Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

somatostatiini (SST) on antiproliferatiivisia ja proapoptoottisten vaikutuksia. Meidän tavoitteena oli analysoida ja vertailla SST ilmaisu normaalin ikääntymisen ja peräsuolen syövän synnyn mRNA ja proteiini tasoilla. Lisäksi testasimme metylaatiostatuksen

SST

biopsianäytteissä, ja solun kasvua estävä vaikutus SST analogisten Oktreotidin paksu- adenokarsinoomasolulinja.

Methods

paksusuolen kerättiin terveistä lapsista (1 = 6), tervettä aikuista (n2 = 41) ja peräsuolen syövän potilaiden (CRC) (n

3 = 34)

SST

mRNA ilmaisun analyysi käyttäen HGU133 Plus2.0 mikrosiruja. Tulokset validoitu sekä alkuperäinen (n

1 = 6; n

2 = 6; n

3 = 6) ja itsenäinen näytteet ((n

1 = 6; n

2 = 6; n

3 = 6) reaaliaikainen PCR. SST ilmentävien solujen havaittiin immunohistokemiallisesti paksusuolen biopsianäytteissä (n

1 = 14, n

2 = 20; n

3 = 23). vaikutus Oktreotidin solujen kasvuun testattiin Caco-2-solulinjaa. SST metylaatio prosenttiosuus biopsianäytteissä (n

1 = 5; n

2 = 5; n

3 = 9) määriteltiin käyttäen metylaatioherkät restriktioentsyymidigestiolla.

tulokset

Jos normaalin ikääntymisen SST mRNA ilmaisu ei vaikuttanut, mutta laskivat syöpä (p 0,05). suhde SST immunoreaktiivisia solut oli huomattavasti korkeampi lapsilla (0,70% ± 0,79%) verrattuna CRC (0% ± 0%) (p 0,05). oktreotidi kasvattanut apoptoottisten Caco-2-soluilla.

SST

verrokkeja korkeampi metylaatio tason tuumorinäytteissä (30,2% ± 11,6%) verrattuna terveiden nuorten yksilöiden (3,5% ± 1,9%) (p 0,05).

Johtopäätökset

syöpä paksusuolen limakalvon alennettu SST tuotanto voi edistää kontrolloimatonta soluproliferaatiota. Havaintomme että koolonkarsinoomasoluissa oktreotidi merkittävästi parannettu solukuoleman ja heikennettyjä soluproliferaation viittaa siihen, että SST voi toimia säätelijänä epiteelisolujen kinetiikan. Estyminen SST ilmentymistä CRC voidaan epigeneettiseltä säädellä promoottorin hypermetylaatio.

Citation: Leiszter K, Sipos F, Galamb O, Krenács T, Veres G, Wichmann B, et ai. (2015) Promoottori hypermetylaation-Related Alennettu somatostatiini Production Edistää Hallitsematon soluproliferaatiota peräsuolen syövän. PLoS ONE 10 (2): e0118332. doi: 10,1371 /journal.pone.0118332

Academic Editor: Robert Dante, Institut national de la Sante et de la Recherche médicale, FRANCE

vastaanotettu: 04 elokuu 2014; Hyväksytty: 13 tammikuu 2015; Julkaistu: 27 helmikuu 2015

Copyright: © 2015 Leiszter et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: tärkeimmät tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja. Microarray data tiedostot ovat saatavilla Gene ilmentymismäärä Omnibus tietokanta (GSE10714, GSE37364, ja GSE37267).

Rahoitus: Kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

somatostatiini (SST), sääntely-estävää peptidiä, on merkittävä vaikutus ruuansulatuskanavan toiminnan. Se tukahduttaa suoliston toimintaa ja sappirakon supistumisen, estää suolen eksokriinisessä eritystä, säätelee suoliston ravinteiden imeytymistä ja verenkiertoa ja vähentää epiteeliproliferaation [1-5]. Lisäksi SST estää hormonin vapautumista (esim. GH, TSH, insuliini, gut hormonit), toimii välittäjäaine ja neuromodulaattorina, ja edistää vesitasapainon [1,4,6]. Näiden fysiologiset hormonitoimintaa ja parakriinisiä /autokriinisella vaikutuksia, SST voi suoraan estää solujen lisääntymisen ja apoptoosin kautta somatostatiinireseptoripositiivisten (SSTR) signalointi [4,7]. Siksi alennettu somatostatiinin tasoja, jotka löysimme esitutkimuksessa saattaa olla merkitystä ruoansulatuskanavan kasvainten synnyssä lukien peräsuolen syöpä, joka on yksi johtavista syistä syövän liittyvät kuolemat [8].

