Krooninen sairaus

tiivistelmä

Pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) transcriptome on profiloitu laajasti, kuitenkin tunnistaa biomarkkerit, jotka ovat kliinisesti merkityksellisiä ja siten kanssa translaation hyötyä, on suuri haaste. Tavoitteena oli tutkia käyttää meta-analyysi lähestymistapa luetteloida ehdokas biomarkkereita, joilla on suuri potentiaali kliiniseen käyttöön HNSCC. Tiedot julkisesti saatavilla mikrosiru sarja (N = 20) profiloitu käyttäen Agilent (4X44K G4112F) ja Affymetrix (HGU133A, U133A_2, U133Plus 2) alustat oli ladattu ja analysoitiin platform /chip-spesifisellä tavalla (GeneSpring ohjelmisto v12.5, Agilent, USA). Principal Component Analysis (PCA) ja klusterointi analyysi suoritettiin iteratiivisesti erottelevat poikkeavia havaintoja; 140 normaali ja 277 kasvain näytteet 15 sarjassa olivat mukana kädessä. Analyysit tunnistettu 181 ilmentyvät eri, yhtäpitävät ja tilastollisesti merkitsevä geenit; STRING analyysi paljasti vuorovaikutukset 122 heistä, jossa kaksi suurta geeniryppäät liittää useilla solmuja (MYC, FOS ja HSPA4). Validointi HNSCC-erityisen tietokannan (N = 528) The Cancer Genome Atlas (TCGA) tunnistetaan paneelin (

ECT2

,

ANO1

,

TP63

,

FADD

,

EXT1

,

NCBP2

), joka on muutettu 30% näytteistä. Validation kohtelu infektoitunut (ryhmä I, N = 12) ja jälkikäsittely (ryhmä II, N = 12) potilaista tunnistettu 8 geenien merkittävästi sairauteen liittyvän (alapuolinen alue käyrän 0,6). Korrelaatio uusiutui /uudelleen toistumisen osoitti

ANO1

oli korkein (herkkyys: 0,8, spesifisyys: 0,6) ennustaa epäonnistumista Ryhmä I

UBE2V2

,

PLAC8

,

FADD

ja

TTK

osoitti suurta herkkyyttä (1.00) I ryhmän taas

UBE2V2

ja

CRYM

olivat erittäin herkkiä ( 0,8) ennustamisessa uudelleen uusiutumisen ryhmään II. Edelleen TCGA analyysi osoitti, että

ANO1

ja

FADD

, joka sijaitsee 11q13, koekspressoitiin at transkriptin tasolla ja merkittävästi liittyvät yleiseen ja taudista vapaan eloonjäämisen (

p

0,05). Meta-analyysi lähestymistapa tässä tutkimuksessa on tunnistettu ehdokas markkereita korreloivat sairauden lopputulokseen HNSCC; lisävalidointia suuremmassa kohortin potilaista perustavat niiden kliinistä merkitystä.

Citation: Reddy RB, Bhat AR, James BL, Govindan SV, Mathew R, DR R, et al. (2016) meta-analyysit Microarray Tietoaineistot Tunnistaa

ANO1

ja

FADD

kuin Prognostic merkkiaineet Pään ja kaulan syöpä. PLoS ONE 11 (1): e0147409. doi: 10,1371 /journal.pone.0147409

Editor: Muy-Teck Teh, Queen Mary University of London, Yhdistynyt kuningaskunta

vastaanotettu: 08 lokakuu 2015; Hyväksytty: 04 tammikuu 2016; Julkaistu: 25 tammikuu 2016

Copyright: © 2016 Reddy et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja asiaan liittyvien tietojen tiedostoja.

Rahoitus: hankkeen rahoittivat Intian neuvoston Medical Research, Intia (nro 5/8 /10-18 (Oto) /CFP /11-NCD -1). (https://www.icmr.nic.in/). AS sai rahoitusta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kaksi laatijat ovat sidoksissa kaupallisen yhtiön Strand Life Sciences. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkoja koskevat tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Molecular profilointi kasvainten, kuten pään ja kaulan Okasolusyöpä (HNSCC), on käytetty ymmärtämään mekanismeja syövän sekä taustalla syitä hoitoon vastus. Kasvava maailmanlaajuinen esiintyvyys HNSCC yhdessä puute merkittävää parannusta yleiseen eloonjäämisaste kuluneen neljän vuosikymmenen edellyttää uudempia lähestymistapoja ymmärtää molekyylitason mekanismeja taudin ja tunnistaa mahdolliset merkkiaineita varhaiseen havaitsemiseen, ennuste ja kohteina terapiaan. Molecular profilointi yhdessä potilaan validointi syövissä eturauhasen, munasarjojen ja rinnan on johtanut kliinisen soveltamisen markkeripaneelit kuten Mamma tulostaa ja Oncotype Dx. [1, 2]. Samanlaisia ​​yrittää muodostaa diagnostisia tai ennustetekijöitä molekyylitason markkereita HNSCC kliiniseen käyttöön ovat pysyneet vaikeasti.

