Krooninen sairaus

tiivistelmä

konstitutiivisen aktivaation Wnt polku johtaa adenooma muodostumiseen, vaadittava askel kohti suoliston syöpä. Ottaen huomioon vakiintunut asema Wnt säätelyssä stemness, yritimme eristäminen syövän kantasoluja (CSCS) kohteesta

Apc

– ja

APC Twitter /

KRAS

-mutant suoliston kasvaimia. Kun taas CSCS ovat läsnä

APC Twitter /

KRAS

kasvaimia, ne näyttävät olevan hyvin harvinaisia ​​(alle 10

-6)

APC

-mutant adenoomia . Sen sijaan, Lin

-CD24

hiCD29

+ alipopulaatio adenokarsinoomasoluja näyttävät rikastettu CSCS kohonneeseen aktiivisen β-kateniinin. Expression profilointi analyysi CSC-rikastettu alaryhmän vahvistivat parannetun Wnt aktiivisuus ja paljasti lisäksi ero ilmentymisen muiden signalointireittien, kasvutekijää sitovat proteiinit, ja soluväliaineen komponentteja. Kuten odotettua, tunnusomaisen geenin Paneth solulinjan (esim defensiinien) ovat yhteistyössä ilmaistaan ​​yhdessä kantasolujen geenien (esim.

Lgr5

) puitteissa CSC-rikastettu alaryhmässä. Tämä on kiinnostava, koska se on merkki syövän kantasolujen kapealla roolia kasvain- Paneth kaltaisia ​​soluja, samankaltainen kuin niiden tehtävä tuettaessa Lgr5

+ kantasoluja normaalissa suoliston kryptassa. Kaiken kaikkiaan tuloksemme osoittavat, että onkogeenisiä

KRAS

aktivaatio

APC

ajettavat kasvaimia johtaa laajentamiseen CSCS osaston lisäämällä ®-kateniinin solunsisäisiä vakauttaminen.

Citation: Ghazvini M, Sonneveld P, Kremer A, Franken P, Sacchettin A, Atlasi Y, et ai. (2013) Cancer Stemness in

Apc

– vs.

APC Twitter /

KRAS

ajettavat Suoliston kasvaimien syntyyn. PLoS ONE 8 (9): e73872. doi: 10,1371 /journal.pone.0073872

Editor: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 24 heinäkuu 2013; Julkaistu: 17 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Ghazvini et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: rahoittajien ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Nämä tutkimukset tukivat avustuksia Alankomaiden Cancer Society (EMCR 2001-2482), Alankomaat tieteellisen tutkimuksen järjestön (NWO /Vici 016.036.636), The BSIK (Kennisinfrastructuur) ohjelma Alankomaiden hallituksen avustusta 03038 (www.stemcells. nl) ja Alankomaissa Institute for regeneratiivisen lääketieteen (NIRM; www.nirm.nl), ja EU FP6 ja FP7 yhteenliittymät Siirtyminen Cancer Stem Cells ohjelman (MCSCs, www.mcscs.eu) ja TuMIC (integroitu käsite tuumorimetastaasin (http : //itgmv1.fzk.de/www/tumic/tumic_main.htm).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

paksusuolensyöpä edustaa vielä ihannemalli tutkia molekyyli- ja solutason mekanismeja että taustalla kasvaimen puhkeaminen ja eteneminen kohti maligniteetin [1], ns adenooma-karsinooma-sekvenssin [2]. Kaiken kaikkiaan keskeytys- toiminto mutaatioita

APC

(adenomatoottisen polypoosin coli) tuumorisuppressorigeeniä tai onkogeenisten mutaatiot β-kateniinin (

CTNNB1

) johtavat konstitutiivisen aktivaation Wnt /β-kateniinin signalointi ja edustaa yleisintä nopeutta rajoittava (adenooma -forming) tapahtumien joukossa paksusuolen syöpäpotilailla. Adenooma kasvun ja etenemiseen liittyy usein muutokset

KRAS

tai

BRAF

, jonka jälkeen menetys

TP53

ja

Smad4

tuumorisuppressoreilla ajateltiin taustalla pahanlaatuisiin osaksi paikallisesti invasiivisia adenokarsinooma [1]. Kuitenkin tämä vakiintunut geneettinen evoluutio malli ei ota huomioon muita olennaisia ​​ominaisuuksia ihmisen paksusuolen syövissä, nimittäin niiden solujen heterogeenisuus (eri solulinjoja ovat usein läsnä ensisijainen massaa) ja oletetun roolin alapopulaatio tuumorisolujen syövän kantasolut (CSCS), ajo kasvaimen kasvua ja määritetään paikallinen invaasio ympäröiviin kudoksiin ja etäpesäkkeiden [3]. Itse asiassa, vaikka edellä geneettinen malli ennustaisi, että jokainen kasvainsolun sisällä paksusuolensyöpä väitetään vireille

