Krooninen sairaus

tiivistelmä

Johdanto

Äskettäin pleiotrooppisten hyödyt inkretiinin-pohjainen terapia on raportoitu. Olemme aiemmin raportoitu, että eksendiini-4, glukagonin kaltaisen peptidi-1 (GLP-1) reseptorin agonisti, vaimentaa eturauhassyövän kasvua. Metformiini tunnetaan syövän vaikutusta. Tässä, tutkimme syövän vastaisen vaikutuksen Eksendiini-4 ja metformiinin käyttäen eturauhassyöpää malli.

Methods

Eturauhassyöpä soluja käsiteltiin Eksendiini-4 ja /tai metformiinia. Solujen proliferaatio määritettiin kvantitatiivisesti kasvukäyrät ja 5-bromi-2′-deoksiuridiini (BrdU) määritys. TUNEL määritys ja AMP-aktivoitu proteiinikinaasi (AMPK) fosforylaatio tutkittiin LNCaP. Sillä

in vivo

kokeissa, LNCaP-solut istutettiin ihonalaisesti kyljen alueelle kateenkorvattomissa hiirissä, joita käsiteltiin sitten Eksendiini-4 ja /tai metformiinia. TUNEL määritys ja immunohistokemia suoritettiin kasvaimia.

Tulokset

Eksendiini-4 ja metformiinin additiivisesti laski kasvukäyrän, mutta ei muuttoliike, eturauhasen syöpäsoluja. BrdU määritys paljasti, että molemmat Eksendiini-4 ja metformiinin laski merkittävästi eturauhassyövän proliferaatiota. Lisäksi metformiini, mutta ei eksendiini-4, aktivoitu AMPK ja indusoi apoptoosia LNCaP. Antiproliferatiivista vaikutusta metformiinin poistettiin esto tai kaataa of AMPK.

In vivo

, eksendiini-4 ja metformiinin merkittävästi vähentynyt kasvaimen kokoa, ja edelleen merkittävästi kasvaimen koon pienentämiseen jälkeen havaittiin yhdistelmähoito. Immunohistokemia kasvaimia paljasti, että P504S ja Ki67 ilmentyminen väheni Eksendiini-4 ja /tai metformiinia, ja että metformiini lisääntynyt fosfo-AMPK ilmentymisen ja apoptoottisten solujen lukumäärä.

Johtopäätös

Nämä tiedot viittaavat siihen, että Eksendiini-4 ja metformiinin heikennettyjä eturauhassyövän kasvua estämällä lisääntymistä, ja että metformiini estivät proliferaatiota indusoimalla apoptoosin. Yhdistetyt hoito eksendiini-4 ja metformiinin heikennettyjä eturauhassyövän kasvua yli erillisestä käsittelystä.

Citation: Tsutsumi Y, Nomiyama T, Kawanami T, Hamaguchi Y, Terawaki Y, Tanaka T, et ai. (2015) Yhdistetty hoito eksendiini-4 ja metformiinin Vaimentaa Eturauhassyöpä Growth. PLoS ONE 10 (10): e0139709. doi: 10,1371 /journal.pone.0139709

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 28 kesäkuu 2015; Hyväksytty: 16 syyskuu 2015; Julkaistu: 06 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Tsutsumi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: MSD omistetun tuoli meidän osastolla ja tuettiin muodossa palkkojen tekijän, Tomoko Tanaka, PhD. Kuitenkin tri Tanaka ei ole työntekijä MSD. MSD lahjoittaa omistetun tuoli meidän osastolla, ja meidän osastolla palkata hänet käyttämällä osa apurahan MSD. Eli Lilly tuki taloudellisesti kuin yhteinen tutkimus. Kuitenkin nämä yritykset eivät ole mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Eli Lilly myönsi rahoitustukea yhteiseksi tutkimukseksi. MSD lahjoittaa omistetun tuoli meidän osastolla, ja meidän osastolla työskentelee kirjailija Tomoko Tanaka, PhD käyttämällä osa avustuksen MSD. TN on saanut luento palkkiot Astrazeneca, Astellas, Boehringer Ingelheim, Eli Lilly, MSD, Novartis Pharma, Ono Pharmaceutical Co Ltd, Sanofi, Takeda Pharmaceutical Co Ltd, Mitsubishi Tanabe Pharma ja Sumitomo Dainippon Pharma, ja tutkimukseen varoja Astellas ja MSD. TY tukivat taloudellisesti hänen tutkimuksen MSD, Sanofi, Takeda Pharmaceutical Co., Ltd., Daiichi Sankyo Company Ltd, Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd., Sanwa Chemistry Co., Ltd., Eli Lilly, Novo Nordisk Pharma Oy ., Novartis Pharma, Kowa Company Ltd., ja Fujifilm Pharma Co., Ltd. ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Lyhenteet: AMPK, AMP-aktivoitu proteiinikinaasi; AR, androgeenireseptorin; DPP-4, dipeptidyylipeptidaasi-4; Ex-4, eksendiini-4; ERK-MAPK, ekstrasellulaarisen signaali säädelty kinaasi-mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi; GAPDH, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi; GLP-1, glukagonin kaltainen peptidi-1; GLP-1 R: n, GLP-1-reseptori; IGF-1, insuliinin kaltainen kasvutekijä-1; mTOR, nisäkkään rapamysiinin kohde; NFKB, tumatekijä kappa-kevytketjun-tehostajana aktivoitujen B-solujen; PSA, eturauhasen seerumin antigeeni