somatostatiini pääasiassa tuotetaan keskus- ja ääreishermoston, että haiman ja suolistossa; Lisäksi pieniä SST eritys on myös voitu osoittaa, että kilpirauhasen, lisämunuaisten, submandibular rauhaset, munuaiset, eturauhanen, istukka ja solut immuunijärjestelmän. SST syntetisoidaan suuri prekursorimolekyylistä kutsutaan preprosomatostatin (preproSST), joka on käsitelty entsymaattisesti kypsyä tuotteita. Kaksi bioaktiivisten peptidi tuotteet SST koodaavan geenin tiedetään, SST-14 ja SST-28 [1]. SST-28 syntetisoidaan suolen limakalvon, joka on suurin reuna lähde peptidin ja tärkeimpien SST tuottavien solujen ruoansulatuskanavan ovat limakalvon δ-solujen suolen epiteelissä, D-solujen mahalaukkua ja haiman, sekä luontainen neuronien myenteeri- ja limakalvon alaista punokset pitkin ruoansulatuskanavan [3]. Somatostatiinin vapautumista voidaan stimuloida ja estävät useat hormonit, neuropeptides, välittäjäaineiden, sytokiinien, kasvutekijöiden ja ravinteita. Esimerkiksi, kasvuhormonia vapauttava hormoni (GHRH), kortikotropiinia vapauttava hormoni (CRH), neurotensiini, bombesiini, IL-1, IL-6 ja TNF-α voi stimuloida SST eritystä useissa kudoksissa. Sitä vastoin γ aminobutiric happo (GABA), opiaattien, TGF-β ja leptiinin ovat mahdollisia estäjiä SST vapautumisen. Ravinteet ovat kudosspesifisiä vaikutus SST tuotantoa, ja suoliston SST eritystä laukaisee luminal, mutta ei verenkierrossa ravinteita [1].

viidelle tunnetulle somatostatiinireseptoreita (SSTR1, SSTR2 /SSTR2A, SSTR2B /, SSTR3, SSTR4 , SSTR5) koodataan viidellä ihmisen geenit ovat tyypillisiä G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (GPCR), jossa on seitsemän α-kierteisen transmembraaninen segmenttejä. Sitoutumisessa SST sen reseptoreihin, useat solutoiminnoille moduloidaan läpi useita G-proteiinin riippuvainen signalointireitteihin. Eri signalointireitteihin aktivoituvat riippuen reseptorialatyypin ja kudosten lokalisointi. Kaikki SSTR alatyyppejä estää adenylaattisyklaasin ja cAMP-tuotantoa, säädellä proteiini fosfataasi ja aktivoi G-proteiinin säänneltyjen sisäänpäin rectifier K

+ kanava (GIRK) perheen ligandin sitoutumisen [1,2,5,9,10].

ilmentymä antiproliferatiivinen ja pro-apoptoottista vaikutusta SST normaaleihin ja kasvainsoluihin riippuu ligandin sitoutumisen SSTR. SST ja sen analogeilla on epäsuoria vaikutuksia solujen kasvuun estämällä angiogeneesiä, muuttaakseen immuunijärjestelmää ja estämällä kasvutekijät (esim. IGF-1) ja ravintoketjun hormonit vapauttaa. Lisäksi, se voi indusoida apoptoosia, estävät solusyklin ja moduloivat vaikutukset kasvutekijät suoraan [11-14].

Aiemmissa tutkimuksissa on koottu makroskooppisen, mikroskooppisen ja molekyylitason muutoksia, jotka vaikuttavat maha-suolikanavan, erityisesti paksusuolen normaalin ikääntymisen aikana [15-17]. Olemme osoittaneet, että terveet nuorten paksusuolen epiteelin ja peräsuolen syöpä voidaan luonnehtia lisääntyneeseen soluproliferaatioon ja laski apoptoosin verrattuna terveen aikuisen paksusuolen limakalvoa. Vaikka solujen lisääntymistä säädellään tiukasti ja tasapainoinen lapsilla, se tulee hallitsematon CRC. Olemme myös ilmi, että muutokset mRNA ilmaisun normaalin ikääntymisen aikana ja peräsuolen syövän syntymistä voi liittyä lisääntynyt, mutta eri tavalla säänneltyjä solujen kasvua [18]. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli analysoida paikalliseen somatostatiinin tuotantoa ihmisen paksusuolen epiteelin normaalin ikääntymisen aikana ja peräsuolen syövän synnyn, sekä mRNA ja proteiini ekspressiotasot. Tutkimme myös vaikutuksia somatostatiinianalogilla oktreotidi ihmisen kolorektaalisen adenokarsinooman solulinjaa (Caco-2). Koska promoottori hypermetylaation voi epigeneettiseltä muuttaa geenin transkription sekä ikääntymisen aikana ja Karsinogeneesin testasimme metylaatiostatuksen