APC

tai β-kateniinin mutaatio olisi aina kohdennetaan tunnusmerkki konstitutiivisen Wnt aktivaation eli ydinvoiman β- kateniinin kerääntyminen, tämä on havaittu vain pienessä osassa soluja yleensä sijaitsee invasiivisia edessä primäärivamma [4], josta ne irtoavat ja hyökätä ympäröivä strooman [5], [6]. Tämä ”β-kateniinin paradoksi” hienosti havainnollistaa intra-kasvain heterogeenisuus ja mahdollisesti kasvaimen stemness seurata aivan alkuvaiheessa adenooma-karsinooma-sekvenssin ja johtaa erilaisiin Wnt signaloinnin tasojen eri kasvainsolujen suvusta, joilla on sama (

APC

) mutaatiot [7]. Se osoittaa myös, että menetys

APC

toiminto (tai onkogeeninen β-kateniinin aktivointi) on oletettavasti tarpeen puhkeamista alkuperäisestä dysplastic vaurio mutta riittämätön täysin aktivoida Wnt signaalitransduktion ja edistää pahanlaatuisen muutoksen puuttuessa lisä- ympäristö- ja (epi) geneettiset tekijät.

Aiemmin käyttämällä

in vivo

mutageneesiä [8], [9] ja geenin kohdentaminen hiiren [10], [11], se oli osoittaneet, että menetys

APC

toiminto johtaa adenooma muodostumiseen ylemmässä maha-suolikanavan. Nämä hiiri adenoomia ei edisty maligniteetin eivätkä spontaanisti kerry geneettisiä osumia endogeenisen

Kras

ja

Tp53

geenejä [12]. Erityisesti kun taas onkogeenisiä

KRAS

aktivointi on yksinään pysty käynnistämään suolen kasvaimien syntyyn jos ei kovin myöhään puhkeaminen ja vasta kun somaattisten osumia klo

Tp53

geeni [13], yhdiste

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G hiiret ominaista 10-kertainen kasvainten lukumäärää ja nopeutunut kasvaimen etenemistä verrattuna

APC

1638N /+ littermates, jossa valtaosa tuumorivaurioon esittäessä adenokarsinoomat [14]. Edelleen analyysit paljastivat, että

APC

ja

KRAS

mutaatiot ovat synergistisiä edistämisessä β-kateniinin tumaansiirtymiseen, mikä parantaa kanoninen Wnt signaalitransduktion [14]. Jälkimmäinen on todennäköisesti aiheutuu kykyä aktivoitua KRAS kautta alavirtaan ja vielä tuntemattomia kinaasien, aiheuttaa β-kateniinin tyrosiinifosforylaation mikä johtaa huomattavaan kasvattamiseen sen sytoplasmaattinen altaan ja sen myöhempi translokaation tumaan, jossa se toimii transkription aktivaattori useita Wnt alavirran kohdegeenien. Niinpä suolen kasvainten

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G hiiret osoittavat merkittävää lisäystä solujen ydin- kertymistä β-kateniinin verrattuna

APC

1638N /+ eläimet [14].

viime vuosina CSCS on onnistuneesti puhdistettiin ihmisen paksusuolen syövissä käyttämällä erilaisia ​​solun pinnan markkereita, kuten CD133 [15], [16] , EpCAM, CD44 ja CD166 [17], ja EphB2 [18]. Vaikka edellä solun pinnan antigeenejä on ollut keskeisessä tunnistamiseksi kasvaimen solualapopulaatioiden rikastettua kasvaimeen aloittamista ominaisuuksia, kun istutetaan immuuni-epäpätevä saajahiiret, ymmärrystämme olevien mekanismien suoliston syöpä stemness ja roolia CSCS vuonna eteneminen kohti maligniteetti on edelleen suurelta osin puutteellisia. Aiemmin Vermeulen, et al. osoittivat, että korkea Wnt aktiivisuus varataan CSCS kuluessa suspension pallojen johdettu koolontuumoreissa [19]. Tästä näkökulmasta useita muita kysymyksiä on käsiteltävä: on ydin- β-kateniinin kerääntyminen toimiva markkeri suoliston CSCS

in vivo

? Ovatko kasvainsolujen kara kaltaisia ​​ominaisuuksia jo alussa, hyvänlaatuinen vaurioita kuten adenoomia? Täällä me käytti