Johdanto

inkretiinin-pohjainen terapia, mukaan lukien dipeptidyylipeptidaasi-4: n (DPP-4: n) estäjät ja glukagonin kaltainen peptidi-1-reseptorin (GLP-1 R) agonistit, on tullut suosittu hoito tyypin 2 diabetes. Viime aikoina paljon huomiota on keskittynyt inkretiinin, koska sen kudosta suojaavia vaikutuksia kuin alentamalla glukoosipitoisuutta [1]. Olemme osoittaneet, että verisuonten-suojaavia vaikutuksia Eksendiini-4 (Ex-4), joka on GLP-1 R-agonisti, koska se vaimenee atheroma muodostumista apoE

– /- hiirissä, eston kautta NFKB aktivaation makrofageissa [2], ja se vähensi intiman paksuuntumista jälkeen verisuonen loukkaantumisen kautta AMP-aktivoitu proteiinikinaasi (AMPK) aktivointi sileän lihaksen soluissa [3]. Lisäksi olemme hiljattain osoittaneet, että DPP-4-estäjä, linagliptiini, väheni neointiman muodostuminen jälkeen verisuonen loukkaantumisen [4]. Siten inkretiinin-pohjainen hoito voi parantaa elämänlaatua ja kuolleisuus diabetespotilaiden kautta verisuonten-suojaavia vaikutuksia. Kuitenkin syöpä on toinen merkittävä kuolinsyy diabeetikoilla [5], erityisesti Japanissa, jossa se on johtava kuolinsyy potilailla, joilla on tyypin 2 diabetes [6]. Näin ollen Japanin Diabetes Society ja Japanissa Cancer Association ovat antaneet varoituksen lisääntynyt syöpäriskiä diabeetikoilla [7]. Kuitenkin useissa tutkimuksissa, jotka ovat tutkineet syövän vastaisen vaikutuksen inkretiinin on rajallinen.

Viime aikoina olemme tutkineet anti-eturauhasen syöpä vaikutuksen Ex-4 sekä

in vivo

ja

in vitro

[8]. Havaitsimme GLP-1 R ilmentymistä ihmisen eturauhasen syöpä kudoksen ja eturauhassyövän solulinjoissa, ja Ex-4 heikennetty eturauhassyövän kasvua sekä

in vitro

ja

in vivo

estämällä solun ulkopuolisen signaalin säännelty kinaasi-mitogeeni-aktivoitu proteiinikinaasi (ERK-MAPK) aktivaation, joka johtaa soluproliferaation inhibointi [8]. Koska meta-analyysi on ehdottanut, suhde eturauhasen syöpä ja diabetes tai metabolisen oireyhtymän keskustellaan edelleen [9-13]. Kuitenkin tuore tutkimus on ehdottanut, että aiemmin puhjenneen diabeteksen liittyy myös korkeampi kuolleisuus potilailla, joilla on eturauhasen syöpä, samoin kuin muut syövät [14]. Lisäksi seurantatutkimus on 2546 potilasta, joilla on eturauhasen syöpä on osoittanut, että sekä korkea painoindeksi ja plasman C-peptidin pitoisuus lisäsi kuolleisuusriskiä [15]. Lisäksi olemme aiemmin raportoitu, että insuliinin ja insuliinin kaltaisen kasvutekijä-1 (IGF-1) nopeuttaa eturauhassyövän solujen lisääntymisen kautta androgeenireseptoria (AR) aktivaation estämällä sen suoraa vuorovaikutusta Foxo1 [16]. Nämä tiedot suosivat hypoteesia, että insuliiniresistenssiä ja hyperinsulinemian pre- tai aikaisin diabeettisen valtioiden ja metabolinen oireyhtymä liittyy huono ennuste eturauhasen syöpäpotilaille. Kuitenkin metformiini on tunnettu anti-diabeettisen aineen, joka on myös syövän vaikutusta [17, 18]. Metformiini vaimentaa syövän kasvua epäsuorasti vähentämällä Seerumin insuliini- ja IGF-1 pitoisuus aiheuttama insuliiniherkkyyden paranemista, ja suoraan solusyklin pysähtymiseen ja eston nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) seuraava AMPK aktivointi [19]. Lisäksi yksityiskohtainen tutkimus on osoittanut suora anti-eturauhasen syöpä vaikutusta metformiinin

in vivo

ja

in vitro

[20].