SST

geeni.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja näytteet

Kun tietoon perustuvan suostumuksen, peräsuolen biopsia otettiin aikana rutiini endoskooppinen intervention 2nd Sisätautien ja 1st Department Lastenklinikka, Semmelweis University, Budapest, Unkari. Kirjallinen suostumus saatiin etukäteen kaikkien aikuisten osallistujia ja lähiomaisille, talonmiesten tai huoltajat sen puolesta alaikäisten /lasten hyväksymä eettiset toimikunnat. Kaikkiaan 81 koepala Näytteet analysoitiin mikrosiruanalyysi (6 tervettä lasta, 41 tervettä aikuista ja 34 CRC aikuisten) ja 36 biopsianäytteissä osallistui reaaliaikainen PCR-validointi (12 tervettä lasta, 12 tervettä aikuista ja 12 CRC aikuisilta) . Viisikymmentäseitsemän kudosnäytteistä analysoitiin immunohistokemiallisesti (14 tervettä lasta, 20 tervettä aikuista ja 23 CRC aikuisten) ja 15 paksusuolen biopsiat tutkittiin käyttäen metylaatioherkät restriktioentsyymillä metylaatio erilaisia ​​analyysi (5 tervettä lasta, 5 terveitä aikuisia ja 9 CRC alkaen aikuisia). Seitsemänkymmentäviisi mikrosirut (joka sisältää aikuisten näytteistä) oli hybridisoitiin aikaisemmin; niiden tiedostoja käytettiin aikaisemmin julkaistuissa tutkimuksissa käytetään erilaisia ​​vertailuja [19-21] ja ovat saatavilla Gene Expression Omnibus tietokanta (sarja-hakunumero: GSE10714 ja GSE37364). Aineistot vasta hybridisoitui 6 mikrosiruja rekisteröidään GSE37267 sarjanumero numero. Ohjaus lapset siirrettiin poliklinikalla ummetus, peräsuolen verenvuoto tai krooninen vatsakipu. Ileocolonoscopy oli osa niiden diagnostista menettelyä (elimellisen sairauden poissulkemiseksi) ja kudosnäytteistä osoittivat normaalia makroskooppinen ulkonäkö ja histologia. Jokainen yksilö varmistettiin histopathologists. MRNA tutkimukset (mikrosiruanalyysi, Taqman RT-PCR) ja metylaation erilaisia ​​analyysi, paksusuolen näytteet säilytettiin RNAlater Reagent (Qiagen Inc, Germantown, USA) -80 ° C: ssa ennen nukleiinihapon uuttamista. Peräsuolen biopsia näytteet rutiininomaisesti kiinnitettiin formaldehydillä ja upotettu parafiinivahaan immunohistokemiaa kokeita.

Ethical hyväksynnät (Nr .: 69/2008 ja 202/2009) tätä tutkimusta varten antama alue- ja institutionaalisten komitean Science ja tutkimus etiikka Semmelweis University (Budapest, Unkari). Yksityiskohtainen kliinis erittely potilaan näytteitä yhteenveto

Taulukko 1

.

mRNA ilmaisu mikrosiruanalyysi

mukaan valmistajan ohjeiden, kokonais-RNA uutettiin käyttäen RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Germantown, USA). Määrä eristetyn RNA: n tunnettu siitä, että mittaamalla absorbanssi (NanoDrop ND-1000 Spektrofotometri, NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, USA) ja laatu eristetyn RNA testattiin kapillaari- geelielektroforeesilla (2100 Bioanalyzer ja RNA 6000 Pico Kit /Agilent Inc ., Santa Clara, CA, USA /). Mukaan Affymetrix kuvaus, biotinyloitua cRNA koettimet syntetisoitiin 1-8 ug kokonais-RNA kanssa RIN (RNA Integrity Number) välillä 7-10 ja hajanainen käyttämällä One-Cycle Target Labeling and Control Kit (http: //www.affymetrix. fi /support /downloads /oppaita /expression_s2_manual.pdf). Kymmenen mikrogrammaa kutakin hajanainen cRNA näyte hybridisoidaan osaksi HGU133 Plus2.0 array (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) 45 ° C: ssa 16 tuntia. Mikrosirujen pestiin käyttäen Fluidics Station 450-laite, ja värjättiin vasta-aineella vahvistus värjäys mukainen menetelmä valmistajan ohjeiden mukaisesti. Fluoresoivien signaalien havaittiin GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix).