Korkea suoritusteho molekyyli- profilointia käyttämällä tekniikoita, luetteloida erot on koko genomin, transcriptome [3] [4] [5] ja proteomi [6] tasoilla on toteutettu HNSCC. Nämä tutkimukset ovat luetteloitu merkkiaineiden etenemisen [7] [8] ja hoitovastetta [9]. Kuitenkin, käännös näistä merkkiaineita kliinistä hyötyä ei ole saavutettu johtuen liittyviä haasteita suurikapasiteettisten tekniikoiden kannalta merkki valinnan ja tarve suuren mittakaavan potilaalle validointi. Nämä haasteet ovat edelleen häpeään johtuu muun muassa huomattava ristiriita eri suurikapasiteettisten tutkimuksia, johtuu eroista näytteen käsittelyn, tyyppi alustojen käytetty ja analyyttinen algoritmit applied [10] [11]. Tämä ongelma on edelleen vahvistunut transcriptomic tutkimuksissa pääasiassa koska transkriptio tason muutokset voivat vaihdella lavalla, kudosspesifisiä ja tilan vaihtelut ilmentymistä erilaisten geenien.

Analyyttinen strategioita, jotka voivat hyödyntää olemassa olevia tietokantoja ja tunnistaa markkereita yhtäpitävät eri tutkimuksissa voi olla hyödyllinen lähestymistapa kaventamaan merkkiaineiden lisääntynyt luottamus ja kliininen sovellettavuus. Meta-analyysi viittasi analyysi julkisesti saatavilla aineistoja, voisi siten mahdollisesti avulla voidaan tunnistaa kliinisesti merkittävää altaan merkkiaineita; monet tällaiset tutkimukset on raportoitu syövät eri sivustoja. Meta-analyysi perustuu lähestymistapojen haimasyövän ovat johtaneet tunnistamiseen uusia tavoitteita ja ehdokas biomarkkerit [12]. Eturauhasen syöpiä, markkereita kausaalinen karsinogeeniseen prosessia tunnistettiin käyttäen samanlaista lähestymistapaa [13]. Lisäksi merkkiaineita erittäin liittyy ennusteen ja hoidon lopputulos ennustaminen rintasyövässä [14] [15] tunnistettiin myös läpi samankaltaisia ​​meta-analyysi lähestymistapoja. Ensisijaisena tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli suorittaa cross-platform, rajat tutkimuksen meta-analyysi julkisesti saatavilla microarray aineistot pään ja kaulan syöpä, tunnistaa merkkiaineiden biologista merkitystä yhteisellä analyyttisen putki ja myöhemmin validoida niitä kliinisissä näytteissä.

Materiaalit ja menetelmät

Search Criteria ja Data Mining

analyysi julkisesti saatavilla mikrosiru aineistot toteutettiin kohti PRISMA suuntaviivat [16]. Julkinen tietokannat, Gene Expression Omnibus (GEO) (NCBI-http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) ja Array Express (EBI) [https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress ] etsittiin läsnäolon raakatietoja microarray tehdyt kokeet pään ja kaulan alueen syöpä. Sarjassa valittu analyysiin sisältyi tietoja i) tehtyjen tutkimusten pään ja kaulan okasolusyöpä potilasta ii) tutkimusten mukaan lukien hoitamatonta potilasta, ja iii) tutkimusten suorittamiseksi maailmanlaajuinen profilointi transkriptomiikka käyttämällä tiheitä matriiseja. Tutkimukset /näytettä, myös kilpirauhasen, nielu ja nenänielun jätettiin pois tutkimuksesta, koska niiden monipuolinen etiologies. Näiden alustojen niissä analyyseissä olivat Affymetrix [Affymetrix Inc., Kalifornia, USA] ja Agilent [Agilent Technologies, Kalifornia, USA]. Raakadata sarja profiloitu Sekä alustoja ryhmiteltiin perustuu yksittäisiin teknologiaan ja kunkin teknologian (joko platform) otettiin mukaan analyysiin, jos vähintään 2 sarja oli saatavilla tietokannassa. Yleinen työnkulku seurasi vaiheittaista protokollan ehdottamia Ramasamy

et al

suorittamiseksi meta-analyysi [17]. Perustyötä algoritmi yksityiskohtaisesti kuvassa 1.

