Krooninen sairaus

tiivistelmä

Olemme hiljattain kuvattu mitokondrioiden lokalisointi ja tuontiin D-vitamiinin reseptorin (VDR) aktiivisesti lisääntyvissä HaCaT soluja ensimmäistä kertaa, mutta sen rooli organelle on tuntematon. Monet aineenvaihdunnan välituotteita, jotka tukevat solun kasvua tarjoavat mitokondriot; näin ollen tunnistaminen, jotka säätelevät mitokondriaalisen metaboliatiet on erittäin kiinnostava, ja pyrimme ymmärtämään, onko VDR voi moduloida näitä reittejä. Olemme geneettisesti vaiennetaan VDR vuonna HaCaT soluissa ja tutkittu vaikutuksia solujen kasvuun, mitokondrioiden aineenvaihduntaa ja biosynteesireiteissä. VDR Knockdown johti vahvaa kasvun inhibition, jossa kertymistä G0G1 vaiheessa solusyklin ja laski kerääntymistä M vaiheessa. Vaikutukset VDR hiljentäminen proliferaatioon vahvistettiin useissa ihmisen syöpäsolujen linjat. Vähentynyt VDR ilmentyminen havaittiin yhdenmukaisesti kaksi erilaista solujen erilaistumista. Arvonalentuminen vaiennettu HaCaT solujen kasvua seurasi jyrkkä nousu mitokondrion kalvon potentiaalia, joka herkistyneet solut oksidatiivista stressiä. Huomasimme, että transkriptio alayksiköt II ja IV sytokromi c oksidaasi lisääntyi merkitsevästi, kun VDR hiljentäminen. Näin ollen hoito HaCaT solujen D-vitamiinia vaimentua molemmat alayksiköistä, mikä viittaa siihen, että VDR voi estää hengitysteiden ketjun ja ohjata TCA välituotteita kohti biosynteesiä, mikä edistää aineenvaihdunnan kytkin, joka on tyypillinen syöpäsoluja. Jotta tutustua tähän hypoteesin, tutkimme erilaisia ​​asetyyli-CoA-riippuvaista biosynteesireittejä, kuten mevalonaatin koulutusjakson (mitattuna kolesterolin biosynteesin ja prenylaatio pieniä GTPaaseja), ja histoni asetylaatio tasolla; kaikki näistä reiteistä inhiboi VDR hiljentäminen. Nämä tiedot saadaan näyttöä roolin VDR portinvartijana mitokondrioiden Hengitysketjun toimintaa ja helpottajana kulkeutuminen asetyyli-CoA energiaa tuottavien TCA cycle kohti biosynteesireiteissä jotka ovat välttämättömiä solujen lisääntymistä.

lainaus: Consiglio M, DESTEFANIS M, Morena D, Foglizzo V, Forneris M, Pescarmona G, et ai. (2014) D-vitamiinin Receptor Estää hengitystapahtumassa, Myötävaikuttaminen Metabolinen Switch, joka on välttämätön Cancer Cell Proliferation. PLoS ONE 9 (12): e115816. doi: 10,1371 /journal.pone.0115816

Editor: Makoto Makishima, Nihon University School of Medicine, Japani

vastaanotettu: 9. elokuuta, 2014; Hyväksytty: 27 marraskuu 2014; Julkaistu: 29 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Consiglio et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Ministero dell’Istruzione Università e Ricerca. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

D-vitamiinin reseptorin (VDR), yhdessä muiden jäsenten steroidihormonireseptori perhe, on yleisesti kuvattu klassista ligandi-moduloidun transkriptiotekijä. Erottava vaikutukset VDR käynnistyvät ligandin indusoiman tumaansiirtymiseen ja sitoutuminen D-vitamiinin reagoivan elementin (VDRE) sivustoja säännellyillä geenien yhdessä hetero- kumppaneiden koaktivaattoreiden ja korepressoreiden. Erot corepressor sitova ja DNA: n metylaatio heijastavat syvää vaihtelevuutta VDR antiproliferatiivisia vasteet eri solumalleissa [1]. Kestävyys ydinvoiman vaikutuksista D-vitamiinin on raportoitu useita malleja syövän, kuten eturauhas-, rinta- ja virtsarakon syöpien, jossa lisääntynyt corepressor ilmaisun ja lokalisointi on katsottu olevan vastuussa välinpitämättömästi hormoni [2] – [4 ].