APC

1638N /+ ja

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G hiiri malleja suolen tumorigeneesin että prospektiivisesti tunnistaa alaryhmien kasvain kantasolujen kaltaisia ​​soluja ja kuvata niitä osalta niiden multipotenttisuus, itseuudistumisen, genominlaajuisten ilmaisun profiilin, ja Wnt /β-kateniinin signalointi aktiivisuutta.

tulokset

Kasvaimen aloittamista solut ovat läsnä

APC

1638N /+ /KRAS

V12G

mutta ovat hyvin harvinaisia ​​

APC

1638N /+

Suoliston Kasvaimet

APC

1638N /+ hiirimallissa kehittyy keskimäärin 4-5 hyvänlaatuisia ylemmän GI (adenoomia) C57BL /6J geneettinen tausta [10], [11]. Nämä vauriot vain harvoin (ja myöhään alkanut) kehittyä adenokarsinooman kuten myös osoittaa puute spontaani somaattisista mutaatioista esiintyvät

Kras

ja

Tp53

geenejä [12]. Arvioida läsnä kasvaimen aloittamista solujen

APC

1638N /+ adenoomia, eli soluja, jotka kykenevät pääpiirteittäin ensisijainen vaurio, kun istutetaan vastaanottavan eläimen suoliston kasvaimet kerättiin

Apc

1638N /+ eläimet ja liukenevat sekä mekaanisesti ja entsymaattisesti yksisolususpensioi- ja köyhdytettyä endoteliaalisesta ja hematopoieettisten solujen (Lin

+) fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelu (FACS). Seuraavaksi eri multiplicities tuloksena Lin

– populaatio bulk kasvainsolujen istutettiin ihonalaisesti NOD-SCID eläimiä. Kuten taulukossa 1 on esitetty, ei kasvaimen kasvu havaittiin jopa injektoimalla jopa 0,5-1,0 * 10

6 Lin

– soluja ja 6 kuukautta transplantaation jälkeen.

Seuraavaksi toistimme elinsiirron määrityksessä irtotavaran Lin

– syöpäsolujen

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G suoliston kasvaimet. Kuten aiemmin on raportoitu, että suurin osa suolen kasvainten löytyy näitä yhdiste eläimillä samalla sisäsiittoinen C57B6 /J geneettinen tausta paikallisesti invasiivisia adenokarsinoomat [14]. Jyrkässä ristiriidassa Lin

– soluja

APC

1638N /+ adenoomia, kasvaimen kasvua havaittiin 23 ulos 33 injektiota 10

5

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G Lin

– soluja ja, joskin harvemmin (3 out of 48 transplantations), vaikka niin alhainen kuin 1500 solut (taulukko 1). Rajoittavan laimennuksen analyysi (L-Calc ™) taajuus kasvaimeen aloittamista solujen Lin

– väestön

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G suoliston kasvaimet arvioitiin 1 72838 (95%: n luottamusväli 109467-48465). Mitä

APC

1638N /+ adenoomia, kasvaimeen aloittamista solut ovat todennäköisesti läsnä, jos ollenkaan, on huomattavasti alemmilla taajuuksilla ( 10

-6). Näin ollen, kun läsnä on kasvaimen aloittamisesta solut, jotka on määritelty elinsiirron määrityksiä, näyttää rajoittuvan kasvainten

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G hiiret verrattuna niillä,

APC

1638N /+ hiirimallissa.

Lin-CD24

hiCD29

+ alaryhmästä peräisin

APC

1638N /+ /KRAS

V12G

Suoliston kasvaimet Encompass kasvainten aloittamista ja uudistuva CSCS

jotta prospektiivisesti rikastuttaa ja lopulta eristää kasvaimen aloittamista solujen suurin Lin

– väestö

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G kasvaimet, me testattiin ensin paneelin aiemmin vahvistettu (syöpä) kantasolujen markkereita kuten CD24, CD29 (β1-integriinin), CD44, CD97, ja L1CAM jonka FACSorting ja myöhempää uudelleen istutusta NOD-SCID-hiirissä. Toisin kuin CD44, L1CAM, ja CD97 (taulukko S1), transplantaatio Lin

-CD24

+ CD29

+ solut paljastivat lievää mutta merkittävällä rikastumista kasvaimia aloittamista soluja (arvioitu taajuus 1 56463 , jossa CI 399211-7986) (taulukko 2). Koska Lin