julkisesti saatavilla raaka microarray tiedot Pään ja kaulan Okasolusyöpä (HNSCC) sarja on ladattu ja ryhmitelty ja analysoitiin GeneSpring tilastollisia ohjelmistoja. Normalisointi tehtiin näytteistä, jotka sitten on ryhmitelty kasvain ja normaali ennen suorittamista geenin tasolla kokeen. Principal Component Analysis (PCA) suoritettiin poistamaan ristiriitainen näytteitä. Kertainen muutos ja

p

arvo laskettiin saada merkittäviä geeni yhteisöjä. Nämä tilastollisesti merkittäviä yksiköitä käytettiin lisäanalyysiä; tietokanta merkinnät (Gene ontologia, STRING ja miRWALK) ja potilaiden validointi (Experimental validointi Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qPCR) ja The Cancer Genome Atlas (TCGA)).

Data Analysis käyttäminen Gene Spring

raaka datatiedostot analyyseissa käytetyn mukana .CEL (Affymetrix platform) ja TXT (Agilent) tiedostoja. Meta-analyysi suoritettiin käyttäen Gene jousi ohjelmistoa (https://genespring-support.com) [v12.5, Agilent, Kalifornia, USA]. Raakadata liittyvät kuhunkin siru oli siirrettyinä ohjelmisto jossa näytteet perustason muunnetaan ja normalisoitu Tukeva Multi-array Analysis (RMA) in Affymetrix tai 75

persentiilin Agilent alustoilla (yksivärinen). Yksittäiset näytetiedostot sitten luokiteltiin ”normaali” ja ”kasvain” ja analysoitava uudelleen yhtenä kokeilu. Gene taso kokeelliset tiedot (aritmeettinen keskiarvo kaikista antureista kartoituksen samaan koetin ID) tuli ja laadunvalvonta suoritettiin käyttäen Principal Component Analysis (PCA) GeneSpring. Näytteet, jotka olivat harha PCA tontit poistettiin ja klustereiden suorittaa myöhemmin varmistaa selvä kerrostuneisuus näiden kahden näytteiden (normaali ja kasvain). Prosessi suoritettiin useita toistojen saada puhdistettu erottaminen. Kertainen muutos analyysi sitten suoritetaan näytteistä minkä parittomia

t

-testi (varianssi on erisuuruinen) suoritettiin saamiseksi merkittäviä geeni yhteisöjä.

p

-arvo laskenta (asymptoottinen) ja useita testaus korjauksen (Benjamini Hochberg FDR) on edelleen saamiseksi suoritetuista geeni yhteisöihin

p

-arvo 0,05 ja taita muutos (FC) ja 2.0. Sisäänrakennettu polku analyysi suoritettiin käyttäen tunnistettu geeni luettelosta. Merkittävä geeni lista ja polkuja poikki erilaisten tekniikoiden Affymetrix verrattiin käyttämällä geeniä symboli /reitin nimiä tunnisteena. Yksittäiset geeni yhteisöluetteloa kustakin tekniikkaa poimittiin GeneSpring ohjelmiston ja viedä Excel-tiedostoja. Yhtäpitävän geeni yhteisöt sekä yhteisiä reittejä tunnistettiin yli teknologioiden avulla Microsoft Access (Microsoft Inc. WA, USA). Vastaavaa lähestymistapaa tunnistaa kaikki yhteiset geenit ja polkuja poikki kahden alustan sekä Affymetrix ja Agilent (kuvio 1).

Functional Lisäykset Usean Web Resources

yhtäpitävät geeni luettelo useissa eri alustojen analysoitiin eri web resursseja arvioida toiminnallisia luokkia, proteiini-proteiini vuorovaikutusten ja miRNA kohdistaminen geenit. Gene ontologia Analyysi suoritettiin käyttäen PANTHER (Protein Huomautukset kautta Evolutionary Relationship) luokitusjärjestelmän (https://www.pantherdb.org/) [18] arvioida toiminnallisiin luokkiin geenien. String-tietokanta (STRING v9.1) (http: //string-db.orgnewstring_cgi) [19] käytettiin ennustamaan ja luetteloida proteiini-proteiini vuorovaikutukset yhtäpitävät geenejä. MiRNA jotka kohdistuvat nämä geenit tutkittiin käyttäen miRWalk2.0 tietokantaa (https://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/index.html) [20].

