Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Myelooisen johdettu suppressorisolut (MDSC) ovat tärkeitä säätelijöitä immuunivasteita. Olemme arvioineet mekanistinen roolin MDSC heikentymisen antigeeniä esittelevän solun (APC), NK, T-solujen toimintaa ja terapeuttinen rokotusvasteeseen hiirimalleissa keuhkosyöpään.

Keskeiset havainnot

Yksittäisten vasta-aine välittämä ehtyminen of MDSC (anti-Gr1 tai anti-Ly6G) tehostetun antituumorivaikutuksen vastaan ​​keuhkosyöpään. Verrattuna kontrolleihin, MDSC ehtyminen parannettu APC toimintaa ja lisätä tiheyttä ja aktiivisuus NK ja T-solujen efektoreita kasvain. Verrokkeihin verrattuna, anti-Gr1 tai anti-Ly6G hoito lisäsi: (i) CD8-T-solujen, (ii) NK-solut, (iii) CD8 T tai NK-intrasytoplasmista ilmentymisen IFNy, perforiini ja grantsyymi (iv) CD3 T ilmentävät solut aktivaatiomarkkeria CD107a ja CXCR3 (v) vähennetään CD8 T-solujen IL-10: n tuotantoa kasvaimia (vi) vähensi kasvainten angiogeeninen (VEGF, CXCL2, CXCL5, ja Angiopoietin1 2), mutta parannettu anti-angiogeeninen (CXCL9 ja CXCL10 ) ilmaisun ja (vii) vähensi kasvainten värjäys endoteelimerkkiaineelle Meca 32. Immunosytokemia kasvaimen kohdat oli vähentynyt Gr1 ilmentävien solujen lisääntynyt CD3 T-solun infiltraatiota anti-Gr1 tai anti-Ly6G ryhmiä. MDSC väheneminen johti huomattavan estymisen kasvaimen kasvun, parantaa kasvaimen apoptoosia ja vähentää kulkeutumista kasvainten ensisijaisen sivuston keuhkojen kontrolleihin verrattuna. Terapeuttinen rokotusvasteeseen parannettiin

in vivo

seuraavissa MDSC ehtyminen 50%: lla hoidetuista hiiristä täysin hävittämään perustettu kasvaimia. Käsitellyt hiiret että hylkäsi heidän ensisijainen kasvaimia hankittu immunologinen muisti vastaan ​​toissijaisen kasvain haaste. Loput 50% hiiristä tässä ryhmässä oli 20 kertaa vähentäminen kasvaintaakkaa kontrolleihin verrattuna.

merkitys

Tuloksemme osoittavat, että kohdistaminen MDSC voi parantaa antituumorivaikutuksen immuunivasteita viittaa laaja sovellettavuus yhdistettyjen immuuni lähestymistapoja syöpää vastaan. Tämä monitahoinen lähestymistapa voi osoittautua käyttökelpoisia kasvaimia jossa MDSC osansa kasvain immuuni kiertämisen.

Citation: Srivastava MK, Zhu L, Harris-White M, Kar U, Huang M, Johnson MF, et al. (2012) Myelooisen vaimennin soluvajeeseen täydentää antituumorivaikutus in Lung Cancer. PLoS ONE 7 (7): e40677. doi: 10,1371 /journal.pone.0040677

Editor: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 12 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 16 heinäkuu 2012