Tässä tutkimuksessa selvitimme syövän vaikutuksia Ex-4 ja /tai metformiinia hoitoon

in vivo

ja

in vitro

käyttäen eturauhassyöpää malli.

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet

Kateenkorvattomiin CAnN.Cg-

Foxn1nu Twitter /CrlCrlj ei-diabeetikoilla koirashiirien hankittiin Charles River Laboratories Japan, Inc. (Yokohama, Japani) ja sijoitettu erityisiä pathogen- vapaa este tilat Fukuoka yliopistossa. Hiiriä käsiteltiin joko suolaliuosta (n = 10) tai Ex-4 (Sigma-Aldrich, Tokio, Japani) 300 pmol painokiloa

-1päivä

-1 (n = 10), toimittaman mini osmoottinen pumppu (ALZEST, malli 1004; DURECT, Cupertino, CA, USA), tai metformiinin kanssa (Wako Pure Chemical Industries, Ltd, Osaka, Japani) 750 mg kg

-1päivä

-1 sekoittamalla se rehun kanssa (n = 10), tai yhdistetyn Ex-4 ja metformiinin (n = 10). Iässä 6 viikkoa, 1 x 10

6 (passage 4-8) LNCaP-solut sekoitettiin 250 ui Matrigel (Becton Dickinson labware, Bedford, MA, USA) ja istuttaa ihon alle kylkeen alueelle, ja osmoottinen pumppu transplantoitiin ihon alle selän kunkin hiiren anestesiassa 2% isofluraani hengitettynä. Iässä 12 viikon otettiin verinäytteet, ja hiiret lopetettiin. Yksi hiiri käsiteltiin Ex-4 kuoli iässä 10 viikkoa, 4 päivää elinsiirron jälkeen uuden infuusiopumpun Ex-4, koska taistelut. Kasvaimen tilavuus laskettiin modifioidun ellipsoidin kaavalla: pituus x leveys

2 x 0,52. Parafinoidut formaliinikiinnitetyt kasvaimet leikattiin 5-um: n leikkeitä ja valmistettiin immunofluoresenssivärjäyksellä, kuten aiemmin on kuvattu [8]. Eturauhasen seerumin antigeeni (PSA) proteiini pitoisuudet hiiren seerumissa mitattiin käyttäen EIA at SRL Inc. (Tokio, Japani). Seerumin insuliini mitattiin käyttäen EIA kit hankittu Morinaga Institute of Biological Science Inc. (Yokohama, Japani). Kaikki menettelyt eläinkokeiden tarkistettiin ja hyväksyttiin institutionaalisten Animal Care alivaliokunnan Fukuoka yliopistollisessa sairaalassa.

Soluviljely ja soluproliferaatiomäärityksissä

Ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa, LNCaP, PC3 ja DU145-solut, hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). LNCaP-solut ja DU145-soluja pidettiin RPMI 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% penisilliini /streptomysiiniä, PC3-soluja viljeltiin Hamin F-12. Kaikki alustat täydennettiin 10% FBS: ää ja 1% penisilliini /streptomysiiniä. Soluproliferaatiomääritykset suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [8] pienin muutoksin. Lyhyesti, solut (3 x 10

4 solua /levy) maljattiin 3,8 cm

2 levyä ja ylläpidetään väliaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää ja 1% penisilliini /streptomysiiniä tai ilman 0,1-10 mM metformiinia, 10 nM Ex-4, yhdistelmä 10 nM Ex-4 ja 0,1 mM metformiini tai 0,1 uM yhdiste C, joka on AMPK-inhibiittori (Sigma-Aldrich). Solujen lisääntyminen analysoitiin jälkeen 0-4 päivää solujen laskenta hemosytometrillä. Kaikissa kokeissa, samalla siirrostettiin (passage 4-8) soluja käytettiin. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena käyttäen kolmea eri valmistetta soluja.

siRNA Knock alas AMPK Expression ja proliferaatiomääritystä

siRNA kaataa ja solujen lisääntymisen määrityksessä suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [8] . Voit pudotus AMPK, mahdollinen tavoite metformiinin, käytimme AMPKɑ1 /2 siRNA (h) (sc-45312, Santa Cruz, Santa Cruz, USA) ja ohjaus siRNA (sc-36869, Santa Cruz). Transfektioon, LNCaP-solut maljattiin tiheyteen 1 x 10

5 solua /kuoppa 6-kuoppalevyille ja transfektoitiin 10 nM AMPKɑ1 /2 siRNA (h) tai Control siRNA tehtävälle

® siRNA Transfection Reagent (Sigma-Aldrich). Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut altistettiin solulisäkasvumääritykselle. Lyhyesti, solut irrotettiin ja uudelleen maljattiin 12-kuoppaisille kudosviljelylevyille täysin median kanssa tai ilman 0,1 mM metformiinia. Kolme päivää käsittelyn jälkeen solut kerättiin ja laskettiin hemosytometrillä.