steroidireseptorit myös hallussaan nongenomisia liikennemuotojen toiminnan, erityisesti solukalvon tai mitokondrion sivustoja, ja VDR ei ole poikkeus. Itse asiassa, nopea, nongenomisia D-vitamiinin näyttävät välittyvän VDR [5] – [7]. Monet steroidireseptorit ja ydinvoiman transkriptiotekijöitä anna mitokondrioiden osastoon, jossa ne joko aiheuttavat transkription säätelyyn mitokondrion DNA: n tai kontrolloida mitokondrioiden biogeneesiä ja aineenvaihdunta [8] – [11]. Olemme äskettäin kuvattu mitokondrioiden lokalisoinnin VDR ihmisen lisääntyvän keratinosyyttisolulinjaa (HaCaT) ensimmäistä kertaa ja osoitti, että mitokondrioiden tuonti reseptorin välittyy läpäisevyyttä siirtyminen huokosten monimutkaisia ​​[12]. Kuitenkin toiminta VDR tämän soluelimen on vielä selvittämättä. Mitokondrioita monitoiminen soluelimiin ja mitokondrioiden toiminta on tärkeää solujen lisääntymisen ja fysiologiaa. Esimerkiksi mitokondriot pelata olennainen rooli solujen energia (ATP) tuotanto kautta trikarboksyylihappo (TCA) kierto on kytketty oksidatiivinen fosforylaatio (OXPHOS), sekä apoptoosin aikana kautta reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) sukupolvi ja sytokromi c: vapauttaa. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että mitokondrioiden edistää kehittymistä ja etenemistä eri ihmisten sairauksia, kuten syöpää [13]. Tunnusmerkki kasvainsolujen on muuttunut aineenvaihdunta tukee nopeaa soluproliferaatioon [14]. Monet aineenvaihdunnan välituotteita, jotka tukevat solun kasvua tarjoavat mitokondrioiden [15]; näin ollen tunnistaminen, jotka säätelevät mitokondriaalisen metaboliatiet on erittäin kiinnostava, ja pyrimme ymmärtämään, onko VDR voi moduloida näitä reittejä.

Tässä tutkimuksessa, käyttämällä aikaisemmin kuvattuja malli (lisääntyvien HaCaT solu line), me geneettisesti vaiennetaan reseptorin ja tutki vaikutusta solun kasvuun, mitokondrioiden aineenvaihduntaa ja biosynteesireiteissä. Kerätyt tiedot saadaan näyttöä uusi rooli VDR negatiivisena säätelijänä hengitysteiden ketjun toimintaa, ja me korosta vaikutuksia solujen anaboliaa ja kasvun tuottaman VDR mitokondrion hengitystä. Perustuen havaintojemme voimme päätellä, että VDR, hillitsemällä mitokondrioiden hengitysteiden toimintaa, mahdollistaa solun säästää aineenvaihdunnan välituotteita, joita voi siirtyä oksidatiivisen aineenvaihdunnan kohti biosynteettinen kohtalo, joka tukee solujen kasvua. Me validoitu yleinen rooli VDR kuin tehostajana soluproliferaation ulottuu havaintojemme useisiin ihmisen syövän solulinjoissa.

Tulokset

VDR hiljentämisen HaCaT soluissa estää solujen lisääntymisen

Koska aiemmin tunnettu VDR mitokondrioiden tuontivuotta HaCaT soluissa, käytimme tätä mallia tutkia VDR toiminnon avulla geneettistä hiljentäminen. Joiden torjuminen VDR tasojen yhteydessä lentiviraalinen toimituksen shRNA jotka oli otettu esille vastaan ​​ihmisen VDR oli merkittävää, kuten on osoitettu mRNA ja proteiini analysoidaan kuvassa. 1A ja 1B, ja laukaisee voimakas kasvu pidätys HaCaT soluissa, arvioituna proliferaatiomäärityksessä, jossa korostettiin ilmeinen lasku kasvuvauhti VDR-vaimennettu solujen verrattuna ohjata soluihin (kuva 1C). Solujen kasvun pysähtymisen leimasi kertyminen VDR kaataa solupopulaation G0 /G1 vaiheessa solusyklin ja lasku M vaiheessa solupopulaation (kuva 1 D). Ei merkkejä apoptoottisten tai kärsimystä soluja näkyivät vaiennettu soluissa, kuten on osoitettu solusyklin analyysi, jota ei havaittu sub-G0 huippu, ja MTT myrkyllisyys määritys, joka paljasti identtiset elinkelpoisuus valvonnassa ja vaiennettu soluja (kuva 1E).