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Kalifornian yliopiston Los Angeles Keuhkosyöpä ohjelma, Department of Veterans Affairs Medical Research Funds, National Institutes of Health ( NIH) Avustukset (RO1 CA95686, RO1 CA126944 ja P50 CA90388), National Center for edistäminen Translational Sciences, Grant UL1TR000124, ja tupakka Related Disease Program palkinto-ohjelma on University of California (15RT-0207 ja 20FT0082). Sisältö on ainoastaan ​​vastuulla kirjoittajien ja ei välttämättä edusta näkemykset NIH. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kun tämä tutkimus suoritettiin RS oli työntekijä University of Virginia, Charlottesville. RS on nyt työskentelee Norvartis Institutes of Biomedical Research. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Keuhkosyöpä on edelleen pelottava terveysongelma yli 1,1 miljoonaa kuolemantapausta johtuu keuhkosyöpään maailmanlaajuisesti vuosittain [1]. Nykyisten terapeuttinen ponnisteluja pitkällä aikavälillä selviytymisen keuhkosyöpäpotilaita edelleen alhainen, mikä uusia terapeuttisia strategioita tarvitaan. Vaikka syövän immunoterapiassa tarjoaa houkuttelevan terapeuttisen vaihtoehto, aktivointi immuunijärjestelmä ei yksinään riitä syövänvastaisen aktiivisuuden kannalta. Arvioimme, että yhdistettynä hoitoihin, jotka kohdistuvat reitit immuuniaktivaatiota ja mekanismit immunosuppression on tarpeen torjua keuhkosyöpään. Kasvaimen mikroympäris- koostuu kasvainsolujen, strooman verisuonten, immuunijärjestelmän suodattuu ja soluväliaineen. Geneettisten muutosten onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille tai epigeneettisiä muutoksia kasvaimessa, jotka moduloivat kasvaimen kasvun ja invaasion ympäröivään kudokseen järjestää pysyvyyden tulehduksellisten infiltraattien. Nämä solu infiltraatit moduloida kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen. Kasvain infiltraatit vaihtelevat koon ja kokoonpanon erilaisissa kasvaintyypeissä ja eri vaiheissa kasvain kehityksen. Kasvain ohjelmat solun suodattuu ylläpitämään säädeltyyn tulehdus, joka on hypo reagoi kasvain. Edistää solujen tulehduksellisten infiltraattien ovat myelooinen johdetaan vaimentimen soluja (MDSC) että moduloivat negatiivisesti immuunivasteita ja edistää kasvaimen etenemiseen ja etäpesäkkeitä [2].

MDSC ovat heterogeeninen populaatio kypsymättömiä myeloidisolujen joka koostuu myelooisten kantasolujen ja esiasteita makrofagien, granulosyyttien ja dendriittisolujen (DC) [3]. Hiirillä, MDSC tunnistetaan vasta-aineita, jotka tunnistavat solun pinnan ilmentyminen Gr1 ja CD11b. Kohonneita määrä MDSC herättää vahvoja luonnollisia suppressiivinen aktiivisuus syöpäpotilailla [4], [5] tai on kasvain [4], [6], [7]. On osoitettu, että Gr1 + CD11 + immunosuppressoivilla solut kykenevät inhiboimaan T-solujen proliferatiivinen vaste indusoidaan alloantigeenejä [8], CD3 ligaatio [9], tai erilaisten mitogeenien [10], [11], ja se voi myös estää IL- 2 hyödyntäminen [12] sekä NK-solujen toimintaa [5], [13]. Nämä tutkimukset osoittavat, että progressiivinen kasvaimen kasvua liittyy alas-säätely T-soluvasteiden ja että MDSC ovat mukana negatiivinen immunoregulatooristen mekanismeja. Hiiren kasvainmalleissa, kasvaa MDSC kasvaimissa, perna, luuydin ja veri downregulates T-soluvasteiden [2]. Ottaen huomioon edellä mainitut tiedot, se on tärkeää ymmärtää vaikutuksen MDSC heikkeni modulaatioon immuunivasteiden keuhkosyövän.

Tässä tutkimuksessa arvioimme panos Gr1 tai Ly6G ilmentävät myelomonocytic solujen 3LL kasvain kasvuun ja terapeuttinen rokottaminen vasteita C57BL /6-hiirissä. Tuloksemme osoittavat, että MDSC ehtyminen lisääntynyt APC aktiivisuus ja täydennettiin taajuus ja aktiivisuus NK ja T-solujen effektorit joka johti alentunut kasvaimen kasvua, parantaa terapeuttisen rokotusvasteeseen ja siirrettävä immunologinen muisti. Tuloksemme tukee kehittämiselle aineita, jotka kohdistuvat MDSC yhdistettyjen immuuniperäisiä hoitomenetelmät keuhkosyövässä.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja reagenssit