-CD24

+ CD29

+ väestö edustaa suhteellisen suuren osan suurin solujen (-80%; tuloksia ei ole esitetty), me sitten määritellään lisäksi kolme ylimääräistä FACS porttia perustuu suhteelliseen ilmentymä CD24 solun pinta-antigeeni (CD24

hi, CD24

med, ja CD24

matala) (kuva 1a). Out of 30 ensisijaisen

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G kasvaimet analysoitiin FACS: llä, keskikoko (ilmaistuna prosentteina suurin Lin

– jae ) kunkin CD24 /CD29 lajiteltu subpopulaatio määritettiin: CD24

-CD29

– 3,4% (SD 2,6); CD24

-CD29

+, 7,8% (SD 4,7); CD24

+ CD29

-, 4,4% (SD 3,4); CD24

loCD29

+ (P1), 7,9% (SD 2,5); CD24

medCD29

+ (P2), 52,9% (SD 7,4); CD24

hiCD29

+ (P3), 10,0% (SD 4,7). Huomaa, että nämä prosenttiosuudet eivät lisää 100% yksinkertaisesti siksi, että tahallinen poissulkeminen solujen sijaitsee erottamiset lajittelun porttien (katso kuva 1a).

a. Suuri paneeli: pistekuvaajan edustaja värjäyskuvion saatu värjäämällä anti-CD24 APC-konjugoidun anti-CD29 PE-konjugoiduilla vasta-aineilla. Lineage positiivisia soluja (Lin

+) jätettiin (aidatulla out) värjäämällä biotinyloidulla vasta-aineiden linjaa markkereita ja streptavidiini-PerCPCy5.5. P1 (Lin

-CD24

lowCD29

+), P2 (Lin

-CD24

medCD29

+) ja P3 (Lin

-CD24

hiCD29

+) populaatiot ilmoitetaan juoni. Pieni paneelit: pistekuvioita edustaja värjättyjen solujen isotyyppisiä ohjaus vasta-aineita (vasemmalla), kompensointiohjaus värjätä ainoastaan ​​anti CD24-APC vasta-aineita (keskellä), kompensointiohjaus värjätä ainoastaan ​​anti CD29-PE-vasta-aineita (oikealla). b. FACS-analyysi CD24 /CD29 mallia kasvainten saatu sarjasiirteillä P3 solujen suspensioiden välillä

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G suoliston kasvaimet. Vasen: ensisijainen elinsiirrot. Oikea: toissijainen elinsiirrot. c. Immunohistokemia analyysi kasvainten saatu 3 kierrosta sarjasiirteillä P3 solujen suspensioiden välillä

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G suoliston kasvaimet.

taajuus kasvaimen aloittamista solujen P1, P2 ja P3 -alapopulaatioiksi määritettiin siirtämällä 1500 solua kutakin osaksi NOD-SCID-hiirissä. Erityisesti, kun taas tämä moninaisuus CD24

medCD29

+ ja CD24

loCD29

+ solujen johdonmukaisesti jättänyt muodostaa kasvaimia (vain 1 kasvua pois 56 transplantations), Lin

-CD24

hiCD29

+ alaryhmästä havaittiin käsittävän merkittävää rikastumista tuumorigeenisiä soluja (13/28; taulukko 2). Siten vaikka tässä tapauksessa emme voi tehdä rajoittavan laimennuksen analyysi L-Calc ™ (koska kiinteä useita soluja käytettiin) Lin

-CD24

hiCD29

+ kasvain subpopulaatio näyttää ominaista merkittävä suhteellinen rikastuminen n. 20-25-kertainen verrattuna yhteensä Lin

– bulk soluja (1 CSC ulos ~3000 kasvainsolujen vs. 1 72838).

määritelmä syövän kantasoluja ei voida pelkästään perustuu niiden kykyyn muodostaa kasvaimia, kun istutetut alhaisilla kirjoa immuuni-epäpätevä hiirillä. Yhtä tärkeitä ominaisuuksia CSCS ovat niiden ainutlaatuinen kyky itse uudistaa ja erilaistuvat polttoaineen ja kerrata heterogeeninen koostumus primaarikasvaimen ne on johdettu. Sen määrittämiseksi, onko kasvaimen aloittamista solujen sisältyvät Lin

-CD24

hiCD29

+ väestöstä kykenevät myös itsensä uudistamisen ja erilaistuminen, suoritimme sarja transplantations kokeiluja. Ensinnäkin, 1500 Lin