TaqMan reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) validointi

TaqMan polymeraasiketjureaktion käytettiin mittaamaan mRNA: n ilmentymisen SST koodaavan geeni alkuperäisiin (6 histologisesti ehjä lasta, 6 histologisesti ehjä aikuisten ja 6 aikuisten CRC näytettä) ja riippumaton näytesarjaa (6 histologisesti ehjä lasta, 6 histologisesti ehjä aikuinen, 6 aikuinen CRC näytettä). 18S ribosomaalinen RNA (Hs03928990_g1 *) ja GAPDH (Hs03929097_g1 *) käytettiin vertailukohtana geeni.

Yhteensä RNA, laadun ja määrän valvonta toimi edellä kuvatulla tavalla. Käyttäen High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit RNaasi Inhibitor, 1 ug kokonais-RNA per näyte käänteistranskriptio (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Laatu cDNA tarkastettiin SDHA reaaliaikainen PCR (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Sveitsi). Sitten 16,7 ng cDNA-templaattia kohti näytettä käytettiin

SST

(Hs00174949_m1 *) mRNA: n ilmentymisen analyysi TaqMan Gene Expression Master Mix (Life Technologies). Mittaukset suoritettiin LightCycler 480 (Roche) Mono Väri hydrolyysikoetin /UPL Probe tunnistus muodossa. Denaturoinnin jälkeen 95 ° C: ssa 10 minuuttia, 40 PCR-sykliä suoritettiin (monistaminen 95 ° C: ssa 15 sekuntia, ja 60 ° C 1 min).

immunohistokemia havaitsemiseksi somatostatiinin tuottavien solujen

sydämiä 2 mm halkaisijaltaan kerättiin valittujen alueiden formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kudosblokeista valmistettiin 20 normaalista paksusuolen näytettä ja 23 kolorektaalisyövissä aikuisten potilaiden ja työnnetään kudokseen mikrosiru (TMA) vastaanottajalohkot. Lisäksi 14 histologisesti ehjä paksusuolen biopsianäytteissä lapsilta tutkittiin proteiinien tasolla. 5 pm paksu kudosleikkeiden leikattiin TMA lohkot ja koepalanäytteistä, ja immunovärjättiin. Endogeeniset peroksidaasia esto (0,5% vetyperoksidia ja metanolin seos, 30 min, huoneenlämpö) ja antigeenin haku (Target Retrieval Solution, Dako, Glostrup, Tanska, koodi: S1699, pH 6-puskuri, suoritetaan mikroaaltouunissa 900 W 10 min ja 370 W 40 min) tehtiin vahat poistettu näytteistä. Ei-spesifinen esto, 1% naudan seerumin albumiinia käytettiin. Immunohistokemiallinen tunnistus somatostatiinin suoritettiin kosteassa kammiossa käyttäen kaniinin anti-ihmisen polyklonaalista vasta-ainetta (1:50 laimennus, yhdessä yössä, Thermo Scientific, Kalifornia, USA, code: RB-038-A). EnVision + HRP-järjestelmä (leimatun Polymer Anti-Rabbit, 40 min, Dako, koodi: K4003) ja diaminobentsidiini-vetyperoksidaasia-kromogeeni–substraattijärjestelmää (Cytomation Liquid DAB + Substrate Kromogeeni System, 10 min, Dako, koodi: K3468) käytettiin signaalin muuntamisen. Lopuksi hematoksyliinillä co-värjäys suoritettiin.

Counting somatostatiinin tuottavien solujen digitaalisen dioja

Stained biopsianäytteissä ja kudosten microarray (TMA) liukuu olivat digitalisoitu korkean resoluution digitaalinen skanneri (Pannoramic Scan, 3DHISTECH Ltd. Budapest, Unkari) käyttäen monikerroksinen loisteputki skannaus on korkea numeerinen aukko (0.8) x20 objektiivilinssi ja high dynamic range AxioCam Mrm Rev.3 musta-valko kamera liitetty skanneriin. Digitaalinen objektilasit pääsee läpi tietokonenäyttö ja analysoitiin käyttäen Pannoramic Viewer (versio 1.11.43.0). Marker Counter ohjelmistomoduuli johtaa pysyvään merkinnät Counted soluja käytettiin arvioitaessa suhteellinen suhde SST käytettäviä ja muita epiteelisoluja. Epiteelin SST positiivisuus näytti kaikki yhtä vahva ruskea sytoplasman merkintöjä diat. Riippuen otoskoko, 500-1000 epiteelisolujen laskettiin pituus- hyvin suuntautunut crypts.

hoito Caco-2-solujen somatostatiinianalogilla okreotidi ja mittaus Sub-G1 käyttävästä väestöstä virtaussytometria