Hiiren Lewis keuhko karsinooma (3LL, H-2

b, joka tunnetaan myös LLC, ATCC CRL-1642) on saatu American Type Culture Collection (Manassas, VA), DC2.4 (ystävällinen lahjoitus KL Rock Dana Farber Cancer Institute, Boston , Mass.) [14] ja β galaktosidaasi reportteri soluhybridoomasoluissa (B3Z), joka tunnistaa k

b luokan I molekyyli ja ovalbumen (OVA) peptidi, SL8 (SIINFEKL) saatiin N Shastri (UC Berkeley, CA) [15], käytettiin näissä tutkimuksissa. 3LL-OVA-soluista tuotettiin transfektoimalla 3LL emosoluilta OVA-konstruktit saatiin Dr. Frelinger (University of Rochester, NY). Ekspressiovektoreita, jotka koodaavat joko täyspitkää Ova tai katkaistun Ova- (138-386) (Ova ei-sekretorisen) transfektoitiin käyttäen Lipofectin (GIBCO /BRL), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Valinta sopivan lääkkeen suoritettiin, kuten on kuvattu [16]. Vakaa 3LL-OVA transfektantit valittiin OVA ELISA solulysaattien ja kloonata rajoitettu laimennoksella 96-kuoppaisille levyille. Kuvatuille kokeille tässä tutkimuksessa käytimme 3LL-OVA, että ilmaistu katkaistun Ova- (138-386). Viljelyalustaan ​​(CM) sisälsi RPMI 1640 (Irvine Scientific, Santa Ana, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA), penisilliiniä (100 yksikköä /ml), streptomysiiniä (0,1 mg /ml), ja 2 mmol /L glutamiinia (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Fluoreseiini isothiocyanate-, fykoerytriinillä, allophycocyanin-, PerCP- tai APC-Cy7-konjugoidun anti-hiiri-mAb: t CD3 (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD69 (H1.2F3) ja CD8a (53-6.7) hankittiin BD Biosciences (San Diego, CA). Loisteputki konjugoitua hiiren Abs: anti-CD49b, anti-CD11 c, anti-CD69, anti-CD44, anti-perforiini, anti-grantsyymi, anti-IL10, anti-IFNy, anti EpCAM ja anti-CD107a olivat eBioscience (San Diego , CA) ja anti-Gr1, anti-CD45 ja anti-CD11b olivat Biolegend (San Diego, CA). Neutraloiva Abs on: Gr1 (RB6-8C5), Ly6G (1A8) olivat BioXCell (West Lebanon, NH) ja keratiini oli Sigmalta. IL-2, IFNy, IL-12, IL-10 ja TNFa kvantitoitiin sytokiinin erityisiä ELISA (eBioScience). Herkkyys: IL-2 (3 pg /ml), IFNy (3 pg /ml), IL-12 (3-5 pg /ml), IL-10 (30 pg /ml) ja TNFa: n (8 pg /ml). Ovalbumen proteiinia ja Bradford-proteiinin määrän väriainetta saatiin Sigma (St. Louis, MO). Kudospilkkoutumisasteisiin puskuri sisälsi [0,2 mg /ml kollagenaasi A: ta (Boehringer Mannheim /Roche, Indianapolis, IN), DNAasi 25 U /ml (Sigma), ja 0,3 U /ml dispaasi (Invitrogen, Carlsbad, CA) RPMI. T-solujen puhdistaminen pylväät ostettiin R Charles River) pidettiin lännessä Los Angeles Veterans Affairs eläinten Research vivariums sopusoinnussa laitoksen eläin Review board ohjeita. Kaikki eläin työ tehtiin sopusoinnussa Veterans Affairs Institutional Animal Care ja Käyttö komitean ohjeet: id A3002-01. Veterans Affairs Institutional Animal Care ja käyttö tarkastavat hallitus hyväksyi kaikki tutkimukset, joissa käytetään eläimiä tässä käsikirjoitus. Eläimet näytteille merkkejä kivusta tai täyttävät päätepisteen kriteerit lopetettiin välittömästi mukaan hyväksytyn laitoksen protokolla.