Patient pohjainen Validation

yhtäpitävät geeni lista myös ristiin verrattiin TCGA tietokanta (https://www.cbioportal.org) [21] niiden mutaation, kopioiden määrä vaihtelu (CNV) ja mRNA: n ilmentymisen tila. Merkittävä geeni paneeli tunnistaa arvioitiin myös niiden yhteistyön ekspressiotietojen, yleinen ja taudista vapaan eloonjäämisen korrelaatio niiden ilme kuvioita TCGA syövän tutkimukset (Head and Neck Okasolusyöpä, Väliaikainen; N = 528 näytettä).

validointi valittujen geenien myös toteutettiin HNSCC käyttävillä potilailla kvantitatiivista reaaliaikaista PCR. Tutkimuksen hyväksyi Narayana Hrudayalaya sairaalat Institutional Review Board [NH /IRB-CL-2012-058]. Kirurginen näytteitä potilaista valittiin bio varasto pään ja kaulan Oncology osasto, Mazumdar Shaw Medical Center, Bangalore. Kaikki näytteet kerättiin sen jälkeen kun kirjallinen lupa. Aiemmin hoitamaton ja toistuva potilaiden diagnosoitu HNSCC kaikkien sivustojen (pois lukien kilpirauhasen, nielu ja nenänielun) ja porrastetusti tammikuussa 2010 2014 yksityiskohtaiset tiedot seurata, olivat mukana tutkimuksessa. Normaali kudos kerättiin terveiltä vapaaehtoisilta aikana hampaiden uuttamisen jälkeen kirjallinen suostumus. Demografinen, kliiniset ja patologiset tietoa potilaista saatiin sähköiset potilastiedot ja potilaita seurattiin ajaksi 2 vuotta.

Potilaat luokiteltiin perustuen niiden Ihmisen papilloomaviruksen (HPV) asema tunnistetaan p16 immunohistokemiallisesti käyttämällä vakiintuneita protokollia. Formaliini parafiiniin upotetut leikkeet potilaista kerättiin patologian osaston keskellä. Lyhyesti, tuumorisektioiden (5 mikronia) on de-paraffinised ja käsiteltiin 3% vetyperoksidilla lopettaa endogeenisen peroksidaasin. Leikkeitä inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineella (anti-p16, BioGenex, Fremont, CA, USA) ja myöhemmät havaitseminen suoritettiin käyttäen piparjuuriperoksidaasi (HRP) järjestelmää valmistajan ohjeiden mukaisesti (Dako REAL

™ EnVision

™ Detection System, Tanska). Kohdat käsitellään samalla tavalla, mutta ilman primaarista vasta-ainetta otettiin negatiivisina kontrolleina. Pisteytystä värjättyjä laseja oli kohti vahvistettu tutkimuksissa [22]. Objektilasit arvioitiin valomikroskoopilla ja pisteytettiin 0-3 mittakaavassa ottaen huomioon prosenttiosuus positiivisuutta ja värjäytymisen intensiteetti; 0 (täydellinen puuttuminen kasvaimen värjäytyminen), 1 (heikko värjäytyminen kasvainsolujen), 2 ( 50% kasvaimista solut värjättiin kohtalainen intensiteetti) ja 3 ( 50% kasvaimen värjäytyminen kohtalaista /voimakas värjäytyminen).

Marker Profilointi käytönaikaisten kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qPCR) B

RNA uutettiin näytteistä, arkistoidaan RNA Myöhemmin (Ambion, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA), käyttämällä TRIZOL reagenssia (Sigma Aldrich , MO, USA) ja käsiteltiin DNaasi (Fermentas, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) ja arvioitiin saastuminen polymeraasiketjureaktiolla (PCR). Eheys ja laatu RNA varmistettiin geelielektroforeesilla ja 260/280 suhde. 1 ug RNA (260/280: 1,8-2,0) muunnettiin komplementaarinen DNA High Capacity cDNA Muunnossarja (Applied Biosystems, CA, USA) kohti valmistajan ohjeiden. Valitut markkereita profiloitiin käyttämällä spesifisiä alukkeita luetellaan S1 taulukossa ja kaikki alukkeet arvioitiin spesifisyys käyttäen Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) analyysi (National Center for Biological Information, NLM, USA). QPCR tehokkuus arvioitiin käyttämällä kulmakerroin lineaarisen regressiomallin kohti vakioprotokollia. Cp mitattiin useille sarjalaimennoksia kustakin cDNA saada standardikäyrä ja vastaava kaltevuus. Hyötysuhde lasketaan kaavalla, Efficiency = 10