-CD24

hiCD29

+ solut eristettiin

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G ensisijainen suoliston kasvaimet ja istuttaa NOD-SCID saajahiiret. Kuten odotettiinkin aikaisemmista tuloksista, tämä alustava määritys aiheutti ihonalainen kasvaimia 8-10 viikkoa. Syntyneet kasvaimet sitten leikattiin vastaanottaja NOD-SCID-eläimiä ja käytetään sekä FACS ja histologista analyysiä varten. Kuten FACS, kasvaimia hajotettiin yksisolususpensioi- ja analysoidaan, lajitellaan ja istuttaa niiden CD24 ja CD29 ekspressiotasoja. Sekundaarikasvaimia peräisin Lin

-CD24

hiCD29

+ solujen täysin kertasi CD24 /CD29 FACS ilmentymisen profiilia ensisijaisen vaurioita (kuva 1b ja kuvio S2). Samoin, kun transplantaation 1500 soluja kustakin Lin

-CD24CD29 väestön saatu sekundaarikasvaimia, vain Lin

-CD24

hiCD29

+ solut, jotka kykenevät muodostamaan tertiäärisen kasvaimia. Näin ollen FACS profiili tertiäärisen kasvainten esitetään yhteenveto, että ensisijaisen leesioita (kuvio 1 b). Erityisesti immunohistokemia (IHC) ja entsymaattiset värjäys paljasti asteittainen kasvu suhteellisen läsnä suolen erilaistumisen suvusta, nimittäin pikari (Periodic Acid Schiffin, PAS), Paneth (lysotsyymi) ja suolistossa hormonitoimintaa (synaptofysiinin) solujen siirrettyjen suoliston kasvaimet verrattuna ensisijaisen

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G vaurioita (kuva 1c). Kuitenkin, FACS-analyysi sarjamuotoisesti siirrettyjen kasvainten osoitti, että suhteellinen koko yksittäisten CD24 /CD29 alapopulaatioita ei merkittävästi muuttunut (kuvio S3).

Siten Lin

-CD24

hiCD29

+ alipopulaatio syöpäsolujen

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G adenokarsinooman käsittämään

bona fide

CSCS kanssa kasvaimeen aloittamista, self -renewing ja erilaistumista valmiuksia.

Lin-CD24

hiCD29

+ Solut

APC

1638N /+ /KRAS

V12G

Suoliston kasvaimet Näytä Lisääntynyt Solunsisäinen β kateniinin arvosanojen

aiemmin ehdottanut, että vähemmistö koolonkarsinoomasoluissa jossa ydin- β-kateniinin kerääntyminen ja ei-satunnaisesti jakautuneet leviämisrintamassa edustavat CSCS [7]. Erityisesti molemmat

APC

1638N /+ adenoomien ja

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G karsinoomat samaa ”β- kateniinin paradoksi ”havaittu ihmisen paksusuolen syöpiä, että kun IHC analyysi, vain pieni osa kasvainsolujen näyttää ydin- β-kateniinin kerääntyminen huolimatta, että suurin osa, ellei kaikki, jaa kahden osumia on

APC

lokus [12], [14] (kuvio 2a). Sen arvioimiseksi, onko CSCS rikastunut Lin

-CD24

hiCD29

+ kasvain alaryhmästä on ominaista lisääntynyt taso solunsisäisten β-kateniinin, analysoimme proteiinin ilmentymistä eri FACSorted kasvain solualapopulaatioiden kahden riippumattoman määritykset, nimittäin immunovärjäyksessä ja western blot-analyysi. Immuno-värjäys osoitti, että suurin osa Lin

-CD24

hiCD29

+ suoliston kasvainsoluja on ominaista solunsisäisten kertyminen β-kateniinin verrattuna muihin lajiteltujen populaatioiden ja suurin osa (Lin

-) tuumorisoluja (kuvio 2b). Tämä tulos vahvistettiin myös entistä määrällinen muoti Western-analyysi suoritettiin vasta-aineilla, jotka ovat spesifisiä signalointi-toimivaltaisen jae (eli defosforyloitiin tähteiden Ser37 ja Thr41) ja β-kateniinin proteiinin (kuva 2c ja Kuva S4).

immunohistokemiallista (a., b.) ja western blot (c.) analyysi β-kateniinin ensisijainen

APC

1638N /+ suoliston adenoomien (a.) ja FACSorted kasvainpopulaatiot alkaen

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G suoliston kasvaimet (b. ja c.). Palkit C. edustaa kvantifiointi bändejä saatu anti-aktiivisen β-kateniinin Ab (anti-ABC; klooni 8E7, # 05-665, Millipore) skannaamalla ja analysoimalla western blot kanssa Odyssey skanneri ja sen jälkeen normalisoinnin β-aktiini.