Hiiriä seurattiin päivittäin merkkejä hätä siitä kasvaintaakkaa ja lievittävät kipua ja kärsimystä hiiret lopetettiin, jos eläinten näytteillä mitään kliinisiä oireita hätä, kuten ruokahaluttomuus, 10% kuihtuminen laihtuminen, liikuntakyvyn heikkenemistä, levottomuus, masennus, hengitysvaikeudet, kasvain /iho- tai epäonnistuminen sulhasen. 3LL kasvainsoluja (2,0 x 10

5) injektoitiin

s.c..

Oikealla edellä lapaluun alueella C57BL /6-hiirissä. Kasvaintilavuudet seurattiin mittaamalla kaksi bisecting halkaisijat kustakin kasvain jarrusatulat. Kasvaintilavuudet laskettiin käyttäen kaavaa: V = 0.4ab

2, (a = suuri halkaisija ja b = pieni halkaisija). Olemme käyttäneet kahta annosta varten

in vivo

ehtymiseen MDSC perustuu aiempiin tutkimuksiin [100 ug /annos [17]] tai [200 ug /annos] annetaan joka toinen päivä [18], [19]. Tutkimuksiin kuvattu tässä käsikirjoitus käytimme 200 ug /annos. Yhden viikon kuluttua kasvaimen istuttamisen, hiiret, joilla palpoitavissa kasvaimia injektoitiin

ip

erikseen anti-Gr-1-spesifinen (200 ug /annos), tai anti-Ly6G erityisiä (200 ug /annos), tai isotyyppi IgG2b ab (200 ug /annos) joka 48: s tunti 2 viikkoa. Yksi, kaksi tai kolme viikkoa kasvaimen istutuksen, kasvaimet, perna, luuydin ja veri kerättiin arviointia taajuuden ja aktiivisuus leukocytic populaatioiden erityisillä värjäys /virtauksen rianalyysit.

Orthotopic Model

implantaatio kasvaimia keuhkoissa suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [20]. Lyhyesti, 10

4 3LL solua 25 ul steriiliä NS laimennusaine ruiskutettiin mukaan rintakehän reittiä C57BL /6-hiirten hyödyntäen tuberkuliiniruiskuun oli 30 gaugen neula vasen keuhko alle ketamiini /ksylatsiini anestesia. Yhden viikon kuluttua tuumorin istuttamisen, ryhmä hiiriä tapettiin vahvistaa ja määritellä perustason kasvaintaakkaa ennen hoidon aloittamista. Yhden viikon kuluttua kasvaimen istuttamisen, hiiret käsiteltiin yksittäin ohjattu isotyyppi tai anti-Gr1Ab (200 ug /annos) kautta

vatsaontelon.

Reitti joka 48 tuntia ja 4 viikkoa. Viisi viikkoa kasvaimen istutuksen jälkeen, keuhkot perfusoitiin ja kerättiin arviointia kasvaimen taakkaa H 0,05 päivä 14 vs. päivä 7) (** p 0,005 päivää 21 vs päivä 14).

1C

,

MDSC mistä kasvain hiirille tukahduttaa DC2.4 APC aktiivisuutta aktivoimaan antigeenispesifisiä CD8 T-solut erittämään IL-2 (* p 0,05 MDSC verrattuna ilman MDSC)

1D

,

MDSC mistä kasvain hiirille tukahduttaa anti-CD3 /CD28 stimuloi CFSE merkitty T-solujen lisääntymistä.

1Di

,

edustaja FACS CFSE intensiteetti tontteja T-solujen lisääntymistä (tai ilman MDSC).

