) on myös huippu ilmaisun välillä, mutta ei ollut eroa geenissä tiheyden joukossa kolme CpG luokkaa (kuva 4B). Yhteenvetona HCG geenejä voidaan rikastaa geenejä, joita säännellään miRNA niiden suuren ekspressiotasot, mutta tämä ei tietenkään ole ainoa syy.

Meillä on myös suoritettava GO analyysin välillä miRNA-säänneltyjen ja miRNA-tunteeton ryhmät osoittavat, että niiden geenit ja toiminnot ovat erilaisia ​​kuin anti-korreloidun ja korreloivat ryhmät (kuvio 5 ja kuvio S5). Kuten on esitetty kuviossa 5, miRNA-säännelty ryhmä sisältää enemmän geenejä seuraavissa prosesseissa: transkription sääntely, nukleiinihappoa sitova, cell viestintä, metabolinen, ja kehittämistä koskevan asetuksen. Nämä erot osoittavat, toisesta kulmasta miksi miRNA taipumus vaikuttaa HCG geenien säilytetty miRNA kohdesivustot kuin CpG-saarekkeen sisältö on aina korreloi geenisäätelyn ja toiminnallinen eriyttäminen, ja nämä geenit saattavat olla merkitystä perus solutoiminnoille eri selkärankaisten tai nisäkkäiden [36 ].

P

0,05 pidettiin merkittävänä [67].

keskustelu

tässä tutkimuksessa tutkimme mRNA ja miRNA profilointi NSCLC. mRNA profilointi paljasti, että useat differentiaalisesti ilmentyvien geenien mukana aktivaation solusyklin NSCLC. Tämä havainto on yhdenmukainen tulosten aiempien tutkimusten, jotka viittaavat siihen, että epänormaali solusyklin liittyy kohonnut keuhkosyövän riskiä [37], [38]. Alas-geenien on todettu pääasiassa rikastettu immuunijärjestelmä samoin kuin paikallisia solukalvon, jotka ovat yleensä korreloi solu-solu-viestintä ja osallistua immuunijärjestelmän prosessiin. Estoja näistä geeneistä on tarkoitus helpottaa keuhkosyövän kehittymistä ja etenemistä, ja tämä voi jossain määrin johtuen paeta syöpäsolujen jäljittämiseltä ja tuholta isännän immuunijärjestelmän [39], [40], [41].

miRNA profilointi vertailun löysimme HSA-miR-96 oli merkitsevästi säädellään ylöspäin NSCLC. 48 HSA-miR-96 potentiaali tavoitteet pääasiallisesti rikastettu alassäädetty mRNA ryhmä ja ovat mukana erilaisissa biologisissa prosesseissa mukaan GO merkinnät. Perustuen sääntelyn arvoon arvioihin, osoitimme, että 42 niistä kuuluu anti-korreloitu ryhmä (kuvio 1A, taulukko S7). Meidän validointi kokeet osoittivat, että kypsän muodon HSA-miR-96 on erittäin ei ilmaista ainoastaan ​​syövän kudoksissa, mutta myös seerumeissa syöpäpotilailla. Tämä tulos viittaa siihen, että HSA-miR-96 on suuret mahdollisuudet voidaan käyttää noninvasive biomarkkeri NSCLC diagnoosia.

Nykyinen tietämys HSA-miR-96 on melko rajallinen. Se asuu intergeenisessä välisellä alueella NRF1 ja UBE2H ihmisen kromosomissa 7 [42] ja on erittäin laaja jakelu eläinten keskuudessa, mistä sukkulamadot nisäkkäisiin, ja on enemmän konservoituneita selkärankaisten (kuva S4). Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että se toimii säädellä etenemisen eriytymisen nisäkkäiden cochlear sisempi ja ulompi karvasolujen [43], ja siihen liittyy aggressiivista ihmisen toiminta [44]. Kun suhde syövät, HSA-miR-96 on raportoitu olevan erittäin ilmaistaan ​​virtsarakon syöpä [45], eturauhassyöpä [46], ja krooninen myelooinen leukemia [47]. Se voidaan havaita virtsassa ja korreloi vaiheessa ja arvosana perustuu virtsan sytologia of urothelial karsinooma [48]. Ylössäätöä HSA-miR-96 johtaa alas-asetusten transkriptiotekijä FOXO3a ja FOXO1, ja siten edistää solujen jakaantumista ihmisen rintasyövän [49], [50]. Meidän määrityksissä, löysimme joukon mahdollisia kohteita, jotka voivat korreloida toimintaa HSA-miR-96 NSCLC kehittämiseen, mutta mikään mahdollisia kohteita on validoitu kokeellisesti. Siksi lisäkokeita on pohjimmiltaan paljastaa suhdetta HSA-miR-96 ja NSCLC. Lisäksi aiomme kasvattaa näytteen tutkimaan mahdollisia suhteita HSA-miR-96 ilmaisutapoja ennusteeseen, ja muut ominaisuudet NSCLC.

