Krooninen sairaus

tiivistelmä

Suun levyepiteelisyöpä (OSCC) potilasta diagnosoitu loppuvaiheissa on rajoitettu kemoterapia-vaihtoehtoja korostunut suuri tarve sillä uusien syöpälääkkeiden tehokkaampaa sairauksien hoidossa. Me, jonka tarkoituksena tutkia syövän vastaisen potentiaalia Apaziquone, [EOquin, USAN, E09, 3-hydroksi-5- atsiridinyyli-1-metyyli-2 (1 H-indoli-4,7-dioni) prop-β-en-α- oli], aihiolääke, joka kuuluu luokkaan syöpälääkkeet kutsutaan bioreductive alkyloivat aineet, OSCC. Apaziquone hoito esti solujen lisääntymistä ja indusoi apoptoosia OSCC soluissa

in vitro

. Apaziquone käsiteltiin OSCC solujen kohonneen kaspaasi 9 ja Caspase 3, ja Poly (ADP riboosi) polymeraasin (PARP) pilkkoutumisen viittaa apoptoosin apaziquone suun syöpäsoluja. Tärkeää on, apaziquone hoito vähensi merkitsevästi suun -tuumoriksenografti tilavuuden immuunipuutteisilla NOD /SCID /Crl hiirten aiheuttamatta näennäinen myrkyllisyys normaaleille kudoksille. Lopuksi todettakoon, että

in vitro

ja

in vivo

tutkimuksissa tunnistettu ja osoitti ennalta kliinistä tehoa Apaziquone, mahdollisena uusi syöpälääkkeen terapeuttista ehdokas suusyöpää hallintaan.

Citation: Srivastava G, Somasundaram RT, Walfish PG, Ralhan R (2015) Anticancer aktiivisuus Apaziquone Oral Cancer Cells ja ksenograftimallia: Implications for Oral Cancer Therapy. PLoS ONE 10 (7): e0133735. doi: 10,1371 /journal.pone.0133735

Editor: Pei-Yi Chu, School of Medicine, Fu Jen Catholic University, Taiwan

vastaanotettu: 06 helmikuu 2015; Hyväksytty: 30 Kesäkuu 2015; Julkaistu: 24 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Srivastava et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: taloudellista tukea tätä työtä tarjosi Spectrum Pharmaceuticals Inc. (Irvine, CA). Rahoittajat hyväksyi tutkimuksen suunnittelu, mutta ei ollut roolia tietojen keruun ja analysoinnin, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Kirjoittajat kiitollisena tunnustavat Canadian Institutes of Health Research Chair in Advanced Cancer Diagnostics (RR), ja Alex ja Simona Shnaider professuurin kilpirauhassyöpä (PGW).

Kilpailevat edut: PGW ja RR ovat osakkaina Proteocyte Diagnostics Inc. Lisäksi taloudellisen tuen tämän työn tarjosi Spectrum Pharmaceuticals Inc. (Irvine, CA). Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Suun levyepiteelisyöpä (OSCC) käsittävät suuren osan pään ja kaulan alueen syöpä kirjanpito arviolta 263000 uutta tapausta ja noin 127000 kuolemantapausta maailmanlaajuisesti vuosittain [1]. Aikaisen vaiheen (I ja II) OSCC potilaita hoidetaan kirurgian ja /tai sädehoidon, ja on viiden vuoden eloonjäämisluvut 70% – 90% [2-4]. Kuitenkin kaksi kolmasosaa OSCC potilaat kärsivät paikallista alueellista kehittynyt sairaus (vaiheet III ja IV) ajankohtana diagnoosin. On olemassa riittävästi tietoa satunnaistettuja kliinisiä kokeita määrittämään optimaalisen strategian potilailla, joilla on vaiheiden III ja IV OSCC. Potilaat, joilla on pitkälle edennyt tai uusiutuva sairaus on rajoitettu hoitovaihtoehdot ja huono ennuste (5-vuoden eloonjäämisluvut 50%) [5]. Ensisijainen leikkaus ja lopulliset sädehoito ovat vaihtoehtoja OSCC potilaille; sekä kirurgian ja sädehoidon voi olla suuri vaikutus elämänlaatuun eloonjääneiden [6, 7].