1D-ii

,

geometrinen keskiarvo (GM) ja T-solujen CFSE intensiteetti edustettuina bar kaavioita. (* P 0,05 MDSC vs ilman MDSC), arvot heijastavat keskiarvo ± keskivirhe keskiarvon (SEM), n = 8 hiirtä ryhmää kohti.

immunologinen muisti

pernasoluja hiiristä, jotka oli hylännyt toissijainen kasvain haaste seurattiin T-solujen immunologisen muistin fenotyyppi värjäämällä T-solujen muistin pintamarkkereihin CD44, CD69 ja sytoplasmaan IFNy tai ilman stimulaatio OVA-proteiinia (2,5 mg /ml yön yli)

in vitro

. IFNy erittyy spenocytes (5 x 10

6) viljelmän supernatantissa määritettiin kvantitatiivisesti ELISA: lla, ja CD4- ja CD8-T-solujen IFNy tai IL-10: n tuotantoa kvantitoitiin värjäämällä /virtaussytometrialla. Pernasolut naiiveja hiirtä toimi valvontaa.

2A

,

Muutoksia kasvaimen tilavuuden seuraavissa anti-Gr1 tai anti-Ly6G Ab välittämä MDSC ehtyminen.

2B

,

Muutoksia kasvainten painot MDSC köyhdytettyä ja kontrolliryhmissä (päivä 21).

2C

,

edustaja FACS tontteja ja pylväskaaviot varten taajuuden CD11 + Gr1 + MDSC kasvainten seuraavissa anti-Gr1 tai anti-Ly6G Ab hoitoa.

2D

,

edustaja FACS tontteja taajuuden CD11 + Gr1 + MDSC kasvainten seuraavissa anti-keratiini Ab hoitoa.

2E

,

edustaja APC aktiivisuutta kasvaimen aktivoida CD8 antigeenispesifisiä T-soluja erittämään IL-2 seuraava anti-Gr1, anti-Ly6G, isotyyppikontrollilla Ab ja liuotin hoitoa.

2F

,

CD107a aktivaatiomerkkiaine ilme T-solujen kasvaimen seuraavissa MDSC ehtyminen.

2G

,

Yhteensä puhdistettu pernan T-solujen sytolyysistä vastaan ​​3LL vanhempien kasvain (E: T 10: 1, 5: 1) varten MDSC köyhdytetyn ryhmien ja isotyyppikontrolleja. Ei ollut eroja T-solujen sytolyysin vanhempien 3LL-solujen välillä laimennusaineen ja isotyyppikontrolli ryhmä (tuloksia ei ole esitetty). Ei tapahtunut muutoksia T-solujen sytolyysiin vastaan ​​ei liittyvän B16 kasvaimia välillä MDSC köyhdytetyn ryhmien ja valvonta (tuloksia ei esitetty). Data kaikissa paneelit edustavat 2-3 itsenäisestä kokeesta (Data, keskiarvo ± SEM, p-arvot: kontrolleihin verrattuna * p 0,05, ** p 0,005, n = 6 hiirtä /ryhmä.

antigeeni käsittely ja esittely Pitoisuus

DC 2.4 tai BMA tai yksisolususpensioon kasvaimen digest (5-10 x 10

4 c /kuoppa) valvonta, anti-Gr1 tai anti-Ly6G käsitelty kasvaimen kantavien hiirten olivat viljeltiin yhdessä OVA-proteiinia (2,5 mg /ml) ja MHC-luokka I-restriktoituja CD8 T-solulinja B3Z (10

5 c /kuoppa) CM-kolmena rinnakkaisena 96-kuoppaiselle levylle 24 tuntia. IL-2 erittämä aktivoitujen CD8-T-solujen supernatantissa määritettiin kvantitatiivisesti ELISA: lla.

3A

,

H E keuhkoleikkeissä arvioida keuhkometastaasitestissä seuraavat MDSC ehtyminen.

3C

Frequency kasvaimen infiltraattien (CD3, CD4, CD8, CD11 c, F480 tai CD49b), 3

D

,

NK solut, jotka ilmentävät IFNy, perforiinin ja grantsyymi,

3E

, CD8 ilmentäviä IFNy, perforiini ja grantsyymi, mutta vähentää IL-10 ilmentyminen analysoitiin virtaussytometrialla.