Soluviljely ja käsittely. Soluviljely koe pidettiin tietyssä taudinaiheuttajan soluviljelmässä laboratoriossa. Caco-2 ihmisen epiteelisolujen adenokarsinoomasolulinja saatiin DSMZ (Braunschweig, Saksa, Cat. No. ACC-169). Solut kasvatettiin konfluenssiin MEM (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA; kat. Nro M 2279), jota oli täydennetty 20% naudan sikiön seerumia (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA; kat. Nro F 24429) ja 160 ug /ml gentamysiiniä (Sandoz GmbH, Schaftenau, Itävalta). Myöhemmin 70.000 Caco-2-soluja ratkaistu l kuoppa 24 kuopan käsittely levy MEM gentamysiiniä ja FCS. 24 tunnin kuluttua väliaine vaihdettiin: MEM lisättiin gentamysiiniä ja 0,1, 1,0, 2,5, 5,0 ja 10,0 nmol /l oktreotidi (Sandoz GmbH) ilman FCS. Mittaus suoritettiin kolmena kappaleena jokaiselle pitoisuudelle. 24, 48 ja 72 tunnin käsittelyn jälkeen solut otettiin talteen, kaksi kertaa pestiin 0,5 ml: aan steriiliä PBS: ää, ja suspendoitiin lopuksi uudelleen 1,0 ml: aan jääkylmää 70% etanolia ja säilytettiin -20 ° C: ssa.

Virtaussytometria ja Sub-G1 väestön tunnistus. Näytteitä sentrifugoitiin 3 minuuttia 1300 rpm, sitten solut suspendoitiin uudelleen 300 μ1 uuttamispuskuria ja 3 ui RNAasi (RNaasi A /T1 Mix, Thermo Fisher Scientific Baltia UAB, Vilna, Liettua) lisättiin. 15 min kuluttua huoneenlämpötilassa inkuboinnin, 3 ui propidium- jodide (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA; Cat. No. 81845) lisättiin. FACS-mittaus suoritettiin Becton Dickinson Immunocytometry Systems (Mountain View, Kalifornia, USA, sarjanumero 81313).

metylaatioherkät restriktioentsyymillä metylaatio erilaisia ​​analyysi

Biopsia homogenisoitiin 2 % natriumdodekyylisulfaatti DNA: n eristämiseksi, ja sen jälkeen inkuboitiin proteinaasi K hajotuspuskuria (4 mg /ml) 60 ° C: ssa 16 tunnin ajan. DNA uutettiin High Pure PCR Template valmistelu Kit (Roche Applied Science, Penzberg, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. DNA eluoitiin 2×100 ui RNaasi- ja DNaasi-vapaaseen veteen ja niitä säilytettiin -20 ° C: ssa. DNA: n metylaatio profiilit tutkittiin käyttäen EpiTect metyyli qPCR Array System (Qiagen, Hilden, Saksa). Eristetty DNA: ta inkuboitiin joko DNA: n metylaatio riippuvaisia ​​tai DNA herkkiä restriktioentsyymejä 16 h 37 ° C: ssa, inkuboitiin sitten 65 ° C: ssa pysäyttää metylaasiaktiivisuuden. Kukin 120 ui: n reaktio sisälsi 500 ng genomista DNA: ta. Seuraavat entsyymidigestiolla näytteet analysoitiin fluoresenssi-pohjainen, kvantitatiivinen PCR käyttäen LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Basel, Sveitsi). PCR suoritettiin seuraavissa olosuhteissa: 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, 40 sykliä (97 ° C: ssa 15 sekuntia; ja 72 ° C 1 min-reaaliaikaista tiedonkeruu). Monistumisen takaamiseksi haluttujen tuotteiden, sulamiskäyräanalyysillä suoritettiin sen jälkeen, kun reaaliaikaisen PCR-reaktiossa. Sulamiskäyrä tiedonkeruu alue oli 65 ° -95 ° C, pitämällä 1 s välein 0,04 ° C: n PCR-tuotteen havaitsemiseksi.

Tilastollinen arviointi

mRNA ilmaisun profilointi, Affymetrix ilmaisu paneelit olivat pääosin valmiiksi käsitelty GCRMA taustakorjauksen menetelmää quantile normalisoinnin ja mediaani kiillottaa yhteenvetoa. Ilmaisu on

SST

geenin eri näytettä ryhmien analysoitiin ANOVA ja testin jälkeen Tukey HSD. Aineistojen ovat saatavilla Gene Expression Omnibus tietopankista (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), sarja liittymisen numerot: GSE10714, GSE37364 ja GSE37267.

reaaliaikainen PCR validointi SST ilmaisun 12 näytteet analysoitiin seuraavissa ryhmissä: lapset, terveet /normaali aikuisten ja aikuisten CRC. Normalisointia, 18S ribosomaalisen RNA käytettiin siivous sisäisen valvonnan ja DCT-arvot olivat edustettuina boxplots. Näin data oli normaali jakautunut tilastolliseen analyysiin ANOVA testi ja Tukey HSD post-testiä sovellettiin, jotta voidaan määrittää merkitystä. Seuraavia kriteereitä käytettiin: Taita change≤0.5 tai Taita change≥2 ja p-arvo 0,05.

tilastollinen analyysi SST Immunovärjäyksen tulosten ANOVA testi ja Tukey HSD post-testiä sovellettiin. Molemmissa menetelmissä merkitys kriteerien oli p 0,05.