Viime vuosina soveltaminen samanaikaisen Kemoterapia on tullut houkutteleva vaihtoehto perinteisille kirurginen hallintaan kehittynyt OSCC [8-10]. On huomionarvoista, että kemoterapia on kehittynyt lievittävä hoito on keskeinen osa parantavaa hoitoa paikallisesti edennyt OSCC. Sisplatiini, karboplatiini, metotreksaatti ja taksaanit ovat aktiivisia yksittäisinä aineina tai yhdistelmänä uusiutuvan tai metastasoituneen OSCC [3, 11-14]. Kuitenkin annosta rajoittavia toksisuuksia syöpäpotilailla rajoittaa niiden kliinistä hyötyä. Tällä hetkellä ei ole olemassa standardia toisen linjan kemoterapian hoitoon toistuvan tai metastaattisen OSCCs. Monotargeted hoitoja, kuten estäjät kasvutekijän reseptorin (EGFR), signaali anturin ja aktivaattori transkription 3 (STAT3), tumatekijä kappa B (NFKB), ja Mammalian rapamysiinin kohde (mTOR) ovat osoittaneet rajoitettu tehoa [15-18 ]. Siten on olemassa suuri tarve kehittää uusia lääkkeitä suun syöpä. Kuitenkin löytämään uusia yhdisteitä, joilla on voimakas syövän vastainen aktiivisuus on pitkä ja kallis prosessi. Vaihtoehtoinen lähestymistapa on hyödyntämistä jo lääkkeitä, jotka on hyväksytty kliiniseen käyttöön muita syöpiä.

Apaziquone [EOquin, USAN, E09, 3-hydroksi-5- atsiridinyyli-1-metyyli-2 (1 H indoli-4,7-dioni) -prop- β-en-α-ol] on pro-drug kuuluvat luokkaan syöpälääkkeet kutsutaan bioreductive alkylaing aineita, jotka on tehty laaja kliininen arviointi virtsarakon syövän [19] . Apaziquone aktivoidaan useiden entsyymien, laajimmin tutkittu entsyymi on NAD (P) H: kinoni oksidoreduktaasi 1 (NQO1) tai DT-diaforaasi, joka vähentää apaziquone osaksi DNA-alkyloiva aine [19]. Täällä tutkimme mahdollisia antituumorivaikutuksen of Apaziquone in

in vitro

ja

in vivo

malleissa suusyövän.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat ja soluviljelmät

Suun levyepiteelikarsinooma solulinjassa AMOS III, on voitu todeta betelpähkinät ja tupakan liittyvät ihmisen OSCC meidän laboratorio [20]. AMOS III käytettiin

in vitro

ja

in vivo

kokeellisessa mallissa suun syöpään tässä tutkimuksessa. Muut perustettu OSCC solulinja, SCC4, on käytetty arvioimaan laajempi sovellettavuus apaziquone mahdollisten suun syövän hoitoon OSCC. Ei-metastaattinen suusyövän solulinja, SCC4, saatiin American Type Culture Collection (ATCC). Suun kautta syöpäsolujen (AMOS III /SCC4) viljeltiin Dulbeccon Modified Eagles Medium (DMEM), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 1 mmol /l L-glutamiinia ja penisilliini-streptomysiiniä (1 X), kosteutetussa inkubaattorissa (5 % hiilidioksidia, 95% ilmaa) 37 ° C: ssa, kuten aiemmin on kuvattu [20-22]. Molemmat solulinjat on testattu käyttämällä lyhyitä tandem toista polymorfia analyysiin ja ovat rutiininomaisesti tuotettu laboratoriossamme.

In vitro Solujen lisääntyminen /sytotoksisuuskokeeseen (MTT-määritys) B

Kyky apaziquone kohteeseen indusoivat sytotoksisia vaikutuksia määritettiin konversio 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) ja formatsaaniksi mitokondrion dehydrogenaasien. Suun kautta syöpäsolujen (AMOS III ja SCC4) maljattiin kolmena rinnakkaisena 96-kuoppalevyillä täydelliseen alustaan. Soluja viljeltiin kiinnittyä yön yli ja sitten altistettiin vaihtelevia pitoisuuksia apaziquone [5 nM TO100 uM] ja 24-96 h määrittämiseksi annoksesta ja ajasta riippuvia inhibitio soluproliferaatiota. Solujen proliferaatio mitattiin lisäämällä MTT soluihin. Lyhyesti, MTT liuotettiin steriiliin PBS: ään ja lisättiin kuoppiin lopulliseen pitoisuuteen 1,5 mM. Solut inkuboitiin MTT: ssa 4 h, elatusaine poistettiin ja jäljellä formatsaanikiteet liuotettiin DMSO: hon. Absorbanssi liukoiseksi formatsaanin mitattiin 540 nm: ssä käyttäen usean hyvin pyyhkäisyspektrofotometrillä. Prosentuaalinen inhibitio soluproliferaatiota laskettiin kunakin ajankohtana ja annos seuraavasti: (A

ohjaus –

käsitelty /A

ohjaus) x 100.

