Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA (miRNA) on keskeinen rooli monissa biologisissa prosesseissa, ja niitä poikkeavasti ilmaistu ihmisen syövissä. Erityistä miRNA toiminto joko tuumorisuppressoreilla tai onkogeenien ja näyttää olevan ja ennustavia merkitys. Vaikka lukuisia miRNA ovat dys-säädellään peräsuolen syöpä (CRC) vain pieni osa on ollut ominaista toiminnallisesti. Käyttämällä korkean suoritustehon toiminnallinen seulontaan ja miRNA profilointi kliinisten näytteiden Tämän tutkimuksen tavoitteena on tunnistaa miRNA tärkeitä valvontaan solujen kasvun ja /tai apoptoosin CRC. Suurikapasiteettisten toiminnallinen seulonta toteutettiin kuudessa CRC jotka transfek- ennalta miR kirjasto sisältäen 319 synteettinen ihmisen pre-Mirs. Fenotyyppiset muutokset arvioitiin immunovärjäyksen pilkkoa cPARP (apoptoosin) tai MKI67 (lisääntymistä). Lisäksi TaqMan Human MicroRNA Array Aseta v2.0 käytettiin profiloida ilmentymistä 667 miRNA 14 normaalissa paksusuolen limakalvolla 46 mikrosatelliittimerkkien vakaa vaihe II CRC potilaille. Niistä miRNA joka indusoi kasvun pysähtymisen ja apoptoosin CRC solulinjoissa, ja samanaikaisesti oli dys-säännellä kliiniset näytteet, miR-375 valittiin lisäanalyysiä varten. Itsenäinen

in vitro

analyysin ohimenevä ja vakaa transfektoidut CRC solulinjoja vahvisti, että miR-375 vähentää solujen elinkykyä indusoimalla apoptoottista kuolemaa. Tunnistimme YAP1 suorana miR-375 tavoite CRC ja osoittavat, että HELLS ja NOLC1 ovat alavirtaan tavoitteita. Knock-down of YAP1 jäljitteli fenotyyppi aiheuttama miR-375 yliekspressio osoittaa, että miR-375 todennäköisimmin kykenee sen proapoptoottisten rooli kautta YAP1 ja sen anti-apoptoottiset alavirtaan tavoitteet BIRC5 ja BCL2L1. Lopuksi,

in vivo

analyysi hiiren ksenograftikasvaimissa osoitti, että miR-375 ilmentyminen vähenee merkittävästi kasvaimen kasvua. Voimme päätellä, että high-throughput seulonta tunnisti menestyksellisesti miRNA, jotka indusoivat apoptoosin ja /tai inhiboivat CRC-soluissa. Lopuksi yhdistämällä toiminnallinen seulonnan profilointia CRC kudosnäytteiden tunnistimme kliinisesti merkittäviä miRNA ja miRNA tavoitteet CRC.

Citation: Christensen LL, Holm A, Rantala J, Kallioniemi O, Rasmussen MH, Ostenfeld MS, et al. (2014) Toiminnallinen Seulonta Osoittaa miRNA vaikuttaminen Apoptosis ja leviämisen peräsuolen syövän. PLoS ONE 9 (6): e96767. doi: 10,1371 /journal.pone.0096767

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 24 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 11 huhtikuu 2014; Julkaistu: 03 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Christensen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Tanskan kansallisen Advanced Technology Foundation, John ja Birthe Meyer Foundation, Tanskan neuvoston riippumattomia Research (Medical Sciences), Tanskan neuvosto Strategic Research, Lundbeckin Foundation ja Euroopan unionin seitsemännestä (SYSCOL TERVEYS-F5 -2010-258236). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yleinen pahanlaatuinen sairaus ja johtava syy syövän kuolleisuus kaikkialla maailmassa. Käyttöikä riski on noin 5% ja nousevan [1]. CRC johtuu kertyminen lukuisia geneettisiä ja epigeneettiset muutokset. Kromosominen epävakaus johtavat alleelisille epätasapainon osuus 70-85%: n kasvaimia taas 20-15%: lla on DNA mismatch korjaus, jotka johtavat microsatellite epävakautta. Molekyyli muutoksia CRC on tutkittu intensiivisesti, jotta löytää ja ennustavia markkereita. Muun muassa, mRNA: n ilmentymisen profilointi on laajalti käytetty tunnistamaan differentiaalisesti ilmentyvien geenien kanssa prognostisia ja diagnostisia vaikutuksia. Kuitenkin tällä hetkellä mikään näistä on käännetty kliiniseen käytäntöön ja näin ollen on edelleen tarvetta molekulaarinen ja luokittelu CRC.