BrdU määrityksissä

arvioimiseksi LNCaP-solujen lisääntymisen, The bromideoksiuridiinia (BrdU) sisällyttäminen analyysi suoritettiin käyttäen Cell Proliferation ELISA-kittejä ( 1647229, Roche Applied Science, Mannheim, Saksa), kuten on kuvattu aiemmin [8]. Lyhyesti, LNCaP-solujen kanssa tai ilman siRNA transfektion maljattiin 5000 solua /kuoppa 96-kuoppaisille viljelylevyille täyteen kasvatusliuokseen. Saavutettuaan 60-70% konfluenssiin, LNCaP-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman 10 nM Ex-4, 0,1 mM metformiinin yhdistelmä 10 nM Ex-4 ja 0,1 mM metformiinin, tai yhdiste C väliaineessa, jossa oli 10% FBS: ää 24 tuntia . BrdU (10 uM) lisättiin viime 2 h stimulaation. Seuraavaksi solut kuivattiin ja kiinteä, ja solun DNA denaturoitiin FixDenat-liuosta (Roche Applied Science), 30 minuuttia huoneenlämmössä (RT). Peroksidaasi-konjugoitua hiiren anti-BrdU monoklonaalisen vasta-aineen (Roche Applied Science) lisättiin viljelmään ja inkuboitiin 90 min RT: ssa. Lopuksi, tetrametyylibentsidiiniä substraattia lisättiin 5 min RT: ssä ja absorbanssi näytteistä mitattiin käyttäen mikrolevyn lukijaa (Thermo Fisher Scientific K.K., Yokohama, Japani) on 450-620 nm. Mean tiedot ilmaistaan ​​suhde ohjaus (käsittelemätön) solujen lisääntymistä.

Apoptosis määrityksissä

merkinnöissä ytimiä apoptoottisten solujen, 1,5 x 10

5 LNCaP-solut maljattiin lasi peitelaseilla Lab-Tek Chamber Kalvot (177380, Nunc, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 25 min. Esikäsitellä parafinoidut kudos, osat poistettiin parafiini, pestiin ksyleenillä ja etanolilla ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 15 min ajan. Jokainen osa inkuboitiin 20 ug /ml proteinaasi K -liuosta 10 minuutin ajan, pestiin ja uudelleen kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 5 minuutin ajan. TUNEL värjäys suoritettiin käyttäen fluorimetristä DeadEnd TUNEL-järjestelmä (Promega, Madison, WI, USA) valmistajan protokollan. Viimeisellä 24 h, LNCaP-soluja inkuboitiin 0,1 tai 10 mM metformiini. LNCaP-soluja käsiteltiin 1 yksikkö /100 ui RQ1 RNase-free DNase (M6101; Promega) 10 min, käytettiin positiivisena kontrollina. Kolme riippumatonta kokeita.

immunohistokemia

Yksi parafiini jakso tehtiin keskellä yksi kasvain. Parafiini leikkeitä inkuboitiin anti-GLP-1 R vasta-ainetta (NBP1-97308; Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), anti-P504S-vasta-ainetta (sc-81710; Santa Cruz Biotechnology Inc.), anti-Ki67-vasta-aine (ab66144; Abcam , Cambridge, UK), anti-AR-vasta (sc-816; Santa Cruz Biotechnology Inc.) tai anti-fosfo-AMPKα vasta-aine (Thr172) (# 2535; Cell Signaling, Danvers, MA, USA). Osiot analysoitiin GLP-1Rand fosfo-AMPKα (Thr172) viljeltiin sen jälkeen Alexa Fluor 488 vuohen anti-kani IgG (A-11008, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), ja profiilit analysoitiin P504S, AR ja Ki67 sittemmin inkuboitiin Alexa Fluor 546 vuohen anti-kani IgG (A-11010; Life Technologies). Osiot vastavärjättiin DAPI ja visualisoitu jota LSM710-ZEN 2008 -konfokaalimikroskoopilla (Carl Zeiss Japani MicroImaging Co., Ltd., Tokio, Japani). Neljällä yhden osan havaittiin, ja positiiviset solut laskettiin hemosytometrillä. Tiedot ovat keskiarvo neljästä itsenäisestä määrä yhdessä jaksossa.

Western blot-analyysi

Western-blottaus suoritettiin, kuten on kuvattu aiemmin [8]. Seuraavat ensisijainen vasta-aineita käytettiin: anti-mTOR (# 2983; Cell Signaling), anti-fosfo-mTOR (Ser2448) (# 2971; Cell Signaling), anti-fosfo-AMPKɑ (Thr172) (# 2535; Cell Signaling), anti-AMPKɑ (# 2532; Cell Signaling) ja anti-GAPDH (sc-20375; Santa Cruz). Ekspression näiden proteiinien tutkittiin LNCaP-soluja, jotka inkuboitiin väliaineessa, jossa oli 10% FBS: ää, ja sen jälkeen stimuloitiin kanssa tai ilman 10 nM Ex-4, 0,1 mM metformiinin, tai niiden yhdistelmää 10 nM Ex-4 ja 0,1 mM metformiini 24 h.