aliyhtyvät HaCaT solut infektoitiin lentiviraalinen VDR shRNA 3 ja shRNA ohjaus hiukkasia. Seitsemän päivää infektion jälkeen ja puromysiiniselektion, VDR ilmentyminen arvioitiin solu-uutteet. (A) mRNA: n ilmentymisen tasojen määrä käyttäen reaaliaikaista analyysiä VDR selostukset, ja arvot ilmaistaan ​​kertaiseksi muutoksia vaimennettu soluissa kontrolleihin verrattuna. (B) VDR ilmaisua mitokondrion jakeet (vasemmanpuoleiset paneelit) ja yhteensä lysaatit (oikea paneeli) alkaen shRNA-transfektoiduista ohjaus ja shRNA transfektoituja VDR soluihin analysoitiin western blotting. Tubulin havaittiin yhteensä tiivisteet ja VDAC tasot mitokondrioiden fraktioita käytettiin sisäisen valvonnan Proteiinilisäyksen. Vaikutukset VDR hiljentäminen proliferaatioon arvioitiin käyttämällä kristalliviolettimäärityksessä määritystä soluissa, jotka oli värjätty eri aikoina ymppäyksen jälkeen (C), sekä käyttämällä solusyklin analyysi (D) soluissa, jotka kerättiin päivänä 7 infektion jälkeen . (E) Solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttäen MTT-määritystä päivänä 7 infektion jälkeen ja arvot ilmaistaan ​​prosentteina absorbanssi shRNA valvontaa. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05 kontrolliin verrattuna.

erottavat ja antiproliferatiivinen toiminta D-vitamiinin in vitro on kuvattu aikaisemmin kirjallisuudessa. Tällaiset vaikutukset välittyvät transkription ohjaus, joka edeltää tumaansiirtymiseen ja ei esiinny D-vitamiinia stimuloiman HaCaT soluihin [12]. HaCaT solut näyttävät olevan vastustuskykyisiä ydinaseiden antiproliferatiivisia vaikutuksia D-vitamiinin ja sen mukaisesti, huomasimme, että D-vitamiini hoito ei muuttanut kasvuvauhti HaCaT solujen (kuten on esitetty S1 kuva). Siten HaCaT solut edustavat malli vastustuskyvyn erottaa ominaisuudet D-vitamiinia, ja ei ole mitään ristiriita välillä ydinaseiden lisääntymistä estävä rooli D-vitamiinin kuvattu kirjallisuudessa ja proliferatiiviset vaikutukset aiheuttaman VDR meidän solumallin. Tulokset meidän hiljentäminen kokeet osoittavat, että VDR vuonna HaCaT soluissa tehostaa solujen kasvua.

Mitokondrioiden lokalisoinnin VDR on yhteinen piirre ihmisen syövän solulinjoista, ja reseptorin hiljentäminen estää solujen lisääntymisen

jotta voidaan arvioida, mitokondriot voidaan katsoa olevan säännöllinen kohde VDR, arvioimme sen ilmentymistä paneelissa ihmisen syöpäsolujen linjat ja edellä mainitun HaCaT soluja (kuva 2A). Joka solulinja, joka positiivisen VDR ilmaisu, mitokondrio-uutteet analysoitiin western-blottauksella ja paljasti, että läsnä reseptorin. Oletimme, että jos VDR oli tuntomerkki jakautuvat solut ja oli mahdollista helpottaa solujen kasvua, ehdottivat fenotyyppi havaittu vaiennetaan HaCaT soluissa, niin se voisi helposti olla säästynyt, tai jopa poistaa, on eriytetty tilassa. Siten arvioimme VDR ekspressiotasot kaksi mallia, joka mahdollistaa tutkimiseksi ihmisen jakautuvat solut ja niiden eriytetty kollegansa: Vertasimme HaCaT lisääntyvien keratinosyyttisoluja täysin eriytetty ensisijainen keratinosyyttien ja rabdomyosarkoomasolut RD18 soluja, jotka oli indusoitu erilaistumaan jonka ehdollinen ilmaus miR-206 [16]. Mitokondrioiden otteita niin vaihteleviin solupopulaatioiden paljasti vähentynyt reseptorin ilmentymistä verrattuna havaitut pitoisuudet lisääntyvät solut (kuva 2B).

(A) VDR ilmentyminen analysoitiin paneelissa useita ihmisen solulinjoja käyttämällä western blotting yhteensä lysaatit (tot VDR) ja mitokondrioiden uutteet (mitoc VDR). Sillä RD ja MCF7-solut, VDR havaitsemiseen tarvitaan pitemmät altistumisen ECL. (B) Kaksi mallia solujen erilaistumisen arviointiin käytettiin VDR tasoilla koko lysaatit ja mitokondrioiden jakeet: Ihmisen lisääntyvien HaCaT-soluja vastaan ​​ihmisen ensisijainen eriytetyn keratinosyyttien erilaistumista indusoitavissa RD18 solut kantavat doksisykliini-indusoituva miR-206-ilmentävät lentivirusvektorilla puuttuessa (indusoimattomia: NI) tai läsnä doksisykliini neljälle (aiheuttama: IND4) ja kuusi päivää (aiheuttama: IND6). Tubulin havaittiin yhteensä tiivisteet ja VDAC tasot mitokondrioiden fraktioita käytettiin sisäisen valvonnan Proteiinilisäyksen. Täplät edustavat joukko kolmen erillisen kokeen.