(- 1 /kaltevuus). Kaikkien reaaliaikainen PCR-reaktiot suoritettiin kolmena kappaleena käyttäen Roche Light Cycler 480 reaaliaikaista PCR -järjestelmää (Roche Diagnostics, Saksa) tai ABI Vaihe yksi Real Time Machine (Applied Biosystems, CA, USA) käyttäen Kapa SYBR Green PCR Master Mix ( Kapa Biosystems, MA, USA). Lämpötilasyklit olosuhteet olivat 50 ° C: ssa 2 min, jota seurasi ensimmäinen denaturaatiovaiheen 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, 45 sykliä 95 ° C: ssa 30 s, 60 ° C 30 s ja 72 ° C: ssa 30 s. Kokeet tehtiin kolmena rinnakkaisena datapisteen. Risteyskohdassa (Cp) ja myöhemmin analyysi suoritettiin käyttäen Second johdannaista max menetelmän ohjelmisto (Roche Diagnostics, Basel, Sveitsi). Kaikki reaktiot vahvistivat niiden spesifisyyden sulamiskäyräanalyysillä näytteen ja ei-kohde- ohjaus (NTC). Joukko (N = 4) viite geenien [(glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasin (

GAPDH

), 60S hapan ribosomaalinen proteiini P0 (

RPLP0

), 18S ribosomaalinen ribonukleiinihappo (

18SRNA

) ja β-glukuronidaasia (

GUS

)] arvioitiin käyttäen RefFinder [23] osajoukossa potilaan kohortin (N = 26) ja kaksi parasta Reference Genes (RG) valittiin lisäanalyysiä. suhteellinen muutos ilmentyminen arvioitiin käyttämällä geometrinen keskiarvo valitun viite geenit [24]. ilmaisua normaaleissa näytteissä toimi kalibraattori.

tilastolliset menetelmät

tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen STATA11.1 (College Station, TX, USA). vastaanotin Käyttö (ROC) käyrä analyysiä käytettiin arvioimaan ennusteita kunkin biomarkkereiden, optimaalinen leikkaus seikka tuotti suurin herkkyys ja tarkkuus määritetään kullekin biomarkkereiden. ROC-käyrät piirrettiin sitten pohjalta joukon optimaalinen herkkyys ja spesifisyys arvoja. Käyrän alapuolinen alue (AUC) laskettiin kautta numeerinen integrointi ROC käyrät. Biomarkkerin että on suurin pinta-ala ROC käyrä tunnistettu olevan vahvin yhdessä läsnäolo pään ja kaulan kasvainten. Herkkyys ja yhdistyksen merkkien uusiutui /uudelleen toistumisen analysoitiin Clinical laskimen (https://vassarstats.net/clin1.html).

Tulokset

Data Mining

Perustuen hakuehtoja, data mining eri tietokantojen havaintojen mukaan yhteensä 42 sarjan [Affymetrix alustalla: N = 32, Agilent: N = 10]. Vielä suodatuksen tietojen perusteella ja poissulkukriteereitä, 18 sarja Affymetrix ja kaksi Agilent otettiin mukaan tutkimukseen (taulukko 1). Tekniikka ja siruja, jotka olivat ristiriidassa analyyttinen putki ja jossa vain yksi sarja oli saatavilla suljettiin pois tutkimuksesta. Kokonaismäärä analysoitujen näytteiden oli 667 kasvaimia ja 271 normaalia. Affymetrix alusta oli mukana yhteensä 246 normaali ja 629 kasvaimet (U133 plus 2.0: N = 207, T = 419; U133A siru: N = 19, T = 147; U133A_2: N = 20, T = 63), kun taas Agilent alustan (4X44K G4112F) sisältyy 25 Normaali (N) ja 38 kasvaimen (T). Sub sivustoja tutkittiin valittujen sarjojen olivat suun limakalvolta, kielen, kurkunpään, nielun, ja alveolus ja retro-molaarinen trigone. Normaali näytteet olivat peräisin gingivobuccal sivusto kaikissa sarjassa. Sarjan kustakin sirun kunkin alustan analysoitiin erikseen käyttäen Gene keväällä analyysin ohjelmisto ja kohti analyyttinen putkilinjaa tunnistamaan yhtäpitäviä geenin yhteisöjä luetteloihin.

Analyysi poikki yhteen alustaan.

Vuonna Affymetrix alustan, 18 sarja analysoitiin, joka sisälsi tehtyjä tutkimuksia U133 plus 2 (N = 13), U133 A_2 (N = 2) ja U133A (N = 4) siruja; yksi sarja, analysoitiin käyttäen kahta erilaista pelimerkkejä (taulukko 1). Viisi sarjaa U133 plus 2 suljettiin, koska näytteet olivat harha aikana PCA ja klustereiden; yhteensä 373 näytettä olivat mukana kädessä (N = 122, T = 251). Tilastollisesti merkitsevä geeni lista, jossa on FC 2,0 ja