MikroRNA (miRNA) käsittävät runsas luokan pieniä (19-24 nt), ei-koodaavan sääntelyyn RNA-molekyylien [2]. Niillä on keskeinen rooli valvonnassa geenin ilmentymisen transkription jälkeisellä tasolla täydentävä sitoutumisen miRNA säikeen mRNA kohdesekvenssin, joka johtaa joko mRNA: n hajoamisen tai translaation estäminen [3]. Yli 60% kaikista proteiinia koodaavan geenit sisältävät konservoituneita miRNA sitoutumiskohdat ja ovat siten mahdollisia kohteita miRNA [4]. MiRNA on osoitettu liittyvän moniin biologisiin prosesseihin, kuten solujen lisääntyminen, apoptoosi, erilaistumista ja angiogeneesiä [5] – [7]. Tällä hetkellä, miRNA on osoitettu olevan tärkeä rooli monissa syöpien (katsaus Garzón et al. [8]). Rooli miRNA kehittämisessä CRC on tutkittu intensiivisesti. Vuonna 2006 Cummins ja työtoverit julkaisi ensimmäisen yksityiskohtaisen ja järjestelmällinen analyysi miRNA ilmaisun CRC, osoittaa ylös ja alas säätely erityisiä miRNA [9]. Sittemmin useat tutkimukset ovat vahvistaneet dys-sääntely miRNA CRC [10] – [15]. Kuitenkin tietomme toiminto yksittäisten miRNA rajoittuu melko pieni määrä miRNA. Toiminnallinen seulonta on käytetty tunnistamaan miRNA jotka olekaan yhteydessä tiettyyn fenotyypit (tarkastelleet Izumiya et al. [16]). CRC, toiminnalliset seulonta on käytetty muutamissa tapauksissa tunnistaa miRNA vaikuttavat solujen lisääntymisen ja kuoleman [17], [18]. Tutkimuksessa kuitenkin suoritetaan Nakano et al. toteutettiin yhdessä solulinjassa vain ja niiden löydökset eivät korreloi ilmaus miRNA kliinisissä CRC näytteistä. Lopuksi, toiminnalliset seulonta on tunnistettu kliinisesti merkittävää miRNA haiman ja kivesten itusolukasvaimet [19], [20].

tunnustettu ja ennustavia potentiaalia miRNA ja tarvitaan vielä järjestelmällistä toiminnallisia analyysejä miRNA CRC kannusti meitä yhdistää korkean suoritustehon toiminnallinen seulonnan miRNA ilme profilointi kliinisissä näytteissä. Kohdunulkoinen ilmentyminen 319 miRNA 6 eri CRC solulinjoissa yhdistettiin miRNA ilmentymisen profilointia 14 normaalin paksusuolen limakalvo ja 46 Kolorektaalituumorien. Nämä analyysit tunnistanut useita miRNA jotka osoitettiin ilmentyä erilailla CRC ja vaikuttaa soluproliferaatioon ja /tai apoptoosin

in vitro

. Joukossa miR-375 valittiin edelleen

in vitro

ja

in vivo

analyysejä, jotka vahvistivat, että miR-375 vähentää kasvaimen kasvua induktion apoptoottista kuolemaa. Tunnistaa mahdolliset miR-375 mRNA tavoitteet ilmentymistä miR-375 oli korreloi genominlaajuisten mRNA ilmaisun profiileja. Korrelaatio analyysi Molempien

in vitro

mallijärjestelmiin ja kliinisistä CRC näytteistä paljastui, että ilmentyminen Kyllä liittyvä proteiini 1 (YAP1) negatiivisesti korreloi miR-375. Ago2 immunosaostus osoitti, että YAP1 on suora miR-375 tavoite CRC. Lisäksi toiminnalliset tutkimukset osoittivat, että pro-apoptoottisen roolin miR-375 todennäköisimmin välittyy YAP1 ja sen antiapoptooppinen alavirtaan tavoitteet BIRC5 ja BCL2L. Lopuksi lymfoidispesifiset helikaasin (HELLS) ja nucleolar ja rulla-runko fosfori proteiini 1 (NOLC1) tunnistettiin alavirtaan tavoitteet miR-375 mahdollisesti pelissä rooli solusyklin säännellä polkuja.

Materiaalit ja menetelmät

täydellinen kuvaus materiaaleja ja menetelmiä on järjestetty oheismateriaali (Methods S1).