In vitro LD

50 mittaukset Apaziquone

mää- rittää apaziquone aiheuttaa solukuolemaa suun syöpäsoluja, sen LD

50 määritettiin käyttäen suun kautta syöpäsolujen AMOS III ja SCC4 soluja. Pitoisuuden määrittämiseksi on apaziquone vaaditaan tappamaan 50% soluista (LD

50), 5000 solua kustakin solulinjasta maljattiin kolmena kappaleena nolla fluoresenssin kudosviljelmässä käsiteltiin 96-kuoppaisilla levyillä (BD Biosciences, Mississuaga, ON, Kanada ). Yli yön inkubaation korvattiin jotka sisälsivät apaziquone pitoisuusalueella 5 nM to100μM. 48 tunnin jälkeen, alamarBlue määritys suoritettiin määrittämään solun elinkykyä.

Apoptosis Assay

tulosten todentamiseksi solujen elinkelpoisuuden määritykset, anneksiini V ja propidiumjodidilla (PI) kaksinkertainen värjäys oli käytetään määrällisesti apoptoosin. AMOS III soluja joko vehikkeliä yksinään tai apaziquone 500 nM: ssa 48 tuntia. Solut leimattiin anneksiini V-FITC-konjugaattia ja PI käyttämällä anneksiini V iinianalyysikitissä seuraten valmistajan ohjeita (Sigma, St. Louis, MO) ja analysoitiin käyttämällä BD Cell Quest Pro -ohjelmisto. Nämä tulokset varmistettiin lisäksi Western-blot-analyysi erityisiä kaspaasien ja Poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) määrityksessä.

Solusyklianalyysiä virtaussytometriaa käyttämällä

viljeltiin media käsittelemättömästä, ajoneuvon ohjaus ja apaziquone käsiteltiin AMOS III solut kerättiin ja sentrifugoitiin kerätä tarttumattomat solut. Kiinnittyneet solut pestiin PBS: llä (pH 7,4) ja trypsiinillä. Sekä tarttumattomia ja kiinnittyneet solupopulaatioiden yhdistettiin lisäanalyysiä. Solut kiinnitettiin 70% etanolilla (-20 ° C, yön yli) ja suspendoitiin uudelleen puskuriin, joka sisälsi PBS: ssä (pH 7,4), EDTA: ta (0,5 mol /l, pH 8,0), Triton X-100 (0,05%), RNaasi A: ta ( 50 ug /ml), ja PI (100 ug /ml) ennen virtaussytometria-analyysia.

TUNEL-määrityksessä

TUNEL-määritys suoritettiin seuraten valmistajan ohjeita. Apaziquone käsiteltyjen ja ajoneuvon hallinnan AMOS III solut kerättiin edellä kuvatulla tavalla. Leimaus ja määritys suoritettiin noudattaen valmistajan ohjeita, ja tulokset analysoitiin tarkemmin konfokaali laser scan mikroskoopilla.

In vivo

antituumorivaikutuksen Apaziquone vuonna ksenograftimallia ihmisen suun okasolusyöpä

Tämä

in vivo

hyväksyi tutkimuksen eläinten eettisen komitean Mount Sinai Hospital ennen aloittamista ja eläinten hoito tehtiin mukaisesti Toronto Centre of Phenogenomics (TCP) suuntaviivat harkitsemaan eläinten hyvinvointi ja minimoida ahdistusta. Prekliiniset tutkimukset suoritettiin tehoa verrataan vaihtelevia pitoisuuksia apaziquone ja ajoneuvon hallinnan eläinmallissa ihmisen suun SCC. Tehokkain ennalta määritetty pitoisuus /annos apaziquone otettiin eteenpäin

in vivo

testaus vierassiirrekokeissa hiirimalleissa suun syöpä. Kaksi kuukautta vanha mies heikentyneisiin NOD /SCID /CRL # 394 hiiret olivat ihon alle (sc) istutettiin 1 x 10

6 syöpäsoluja seerumivapaassa väliaineessa kylkeen alueelle perustaa kasvaimia, noudattaen institutionaalisten eläinten hoito ohjeet . Kun kasvaimet saavuttivat koon noin 100-200 mm