p

-arvo 0,05 käytettiin lisäanalyysiä. Kaikkiaan 12079 geenejä tunnistettiin sen jälkeen, kun analyysit U133 plus 2.0 taas 4134 tunnistettiin U133A ja 3438 geenit geenin U133A_2. Microsoft pääsy analyysi kaikkiin näihin geeni luettelot paljasti listan 965 geenin yhteisöistä joista 64.46% (N = 622) yhteisöt ovat yhtäpitäviä poikki 3 pelimerkkiä (585 ylös säänneltyä ja 37 alas säännelty) (S1A File) ja 35.54% (N = 343 ) geenien osoitti ristiriitaiset suuntaukset sääntelyn. Vastaavasti arvio viskositeettiluku ja diskordanssi- toteuttavat sääntelyä kaikkialla teknologiat osoittivat eri suuntauksia (U133 Plus 2 Vs U133A Concordance = 76,53%; U133 Plus 2 Vs U133A_2 Concordance = 58,27%; U133A Vs U133A_2 Concordance = 86,11%).

yhteinen polkuja poikki teknologiat tunnistettiin vertaamalla niiden yksittäisten polku luetteloissa. Lista (N = 54) Sen jälkeen lajiteltu perustuu prosenttiosuus Hyväksytty yhteisöihin suhteessa kokonaismäärään reitin yhteisöjä. Kaksikymmentä yksi polkuja tunnistettiin 30% tai enemmän Hyväksytty yhteisöt kaikissa 3 teknologioita, joista suurin osa niistä ovat solukierron liittyvät reitit (S1B File).

Agilent alustan (4x44k G4112F), 2 sarja, josta yhteensä 44 näytettä (N = 18, T = 26) olivat mukana kädessä yhteensä 8493 geenien (ylös ja alas säännelty) tunnistettiin analyysistä (FC 2,0;

p

0,05); 338 heistä on erittäin merkittävä (

p

0,001) korkea kertainen muutos eroja (FC 25-kertainen). Soveltamalla käytettiin raja-arvoa 50% Hyväksytty yksiköt kokonaismäärästä yhteisöistä, 43 polkuja tunnistettiin. Merkittävimmät reitit ( 65% Hyväksytty yksiköille) tunnistettu olivat tulehdusreaktio ja soluväliaineen organisaatio (ECM) (S1C ja S1D File).

Cross-platform Analysis.

Luettelo geenien yhteisesti tunnistettu näiden alustojen välillä paljasti yhteensä 402 geenien (

p

0,05 ja FC 2,0), joista 181 (45.03%; 13 säädeltiin ja 168 ylös säännelty) olivat yhtäpitävät ja 221 (54.97%) ristiriitainen asetuksessa trendi. Yhtäpitävän lista 181 geenien annetaan S2A File. Gene ontologia analyysi tämän geenin alalta PANTHER tietokantaan luokittelua geenien, osoitti, että molekyyli toimintojen sitova luokka (GO: 0005488) osoitti suurin edustus (28,5%; N = 49), jossa proteiinin ja nukleiinihapon happoa sitovia molekyylejä ovat pääkomponentit. Samoin biologisissa prosesseissa, solun (GO: 0009987, 20,10%, N = 75) ja aineenvaihduntaa (GO: 0008152, 18,8%, N = 70) olivat enemmistönä. 24.40% Matkapuhelinverkon komponentit olivat solun osat (GO: 0043226) ja solunulkoisen alueet (GO: 0005576). Suurin osa proteiinin luokkien tunnistettu olivat kuljettajat (PC00227) (9,30%, N = 21), ja reseptorit (PC00197) (8,40%, N = 8), (S1A kuvio).

Yhteinen reitit (N = 16) havaittiin poikki kahden alustan MS pääsy. Merkittävimmät reitit olivat esimerkiksi ne, jotka liittyvät solun tukirangan käyttäytyminen, kolesterolin biosynteesin ja IGF liikenne ( 70% Hyväksytty yksiköiden poikki alustoilla). Onkostatiini M signalointi ja Focal Adhesion olivat muut merkittävät polkuja, jotka olivat väärin säädellystä ( 25% Hyväksytty yksiköiden poikki alustoilla) (S2B File).

STRING tietokannan analyysien tunnistaa verkon välisen vuorovaikutuksen 122 geenit yhtäpitävät luettelosta . Suurin vuorovaikutusverkosto koostui kahden suuren toisiinsa ryhmiä FBJ Hiiren Osteosarkooman Viral Oncogene Homologi (FOS), fibronektiinin 1 (FN1), sykliiniriippuvainen Kinase 1 (CDK1), Heat shock 70 kDa proteiini 4 (HSPA4) ja V-Myc Avian Myelocytomatosis (MYC) ollessa solmut yhteyden (kuvio 2). Yhtäpitävän luettelosta, kun analysoidaan edelleen tunnistamaan kokeellisesti validoitu geeni tavoitteet miRNA ilmentyminen miRWalk2.0 tietokannasta, kaksi suurta perheet miRNA [

antaa

(N = 17) ja

mir

( N = 47)] identifioitiin, joka oli suunnattu yli 5 geenejä listasta (S3 File).