Mann-Whitneyn testiä käytettiin vertaamaan osuus Caco-2-solujen eri solusyklin vaiheissa (Sub-G1, G1, S, G2 ja M) oktreotidi-käsiteltyjen ryhmien ja kontrolliryhmässä. p 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

tulokset metylaation erilaisia ​​analyysi arvioitiin ANOVA ja Tukey HSD post-testi määrittää ja verrata osuudet

SST

promoottori metylaatio kolme näytettä ryhmään.

tilastollinen analyysi R 3.1.0 tilastojärjestelmään sovellettiin. Boxplots edustaa mediaani ja keskihajonta tiedot virheellisten havaintojen.

Tulokset

somatostatiini ilmaisun muutoksia hyperproliferatiivisissa valtioissa paksusuolen

somatostatiini mRNA ekspressiotasot peräsuolen biopsianäytteissä terveistä nuorten, aikuisten ja peräsuolen syövän todettiin käyttäen 213921_at Affymetrix probeset ID (https://www.affymetrix.com/analysis/index.affx). mRNA ilmaus SST ei muuttanut normaalin ikääntymisen aikana verrattuna terve nuoruusiän (Ch) ja aikuisten (N) näytettä kuitenkin geenien ilmentyminen väheni merkittävästi kolorektaalisyövässä (CRC) (p 0,05) verrattuna normaalin aikuisen (N) näytettä

(Fig. 1)

.

Reaaliaikainen PCR validointi alkuperäisestä, riippumattoman ja yhdistetty näytesarjaa tarkastanut vähensi

SST

ilmentymistä CRC (p 0,05)

(Fig. 3, 4) B.

mRNA ilmaus mikrosiruanalyysi somatostatiinin (SST) -geenin mikroskooppisen normaalissa paksusuolen biopsianäytteissä lapsilta (Ch) ja aikuisille (N) ja peräsuolen syövän ohutsuolikoepalan (CRC). Punaiset pisteet ovat normalisoidut mRNA ilmaisun arvot, boxplots edustavat mediaani ja keskihajonta.

SST

ilmaisun merkittävästi vähentynyt CRC.

Validation mRNA: n ekspression muutoksia somatostatiinin (

SST

) -geenin histologista normaalissa paksusuolen biopsianäytteissä lapsilta (Ch) ja aikuisten (N) ja peräsuolen syövän ohutsuolikoepalan (CRC) avulla reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) yhdistetystä näytteestä sarjaa. Punaiset pisteet ovat normalisoidut RT-PCR ilmaisun arvot, boxplots edustavat mediaani ja keskihajonta. RT-PCR-analyysi varmisti merkittävästi vähentynyt

SST

ilmaisun CRC.

Detection of SST tuottavien solujen (ruskea solulima) normaalin ikääntymisen ja peräsuolen syöpä (CRC). Kuvat on otettu digitaalisella mikroskoopilla: normaali lapsi kudos (Ch) (80-kertainen suurennus), normaalin aikuisen kudoksen (N) (55-kertainen suurennus) ja syövän (CRC) aikuisilla (20-kertainen suurennus). Vain hyvin pieni SST proteiinin taso voitiin havaita CRC näytteissä.

Detection somatostatiinin (SST) tuottavien solujen ihmisen normaalia paksusuolen epiteelin lapsilta (Ch) ja aikuisten (N) ja peräsuolen syövät (CRC). Punaisia ​​pisteitä ovat suhde SST tuottavien solujen verrattuna koko epiteelin solujen määrä (%); boxplots ovat mediaani ja keskihajonta tietoja. SST tuotanto väheni merkittävästi vuonna CRC.

Antiproliferatiivistä vaikutuksia somatostatiinianalogilla on peräsuolen syövän solut

somatostatiinianalogilla oktreotidi lisättiin peräsuolen adenokarsinooma soluihin (Caco-2) eri pitoisuuksia. Runsaasti lisää DNA pirstoutuminen (Sub-G1 väestöstä) mitattiin virtaussytometrialla 48 tunnin jälkeen kontrolliin verrattuna soluihin, pitoisuudesta riippuvaisella tavalla. Tapauksissa somatostatiinianalogi hoito suurempina pitoisuuksina 0,1 nmol /l, osuus apoptoottisten Sub-G1 fraktiot oli merkitsevästi korkeampi (p 0,05), kuin mitä se oli kontrolliryhmässä, kun taas solujen osuus muissa solusyklivaiheista ( G1, S, G2, M) oli huomattavasti pienempi. Korkeimmat apoptoottinen fraktio (Sub-G1) ja alin G1, S, G2, M väestö mitattiin 5,0 nmol /l oktreotidin pitoisuus. Virtaussytometria Tulokset on koottu

Taulukko 2 Taulukko 3

ja

Fig. 5.