Kun havaitaan laajaa mitokondrioiden ilmaus VDR, pyrimme vahvistamaan, että VDR ablaatio vaarantaa solujen lisääntymistä; Näin ollen, olemme poistaneet VDR ilmentymistä kaikissa syöpäsolulinjoissa käyttämällä geneettisiä hiljentäminen. VDR ilmentyminen vaiennettu kaikissa VDR-positiivisia solulinjoja, sekä HaCaT-soluja, ja reseptorin ilmentymisen oli jälleen vähenee voimakkaasti, kun arvioidaan sekä koko tiivisteet ja mitokondrion fraktiot (kuva 3A). Tehdyt havainnot HaCaT solut voimakkaasti tukevat tulokset Knockdown kokeita, koska leviämisen kaikkien solujen inhiboivat merkittävästi VDR hiljentäminen. Itse asiassa me pystyimme osoittamaan väheneminen yleisesti leviämisen nopeus kaikkien vaiennettu soluja, mikä oli samankaltainen kuin havaittiin HaCaT soluissa, jolloin niiden kasvu arvioitiin välillä 72 tuntia ja 5 päivää verrattuna että luonnonvaraisen tyypin soluja (kuva 3B). Vaiennettu fenotyyppi varmistettiin käyttämällä erilaista shRNA varten VDR (ShRNA 4, kuten on kuvattu menetelmät jaksossa), mikä oli yhtä tehokas hiljentäminen VDR ShRNA 3 ja myös vähentynyt solujen kasvua (S2 kuva). Lisäksi kun me antanut shRNA joka oli tehoton kannalta VDR hiljentäminen (ShRNA 2, kuten on kuvattu Menetelmät jaksossa) proliferaatio HaCaT solujen ei rajoita (S2 kuva).

(A) solut infektoitiin lentiviraalinen VDR shRNA 3 tai shRNA ohjaus ja hiljentäminen tehoa tutkittiin sekä kokonais- ja mitokondrioiden uutteita käytetään western blot. Tubulin havaittiin yhteensä tiivisteet ja VDAC tasot mitokondrioiden fraktioita käytettiin sisäisen valvonnan Proteiinilisäyksen. (B) Sekä vaiennetaan ja ohjaus solut altistettiin lisääntymismäärityksissä seitsemän päivää sen jälkeen infektion ja valinta. Solut värjättiin 72 tuntia tai viisi päivää ymppäyksen jälkeen ja arvot vaimennettu solut ilmaistaan ​​prosentteina niiden valvontaa. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05 kontrolliin verrattuna.

VDR hiljentäminen lisää mitokondrioiden hengityksen

Muut steroidireseptorit on aiemmin osoitettu säädellä mitokondrioiden transkription ja aktiivisuus [17] – [19], kannustavat myös tutkia, VDR, joka on lokalisoitu mitokondrion osastossa (samanlainen kuin sen perheen analogit), ohjaa mitokondrioiden aineenvaihduntaa. Ensin arvioitiin mitokondrioiden hengitysteiden toimintaa HaCaT solujen muutoksien mittaamiseksi kalvojännite- kautta JC-1-analyysi käyttäen cytofluorimetry. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, VDR Äänenvaimennusjärjestelmä voimakkaasti lisääntynyt mitokondrion kalvon potentiaalia, ja kun me altistetaan näiden solujen oksidatiivista stressiä (H

2O

2), niiden potentiaali heikentynyt suuremmassa määrin kuin villityypin solujen altistettiin samalle hoidon (kuva 4A). Kuitenkin, kun solut altistettiin eri, ei-oksidatiivisen stressin (esimerkiksi sorbitoli aiheuttama osmoottinen stressi), mitokondrioiden potentiaalia sekä villityypin kaataa solut vähenivät samassa määrin (kuva 4B). Näiden havaintojen perusteella, päättelimme, että VDR esti mitokondrion kalvon potentiaalia ja todennäköisesti hillitty ROS tuotanto, suojella solun ylimääräisiä oksidatiivisen stressin. Päinvastoin, VDR tappio lisääntynyt hengitysteiden potentiaali, mutta sulatettu solut alttiimpia hapettimen perustuva mahdollinen romahtaminen. Tätä mahdollisuutta tukee merkittävästi pienempi glutationin (GSH) kulutus villityypin soluissa, kuten paljasti suurempia antioksidantin molekyylin, joka mitattiin villityypin soluissa verrattuna vaiennettu soluihin (S3 kuva).