analyysi proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen MERKKIJONOn verkko tunnisti kaksi tärkeää toisiinsa klustereiden on suurella vuorovaikutuksesta geenien ( N = 122). Nämä 2 suurten klustereiden olivat toisiinsa solmujen MYC, FN1, FOS ja HSPA4. Rivien lukumäärä edustaa tasoa todisteiden esitettyjä väri legenda. Erikokoisia solmun perustuvat laajuudesta proteiinin rakenteellisten tietojen kustakin geenistä, kun taas värit solmun ovat visuaalinen tuki käytetään paremmin edustettuina. Merkit tästä analyysistä valittu potilaan validointi on ympäröity.

TCGA Tietokanta ja kokeellinen validointi geenien HNSCC Potilaat

181 geeni lista oli risti verrattuna TCGA tietokantaan ( https://www.cbioportal.org) arvioida mutaatio, kopioiden määrä ja mRNA ilmentymistilanne pään ja kaulan alueen syöpä kohortti (N = 300). Yhteensä 59 geenien muutettiin vähintään 10%: lla potilaista, kun taas osa-sarja 6 geenien [(epiteelisolujen Transforming geeni 2 (

ECT2) B, Anoctamin 1

(ANO1)

, tuumoriproteiinia p63

(TP63) B, Fas -Associated Via Death Domain

(FADD) B, Exostosin-1

(ULK1) B ja Nuclear Cap Binding proteiinialayksikkö 2

(NCBP2

)] muutettiin vähintään 30% näytteistä on mutaatio /CNV ja mRNA-tasot (S3 File ja S1B Kuva). top 20 geenit perustuu prosenttiosuuden muutokset TCGA luetellaan Taulukko 2.

Kokeellinen validointi käyttäen Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qPCR) toteutettiin yhteensä 34 näytettä, myös ensisijaisen käsittelemättömät kasvaimet (ryhmä I, N = 12), toistuvia näytteitä (ryhmä II; N = 12) ja terveet normaalit kontrollit (N = 10). Suurin osa näytteistä potilaan kohortin (N = 24) oli miehiä (75%, N = 18) ja suuontelon sub-sivuston (83,3%; N = 20), jossa pitkälle IV syöpiä (62,5%; N = 15). Suurin osa potilaista oli yli 40-vuotiaana vuotta (95,8%; N = 23) ja 79,2% oli joko tupakoitsijoita, chewers tai käyttivät alkoholia (N = 19). Potilaat ensisijaisen kohortin joko koki säteily leikkauksen jälkeen tai ei ollut adjuvanttia hoitoa. Viisi näistä potilaista kehittyi uusiutumisen aikana seurata, kun kolme oli taudista vapaan (neljä potilasta menetettiin seurata) (S2 taulukko). Vuonna toistuvat kohortin potilaista koki kemoterapiaa ja säteily ennen leikkaushoitoa.

Geenit validointi poimittiin 181 geenistä lista perustuu useisiin kriteereihin; säädeltiin yli 5-kertaiseksi 2 teknologioihin [Istukka-Specific 8 (

PLAC8

) ja kristalliinin, Mu (

CRYM

)], solmuja String tietokannassa (

FOS

,

TTK

, Ubiquitin konjugointientsyymiä E2 variantti 2 (

UBE2V2) B ja Centrosomal Protein 55kDa (

CEP55

)] ja osajoukko geenien kanssa muutoksia vähintään 30% potilaiden (mutaatio, CNV ja ilmaus) (

ECT2

,

ANO1

,

FADD

) in TCGA tietokantaan. Kaikki alukkeet, kun validoitu osoitti hyötysuhde vaihtelee 1,9 2,1 prosentuaaliset hyötysuhde on 93%: sta 110% (S2 Kuva). Analyysi RefFinder osoitti, että joukossa viittaus geenit arvioi,

RPLP0

ja

18SRNA

arvioitiin vakain ( geometrinen keskiarvo ranking-arvot:

RPLP0

: 1,19,

18SRNA

: 1,41,

GAPDH

: 3,0 ja

GUS

: 4.00) analyysin jälkeen useat ohjelmistot (Delta CT, geNORM, Normfinder ja Bestkeeper) (S3 kuvassa). qPCR validointi valittujen geenien (N = 9) suoritettiin sitten käyttäen suhteellisen kvantifiointimenetelmän käyttäen geometrinen keskiarvo kahden viite geenejä.