Kaiken kaikkiaan nämä tiedot vahvistavat, että Lin

-CD24

hiCD29

+ alaryhmästä peräisin

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G kasvaimia, tässä osoitettu olevan rikastettu CSCS, kattaa huomattavasti korkeammat solunsisäisten ja signalointi-toimivaltaiselle β-kateniinin verrattuna irtotavarana Lin

– ja muissa elimissä solualipopulaatioissa. Lisääntynyt Wnt signalointia aktiivisuus CSCS vahvistettiin myöhemmin ilmaisun profilointi ja Taqman qPCR analyysi Wnt alavirran kohdegeenien (esim

Lgr5

,

Axin2

,

T

, ja

Lef1

; katso tässä alla).

Expression allekirjoitus CSCS alkaen

APC

1638N /+ /KRA

SV12G

Suoliston kasvaimet on eroaa eriytettyä ja Bulk Syöpäsolut ja sisältää sekä Stem ja Paneth Solumerkkiaineet

tunnistaa molekyylien väliset erot varsi kaltaiset ja eriytetympää (bulk) syöpäsolujen

APC

1638N /+ ja

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G suoliston kasvaimet, me eristetty kokonais-RNA: 10

4 Lin

-CD24

hiCD29

+ (P3), Lin

-CD24

medCD29

+ /Lin

-CD24

loCD29

+ (P1 + P2, sulautunut portti) ja Lin

– ( bulk) syöpäsolujen 5 yksittäisistä hiiristä kunkin genotyypin (

APC

1638N /+ ja

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G). Kokonais-RNA-näytteet käytettiin sitten hybridisoitumaan oligonukleotidigeenisirumenetelmää (Affymetrix Mouse Genome 430A 2,0 Array) tavanomaisten käytäntöjen mukaisesti.

Ensinnäkin eri kasvainsolupopulaatioissa eristetty hiiristä eri genotyyppien (

Apc

1638N /+ ja

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G) verrattiin ANOVA (3 tapaa), jossa on FDR (väärä löytö rate) setti 0.05 selektoimiseksi geenien ≥2-kertainen ero ilme. On huomattava, että P3 (CSCS molemmista genotyyppien) vs. Lin

– (bulk; molemmat genotyypit) ja P3 vs. P1 + P2 vertailut huomattavia eroja ja määritelmässä kaksi luetteloa differentiaalisesti ilmaisi koetinsarjojen (n = 1062 [851 ei-tarpeeton, selityksin geenit] ja 746 [602 ei-tarpeeton, selityksin geenit], tässä järjestyksessä, taulukot S3 ja S4). Tällä tavoin voimme tunnistaa lista 587 differentiaalisesti ilmaisi koetin settejä risteyksessä Lin- vs. P3 ja P1 + P2 vs. P3. Tunnistetut koetinsarjojen vastaavat 482 geenejä (ei-tarpeeton) (taulukko S5).

ekspressioprofiileja saatu CSC-rikastettu alapopulaatiot (Lin

-CD24

hiCD29

+) molempien genotyyppien (

APC

1638N /+ ja

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G) eroavat eriytetympää (Lin

-CD24

medCD29

+ /CD24

loCD29

+) ja Lin

– bulk osapopulaatioiden selvästi näkyvissä hierarkkinen klusterointi (HCA) ja pääasiallinen komponentti ( PCA) analyysi (kuva 3).

(a.) Hierarkkinen klusterointi ja (b.) Principal Components Analysis (PCA) (molemmat toteutettu Partek) Lin

-CD24

hiCD29

+ (P3), Lin

-CD24

medCD29

+ /Lin

-CD24

loCD29

+ (P1 + P2, sulautunut portti) ja Lin

– ( bulk) syöpäsolujen 5 yksittäisistä hiiristä kunkin genotyypin (

APC

1638N /+ ja

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G). Paremman visualisointia yksittäisiä värejä käytettiin kussakin ryhmässä ja b. ellipsoideille vedettiin noin kolme kasvainpopulaatiot.

On huomattava, että

Apc

– ja

APC Twitter /

KRAS

-mutant genotyypit eivät ole ratkaista HCA ja PCA, mahdollisesti johtuen suhteellisen rajallinen määrä

APC

1638N /+ ja

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G kasvain näytteet (n = 5 kussakin ryhmässä) käytetään vertailevan ilmaisun profilointi analyysi, riittämätön korostamaan väitetysti hienovaraisempaa eroja hyvän- ja pahanlaatuisten CSCS.