HaCaT-solut infektoitiin shRNA valvontaa tai VDR shRNA 3 ja mitokondrion kalvon potentiaalia tutkittiin käyttäen JC-1 sy- tofluorimetrisillä arviointia, kun läsnä on tai ei ole kahden eri stressitekijöitä: (A) valvonnan ja vaiennettu soluja käsiteltiin joko 10 mM H

2O

2 tai (B) 0,5 M sorbitolia. Molemmissa kuvioissa, edustaja kuvan sy- tofluorimetrisillä analyysi esitetään yläpaneelissa, kun taas tulokset kolmesta erillisestä kokeesta piirretään kuvaaja alemmassa paneelissa. FL-2 /FL-1-suhde laskettiin ja arvot ilmaistaan ​​prosentteina käsittelemättömien shRNA ohjaus. * P 0,05 verrattuna käsittelemättömiin shRNA ohjaus,

$ P 0,05 verrattuna käsitellyn shRNA ohjaus. (C) Reaaliaikainen analyysi COX II (COX II) ja IV (COX IV) alayksikköä transkriptin ilmentymistä hallitsee ja vaiennetaan soluja. Kertamuutoksia piirretään kuvaajat keinona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05 ** P 0,01 verrattuna shRNA valvontaa. (D) HaCaT-soluja kasvatettiin läsnä ollessa tai poissa ollessa 10 nM D-vitamiinin ja COX II ja COX IV transkriptin ilmentyminen arvioitiin käyttäen reaaliaikainen analyysi sen jälkeen, kun 24 ja 48 tuntia hoidon jälkeen. Arvot piirrettiin kuvaajat edustavat kertainen muutos transkriptioekspressiokuvio käsitellyissä vs. käsittelemättömissä soluissa ja näkyvät keinona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

§ P 0,05 ja

§§ P 0,01 verrattuna käsittelemättömiin soluihin.

Mitokondrioiden potentiaali ylläpiti protonigradienttia joka on luotu Hengitysketjun toimintaa; Siksi päätimme tutkia ilmaus kahden alayksikön kompleksi IV: Sytokromi c oksidaasi (COX) alayksiköt II ja IV, jonka selostukset ovat mitokondrioiden (entinen) ja ydinvoiman (jälkimmäinen) alkuperä. Sekä ydin- ja mitochondrially koodatut proteiinit tarvitaan muodostuisi aktiivisia hengitysteiden komplekseja. Mitokondrioiden RNA: t transkriboidaan niin kauan, polykistroniseen esiaste selostukset, joita myöhemmin jalostetaan vapauttamaan yksittäisten rRNA ja mRNA: t. Siksi me pidetään COX II olevan markkeri mitokondrioiden transkription aktiivisuuden ja COX IV olevan merkkiaine ydinvoiman osuus Hengitysketjun modulaatiota.

Lisääntynyt ilmentyminen molempien alayksiköiden vaimennettu soluissa verrattuna ohjata soluihin havaittiin käyttäen reaaliaikaista PCR: llä (kuva 4C). Sen vahvistamiseksi, että VDR vaikutti kielteisesti COX transkriptio, käsittelimme villityypin HaCaT solujen D-vitamiinin ja totesi, että tasojen kaikkien transkriptien alenivat (kuva 4D). Kun otetaan huomioon, että transkriptio alayksikköä IV on ydin-, kun taas alayksikkö II koodaa mitokondriaalisen DNA (mtDNA), päättelimme, että D-vitamiinin transkription ohjaus kohdistuu molemmilla tasoilla, mikä ei ole yllättävää ottaen huomioon, että ydin- ja mitokondrioiden transkriptio Hengitysketjun proteiinien hienosäädetty [20].

Koska modulaatio mitokondrion transkription VDR ei ole aiemmin kuvattu, me harkinnut mahdollisuutta suoraan sitoutumisen reseptorin mtDNA.