markkereita osoitti sääntelyn suuntaukset sekä ryhmissä samanlaisia ​​kuin saatujen meta-analyysi (kuvio 3A-3D). Kuusi geenien osoitti yli 70% validointi näytteistä arvioitiin;

PLAC8

(91,67),

UBE2V2

(87,5%),

ECT2

(72,2%),

FADD

(69,5%),

CEP55

(69,5%) ja

TTK

(76,2%). Arviointi kelpoistustila kahdessa kohorteissa osoitti, että vaikka kaikki geenit validoitu yli 60% ryhmän I, vain 4 geenit osoitti samanlaista validointi II ryhmän (

PLAC8

,

CRYM

ECT2

ja

UBE2V2

). ROC analyysi merkkiaineiden Kohortin 1 osoitti, että

PLAC8

(AUC: 0,89),

FOS

(AUC 0,82),

ANO1

(AUC: 0,81) ja

UBE2V2

(AUC: 0,82) oli korkeimmat yhdessä tauti (kuvio 3E-3H).

Quantitative geeniekspressioprofilointi valittujen markkereiden suoritettiin ryhmä I (ensisijainen; A) ja ryhmän II (toistuva; B) kohortti.

PLAC8

ja

UBE2V2

validoitu kaikissa näytteissä (100%) Ryhmän I osalta asetuksen trendejä taas muiden geenien osoitti vastaavia kehitys 60% näytteistä. II ryhmään 60% potilaista osoitti yhdenmukaisia ​​sääntelyä suuntauksia neljä geenejä. Perustuu potilaan seurantaan, ryhmän olin alaluokat kertaluonteinen (C) ja toistuvia (D) ja lauseke arvioitiin edelleen. ROC-käyrä analyysi ryhmän I potilaista osoitti, että

PLAC8

(E),

FOS

(F),

ANO1

(G) ja

UBE2V2

(H) oli korkein yhdessä tauti (AUC 0,8). Pylväs mediaani kertainen muutos Normaali.

Assessment of HPV- statuksesta käyttäen p16 kuten korvikemarkkerina, osoitti, että joukossa potilaan kohortin kanssa käytettävissä näytteiden (N = 20), 12 potilaalla oli heikko tai mitään värjäytymistä, kun taas loput oli kohtalainen /voimakas värjäytyminen p16 (N = 8) (S4A-S4d Kuva). Korrelaatio geenien kanssa HPV asema (HPV tulokset 2-3 otetaan positiivinen), osoitti, että yleinen ilmaus mallia markkereita ei osoita mitään yhteyttä HPV- statuksesta. Yksittäiset analyysit osoittavat, että joukossa markkereita, vain

FADD

osoitti yhdessä HPV positiivisuus; lisääntynyt potilaiden prosenttiosuus (83%) heikosti tai ei lainkaan värjäytymistä HPV osoitti korkean ilmentymisen

FADD

verrattuna potilaisiin positiivinen HPV (57%; p = 0,03) (S4E Kuva).

korrelaatio Marker Profile jossa hoitotulokseen

markkereita korreloivat hoitotulokset (uusiutumisen ryhmän I ja uudelleen uusiutumisen ryhmän II).

ANO1

osoitti parhaan teho (herkkyys: 0,83, spesifisyys: 0,67) havaitsemiseksi potilailla, jotka eivät hoitoa kohortissa 1.

ANO1

osoitti myös 3-kertainen mediaani taita ilmaisun toistuva kohortti (4/5) ryhmän I verrattuna kertaluonteisten kohortti.

ECT2

(0,83),

FADD

ja

UBE2V2

(1) osoitti myös suuren herkkyyden Ryhmä I. ryhmä II 7/9 (

UBE2V2

,

CRYM

,

FADD

,

CEP55

,

PLAC8

,

TTK

ja

FOS) B osoitti suurta herkkyyttä (0,67: 1) havaitsemisessa hoidon epäonnistuminen. Toinen markkereita osoitti alhainen herkkyys ja spesifisyys (S3 taulukko) molemmissa ryhmissä.

HPV positiivisuus oli hyvä prognosticator yleisessä kohortissa 37% (3/8) osoittaa hoidon epäonnistumiseen verrattuna 63% ( 7/11) in negatiivisilla potilailla. Kuitenkin yhdessä FADD, ainoa merkki, joka osoitti merkittävää yhteyttä HPV asema, FADD

korkea /HPV potilailla esiintyi suuri osa hoidon epäonnistumisen (60%, 6/10) verrattuna FADD

alhainen /HPV + potilasta (33%, 1/3).

näistä geeneistä, vain

ANO1

ja

FADD

osoittivat merkittävää yhteyttä yleiseen eloonjäämiseen (OS) ja taudista vapaan