Seuraavaksi edellä luetteloista differentiaalisesti ilmaisi koettimia välillä P3 ja muiden kasvainsolupopulaatioissa me validoitu ilmaus yhteensä 35 geenien kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä (taulukko S2). Valinta validoitu geenien sisältää lisäksi ylhäältä ylä- ja alas geenien, myös muita jäseniä kanoninen Wnt signaalinvälitysreitin, ja geenit, joiden tiedetään pelata asiaa roolista syövässä. Kaiken kaikkiaan valtaosa valittujen geenien (33/35) on validoitu niiden ero ilmentyminen qPCR (kuva S1).

Gene ontologia analyysi [20] risteyksessä allekirjoituksen ilmenee melko laaja cellular toiminnot, rakenteiden ja prosessien joukossa ylös geenien kuten soluväliaineen, soluadheesiota, urut kehittäminen ja morfogeneesiin (taulukko S6). Erityisesti analyysi geenien differentiaalisesti ilmaistut CD24

hiCD29

+ soluja

APC

1638N /+ ja

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G kasvaimia verrattuna irtotavarana ja eriytetympää kasvainsoluja, paljasti useita biologisia prosesseja todennäköisesti pelata toiminnallisten roolien syövän stemness. Ensinnäkin, kuten myös osoittaneet kertymiseen solun aktiivisen β-kateniinin, useita tavoitteita ja jäsenten Wnt signalointiryöpyn ilmentyvät eri P3 allekirjoitus lukien

Lgr5

,

Mmp2

ja

MMP7

,

Dkk2

,

Pla2g2a

,

Prox1

,

Sox17

,

T

(brachyury),

Wif1

, ja

Fzd5

. Läsnäolo

Lgr5

keskuudessa voimistunut geenit on kiinnostava, koska se osoittaa, että tämä tunnettu markkeri normaalien pyöräily kantasolujen hiiren suolistoon [21] voisi myös edustaa hyödyllinen CSC markkeri hiiren suoliston kasvaimet äskettäin osoituksena linjaa jäljitys [22]. Myös transkriptiotekijä

Prox1

, suora ja annoksesta riippuvaa tavoite Wnt /β-kateniinin signalointireitin, säädeltiin voimakkaammaksi P3 väestöstä.

Prox1

aiemmin osoitettu edistävän dysplasiaa koolonin adenoomien ja peräsuolen syövän etenemisen [23]. Emme kuitenkaan löytäneet mitään merkittäviä eroja

Prox1

ekspressiotasot välillä

APC

1638N /+ ja

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G kasvainsoluja sekä alkuperäisessä microarray data ja päälle qPCR validointi (kuva S1). Tämä havainto heijastaa hieman yleisempi puute merkittäviä eroja P3 populaatiot

APC

1638N /+ ja

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G kasvaimia, kuten myös on esitetty hierarkkinen klusterointi ja PCA-analyysi (kuvio 3a ja b, vastaavasti). Edellisessä tutkimuksessa [14], ilmentyminen profilointi irtotavarana kasvainten

APC

1638N /+ ja

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G hiiret eivät myöskään ratkaise kaksi genotyypit. Itse asiassa vain suhteellisen määrän kasvainsolujen ydin- β-kateniinin voisi merkittävästi eroa

APC

1638N /+ iältään

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G suoliston kasvaimia [14].

lisäksi Wnt, lisäsignalointia reitit esittää differentiaalisesti geenien, kuten on esitetty ero ilmentyminen

Bmp7

ja

Bmper

(BMP signalointi),

Fgfbp1

,

Fgfrl1

, ja

Etv5

(fibroblastikasvutekijä reseptoreita, sitovat proteiinit ja transkriptiotekijät), ja

IGF1-

,

IGFBP1

,

Igfbp5

, ja

Igfbp7

(insuliinin kaltainen kasvutekijöiden ja sitovat proteiinit).

Kaiken nämä tulokset osoittavat, että CSCS iältään

Apc

– ja

APC Twitter /

KRAS

-mutant kasvaimet ovat erillisiä ekspressioprofiileja muista kasvainsolupopulaatioissa ja on ominaista lisääntynyt Wnt signalointi aktiivisuutta yhteisymmärryksessä tehostetusta solunsisäiset β-kateniinin, yhdessä muiden signalointi pathays (BMP, IGF), ja että ne ilmentävät Paneth cell-geenit.

keskustelu

mutaatiot

APC

tuumorisuppressorigeeniä edustavat tärkeimmät aloite- ja nopeutta rajoittavaa tapahtuma adenooma-karsinooma järjestyksessä johtaa paksusuolen syövän man [1]. Menetys