In silico

analyysi tehtiin tavoitteena seulonta mtdna tunnistaa D-vitamiinin reagoivan elementin (VDRE) sivustoja. Käytimme VDRE sekvenssi, jota edustaa joukko asennon paino matriisien (kuten on kuvattu menetelmät-osassa ja näytetään S1B taulukko) laskea affiniteetti VDR varten mtDNA sekvenssi. Vain kaksi VDRE sivustoja havaittiin olevan suuri affiniteetti cutoffs (89% ja 82% maksimipistemäärästä) ja molemmat sijaitsevat tilavuus silmukka (D-loop), joka ei koodaus ja säätelyalueen. Havaitsimme myös yhteensä 40 VDRE sivustoja, joilla on alhainen affiniteetti tulokset ( 60% suurimmasta) ryhmittyneet muutamalle alueelle (katso taulukko 1 on kuvaus korkeamman affiniteetin VDRE sivustoja ja S1A pöytä täydellinen luettelo). Joissakin tapauksissa nämä VDRE sivustot on muodostettu useita toistoja, osoittaa merkittävää läsnäoloa sitoutumiskohtien näillä alueilla. Huomattavaa on, että valtaosa VDRE sivustoja löydettiin käännetyn lohkon, joka todennäköisesti johtuu vinous mtDNA nukleotidin jakelun. Lisäksi alhainen affiniteetti sivustoja rikastettiin on hypervariaabeli segmentin 1 (p = 0,01425). Korkea affiniteetti tunnistettu VDRE sivustoja mahdollistaa mahdollisuudesta VDR välittämän suoran transkriptionaalisen säätelyn mtDNA. Lisätutkimukset suunnitellaan tutkimaan ominaisuuksia tämän sitoutumisen.

Kasvanut kalvon potentiaalia, joka havaittiin vaiennettu soluissa yhdistettynä indusoima COX tekstitystiedostojen osoitti, että Hengitysketjun oli tehostua vaiennetaan HaCaT soluja.

Yhteenvetona tuloksemme osoittavat, että VDR on rooli negatiivinen modulaatio Hengitysketjun ilmaisun ja hengitysteiden toimintaa, joka sekä maltilliset kalvo potentiaali ja on suojaava oksidatiivista stressiä vastaan.

VDR hiljentäminen minimoi asetyyli-CoA käyttöaste biosynteesireiteissä

Kun pyritään yhdistämään alennetun solujen kasvuun ja lisääntynyt mitokondrioiden potentiaali, joka havaittiin VDR kaataa soluja, me arveltu, että voimakas aktiivisuus Hengitysketjun stimuloi TCA syklin vaiennetaan soluissa. Vuonna lepotilassa olevat solut, keskeinen tehtävä mitokondrioiden on tuottaa ATP kautta TCA cycle-ruokinta elektroninsiirtoketju ja oksidatiivisen fosforylaation voidakseen toimittaa energiaa erilaisia ​​solutoiminnoille; Sitä vastoin syöpäsolut eivät ole suuresti riippuvaisia ​​OXPHOS niiden energiantarve ja uudelleen suoran TCA cycle välituotteita säilyttämiseksi biosynteettisten toiminto. Näin ollen jakautuviin soluihin, mitokondrioiden reitit rewired tukemaan leviämisen.

tiedot osoittivat, että VDR, vähentää aineenvaihdunnan vaatimuksiin hengitysteiden ketjun, voidaan ohjelmoida TCA aikana ja sen välituotteita voidaan käyttää biosynteettisen prosesseissa . Jotta testata tätä hypoteesia, olemme analysoineet biosynteesireiteissä riippuvainen asetyyli-CoA poiketa mitokondrion hajoamista. Ensin katsotaan tuotteet mevalonaatin cascade, eli kolesteroli, ubikinonia ja isoprenic yksiköiden välttämättömiä translaation jälkeiset modifikaatiot proteiineja. Kolesteroli ja ubikinonin

de novo

synteesi mitattiin HaCaT soluissa. Ohjaus ja VDR kaataa solut leimattiin [

3H] asetaattia ja rasvapitoisuus soluista määritettiin käyttäen TLC. VDR hiljentäminen vähensi

de novo

kolesterolin synteesiä (kuva 5A), kun taas ubikinonia biosynteesireitin oli vaikuttanut hiljentäminen (kuva 5B). Synteesi isoprenic yksiköiden mitattiin prenylaatio tilan kaksi pientä GTPaasit: RhoA ja Ras. VDR hiljentäminen alensivat prenylaatio molempien proteiinien, kun taas niiden yleistä ilmaisua pysyi ennallaan (kuva 5C).

HaCaT solut infektoitiin shRNA ohjaus tai VDR shRNA 3 ja biosynteesireiteissä tutkittiin seitsemän päivää infektion jälkeen. Mevalonaatin reitti arvioitiin

de novo

kolesterolin synteesiä (A) ja ubikinonin (B). Arvot edustavat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (C) isoprenoid yksiköt tuottaman samaa reittiä analysoitiin prenyyli osan sisällyttäminen pienessä GTPaaseja RhoA ja Ras. Ohjaus ja vaiennetaan solut kerättiin ja lysaatit alistettiin TX-114 vaihe-louhinta, jotta erottamiseksi prenyloituja muotoja. Yhteensä ja prenyloituja proteiinit analysoitiin western blotting. VDAC ja aktiinin ilmaisun vastaavaksi osoitettu Proteiinilisäyksen hydrofobisen faasin ja kokonaisuutteissa, vastaavasti. (D) histoni asetylaatio tasot arvioitiin western blotting -analyysillä käyttämällä anti-asetyyli H4-vasta-ainetta ja tubuliinin latauskontrollina. Täplät edustavat joukko kolmen erillisen kokeen.