Cell migraatiokokeessa

solun migraatiokokeessa suoritettiin käyttäen CytoSelect 24 kuopan solumigraatio Kolorimetrinen Format määritys (CBA-100-C; Cell Biolabs), seuraten valmistajan tuote käsikirja. Kukin kuoppa sisälsi Boyden kammion, jossa on 8 um: n pore polykarbonaattikalvon ja väliainetta, joka sisälsi 10% FBS: ää tai ilman sitä 10 nM Ex-4, 0,1 mM metformiinin, tai niiden yhdistelmää 10 nM Ex-4 ja 0,1 mM metformiini. Chambers oli peitteellä 1,5 × 10

5 LNCaP tai PC3 solut seerumivapaassa ja inkuboidaan 37 ° C: ssa yli yön. Soluja Kuopat pestiin pois, ja muuttavien solut värjättiin ja laskettiin käyttäen mikrolevyn lukijaa OD 570 nm: ssä.

Tilastollinen

Parittomia

t-

testejä ja yksi- tapa varianssianalyysi (ANOVA) suoritettiin tilastollinen analyysi tarvittaessa.

P

arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM.

Tulokset

Eksendiini-4 ja metformiinin Vähennä Eturauhassyöpä Growth Additiivisesti

In vivo

Käsittelimme kateenkorvattomissa hiirissä, jotka oli siirretty LNCaP, jossa ihonalaisesti Ex-4, suun kautta syötetty metformiinia tai yhdistelmähoito. Kun 6 viikon hoidon kasvaimen mätästys oli poissa yhdellä hiiren Ex-4-hoidetussa ryhmässä kaksi hiirtä on metformiini-hoidetussa ryhmässä ja kolme hiirtä yhdistetyn hoitoryhmässä. Laskeminen kasvaimen koon käyttäen muunneltua ellipsoidin kaava paljasti, että tuumorin tilavuus väheni merkittävästi käsittelyn jälkeen sekä Ex-4 ja metformiinin kontrolliin verrattuna, mutta edelleen vähentää kasvaimen koon havaittiin yhdistetyn hoidon hiirissä (kuvio 1A ja 1 B). Mittaus paino muodostettu kasvaimia osoitti, että yhdistetty käsittely Ex-4 ja metformiinin merkittävästi vähentää kasvaimen painoa verrataan ohjaus- ja erillisen hoidon Ex-4 tai metformiinin (kuvio 1C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että Ex-4 ja metformiinin heikennettyjä eturauhassyövän kasvua

in vivo

ja yhdistetyt hoito molempien kanssa laskivat edelleen kasvaimen kasvua additiivisesti.

(A) Kateenkorvattomiin CAnN.Cg-

Foxn1nu Twitter /CrlCrlj hiirille (ikä 6 viikkoa) istutettiin 1 x 10

6 LNCaP (passage 4-8) ja vehikkeliä (n = 10), Ex-4 (300 pmol kg kehon paino

-1päivä

-1; n = 9), metformiinin (met; 750 mg kg

-1päivä

-1; n = 10), tai yhdistetty hoito Ex 4 ja metformiinin (n = 10). Kasvaimet kuvattiin 12 viikon iässä. (B) Kasvaimen tilavuus laskettiin modifioidun ellipsoidin kaava. Parittomia

t-

suoritettiin laskea tilastollinen merkittävyys (**

P

0,01 vs. kontrolli). Hiirissä ilman mätästys kasvain, kasvaimen tilavuus laskettiin ”nolla”. (C) Kasvaimen paino mitattiin mittakaavoissa. Parittomia

t

-testaukset tehtiin laskea tilastollinen merkittävyys (**

P

0,01 vs. kontrolli;

#

P

0,05 vs. Ex -4). Hiirissä ilman mätästys kasvain, kasvaimen paino laskettiin ”nolla”.

Näissä hiirissä, lopullisen painon ja plasman glukoosipitoisuuden olivat merkittävästi alemmat metformiini hoidetussa ryhmässä verrattuna ohjaus ja Ex-4-käsiteltyjen ryhmien (taulukko 1). Plasman PSA taso laski hieman jälkeen Ex-4 tai metformiiniin yksinään kontrolliin verrattuna, ja lisäksi sekä merkittävä väheneminen havaittiin jälkeen kombinaatio kontrolliin verrattuna (taulukko 1). Ex-4 lisäsi merkittävästi seerumin insuliinin tasoa; kuitenkin yhdistetty Ex-4 ja metformiiniin laski sen valvonta tasolle (taulukko 1).