3F

,

Tumor sytokiinien ilmentymistä (IFNy, IL-12, TNFa ja IL-10), kun MDSC ehtyminen. (Data, keskiarvo ± SEM, * p 0,05 verrattuna kontrolleihin, n = 8 hiirtä /ryhmä).

virtaussytometria

Virtaussytometria suoritettiin seuraavien T-solujen pinnalla CD3, CD4, CD8, CD69 on yksittäisten solujen suspensio pernasolujen tai kasvaimen Näyteliuokset hoidon jälkeen, kuten edellä on kuvattu. Pernasoluja ja kasvainsolun digestiot arvioitiin myös NK-solujen pintamerkkiaine CD49b. CD4 T, CD8 T- ja NK-solut arvioitu yksittäin intracytoplasmic Perforiinin, grantsyymi, IFNy tai IL-10. CD107a T-solut arvioitiin solun pinnalla värjäys /virtaussytometrialla. Analyyseistä leukocytic infiltraatteja tuumorikudokseen, kasvaimia hajotettiin mekaanisesti on metalliverkko murskaamalla, jossa on 10 ml: n ruiskua ja inkuboitiin kudospilkkoutumisasteisiin puskurissa 37 ° C: ssa 25 min. Solut suodatettiin 70 um nylonia siivilät (BD Biosciences, Bedford, MA), värjättiin spesifisten ja analysoitiin virtaussytometrialla. Näytteet hankittiin sijoitukset FACSCanto (BD Biosciences /FACSCalibur virtaussytometrillä (Becton Dickinson, San Jose, CA) on University of California, Los Angeles, Jonsson Cancer Center Flow Cytometry Core Facility. Kaikkiaan 10000 25000 tapahtumiin hankittiin ja solujen värjäystä positiivinen sisällä koko elävien solujen populaation analysoitiin FCS Express 3 (De Novo Software, Kanada). soluja inkuboitiin merkityksetön isotyypin vasta-aineita ja unstained solut toimivat kontrolleina.

4A

,

IHC varten lohkaistaan ​​kaspaasi 3 tuumorisektioiden seuraavissa MDSC ehtyminen. nuolet ovat osoitus pilkotun kaspaasi 3 värjäystä.

4B

,

anneksiiniV ja PI värjäytymistä kasvain liuottamaa virtaussytometrialla.

4C

,

Suhteellinen kaspaasi 8 ilmentyminen QRTPCR normalisoitu β-aktiinin ilmentymistä tuumorikudoksissa.

4D

,

Endoteliumin MECA 32 solumarkkerille ilmentyminen ja koko T-solujen CXCR3 ilmentyminen kasvaimissa virtaussytometrialla.

4E-H

,

suhteellinen pro-angiogeenisten ja anti-angiogeenisten markkerin ekspression kasvainten QRTPCR normalisoidaan β- aktiini. MDSC ehtyminen laski angiogeneesiä (VEGF-a, CXCL2, CXCL5, Ang1 ja Ang2) (4E-F), mutta lisääntyi anti-angiogeeninen (CXCL9 ja CXCL10) (4G) ja CXCR3 (4H) ilmentyminen kasvaimissa. (Data, keskiarvo ± SEM, p-arvot: kontrolleihin verrattuna * p 0,05, n = 8 hiirtä /ryhmä).

5A

,

edustaja H nuolet osoittavat kasvaimen.

5B

,

Tuumorirasitusta arvioida solun pinnan värjäystä EPCAM yhdessä solususpension kasvaimen Näyteliuokset ja määrällisesti virtaussytometrialla. (Data, keskiarvo ± SEM, p-arvot: kontrolleihin verrattuna * p 0,05, n = 8 hiirtä /ryhmä).