Lopuksi saatavuus asetyyli yksiköiden biosynteettisille varten arvioitiin histoni asetylaatio ja VDR hiljentäminen myös vähentynyt tätä prosessia, joka mitattiin kuten histoni H4 asetylaatio (kuva 5D).

Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että kun VDR hiljentäminen, lisääntynyt hengitysteiden ketjun toimintaa hapettuu aineenvaihdunnan välituotteita, estää niiden hyödyntäminen biosynteesireiteissä. Olemme osoittaneet esimerkillistä kulkeutumisen asetyyli-CoA, sisällyttäminen joka pelkistetään aikana kolesterolin biosynteesin, prenylaatio tapahtumia ja histoni remodeling.

Keskustelu

Aikaisemmat työ HaCaT soluissa osoitti VDR mitokondrioiden lokalisointi ja mekanismi tuonti. Tässä tutkimuksessa, tunnistimme silmiinpistävän tärkeä uusi rooli reseptorin organelle toiminta ja solujen aineenvaihduntaan, koska osoitimme, että VDR toiminta syvästi vaikutuksia lisääntymistä.

Mitokondrioiden toiminnoista on aiemmin kuvattu muille steroidi reseptoreihin, useat jotka stimuloivat mitokondrioiden hengitystä ja siksi pidetään joko erottaa hormonireseptorit (eli tyroidireseptori, estrogeenireseptorin beta ja androgeenireseptorin) tai energiankulutuksen parantajina ja tarjoajien (eli glukokortikoidireseptorin) [17], [21], [22]. Hormonaaliset ärsyke vaikuttaa transkriptioon mitochondrially koodatun OXPHOS sekä epäsuorasti, indusoimalla ydin- signaaleja (kuten mitokondrioiden transkriptiotekijöitä, joka positiivisesti sääteli mitokondriaalisen genomin), ja suoraan, hakeutumaan organelle ja vuorovaikutuksessa vaste elementtien mitokondriaalisen DNA [ ,,,0],23]. Tähän mennessä VDR funktio mitokondrioissa edelleen tuntemattomia.

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että VDR edistää proliferaatiota, sillä sen vaientaminen vaikuttaa voimakkaasti kasvuvauhti HaCaT ja muiden syöpään jotka ilmentävät mitokondrio VDR. Alkaen aiemmin tunnettu HaCaT soluja ja laajentamalla analyysimme muihin solun malleja, huomasimme, että mitokondrioiden reseptorin paikallistaminen on laajalle levinnyt ominaisuus lisääntyvien solujen, ja yhdistys VDR kanssa leviämisen vahvisti tulokset analyysimme eriytetyn solut. Havaitsimme laski mitokondrioiden VDR tasoilla kaksi erilaista erilaistuneita soluja (primääriviljelmien keratinosyyttien edustaa fysiologista erilaistumista, kun taas miR-206 aiheuttama RD18 solut edustavat miRNA perustuva eriytetty tilassa). Mielestämme tämä on mielenkiintoinen havainto, joka oikeuttaa lisätutkimuksia metabolisen vaikutuksen ja molekyylitason mekanismit VDR downregulation lepotilassa soluissa.

Edellinen kirjallisuudessa kuvattu erottava ominaisuudet D-vitamiinia, perinteisesti välittyvät ydinaseiden vaikutukset VDR transkriptioon. Kuitenkin syöpäsolut ovat usein vastustuskykyisiä antiproliferatiivisia ja erottaa ominaisuudet D-vitamiinia, seurauksena lisääntynyt yhdistyksen VDR kanssa korepressoreiden on kromatiini [24]. Tämä on raportoitu ihosyöpä, muiden joukossa [25]. Ihmisen lisääntyvän keratinosyyttisolulinjaa HaCaT ei reagoi antiproliferatiivinen toiminta D-vitamiinin (S1 kuva), ja me aikaisemmin osoittaneet, että tumaansiirtymiseen VDR, joka on edellytys transkriptioaktiviteettia, ei aiheuttama ligandin stimulaation [12 ], mikä osoittaa tehoton, tai heikko, ydin- VDR signalointi näissä soluissa. Siksi HaCaT solut ovat hyvä malli, jota voidaan käyttää tutkia mitokondrioiden vaikutuksia VDR aktiivisuuden taustalla olivat erottaa ominaisuudet D-vitamiinin on menetetty.