Eksendiini-4 ja metformiinin Vähennä Cell Proliferation ja lisätä GLP-1 R Expression

immunohistokemiallinen analyysi parafiiniin upotetut leikkeet ihonalaisen eturauhassyövän kasvaimia osoitti, että Ki67 ilmaisu, joka paikannettiin selvästi tumassa, oli merkittävästi tukahdutti Ex-4, metformiinin ja yhdistetyt jälkeen (kuvio 2A ja 2B). Kuitenkin ylimääräinen lasku Ki67-positiivisten solujen ei havaittu yhdistetyssä hoitoryhmässä verrattuna erillisestä käsittelystä. Ilmentyminen P504S, eturauhasen syövän merkkiaineita, dramaattisesti vähentynyt Ex-4, metformiinin ja kombinaatio (kuvio 2C). Kvantifiointi P504S ilmaisun perusteella keskimääräinen lukumäärä P504S-positiivisten solujen jaettuna kokonaismäärä ytimien vahvisti, että oli merkittävä väheneminen syöpäsoluissa, kun Ex-4, metformiinin ja yhdistetyt jälkeen (kuvio 2D). Mielenkiintoista on, että useita eturauhassyövän soluissa, jotka ilmentävät GLP-1 R kasvoi sen jälkeen, kun Ex-4 ja /tai metformiiniin (kuvio 2C). Kvantifiointi osuus GLP-1 R-positiivisten solujen paljasti, että yhdistetty hoito lisäsi merkittävästi määrä GLP-1 R-positiivisia soluja verrattuna kontrolliin (kuvio 2E). Lisäksi olemme havainneet AR-positiivisten solujen eturauhasen syövän kasvain (kuvio 2F). Ei havaittu muutosta AR ilmaisun jälkeen Ex-4 ja metformiini hoito eturauhasen syöpä kasvain (kuvio 2G).

parafinoidut tuumorisektioiden (5 pm) altistettiin immunohistokemiaallisesti (A) Ki67, ( C) P504S ja GLP-1 R, ja (F) AR, ja vastavärjättiin DAPI. Suurennos, × 400. (B) Ki67, (D) P504S, (E) GLP-1 R, ja (G) AR-positiiviset solut kvantitoitiin analysoimalla osa värjäytyneiden solujen kasvaimen suhteen kokonaismäärä ytimiä. Arvot ilmaistaan ​​prosentteina positiivisia soluja. Parittomia

t

-testaukset tehtiin laskea tilastollinen merkittävyys (*

P

0,05, **

P

0,01 vs. kontrolli).

Eksendiini-4 ja metformiinin Vaimenna eturauhassyöpä Cell Proliferation, mutta ei Cell Migration

vieressä tutkittiin, mikä vaikutus Ex-4 ja metformiinin eturauhasen syöpäsolujen

in vitro

. Edellisessä tutkimuksessa [8], me havaitsimme, että Ex-4 vähensi merkittävästi solujen määrä ihmisen androgeenista riippuvaisten solujen, LNCaP-solut, ja ihmisen androgeenista riippumaton solujen, PC3-solut ja DU145-solut, in kasvukäyrät on annoksesta riippuvaisella tavalla. Samanlainen Ex-4 hoidon, metformiinin vähensi solujen lukumäärää LNCaP-soluissa (kuvio 3A), PC3-solut (kuvio 3B) ja DU 145 soluja (kuvio 3C), annoksesta riippuvalla tavalla. Lisäksi yhdistelmähoito 0,1 mM metformiinin ja 10 nM Ex-4 additiivisesti heikennetty kasvukäyrän etenemistä LNCaP-soluja (kuvio 3D) ja PC3-soluissa (kuvio 3E), mutta ei DU145-soluissa (kuvio 3F). Tutkimme seuraavaksi mekanismi, jonka Ex-4 ja metformiinin estävät eturauhasen syöpäsolujen kasvua. Ensimmäinen, suoritimme BrdU arvioimiseksi DNA-synteesiä. Ex-4 ja metformiiniin yksin 24 tuntia merkittävästi vähentynyt DNA-synteesiin LNCaP-soluissa (kuvio 3G). Vaikka metformiinin yksinään eivät aiheuttaneet tilastollisesti merkittävä väheneminen BrdU PC3-soluissa (kuvio 3H), Ex-4 ja metformiini laskivat BrdU sekä PC3-soluissa ja DU145 soluja (kuvio 3I), samoin kuin LNCaP. Yhdistetyt hoito metformiinin ja Ex-4 laskivat edelleen BrdU, viittaa siihen, että metformiinin ja Ex-4 additiivisesti laski DNA-synteesiin eturauhassyövän soluissa (kuvio 3G-3I). Lisäksi suoritimme migraatiokokeessa LNCaP-soluissa ja PC3-soluissa. Kuitenkin Ex-4, metformiinin ja yhdistetty hoito ei vaimentanut soluvaelluksen LNCaP-soluissa (kuvio 3J). PC3-soluja, pieni vähennys hoitoja havaittiin, mutta se ei ollut tilastollisesti merkitsevä (kuvio 3K). Nämä tiedot viittaavat siihen, että Ex-4 ja metformiinin vaimentaa eturauhasen syöpäsolujen proliferaatiota, mutta ei solujen vaeltamiseen.