CFSE Based Sytolyysimääritys

Yhteensä sytolyyttisen T-solujen aktiivisuuden perna vastaan ​​vanhempien 3LL kasvainsoluja tai syngeenistä B16-solut arvioitiin hoidon jälkeen anti-Gr1 tai anti-Ly6G Ab 21 päivää tuumorin istuttamisen. Tuumorikohteita leimattiin CFSE: llä annoksilla (1 uM) PBS 15-20 minuuttia mukaan valmistajan ohjeiden. Pesun jälkeen leimatut kohteet inkuboitiin T-solujen puhdistettiin pernoista käyttämällä T-solujen sarakkeita (R 6E, Pernan tuotanto IFNy, 6F, Frequency tuottavan IFNy CD4 ja CD8 muisti (CD44) ja aktivointi (CD69) markkeri ilmentäviä T-soluja. 6G, geometrinen keskiarvo tuottavan IFNy muisti-T-solut rokottamatta plus anti-Gr1 hoito stimulaation jälkeen OVA-proteiinia verrattuna naiivi valvontaa. (Data, keskiarvo ± SEM, p-arvot: kontrolleihin verrattuna * p 0,05, n = 8 hiirtä /ryhmä).

CFSE nimeäminen ja T Cell Suppression määritykset

T-solut puhdistettiin pernoista käyttämällä T-solujen eristäminen sarakkeita. Kahden pesun jälkeen PBS: llä, puhdistetulla T-solut olivat (2 x 10

6 solua /ml) sekoitettiin yhtä suuren tilavuuden kanssa 10 uM CFSE liuokseen 10 min ajan. Reaktio lopetettiin lisäämällä 10 tilavuutta kylmää RPMI 1640/10% FBS: ää. Leimattuja soluja (1 x 10

6 solua /ml), pestiin kahdesti PBS /2% FBS: ää. U-pohjaisen 96-kuoppaisen soluviljelylevyn levylle etukäteen päällystetty anti-CD3-Ab: n (5 ug /ml), puhdistettiin T-solut (2 x 10

5) viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja anti- CD28 Ab: n (5 ug /ml) 72-96 tunnin ajan. Voit selvittää vaikutukset MDSC T-solujen lisääntymiseen, CFSE merkitty T-soluja viljeltiin yhdessä puhdistettu Gr1 pernan MDSC (2-4 x 10

5) päässä 3LL kantavien hiirten tai naiiveja hiiriä ja muutoksia lisääntymistä arvioitiin flow cytometry. MDSC eristettiin pernoista leimaamalla solususpensiot rotan anti-hiiri-Gr1 mAb (eBioscience), mitä seurasi magneettinen vasta-aine solujen erottaminen käyttäen anti-rotta-mikrohelmiä (Miltenyi Biotec). Eristetyt solut 90% puhdasta CD11 + Gr1 + ilmentävät MDSC määritettynä virtaussytometrialla.

Sytokiini-ELISA

sytokiinien (IFNy, TNFa, IL-10 ja IL-12) in pemasolu viljelmien supernatanteissa tai pernan tai kasvaimen homogenaatit määritettiin ELISAlla ja levyt luettiin tietyllä aallonpituudella käyttäen Microplate Reader (Amersham Biosciences, Sunnyvale, CA).

Tuumorikudoksen leikkausnopeudesta ja immunohistokemia

laajuuden määrittämiseksi lymfosyyttien tunkeutuminen kasvaimia eri hoitoryhmissä, C57BL /6-hiirillä, joilla on 7-päivän kasvaimia injektoitiin

ip

kanssa Gr1-spesifinen (200 ug /annos) tai Ly6G erityiset (200 ug /annos), tai isotyyppi IgG2b Ab: n (200 ug /annos) joka 48: s tunti 2 viikkoa. Non-nekroottinen kasvaimia eristettiin ja upotettiin parafiiniin ja sarjoittain leikattiin 5 um paksuus. Osiot olivat H

kaspaasi

8 F, 5’TGCTTGGACTACATCCCACAC-3 ’ja R, 5’GTTGCAGTCTAGGAAGTTGACC -3’;

Ang-1

F, 5′-TCTCATGCTAACAGGAGGTTGGTG -3 ’R, 5′-GGATCATCATGGTGGTGGAACGTA-3’;