.

Suhteellinen solujen valvontaa ja oktreotidi-käsiteltyjen ryhmien keskiarvon ja keskihajonnan arvot. Sininen pylväät edustavat soluja Sub-G1 vaiheeseen ja osuudet solujen G1 + S + G2 + M vaihe on havainnollistettu punainen sarakkeita. Suurempina pitoisuuksina kuin 0,1 nmol /l, lisättiin oktreotidi, osuus apoptoottisten Sub-G1 osa oli merkitsevästi korkeampi (p 0,05) kuin kontrolliryhmässä, kun taas solujen osuus muissa solusyklivaiheista (G1 + S + G2 + M) oli huomattavasti pienempi. Korkeimmat apoptoottinen fraktio (Sub-G1) ja alin (G1 + S + G2 + M) väestö mitattiin 5,0 nmol /l oktreotidin pitoisuus.

SST promoottori DNA metylaatio muutoksia hyperproliferatiivisissa valtioissa paksusuolen

Promoottori metylaatio somatostatiinin geenin kasvoi normaalin ikääntymisen ja syövän syntymistä. Pienin

SST

promoottori metylaatio havaittiin nuoruusiän paksusuolen epiteelissä (3,5% ± 1,9%), joka voidaan luonnehtia hallinnassa, lisääntynyt solujen lisääntymisen. Kuitenkin kolorektaalisyövässä jossa lisääntynyt solukasvu on säädeltyyn,

SST

metylaatio oli merkitsevästi suurempi (30,2% ± 11,6%) (p 0,05). Korkeimmat metylaatiostatuksen havaittiin CRC

(Fig. 6)

.

Evaluation of promoottorin metylaation

SST

geenin normaalissa peräsuolen biopsianäytteissä lapsilta (Ch) ja aikuisista (N) ja peräsuolen syöpien (CRC) käyttäen metylaatioherkät restriktioentsyymillä metylaatio erilaisia ​​analyysi. Punaiset pisteet ovat promoottori metylaatio arvot

SST

(%); boxplots edustavat mediaani ja keskihajonta. Promoottori metylointi kasvaa normaalin ikääntymisen ja syövän synnyn, ja ylin metylaation aste havaittiin tumorous näytteissä.

Keskustelu

peräsuolen syöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia, joilla on heikko tulos kehittyneiden tapauksissa. Sen esiintyvyys on alhainen alle 50, mutta se nousee nopeasti vanhemmissa ikäryhmissä. Kehittyneissä maissa mediaani-ikä diagnoosin on noin 70 vuoden ajan [8] ja useimmissa CRC tapauksista diagnosoidaan yli 65-vuotiaita. [22] Siksi ikä voidaan pitää määräävä riskitekijä ja peräsuolen syövän synnyn [23]. Aikaisemmin osoitimme, että kohonnut soluproliferaatiota on yhteinen piirre peräsuolen epiteelin sekä lapsenkengissä ja syövän kanssa merkittävää eroa kontrolliryhmän soluproliferaation syöpää [18]. Tässä tutkimuksessa osoitettiin sekä mRNA ja proteiini tasoilla että somatostatiinin ilmaisua ei poikkea merkittävästi iäkkäillä terveillä paksusuolen epiteelin verrattuna nuorten näytteitä, mutta se on lähes poissa peräsuolen syöpä. Promoottorialueen

SST

geenin havaittiin olevan hypermetyloitunut CRC koepaloja, jotka voivat osittain kumota demetylaation syöpäsolulinjoissa. Koska hoidon somatostatiinianalogilla oktreotidi vähensivät solujen lisääntymisen ja kohonnut apoptoosin paksu- adenokarsinoomasolulinjasta tuloksemme ehdotti, että puute paikallisen SST tuotanto voi edistää kohonnut ja hallitsematon solujen lisääntymisen in CRC.

maha-suolikanavan (GI) hormonit (esim somatostatiini, kolekystokiniini (CCK), gastriini, bombesiini (BBS) /gastriinia vapauttava peptidi (GRP), neurotensiini (NT), peptidi YY (PYY), glukagonin kaltainen peptidi 2 (GLP-2) ) erittävät endokriiniset solut, jotka sijaitsevat suolen limakalvon ja haimassa. Nämä kemialliset sanansaattajia säätelevät suoliston ja haiman eritystä, ruoansulatusta, imeytyminen, liikkuvuuteen ja solujen lisääntymistä. Somatostatiini sääntely-estävää peptidiä, jota voidaan pitää universaalina poiskytkentä hormoni ja lisäksi se voi estää solujen kasvua normaaleissa ja neoplastisia kudoksia. SST on hormonaalisia ja parakriinisiä /autokriinisen vaikutuksia, ja se voi sitoutua sen solun pinnan G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (SSTR1-5) käynnistetään signaalintransduktioreitteihin [24].