(A) LNCaP-solut, (B) PC-3-solujen ja (C) DU145-solut ylläpidettiin media, johon on lisätty 10% FBS metformiinin kanssa tai ilman (0.1-10mM). 0, 24, 48, 72 ja 96 tuntia, solut kerättiin, ja solujen lisääntyminen analysoitiin solujen laskenta hemosytometrillä. Parittomia

t

-testaukset tehtiin laskea tilastollinen merkittävyys (*

P

0,05, **

P

0,01 vs. kontrolli). (D) LNCaP-solut, (E) PC3-soluissa ja (F) DU145-soluja ylläpidettiin, kuten on kuvattu A-C, mutta asianomaiset hoidot. Parittomia

t

-testaukset tehtiin laskea tilastollinen merkittävyys (*

P

0,05, **

P

0,01 vs. kontrolli). (G) LNCaP-solut, (H), PC3-solut ja (I) DU145-solut maljattiin tiheydellä 5000 solua /kuoppa 96-kuoppalevyille-alusta täydennettynä 10% FBS: ää ja inkuboitiin suolaliuoksella (kontrolli), Ex-4 (10 nM), metformiinin (0,1 mM), tai molemmat Ex-4 (10 nM) ja metformiinin (0,1 mM) 24 tunnin ajan. BrdU lisättiin viime 2 h, ja solut otettiin talteen mittausta varten DNA-synteesin käyttäen mikrolevyn lukijaa 450-620 nm. Mean tulokset ilmaistaan ​​suhteessa valvonnan solujen lisääntymisen. Parittomia

t

-testaukset tehtiin laskea tilastollinen merkittävyys (*

P

0,05, **

P

0,01 vs. kontrolli,

#

P

0,05 vs. Ex-4,

††

P

0,01 vs. metformiini). (J) LNCaP ja (K) PC3-soluja ympättiin 1,5 x 10

5 kussakin kammioissa migraatiokokeessa. Sen jälkeen Chemo vetovoima 10% FBS: ää tai suolaliuoksella (kontrolli), Ex-4 (10 nM), metformiinin (0,1 mM) tai molemmat Ex-4 (10 nM) ja metformiinin (0,1 mM), solut värjättiin ja tutkittiin OD 570 nm. Parittomia

t

-testaukset suoritettiin laskea tilastollista merkittävyyttä.

Metformiini indusoi apoptoosia ja vaimentaa soluproliferaation eturauhassyöpäsoluissa kautta AMPK aktivaation

seuraavassa lähemmin tarkastelemaan apoptoosin TUNEL-määritystä. Vaikka apoptoottisia soluja ei havaittu Ex-4-käsiteltyjen LNCaP edellisessä tutkimuksessa [8], pieni mutta merkittävä määrä apoptoottisten solujen havaittiin 0,1 tai 10 mM metformiini-käsiteltyjen LNCaP-soluja (kuvio 4A). Koska AMPK aktivointi on yksi tärkeimmistä molekyylitason mekanismit, joilla metformiinin toimii metabolisen ja anti-proliferatiivinen aine [21], tutkimme AMPK: n fosforylaation LNCaP käsiteltiin metformiinin kanssa. Kuten kuviossa 4B, AMPK fosforyloitiin jälkeen metformiiniin. Kvantifiointi havaitun bändi densitometrian paljasti merkittävän induktion AMPK fosforylaation metformiinia saaneilla LNCaP suhteutettuna vastaan ​​yhteensä AMPK (kuvio 4C) ja talon pitäminen geeni, GAPDH (kuvio 4D). Selvittää, onko AMPK on pääkohde metformiini vaimentamiseksi LNCaP solujen lisääntymistä, käytimme AMPK estäjä, yhdiste C tai pudotti AMPK siRNA. Kuten on esitetty kuviossa 4E ja 4F, sekä yhdiste C ja siAMPK selvästi peruutettu anti-proliferatiivista vaikutusta metformiinin LNCaP-soluissa. Lisäksi hoidot, joissa yhdiste C tai siAMPK merkittävästi lisääntynyt solujen määrä metformiinin käsiteltyjen LNCaP-soluja. Lisäksi väheneminen BrdU aiheuttama metformiinin selvästi lakkautettiin sekä yhdistettä C ja siAMPK (kuvio 4G ja 4H), ja nämä hoidot kasvoi BrdU metformiinia saaneilla LNCaP solujen johdonmukaisesti kasvukäyrän analyysiä. Koska pääkohde antiproliferatiivinen vaikutus AMPK on inaktivaation mTOR, tutkimme seuraavaksi mTOR aktivointi käyttäen western blotting. Kuten kuviossa 4I, mTOR fosforylaation tukahduttaa metformiinin hoitoon. Kuitenkin densitometrian analyysi osoitti, että tulos ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Nämä tiedot viittaavat siihen, että metformiini indusoi apoptoosia ja vaimentaa LNCaP soluproliferaatiota kautta AMPK aktivaation.