3, hiiret jaettiin satunnaisesti ryhmiin (n = 6 /ryhmä) mukainen kasvainten ja kehon painot seuraavista käsittelyistä: käsittelemätön vehikkelikontrollin (0,1% DMSO -n = 6) ja apaziquone-käsitelty käsivarsi tutkimus (n = 6). Vuonna apaziquone varren tutkimuksen, hiirille, joilla on kasvaimia, annettiin intraperitoneaalisesti tiputtamista ja apaziquone 0,1 mg /kg kehon painoa tai ajoneuvon hallinnan 0,1% DMSO: 8 viikkoa kasvaimen istutuksen jälkeen. Huumehoidon jatkettiin 6 viikkoa. Kasvaininsidenssiä, kasvaimen tilavuus, paino ja yleinen ja eloonjäämismediaani eläinten kirjattiin. Hiiriä seurattiin kahdesti viikossa mitään merkkejä ja oireita. Tällä johtopäätös, veri kerättiin jalkavarreniholaskimon hiirien kokonaiselle verenkuva analyysi ja elintoiminnot testi ennen anestesian. Sitten hiiret lopetettiin katkaisemalla kaula tai aikaisemmin, jos kasvaimet ylittivät 20% painoindeksi ja /tai jos hiiret osoittaa mitään kliinisiä oireita kalpeus, kyyryssä, hengenahdistus ja epänormaali liikkuminen. Sen jälkeen euthanization, elimet kerättiin ja välittömästi kiinnitettiin formaliiniin. Kasvaimen tilavuus mitattiin. Kasvaimet kerättiin sitten ja etu-taka-keskiviivan face leikattu siivu kasvain kiinnitettiin formaliiniin. Kasvain reuna ja keskus kuutioiksi ja flash jäädytettiin nestetypessä eri pulloissa. Ki67 immunohistokemia (IHC) suoritettiin käyttäen FFPE kudosleikkeiden (4 um paksuus) kasvainten apaziquone testi- ja kontrolliryhmän hiiret ksenografteissa noudattaen, kuten on kuvattu meidän aikaisemmassa [23]. Laseja inkuboitiin anti-Ki67-vasta-ainetta laimennoksena 1: 100 (Abcam, Cedarlane Labs, Burlington, ON, Kanada) 1 h ja kaniini-vasta-ainetta 20 minuutin ajan, minkä jälkeen Vectastain Elite ABC-reagenssia (Vector Labs, Burlingame, CA) käyttäen diaminobentsidiiniä kromogeenin. Negatiivisen kontrollin kudosleikkeiden, ensisijainen vasta-aine korvattiin isotyyppispesifisessä ei-immuuni hiiri /kani IgG. Leikkeet arvioitiin valo mikroskooppinen tutkimus. Hemotoksyliini- Eosiini (H 0,001, pariksi kaksisuuntainen Studentin t-testiä välillä käsitellyn ja käsittelemättömän ryhmien kuvio 5B ja 5C).

(A) Ei merkittäviä muutoksia kehon painon havaittiin apaziquone käsitellyissä hiirissä tai vehikkelikontrollihiiret aikana hoidon. (B) vaikutus apaziquone hoito kasvaimen kokoon hiirissä. Edustaja leikattiin kasvaimia kuvaa eroa kasvainten koon välillä apaziquone käsitellyn ja käsittelemättömän kontrolliryhmän hiirillä. (C) vaikutus Apaziquone hoito kasvaimen kasvun hidastuminen. Tuumoriksenografteja kehitetty kyljet NOD /SCID /CRL hiirille annettiin apaziquone (0,1 mg /kg) intraperitoneaalisesti injektoimalla viikoittain 6 viikkoa. Apaziquone hoito viivästytti kasvaimen kasvua merkittävästi (p-arvo 0,001, pariksi kaksisuuntainen Studentin t-testi) että lääkeaineen käsitellyssä ryhmässä hiiret verrattuna hiiriin käsittelemättömään kontrolliin tai ajoneuvon kontrolliryhmiin. (D) vaikutus Apaziquone hoidon munuaisissa ja maksassa hiirillä. Histologia maksan ja munuaisten kudosten päätteeksi

in vivo

tutkimuksessa. Kudosleikkeet värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H perusteellinen tutkinta NQO1 vuonna OSCC ja sen merkitys apaziquone tehoa OSCC potilaille käydään tulevassa tutkimuksessa. Kuitenkin NQO1 proteiinin ilmentyminen on viime aikoina raportoitu ennustaa huonoon ennusteeseen ei-pienisoluisen keuhkosyövän [38].

Päätelmät

Apaziquone osoittivat lupaavaa syövän vastaista aktiivisuutta suun syöpäsolulinjoissa tappaa syövän solujen apoptoosin. Edelleen apaziquone osoittivat lupaavaa antituumorivaikutuksen suun syöpä tuumoriksenografteja ilman merkittävää toksisuutta normaaleissa kudoksissa korostuu prekliininen tehoa apaziquone, mahdollisena uusi syöpälääkkeen terapeuttista ehdokas suusyöpää hallintaan.

tukeminen tiedot

S1 Kuva. Western blot densitometrian analyysi.

Histogrammit Länsi blot densitometria analyysi Caspase 3, Caspase 9, irrotettiin Caspase 9, PARP ja halkaistut PARP normalisoidaan p-aktiini verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin (NTC).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0133735.s001

(TIF) B S1 Taulukko. Kliinisen kemian Profile, Liver Munuaisten toiminta.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0133735.s002

(DOCX)

S2 Taulukko. Täydellinen verenkuva.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0133735.s003

(DOCX) B