Tässä tutkimuksessa on havaittu, että osuus somatostatiini tuottavia soluja on alle 1% histologisesti normaalissa nuorten ja aikuisten paksusuolen epiteelin, ja pienentynyt merkittävästi tumorous näytteissä. Aiemmat immunohistokemialliset tutkimukset ovat osoittaneet dual lokalisointi somatostatiinin samalla sekä hormonaalisten D-soluja ja hermoja paksusuolessa [25]. Lisäksi

Parsons et al

. ovat löytäneet myös suhteellisen pieni määrä SST positiivisten solujen paksusuolen epiteelissä [26]. Meidän työryhmä

Galamb et al

. aiemmin tunnistettu geenejä (esim.

AMN, PTGDR

) laskiessa ilme aikana peräsuolen kasvaimien syntyyn [20,27]. Samoin näiden merkintöjen, laski merkittävästi SST tuotanto voi myös edistää peräsuolen syövän muodostumisen.

Koska vaikutuksia SST on ruoansulatuskanavasta, SST analogit voidaan soveltaa tehokkaasti ei-neoplastisia suoliston sairaudet kuten akuutti ruokatorvivariksvuotojen verenvuoto, haiman fisteli, polkumyyntiä oireyhtymä, tai joissakin tapauksissa kroonista ripulia ja suoliston pseudoobstruction [28].

soveltaminen SST analogien on laajalti koskien diagnosointiin ja terapiaan neuroendokriinisten kasvainten [29-31]. Diagnoosi näiden kasvainten voi olla vaikeaa ja aikaa vievää, jotka voivat pahentaa mahdollisuus tehokkaan terapeuttisen intervention [30]. Radioaktiivisesti somatostatiinianalogit voidaan evince lokalisointi primaarinen ja metastaattinen ilmentävien kasvainten somatostatiinireseptoreihin, joita ei voi havaita tavanomaisilla kuvantamismenetelmiä johtuen niiden pienestä koosta [32]. Lisäksi somatostatiini ja sen johdannaisia ​​on useita myönteisiä vaikutuksia hoidossa neuroendocrine kasvaimet. Estyminen hormonaalista liikaeritystä voi tarjota lievittää oireita ja kasvaimen kutistuminen [7]. SST-analogit voivat estää tuotannon GH ja IGF, edistävistä tekijöistä syövän kasvua [33]. Ne voivat estää angiogeneesiä [34,35], voi olla immunemodulatory rooli [36,37], ja voi aiheuttaa solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin kautta somatostatiinireseptoreja [11,14]. SST analogit voivat olla turvallisempia lääkkeitä pitkäaikaiseen käyttöön kuin sytotoksinen chemotherapies, koska niillä on vähemmän ja lievempiä sivuvaikutuksia, kuten ruoansulatuskanavan, sappikivitauti ja vaikutuksia sokeriaineenvaihduntaan [30].

SST analogisia gammakuvaus voi hakea diagnosoinnissa immuunivälitteisiä häiriöitä (esim lymfoomat, granulomatoottinen sairaus tai nivelreuma) [38-41] ja ei-neuroendokriinisten kasvainten, sekä [42]. On olemassa useita soluviljelmäkokeita, eläinmalleissa ja kliinisissä tutkimuksissa myönteisiä vaikutuksia SST analogeja pahanlaatuiset kasvaimet mukaan lukien lymfoomat, rintasyövän ja eturauhassyövän [43-47].

Yhdessä kliinisessä tutkimuksessa vaikutusta oktreotidi tutkittiin kemoterapiaa tulenkestävä potilailla mahalaukun syöpä. Merkittävä parannus eloonjäämistä havaittiin hoidetussa ryhmässä verrattuna parhaiten tukihoito ryhmä [48]. Positiivinen vaikutus SST analoginen terapiassa maksasyövän (HCC) ei ole selvä. Samassa tapauksissa oktreotidi hallinto paransi eloonjäämismediaani verrattuna hoitamattomien potilaiden [49,50], mutta myöhempi tutkimus suuremmissa väestöstä ei osoittanut eloonjäämishyötyä kokeneille HCC hoidetuilla potilailla pitkävaikutteisten oktreotidi lumelääkkeeseen verrattuna [51].