(A) LNCaP-solut maljattiin lasipeitinlevyille Lab-Tek 2 hyvin Chamber diat. Inkubaation jälkeen 0,1 tai 10 mM metformiini 24 h tai 1 yksikkö /100 ui RQ1 DNaasia (positiivinen kontrolli) 10 minuutin ajan, apoptoottisia soluja havaittiin TUNEL värjäys. Kuvissa edustavat kolmen erillisen kokeen. (B) LNCaP-soluja ylläpidetään väliaineessa, jossa oli 10% FBS: ää stimuloitiin suolaliuoksella (kontrolli), Ex-4 (10 nM), metformiinin (0,1 mM) tai molemmat Ex-4 (10 nM) ja metformiinin (0,1 mM) 24 h. Solulysaatit kerättiin ja alistettiin western blotting arvioida fosforyloidun AMPK ja AMPK ilme. Fosforyloitu AMPK /AMPK-proteiinin tasot (C) ja fosforyloitua AMPK /GAPDH-proteiinin tasot (D) kvantitoitiin densitometrillä. Tiedot laskettiin kolmen erillisen kokeen ja on esitetty suhteessa valvonnan (*

P

0,05, **

P

0,01 vs. kontrolli,

#

P

0,05,

##

P

0,05 vs. Ex-4). (E) LNCaP-solut ylläpidettiin alusta täydennettynä 10% FBS kanssa yhdistettä C (0,1 uM; CC) tai kontrolli ajoneuvo (NT), ja kanssa tai ilman Met (0,1 mM). 0, 24, 48 ja 72, solut kerättiin, ja solujen lisääntyminen analysoitiin solujen laskenta hemosytometrillä. Parittomia

t

-testaukset tehtiin laskea tilastollinen merkittävyys (*

P

0,05, **

P

0,01 vs. NT-ohjaus,

#

P

0,05 vs. NT-Met 0,1 mmol). (F) LNCaP-solut ylläpidettiin-alusta täydennettynä 10% FBS: ää transfektion jälkeen 10 nM ohjaus siRNA (siCT) tai siRNA varten AMPKα1 /2 (siAMPK) kanssa tai ilman Met (0,1 mM). 0, 24, 48 ja 72, solut kerättiin, ja solujen lisääntyminen analysoitiin solujen laskenta hemosytometrillä. Parittomia

t

-testaukset tehtiin laskea tilastollinen merkittävyys (**

P

0,01 vs. siCT-ohjaus,

##

P

0,01 vs. siCT-Met 0,1 mM). (G) LNCaP-solut maljattiin tiheydellä 5000 solua /kuoppa 96-kuoppalevyille-alusta täydennettynä 10% FBS: ää ja inkuboitiin Yhdiste C (0,1 uM) (CC) tai kontrolli ajoneuvo (NT), ja tai ilman Met (0,1 mM) 24 tuntia. BrdU lisättiin viime 2 h, ja solut otettiin talteen mittausta varten DNA-synteesin käyttäen mikrolevyn lukijaa 450-620 nm. Mean tulokset ilmaistaan ​​suhteessa valvonnan solujen lisääntymisen. Parittomia

t

-testaukset tehtiin laskea tilastollinen merkittävyys (**

P

0,01 vs. Met (-) ja Yhdiste C (-),

#

P

0,05 vs. Met (+) ja yhdiste C (-)). (H) LNCaP-solut maljattiin tiheydellä 5000 solua /kuoppa 96-kuoppalevyille-alusta täydennettynä 10% FBS: ää transfektion jälkeen 10 nM ohjaus siRNA (siCT) tai siRNA varten AMPKɑ1 /2 (siAMPK) kanssa tai ilman Met ( 0,1 mM) 24 tunnin ajan. BrdU lisättiin viime 2 h, ja solut otettiin talteen mittausta varten DNA-synteesin käyttäen mikrolevyn lukijaa 450-620 nm. Mean tulokset ilmaistaan ​​suhteessa valvonnan solujen lisääntymisen. Parittomia

t

-testaukset tehtiin laskea tilastollinen merkittävyys (**

P

0,01 vs. Met (-) ja siControl,

##

P

0,01 vs. Met (+) ja siControl).

metformiinin indusoi AMPK aktivointi ja apoptoosi Eturauhassyöpä

in vivo

Lopuksi vahvista