Yleistä, miRNA uskotaan sitoa 3’alue kohde-mRNA ja alas-säädellä sen ilmentymistä mRNA tai proteiini tasoilla, mutta lähinnä mRNA tasolla [51]. Siksi, kun ilmaus miRNA on kohonnut, mRNA: t, jotka säätelevät miRNA odotetaan olevan alassäädetty; kun ilmaus miRNA on tukahdutettu, kohteeseensa mRNA: iden pitäisi näkyä-asetuksia. Kuitenkin mukaan tuloksemme, anti-korreloivat mRNA: t ovat aina alassäädetty ja vain pieni murto-osa geeneistä ovat ajan säännelty. Lisätutkimuksia ehdotti, että anti-korreloivat ryhmä, alassäädetty mRNA: t ovat aina erittäin ilmaistaan, ja säädelty mRNA: t ovat aina nöyrä ilmaistu. Sen vuoksi, että on olemassa enemmän erittäin ilmentyvien geenien voi olla tärkeä tekijä vaikutus. Syy, miksi korkeasti ilmaisi mRNA: t yleensä alas-säädellä miRNA ja nöyrä-ilmaisi mRNA: t ovat yleensä ajan säädellään miRNA ehdottaa olemassaolo sääntelyn tasapaino, joka toimii pitäen koko transcriptome optimoidussa dynaaminen alue.

meidän analyysi, emme löytäisi mitään johtolankoja, jotka ovat vastuussa eroa anti-korreloivat ja korreloivat mRNA: t. GO luokitus eivät osoittaneet mitään ilmeistä eroa joko (kuva S5). Lisäksi ekspressiotasot kohde mRNA: iden, joilla on korkea asetus arvo ei ilmennyt merkittävää vaihtelua, ja päinvastoin (taulukko S2, taulukko S3, taulukko S7, Table S9, taulukko S11), ja geenejä, joiden ilmentyminen on huomattavasti vaihtelevia eivät ole väistämättä huomattavasti säännelty. Koska mRNA usein säätelee useampi kuin yksi miRNA [28], emme vieläkään pysty tiedä, miten nämä miRNA vuorovaikutuksessa keskenään, ja millaisia ​​suoria vuorovaikutukset ovat tehokkaimpia. Lisäksi miRNA voi tukahduttaa niiden kohdegeenien vain proteiinitasolla [52], ja tavoitteet eivät saa ilmetä havaittavia muutoksia mRNA-tasolla. On muitakin tekijöitä, jotka ovat mukana säännellä mRNA: ta epigeneettiset tasoilla, kuten histoni metylaatio [53], [54] ja asetylaatio [55], [56], ja jotka ovat aina kykenevä häiritsemään miRNA-keskeinen verkkojen [57] , [58], joten selvittämisessä tällaisia ​​verkkoja vaikeammaksi.

Toinen mielenkiintoinen havainto on se, että geenit joko vastaaviin ryhmän tai anti-korreloivat ryhmä on suurempi osuus HCG geenejä kuin että ”muut” -ryhmään. Sekä korreloi ja anti-korreloivat ryhmät pidetään todennäköisimmin vaikuttaa tai mahdollisesti säätelee miRNA. Tämä tulos viittaa siihen, että miRNA tapana säännellä HCG geenejä. Lisätutkimuksissa osoitettiin, että HCG geenit taipumus ilmaista korkeammalla tasolla verrattuna ICG tai LCG geenejä. Siksi voi olla mahdollista, että enemmän HCG geenit vaikuttavat miRNA. Kuitenkin vertailut perustuvat kaikki mahdolliset kohteet ole osoittanut mitään eroa näistä ryhmistä (kuvio 4A). Koska tiukat standardi valitut kohteet ovat säilyneet sitoutumiskohtia of miRNA joukossa selkärankaisten tai nisäkkäiden, enemmän HCG kohdegeenien miRNA-vaikutteita ryhmä voi korreloida geenin evoluution keskuudessa selkärankaiset.

GO vertailu säänneltyjen ja sääntelemättömien ryhmät osoittivat ne olivat aivan erilaiset kuin entinen sisältää aina enemmän geenien transkription säätelyyn, nukleiinihappoa sitova, cell viestintä, metabolinen, ja kehittämistä koskevan asetuksen. Geenien toimintaa ja niiden ilmentyminen on aina korreloi CpG-saarekkeen sisältöä promoottoreita. On ehdotettu, että talon pitäminen toimintoja merkittävästi yliedustettuna HCG luokassa, kun taas termit liittyvät erityiset ominaisia ​​toimintoja eriytetympää tai erittäin säänneltyjä solut merkittävästi yliedustettuna LCG luokan [36], [59]. miRNA on ehdotettu olevan ensisijainen asetus mekanismi, koska se on läsnä matalasta korkeaan organismeihin, se voi näin ollen mieluummin säädellä suurempi osuus HCG geenien perus solutoiminnoille.