Ethics lausunto

käyttö ihmisen kudosnäytteiden tutkimuksen tarkoitukseen hyväksyttiin Research Board on Walter ja Eliza Hall Institute of Medical Research HREC (kohortti 1 AUS; HREC nro 12/19), eettisen toimikunnan yliopiston Pommerin (kohortti 1 POL, BN-001/174/05) , Keski-Jyllanti valiokuntaistunnot Biomedical Research Ethics (kohortti 1 DK, 1999/4678) ja Etelä-Jyllanti valiokuntaistunnot Biomedical Research Ethics (kohortti 2 DK, VF-20040047). Tietoon kirjallinen suostumus annettiin kaikki osallistujat. Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin Tanskan eläinkokeet tarkastuslaitos (tiedoston numero: 2013-15-2934-00861 /ACHOV) B

Kliiniset näytteet ja solulinjoissa

Kohortti 1 koostui yhteensä 46 tuore mikrosatelliitti vakaa (MSS), ensisijainen vaiheessa II (T2-4, N0, M0) CRC ja 14 normaalia paksusuolen limakalvoa. Riippumaton kohortti koostuu 25 normaalin paksusuolen limakalvo ja 63 MSS, ensisijainen vaiheessa I-IV (T2-4, N0-3, M0 /1) CRC (kohortti 2) käytettiin vahvistettavaksi. Potilaat ja näytteen ominaisuudet on koottu taulukkoon 1. Solulinjat, kasvuolosuhteet ja solulinjaa autentikointi löytyy täydentävän Material (menetelmät S1).

Eläimet

BALB /cAnNTac -nude immuuni hiirillä (6-8 viikkoa, 20-22 g) hankittiin Taconic Euroopassa (DK-4623 LI. Skensved, Tanska). Ennen kokeita, hiiret saatiin sopeutumisajan vähintään 14 päivää. Hiiriä pidettiin identtisissä olosuhteissa (vakio huoneenlämmössä (22 ° C) ja luonnollinen päivä /yö valosykli. Peruslaboratoriolaitteisto ruokaa ja vettä tarjotaan mielin määrin.

Mirna toiminnallinen kirjasto näytön

solun paikka microarray-tekniikkaa käytetään tuottamaan korkean tiheyden pre-miRNA transfektion mikrosiruja, kuten aikaisemmin on kuvattu vähäisin muutoksin [21]. Lyhyesti, kirjaston tilalla 319 synteettistä ihmisen pre-miRNA (Ambion pre-miR v1.0) (Ambion , Austin, TX, USA) käytettiin painamista paneelit. Tämän jälkeen CRC-solut (HCT116, LS174T TR4, DLD1 TR7, HT29, Caco2 ja SW480) ympättiin taulukot ja reverse transfektoidaan 48 tuntia. Jotta mikroskooppinen havaitseminen ennalta miRNA vaikutuksia vaikutetaan solujen lisääntymistä ja /tai apoptoosin taulukot immunovärjättiin Ki-67 (leviämisen markkeri) ja pilkotun poly ADP-riboosi-polymeraasi (cPARP) (apoptoosin merkki). DNA värjättiin 4 ’, 6 diamidino -2-fenyyli-(DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) tai SYTO60 (Invitrogen). Microarray analyysi suoritettiin mikroskooppinen kuvantaminen taulukoihin käyttäen scanR korkea pitoisuus lämpökamera (Olympus) ja vaikutus miRNA yli-ilmentymisen vaikutus apoptoosiin ja solujen lisääntymistä pidettiin aiemmin kuvattu [21]. Lyhyesti, normalisoinnin jälkeen z-arvoksi (z = (χ-μ) /σ) laskettiin pisteytyksen mitatun paikan arvoja. χ = normalisoitu paikalla tason arvon, μ = globaali array keskiarvo ja σ = keskihajonta (sd).

RNA ja miRNA eristys

kokonais-RNA ( 200 emästä) eristettiin solupelleteistä ja tuore kudosnäyte käyttäen RNeasy Mini Kit (Qiagen), mukaan valmistajan ohjeiden. Pieni RNA: t ( 200 emästä) otettiin talteen Läpivirtausfraktio käyttäen RNeasy Micro Kit yhdessä RNeasy MinElute spin pylväät (Qiagen) (kuvattu oheismateriaali (menetelmät S1)). Pieni RNA: t alkaen RNAlater säilynyt kudosnäytteet eristettiin suoraan käyttämällä RNeasy Micro Kit (Qiagen).

miRNA profilointi kliinisissä näytteissä

miRNA ilmentymisen profilointi tehtiin käyttäen varren silmukka RT qPCR pohjainen TaqMan Human MicroRNA Array Aseta v2.0 kuten valmistajan (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) [22]. NormFinder algoritmia käytettiin tunnistamaan mukaan viittaus geenejä [23].

miRNA ja mRNA RT-qPCR

Single putki TaqMan microRNA tai mRNA määritykset (Applied Biosystems) käytettiin määrittämään yksittäisiä kypsä miRNA tai mRNA: t (lisätietoja oheismateriaali (menetelmät S1)). Applied Biosystems TaqMan Pitoisuus ID: n ja käytetty aluke havaitsemiseksi mRNA viittaus geeni ubikitiinipromoottori C (UBC) on lueteltu taulukossa S1 File S1.