APC

toiminto johtaa konstitutiivisen aktivoitumisen kanoninen Wnt /β-kateniinin signalointireitin tiedetään olevan ratkaiseva rooli säätelyssä itseuudistumisen ja erilaistuminen laajan kirjon kudosspesifisiä kantasolujen markkinaraon mukaan lukien suoliston crypt ja näin ollen puhkeamisen monien syöpätyyppien [24]. Konstitutiivinen Wnt signalointia aktivaatio suoliepiteeliin laukaisee adenooma muodostumista ja on välttämätön, vaikkakin riittämätön, askel pahanlaatuisiin. Somaattiset mutaatiot

KRAS

,

BRAF

,

TP53

, ja

Smad4

yleensä taustalla edelleen etenemistä hyvänlaatuinen kasvain osaksi paikallisesti invasiivisia adenokarsinooma ja etäpesäkkeiden kaukaisiin elinkohdissa [1]. Mutaatiot hiiren endogeenisen

APC

geeni aiheuttaa myös suoliston polyyppien muodostumista, vaikka pääasiassa yläkulmassa ruoansulatuskanavasta. Erityisesti mouse

APC

ajettavat suoliston adenoomia eivät spontaanisti kerry

Kras

tai

Tp53

somaattiset mutaatiot ja näin ollen hyvin harvoin edetä adenokarsinooman [12].

meidän laboratoriossa, olemme tuottaneet

APC

1638N /+ hiirimallissa koodaa hypomorphic

APC

mutaation tuloksena muutama (5-6) ylempi GI adenoomia , pidempi selviytymisen, ja lisääntynyt mahdollisuus spontaani pahanlaatuisen muutoksen tosin vain eläimillä yli 1-vuotiailla [10], [11], [12]. Sen sijaan yhdiste heterotsygoottinen

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G hiiret ominaista lisääntynyt kasvainten lukumäärää (~ 10-kertainen) ja nopeutetun pahanlaatuinen etenemisen kanssa enemmistön vauriot ovat paikallisesti invasiivisia adenokarsinooman [14]. Erityisesti onkogeenisia aktivointi

KRAS Twitter /

Kras

omasta ei riitä käynnistämään suoliston kasvaimien syntyyn [25], ellei myöhään alkanut ja kun somaattisten inaktivoitumisen

Tp53

geeni [13]. Siten dramaattinen fenotyyppiset erot tuomat onkogeeninen aktivoituminen

KRAS

geenin yhdiste

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G hiirten tulokset sen synergistinen vaikutus edistää kanoninen Wnt signalointia, mikä näkyy lisääntyminen TOP-Flash toimittaja toimintaan ja tuumorisolujen lukumäärän varaamat ydin- β-kateniinin kerääntyminen [14].

havaittu suhteellinen kasvu määrä

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G kasvainsoluja varaamat ydin- β-kateniinin on tärkeää, kun otetaan huomioon niin sanottu ”β-kateniinin paradoksi ”[7]: siitä huolimatta, että menetys

APC

toiminto on yhteinen kaikille kasvainsoluihin ja ennustetaan johtavan solunsisäiseen ja ydinvoiman kertymistä β-kateniinin, tämä on havaittu vain muutamissa syöpäsolut, joille epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) ja ei-satunnaisesti jaettu leviämisrintamassa kasvaimen massa [4], [5] (katso myös kuvio. 2a). Tämä havainto johti hypoteesiin, jonka mukaan ydinaseiden β-kateniinin varataan varsi kaltaisten suoliston kasvainsolujen korkeampi Wnt signalointia toimintaan, joka irrottautumalla ensisijaisen massan ja tehokkaasti levittää ja kotiin distaalinen, elintärkeissä elimissä [6], [19], [26].

Tässä yritimme mahdollinen puhdistus syövän kantasoluja (CSCS) kohteesta

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G suoliston kasvaimia. Erityisesti, kun läsnä on kasvaimen aloittamista soluja, ei ole voitu osoittaa

APC

1638N /+ kasvaimia. Mukaan operatiivisen CSC määritelmän mukaisia ​​eli niiden kyky muodostaa kasvaimia, kun rajoittavan laimennuksen siirrettäväksi saajahiiret,

bona fide

CSCS joko puuttuvat tai erittäin harvinaisia ​​( 10

-6) in suoliston haavaumat ominaisuus

APC

1638N /+ hiirillä. Sen sijaan pahanlaatuisiin ja nopeutettu adenooma-karsinooma sekvenssin tuomat gut-erityinen ilmaisu onkogeenisten

KRAS

tulos perustamista alapopulaatio kasvaimen aloittamista soluja (arvioitu 1 n. 7 × 10

4 bulk kasvainsoluja).

a. b.