Ang-2

F, 5’CAAGAGCTCGGTTGCTATCCGTAA-3 ’R, 5’ GTCCATGTCACAGTAGGCCTTGAT3 ’;

VEGF-a

F, 5′-TGTACCTCCACCATGCCAAGT-3 ’R, 5’CGCTGGTAGACGTCCATGAA-3’;

CXCL5

F, 5′-GGTCCACAGTGCCCTACG-3 ’R, 5’GCGAGTGCATTCCGCTTA-3’;

CXCL2

F, 5′-AGTGAACTGCGCTGTCAATG -3 ’R, 5’GAGAGTGGCTATGACTTCTGTCTG-3’;

CXCL9

F, 5′-GCACGATCCACTACAAATCCC-3 ’R, 5’GGTTTGATCTCCGTTCTTCAGT-3’;

CXCL10

F, 5′-CCAAGTGCTGCCGTCATTTTC-3 ’R, 5’TCCCTATGGCCCTCATTCTCA-3’; ja

CXCR3

F, TCTCCCTACGATTATGGGGAAAA-3 ’ja R, 5’GGTTCTGTCAAAGTTCAGGCT-3’.

TILASTOANALYYSI

Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SE. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Prism (GraphPad Software). Käytimme varianssianalyysi tietojen kanssa useita ryhmiä, paritonta Studentin

t

-testi dual vertailua.

P

arvojen 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

MDSC Lisääntynyt in Kasvain kantavien hiirten funktiona tuumorikasvun

Voit selvittää vaikutukset of 3LL kasvaimen kasvun taajuus MDSC, ei nekroottista kasvaimet, verta, perna tai BM arvioitiin Gr1 + CD11b + lauseke (päivinä 7, 14 ja 21 post kasvaimensiirrostuspäivänä). Samanlaisia ​​havaintoja MDSC kasvusta syöpäpotilailla [4], [5], siellä nostettiin MDSC taajuus 3LL kasvain hiirille. MDSC taajuus kasvoi veressä (2-4-kertainen), perna (2,6-4-kertainen) ja BM (1,5-2-kertainen) kasvaimen kantavien hiirten verrattuna ohjata naiivi hiiret (kuvio 1A-B). Päivä-7 kasvaimia oli pienempi taajuus MDSC verrattuna päivinä 14 ja 21. taajuus MDSC kasvaimen Näyteliuokset on entisestään päivänä 21 (3-kertainen) verrattuna päivänä 14 kasvainten (kuvio 1A-B). Vahvistaa immuunijärjestelmää tukahduttava vaikutus MDSC, arvioimme toiminto pernan MDSC kasvaimen kantavien hiirten inhibitioon DC2.4 APC toiminnan tai T-solujen proliferaatiota. Sillä

in vitro

DC APC aktiivisuuden arviointi, valitsimme solumäärät DC ja OVA CD8 T-soluja, jotka tuottivat suuria määriä IL-2 määritysolosuhteissa antamaan selkeitä eroja IL-2 tasot läsnäolo tai puuttuminen MDSC. MDSC alkaen naiivi hiiret eivät tukahduttaa DC APC aktiivisuutta. Vaikka MDSC päivästä 7 kasvain hiirille tukahdutetaan DC APC toimintaa, estävä vaikutus oli pienempi verrattuna MDSC päivästä 14 ja 21 kasvaimen hiirille (kuvio 1 C). Lisäksi, MDSC naiiveista hiiret eivät inhiboi anti-CD3 /CD28-stimuloiduissa CFSE leimattu T-solujen proliferaatiota ja MDSC päivästä 7 kasvaimen hiirille oli pienempi tukahduttava kapasiteetti T-solujen lisääntymiseen verrattuna MDSC päivästä 14 ja 21 kasvaimen hiirille [Kuva 1D (i-II)].

MDSC väheneminen Alennettu 3LL tuumorikuorma, Lisääntynyt APC Activity and Augmented sytolyyttisen toiminto T Cell efektibokseille

vaikutusten arvioimiseksi MDSC on kasvaintaakkaa