MTT-määritys

Solut ympättiin 96 -No levyt, kääntää transfektoidut ja inkuboitiin 72 tuntia ennalta Mirs tai siRNA. Solujen elinkelpoisuus /kasvu mitattiin käyttäen 3- [4,5-dimetyylitiatsol- 2-yyli] -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) (Roche Applied Science, Penzberg, Saksa) (kuvattu oheismateriaali (menetelmät S1)). Applied Biosystems ennalta miR ja

Äänenvaimennin

Valitse siRNA ID: n ja sarjoissa YAP1 siRNA: iden välillä GenePharma (Shanghai, Kiina) on lueteltu taulukossa S2 File S1.

LDH määritys

Solut ympättiin 96-kuoppalevyille ja takaisinmallinnuksella transfektoitiin 48 tai 72 tuntia ennalta MIRS tai siRNA: ita (taulukko S2 File S1) (lisätietoja löytyy oheismateriaali (menetelmät S1)). Tämän jälkeen solujen kuoleman (LDH-aktiivisuus) mitattiin käyttämällä Sytotoksisuus Detection Kit

PLUS (LDH) (Roche Applied Science).

kaspaasi 3/7 aktiivisuusanalyysiä

kaspaasi 3 /7-aktiivisuus määritystä käytettiin mittaamaan apoptoottisen kuoleman ja suoritettiin pääosin kuten aiemmin on kuvattu [24]. Lyhyesti, solut siirrostettiin 24-kuoppalevyille ja kääntää transfektoitiin ennalta MIRS tai siRNA: ssa 48 tunnin ajan (taulukko S2 File S1). Kaspaasi 3/7 estäjä (z-DEVD-fmk) (BioVision, San Francisco, CA, USA), lisättiin 6 tuntia transfektion jälkeen (lopullinen konsentraatio 25 uM). Kaspaasi 3/7 aktiivisuus solulysaateista mitattuna vapautumisen AFC (eksitaatio, 400 nm; emissio 489 nm) alustasta Ac-DEVD-AFC (Biomol, Plymouth Meeting, PA, USA), mitattiin käyttäen monilevylukija ; Multiscan MCC /340 (ThermoFisher Scientific).

Laser Capture Mikrodissektiomenetelmiä

Laser Capture Mikrodissektiomenetelmiä (LCM) suoritettiin kryoleikkeet saatuna syöpään ja viereisen normaalin paksusuolen limakalvo koepaloja (kuvattu yksityiskohtaisesti Täydentävä materiaali (menetelmät S1)). Epiteelisolujen vangittiin yksittäisiin caps kanssa Veritas 704 Mikrodissektiomenetelmiä Instrument (Applied Biosystems) käyttäen ultravioletti laserleikkaukseen ohjeiden mukaisesti valmistajan antamista.

MIR-375 metylaatiotasoilla CRC solulinjoissa ja kliinisistä näytteistä

bisulfiittimodifiointi muunnettua DNA: ta oli koko genomin monistettiin ja hybridisoitiin Infinium HumanMethylation450 BeadChips (Illumina, San Diego, CA) yli yön, kuten valmistaja on kuvannut. BeadChips skannattiin kanssa BeadXpress Reader väline (Illumina) ja tiedot analysoidaan Helmet Studio Metylointi Module Software (Illumina). Metylaatiotasoilla tarjottiin beta-arvojen, jonka beta-arvo 0 vastaa ei metylaatio, ja 1 vastaa täydellistä metylaatio. Tunnukset CpG sivustoja lähellä

MIR-375

olivat seuraavat CpG1; cg00215432, CpG2; cg00218620, CpG3; cg00705280, CpG4; cg02257674, CpG5; cg04348419, CpG6; cg06214770, CpG7; cg14358282, CpG8; cg21615583, CpG9; cg22306928, CpG10; cg01822124 ja CpG11; cg26394220.

ChIP analyysi

ChIP-analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [25]. Alukkeet, joita käytettiin monistamaan siru DNA-alueet ovat taulukossa S1 File S1.

Mahdollisten miR-375, jotka perustuvat mRNA profilointiin ja

in silico

kohde ennustus

mRNA profilointi miR-375 transfektoitujen HCT116-solut ja kliinisistä näytteistä on kuvattu oheismateriaali (menetelmät S1). Sijainti ja määrä miR-375 siemenen sekvenssit (eli komplementaarinen asentoon 2-8 ja miRNA) sisällä täyspitkän mRNA-sekvenssin kartoitettiin käyttäen sekvenssitiedot noudetaan TargetScan v5.2 ja Ensembl 62 tietokannoista [26], [27 ].