Genetic hiljentäminen VDR vuonna HaCaT soluissa tuotti kaksi vaikutuksia, jotka liittyivät: alennettu leviämisen joka vastasi kasvu Hengitysketjun ilmaisun ja mitokondrion kalvon potentiaalia. Meillä oli todisteita siitä, että VDR tasapainottaa elektroni-ketjun toimintaa, jolloin kaksi etuja solun: suojaa oksidatiivista stressiä ja tuki leviämisen kautta helposti saatavilla biosynteettisiä välituotteita. Entinen päätelmä tehtiin havaitsimme lisääntynyt haavoittuvuus vaiennettu solujen vahva oksidatiivisen loukkaus, mukana on vähentynyt intrasellulaarisen GSH allas. Jälkimmäinen tulkinta, toinen merkittävä havainto työmme, ehdotti kokeissa tavoitteena on arvioida biosynteettistä kapasiteettia vaiennettu HaCaT soluja. Analysoimme eri biosynteesireiteissä jotka tukeutuvat asetyyli-CoA mitokondrioiden alkuperää. Asetyyli-CoA on elintärkeä rakennuspalikka endogeeninen biosynteesin rasvahappojen ja kolesterolin ja on mukana isoprenoid-pohjainen proteiini muutoksia; asetyyli-CoA tarvitaan myös asetylointi reaktioita, jotka muuttavat proteiinit, kuten histoni asetylaatio. Huomasimme, että VDR kaataa solujen muotoutuneet rajoitettiin biosynteettistä nopeus on mevalonaatin koulutusjakson, mitattuna vähentyminen kolesterolin ja prenyyli molekyylejä voidaan käyttää proteiinin muutos. Olemme ulkopuolelle sitä, että kokeissa olimme poistamalla positiivinen modulaatio 3-hydroksi-3-metyyliglutaryylikoentsyymi A: n (HMG-CoA) reduktaasin, joka on keskeinen entsyymi mevalonaatin cascade, koska tasot yksi tuotteiden reitin, ubikinoni (CoQ), eivät vaikuttaneet VDR hiljentäminen. Sen sijaan syyttää haittaavat biosynteettinen korko laski asetyyli-CoA saatavuus, ja tämä mahdollisuus validoitiin se havainto, että VDR hiljentäminen myös laantui histoni asetylaatio. Epäherkkyyden ubiquinone synteesin vähenemisestä asetyyli-CoA- tasolle, joka on kriittinen muita lipidejä, saattaa johtua eroista Km arvot haaran pisteen entsyymien mevalonaatin kautta. Periaate klassisen virtaus kulkeutumisen hypoteesi osoittaa, että vaihtelut koko esiaste altaan ensisijaisesti vaikuttaa kolesterolin synteesiä koska Km skvaleenisyntaasin sen alusta on korkea, kun taas kaikki muut haaran pisteen entsyymeillä alhaiset Km-arvojen ja nopeutta rajoittavaa entsyymejä CoQ biosynteettisissä haara voi olla pienin Km-arvot. Valitettavasti täydelliset tiedot CoQ synteesin eläinkudoksessa vielä selvittämättä.

totesi, että VDR, hillitsemällä mitokondrioiden hengitysteiden toimintaa, säästää mitokondrion aineenvaihdunnan välituotteita, joita voidaan ohjata pois oksidatiivisen aineenvaihdunnan kohti biosynteettinen kohtalo . Lopputuotteiden, jotka todettiin vaikuta kytkimen tässä tutkimuksessa ovat olennaisia ​​leviämisen; erityisesti, kolesteroli, joka on jatkuvasti sisällytetty kalvot, ja useat raportit osoittavat, että cholesterogenesis on huomattavasti kohonnut erilaisissa syöpäsoluissa [26] – [28]. Lisäksi prenylaatio on translaation jälkeisen modifikaation useita pieniä GTPaaseja ja on välttämätöntä telakointi ja näiden entsyymien aktiivisuus; haittaa GTPaasi-aktiivisuus häiritsee leviämisen, joka on laajasti raportoitu kaksi pientä GTPaaseja, jotka analysoitiin tässä tutkimuksessa, RhoA ja Ras, The prenylaatio joka tarvitaan niiden kyky indusoida pahanlaatuinen transformaatio, invaasio ja metastaasi [29] . Lopuksi histoni asetylaatio tila on tärkeä näkökohta leviämisen koska se edustaa epigenetic strategian ohjaamalla chromatin remodeling. follows:

5′-CCGGCCTCCAGTTCGTGTGAATGATCTCGAGATCATTCACACGAACTGGAGGTTTTT-3′,

5′-CCGGCTCCTGCCTACTCACGATAAACTCGAGTTTATCGTGAGTAGGCAGGAGTTTTTG-3′,