Ago2 immunosaostus

Scr ja miR-375 transfektoitujen solujen (~ 3,5 × 10

6) kaavittiin kulttuurin pulloja jäällä lempeä lyysipuskuria (20 mM TRIS, pH 7,5 , 10 mM NaCl, 0,5% NP-40, 2 mM EDTA, johon oli lisätty RNaasi-inhibiittoria RNaseOut (Invitrogen) ja Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail (Roche)) ja hypertonically hajotettiin lisäämällä NaCl-pitoisuus on 150 mM. Kun oli sentrifugoitu 4 ° C: ssa ja 19000 * g 10 minuuttia supernatantti otettiin talteen ja altistettiin immunosaostus (10% käytettiin tulo-ohjattu) inkuboimalla monoklonaalisen Ago2 vasta-ainetta (11A9) (Sigma-Aldrich) -bound Protein G-kytketyn magneettinen Dynabeads (Life Technologies) (15 mg 11A9 per 25 ml helmiä) valmistajan suositusta. Anti-FLAG-immunosaostus tehtiin rinnakkain negatiivisena kontrollina (vasta-aineen F1804, Sigma). Helmet pestiin 5 kertaa jääkylmällä pesupuskurilla (50 mM TRIS pH 7,5, 150 mM NaCl ja 0,05% NP-40). Kokonais-RNA panos, Ago2-IP ja FLAG-IP kompleksit puhdistettiin käyttäen QIAZol (Qiagen).

Ingenuity Pathway Analysis

Ingenuity Pathway Analysis (IPA) ohjelmisto (Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA) käytettiin perehtyä yleiseen biologiseen muutokset kohdunulkoinen ilmaus miR-375. Normalisoitu ja suodatetaan mRNA tietoja ladattu IPA. Käyttämällä Nerokkuus Pathways Knowledge Base (IPKB) kukin geeni erityisiin toimintoihin liittyviä, reittejä ja sairaudet sekä rikastus analyysi suoritettiin tutkii onko tiedot rikastettiin liittyviä geenejä tiettyä toimintoa. Fisherin testiä käytettiin arvioimaan merkitystä rikastusta

Proteiinin uutto ja Western blotting

Proteiinin uutto ja Western blotting-analyysi suoritettiin standardimenetelmien mukaisesti (lisätietoja oheismateriaali (menetelmät S1) ).

plasmidien varten lusiferaasireporttiterilla määritys

Valitut fragmentit 3’UTRs on HELLS (NM_018063) ja NOLC1 (NM_004741), joka sisältää oletetun miR-375 sitoutumiskohtien monistettiin normaalista ihmisen genomi-DNA: ta ja kloonattiin alavirtaan

Renilla

Luciferase geenin siCHECK-2-vektoriin (Promega, Fitchburg, WI, USA). Valitut konstruktioita mutatoitiin oletetun miRNA sitova alue käyttäen QuickChange Salama kohdennetun mutageneesin Kit (Agilent Technologies) mukaisesti tarjotaan protokollaa. Tiedot annetaan täydentävä Material (menetelmät S1) ja käytettyjen alukkeiden kloonaukseen ja kohdennettua mutageneesiä on kuvattu taulukossa S3 File S1.

lusiferaasireporttiterilla määritys

Transfektoituja HEK-293T-solut analysoitiin käyttäen Dual Glo Luciferase Assay System (Promega), kuten aiemmin on kuvattu [28] (yksityiskohdat on kuvattu täydentävä Materiaali (Methods S1)). Luminenssi havaittiin kanssa monilevylukija; Multiscan MCC /340 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Renilla

Lusiferaasiaktiivisuutta normalisoitiin

Firefly

Lusiferaasiaktiivisuutta kullekin transfektoitujen hyvin, korjata erot transfektioon ja sato tehokkuutta.

Generation ja luonnehdinta vakaa HCT116 solut indusoituva miR-375 ilmaisu

sukupolvi vakaa HCT116-solujen indusoituvan ilmentymisen miR-375 on kuvattu yksityiskohtaisesti oheismateriaali (menetelmät S1). Aluksi,

MIR-375

kloonattiin 3 ’UTR alue

turbo punaisen fluoresenssin proteiinin geenin

(tRFP) on pSBInducer10 vektorin (

MIR375

_pSBInducer10). PSBInducer10 konstruoitiin korvaamalla lentiviruksen elementit pINDUCER vektori [29] kanssa SleepingBeauty terminaalin käänteistoistoa. Vakaa HCT116_miR-375 ja HCT116_Scr solujen altaat muodostettiin seuraavasti. Ensinnäkin, 1,5 x 10

6 HCT116-solut transfektoitiin pCMV-SB100XCO (vektori transposaasi) ja joko

MIR375

_pSBInducer10 (HCT116_miR-375) tai

Scr

_pSBInducer10 (HCT116_scr). Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen puromysiiniä (lopullinen konsentraatio 1 ug /ml) (Sigma) lisättiin valita stabiilisti transfektoitujen solujen. Puromysiini valinta suoritettiin 5 päivää. Tämän jälkeen soluja käsiteltiin 50 ug /ml doksisykliiniä (DOX) (Sigma) 48 tuntia johtaa transkriptionaalisen aktivoinnin tRFP-

MIR375

kasetti. TRFP fluoresenssi markkeri on käytetty korvikkeena lajitella solujen populaatioita, jotka ekspressoivat korkean tason miR-375 induktion jälkeen DOX. Lyhyesti, solut, joilla on korkein tRFP tasolla (100-1 tuhat kertaa taustatason yläpuolelle käsittelemättömissä soluissa) (HCT116_miR-375h ja HCT116_ScrH) eristettiin fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) käyttäen 4-laser FACSAriaIII (BD Biosciences, San Jose, CA) ja käytetään kaikissa sen jälkeen analyysejä. Dox riippuvainen ilmentyminen kypsän miR-375 on HCT116_miR-375h soluihin analysoitiin RT-qPCR kuten aiemmin on selitetty. HCT116_miR-375h solut fenotyyppisesti ominaista käyttämällä xCELLigence (Roche Applied Science), kaspaasi 3/7 määritykset ja YAP1 Western blotting (yksityiskohdat oheismateriaali (menetelmät S1)).

In vivo

kasvaimen kasvua analyysi

HCT116_miR-375h soluja (3,5 x 10

6 solua injektiota kohti) suspendoitiin 200 ul PBS: ää ja injektoitiin ihon alle vasempaan kylkeen nukutettujen hiirien (n = 12). Hiiret jaettiin kahteen ryhmään, joissa oli 6 eläintä kussakin: Ryhmä A; miR-375 (+ DOX) ja ryhmä B; ohjaus (- DOX). Kasvaimet mitattiin säännöllisesti (pituus ja leveys) saman tarkkailijan. Ilmentymisen indusoimiseksi miR-375, DOX (Vibradox Sandoz) (0,2 mg /ml) lisättiin juomaveteen hiirten ryhmässä A, kun kasvaimet saavuttivat koon noin 50 mm

3. Hiiret ryhmässä B annettiin tavallista juomavettä. DOX käsittely suoritettiin 14 päivää. Neljä hiiret otettiin pois tutkimuksesta ennen DOX hoitoa (kaksi oli erittäin nopeasti kasvava kasvaimia ja kaksi oli kasvaimia että enää kasva) eli n = 4 ryhmässä A ja B. arvioitu kasvaimen (EV) laskettiin EV = pituus x (leveys)

2 x 1/2. EV piirrettiin päivien aloittamisen jälkeen DOX hoidon ja ksenografti kasvu dikäyrät.

Tilastollinen

merkitystä miRNA ilmentyminen muuttuu analysoitiin käyttäen Mann Whitney U testi Multi Experiment Viewer (MeV) array analysaattorin [30]. Hierarkkinen ryhmittely ilmentyvät eri miRNA suoritettiin käyttäen Gene Cluster 3.0 [31]. Vain, miRNA jotka ilmaistaan ​​yli 80% näytteistä otettiin mukaan. Lämpö kartat syntyi Java TreeView [32]. Opiskelijan pariton

t

-testi levitettiin verrata miRNA aiheuttamiin muutoksiin vastaavien valvonnan MTT-määritystä, LDH määritys, apoptoosimäärityksessä, RT-qPCR analyysi ja

in vivo

kasvaimen kasvua analyysi. Studentin parillista t-testiä käytettiin RT-qPCR analyysi mikropaloitelluista kudosnäytteistä.

p

-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Suurikapasiteettinen seulonta nimetään joukko miRNA joka indusoi apoptoosia ja /tai estää proliferaation CRC solussa linjat

tunnistaa miRNA kanssa parhaiten yhteen vaikutus kasvuun ja /tai eloonjäämistä CRC syöpäsolujen suoritimme suuren seulonnan kuudessa CRC solulinjoissa käyttämällä kirjaston tilalla 319 synteettistä ihmisen pre-miRNA. Pre-miR aiheuttamat muutokset cPARP ja Ki-67 käytettiin tunnistamaan miRNA, joka indusoi apoptoosia ja /tai inhiboivat vastaavasti. Jakaumat z-arvoja kullekin ennalta miR on esitetty kuviossa S1. Z-rank tuotteita käytettiin tunnistamaan johdonmukaisuutta ennalta miRNA vaikutuksia kaikissa testattu CRC solulinjoissa [33]. Sijoitus tuote Top-40 ennalta MIRS lueteltu taulukossa S4 File S2 (lisääntynyt cPARP) ja taulukko S5 File S2 (alennettu Ki-67). Useat Top-40 sijoittui miRNA on aiemmin osoitettu vaikuttavan joko apoptoosin ja /tai proliferaation

in vitro

(joissakin näistä on esitetty taulukossa S6 File S1).

miRNA ilmentymisen profilointi kliinisistä näytteistä

Vastatakseen

in vivo s

ignificance n miRNA tunnistettu suurikapasiteettisten toiminnallinen seulonta me profiloitu ilmaus 667 ainutlaatuista miRNA 14 normaalissa paksusuolen limakalvon ja kudosten näytteet 46 kliinisen vaiheen II CRC näytteitä. Kaikkiaan 53 miRNA oli ilmennetty eri normaalin limakalvon ja CRC (Mann Whitney U-testi p≤0.01 ja 1.5≤FC

(log2) ≤-1.5) (kuvio 1 ja taulukko 2). Osajoukko 25 miRNA oli kohonnut ilmentyminen CRC kasvaimissa suhteessa normaaliin limakalvoon taas 28 miRNA olivat alassäädetty CRC kasvaimia. Yhdistämällä tulokset miRNA profiloinnin kliinisten näytteiden tulokset suurikapasiteettisten toiminnallinen seulonta tunnistimme 10 miRNA jotka ilmentyvät eri kliinisissä CRC näytteitä ja samalla aiheuttamaa fenotyyppisiä muutoksia toiminnallisen seulonta (Top-40 sijoittui) (taulukot 2 ja S6 File S1). Lisäksi kahdeksan dys-säännelty miRNA aiheuttama fenotyyppisiä muutoksia ainakin yhdessä solulinjassa, mutta eivät olleet Top-40 sijoittui (taulukko 2). Yksitoista edellä miRNA olivat alassäädetty ja siksi nämä miRNA ovat kasvaimia estävä ehdokkaita. Lopuksi, 20 dys-säänneltyjen miRNA eivät sisälly ennalta miRNA kirjasto Ambion ja siten niiden kyky indusoida fenotyyppisiä muutoksia ei voida analysoida tässä tutkimuksessa (taulukko 2). Lopuksi tunnistimme 11 miRNA jotka säädellä vähentävästi CRC näytteitä ja samalla indusoitua proliferaatiota ja /tai esti apoptoosin CRC solulinjoissa ja siten nämä miRNA liittyvät potentiaalisesti peräsuolen kasvaimien syntyyn.

Hierarkkinen klusterointi of miRNA, joilla on merkittävä eri ilme välillä peräsuolen adenokarsinomia ja normaalin paksusuolen limakalvo näytettä (p≤0.01). Rivit edustavat yksittäiset miRNA ja sarakkeet edustavat yksittäisen kudoksen näytteitä. Asteikko edustaa intensiteetti geenin ilmentymisen (log2 asteikko on välillä -2,98 ja 2,98) (p-arvot ja FC-on esitetty taulukossa 2). MiRNA merkitty sinisellä havaittiin estävän proliferaation ja /tai apoptoosin indusoimiseksi suurikapasiteettisten näyttö (Top-40 sijoittui miRNA).

validointi fenotyyppien yksilöityjen korkea- seulonta

validoimiseksi tunnistettu fenotyyppejä, miRNA jotka alassäädetty kliinisissä näytteissä ja Top-40 sijoittui fenotyypin näyttö (miR-150, miR-375, miR23b, miR-138, asennuspalveli- 139-5p ja miR-9) tehtiin yksityiskohtainen toiminta-analyysi käyttäen HCT116, HT29, LS174T TR4, DLD1 TR7 ja SW480 paksusuolen syövän solulinjat. Olemme äskettäin julkaisi yksityiskohtaisen toiminnallinen analyysi miR-139-5p ja siten miR-139-5p ei sisälly näihin analyyseihin [25]. Ektooppinen ilmentyminen miR-375, miR-9 ja miR-138 vähensi merkittävästi elinkelpoisuuden useamman kuin yhden solulinjan (MTT vähentäminen 20% ja p≤0.05) (kuvio 2A (HCT116) ja kuvio S2), mahdollista, koska yleiseen antiproliferatiivinen tai pro-apoptoottisen roolin näiden miRNA. miR-150 ja miR-23b pienentänyt elinkelpoisuuden yhden solulinjan (DLD1 TR7). Niistä jäljellä miRNA, miR-375 otettiin esimerkiksi apoptoosin indusoiva miRNA korkean seulonta. Validoida Tämän havainnon, teimme LDH ja kaspaasi 3/7 määrityksissä transfektoiduissa CRC solulinjoissa. MiR-375 lisääntynyt Caspase 3/7 toiminta ja osoittivat päällekkäisiä lisääntyminen solujen kuoleman (LDH: n vapautuminen) sekä HCT116 ja DLD1 TR7 (kuviot 2B ja C, ja kuva S3). Lisäksi apoptoottisen kuoleman aiheuttama miR-375 voitiin estää kanssa z-DEVD-fmk (kaspaasi 3/7 estäjä) (kuvio 2D) osoittaa, että aiheuttaman apoptoosin riippuu kaspaasi 3/7 toimintaa. Yhteenvetona validointi analyysi vahvisti antiproliferatiivisia roolia miR-9 ja miR-138, ja apoptoosin indusoiva kapasiteettia miR-375 yksilöityjä suurikapasiteettisten analyysi. Edellä miRNA on aiemmin osoitettu olevan dys-säänneltyjen ihmisen syövissä ja leviämisen vähentämiseksi ja /tai apoptoosin

in vitro

(taulukko S6 File S1). miR-375 ja miR-138 ei ole toiminnallisesti tunnettu yksityiskohtaisesti CRC. Lopuksi miR-375, miR-138 ja miR-9 valittiin lisäanalyysiä johtuen niiden alassäätöä kliinisissä näytteissä ja niiden kykyä aiheuttamaa fenotyyppisiä muutoksia

in vitro

.

( A) Cellular elinkelpoisuus (MTT-määritys): Tulokset esitetään ± sd. vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen kussakin on kolme biologisen rinnakkaisnäytettä ja normalisoitiin Scr. * P-arvo 0,05 ja MTT vähentäminen 20%. (B) Cellular kuoleman (LDH: n vapautuminen määritys): Solu kuoleman ilmaistiin prosentteina vapautetaan LDH ulos solun kokonais-LDH. Vähintään kaksi itsenäistä koetta suoritettiin ja suoritetaan kolmena rinnakkaisena. Tuloksena on yksi edustaja kokeita ± sd. on näytetty. * P-arvo 0,05. (C) Apoptoosin (kaspaasi 3/7 aktiivisuus): kaspaasi 3/7 aktiivisuus lysaatin ennalta miRNA transfektoiduissa soluissa tutkittiin fluorometrisellä kineettisen analyysin ja ilmaistu suhteessa kaspaasi 3/7 aktiivisuus ”Scr” transfektoitu solut. Tiedot esitetään ± SD. vähintään 2 itsenäisen kokeen kussakin on kolme biologisen rinnakkaista. * P-arvo 0,05. (D) esto miR-375 aiheuttama apoptoosin kaspaasi 3/7 estäjä z-DEVD-fmk. Kaspaasi 3/7 aktiivisuus mitattiin kuten on kuvattu (C). Z-DEVD-fmk (DEVD) (25 uM) lisättiin soluille kuusi tuntia transfektion jälkeen. Non käsitellyt solut (NT), Lipofectamine vain (Lipo) ja pre-miR miRNA prekursorimolekyylit-Negative Control # 1 (SCR) sisällytettiin negatiivisina kontrolleina kaikissa määrityksissä. Pre-miR-145 transfektoidut solut sisällytettiin mukaan positiivisena kontrollina suorituskyvyn MTT-määritystä. (E) Alas-säätely miR-375 on vähennyttyä ilmaisun epiteelisoluissa kasvain. Expression of miR-375 laser kaapata microdissected peräsuolen syövän kudosta. Ilmaisu analysoitiin epiteeli- ja strooman soluja pariksi peräsuolen adenokarsinoomat (n = 3) ja viereisen normaalin (n = 3), paksusuolen limakalvon LCM koepaloja käyttäen RT-qPCR. Pylväät edustavat keskiarvoa ilmentymistä kolmessa näytteessä ± sd.

Detection of miR-375, miR-138 ja miR-9 laser microdissected peräsuolen kudokseen

Valaistaan ​​matkapuhelinverkon alkuperä Mir-375, miR-138 ja miR-9, mittasimme niiden ilmaisun laser jää mikropaloitelluista peräsuolen adenokarsinomia ja viereisen normaalin paksusuolen limakalvo (kuvio 2E ja kuvio S4). Nämä analyysit osoittivat, että normaalissa paksusuolen limakalvon miR-375 ilmentyi korkeammalla tasolla epiteelisoluissa kuin stroomasoluissa (p = 0,02) (kuvio 2E). Kun taas adenokarsinoomaa miR-375 ilmentyi vertailukelpoisilla tasoilla epiteelin ja strooman soluja (p = 0,27). Lisäksi, miR-375 ilmentyminen normaaleissa epiteelisoluissa oli huomattavasti korkeampi kuin ilmentymisen epiteelisolujen adenokarsinooma (p = 0,03). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että säätely alaspäin miR-375 CRC on seurauksena vähentäminen miR-375 ilmentyminen epiteelisoluissa kasvain. miR-9 ja miR-138 esitettiin pääasiassa stromasoluja molemmista normaalin paksusuolen limakalvolla adenokarsinoomien (kuva S4). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​aiemmin julkaistu miRNA ilmentymisen profiilit laser-microdissected normaali limakalvo, ja -adenokarsinoomien [34]. *

p

0,05.