Krooninen sairaus

tiivistelmä

Johdanto

Tässä artikkelissa, me raportoimme 7 novel KRAS-geenin mutaatiot löydettiin kun jälkikäteen opiskelun yleisyyttä ja rakenteessa KRAS mutaatioiden syöpäkudoksen saatu 56 Saudi satunnaista peräsuolen syöpäpotilailla alkaen Eastern Province.

Methods

Perimän DNA uutettiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut syöpä- ja noncancerous peräsuolen kudoksiin. Onnistunut ja PCR tuotteet olivat sitten kaksisuuntaisesti sekvensoitiin havaitsemaan eksonin 4 mutaatioita, kun taas Mutector II Detection Kit käytettiin mutaatioiden tunnistamiseksi kodoneissa 12, 13 ja 61. toiminnallinen vaikutus uusien mutaatioiden arvioitiin käyttämällä bioinformatiikan työkaluja ja molekyylien mallintamiseen.

tulokset

KRAS geenimutaatioita havaittiin syöpäkudoksessa 24 tapausta (42.85%). Näistä 11 oli eksoni 4 mutaatiota (19,64%). Ne kanna 8 eri mutaatioita, jotka kaikki paitsi kaksi muuttanut KRAS-proteiinin aminohapposekvenssin ja yhtä lukuun ottamatta kaikki olivat uusia, joka käy ilmi KOSMINEN tietokantaan. Havaittu uusia mutaatioita havaittiin olevan somaattisten. Yksi mutaatio ennustetaan olevan hyvänlaatuinen. Loput mutaatiot ennustetaan aiheuttavan merkittäviä muutoksia proteiinin rakenteessa. Näistä Q150X nonsense-mutaatio on toinen Typistävä mutaatio raportoidaan kolorektaalisyövässä kirjallisuudessa.

Johtopäätökset

löytö uusien eksonin 4 KRAS-mutaatioita, jotka ovat toistaiseksi ainutlaatuinen Saudi peräsuolen syövän potilaille voidaan katsoa johtuvan ympäristötekijöistä ja /tai rotuun /etniseen vaihtelut johtuvat geneettisiä eroja. Vaihtoehtoisesti se voi liittyä vähäisyydestä kliiniset tutkimukset mutaatioita muista kuin kodoneissa 12, 13, 61 ja 146. Edelleen KRAS testaus suuri määrä potilaita eri etnisten ryhmien, erityisesti yli yleisin hotspot alleeli eksonien 2 ja 3, jotta voidaan arvioida esiintyvyyttä ja tutkia tarkka ennustetekijöiden ja ennustava merkitys keksineet uusia mutaatioita sekä niiden mahdollinen rooli peräsuolen syövän syntymistä.

Citation: Naser WM, Shawarby MA, Al-Tamimi DM, Seth A, Al-Quorain A, Nemer AMA, et ai. (2014) Novel KRAS geenimutaatioita Sporadic peräsuolen syövän. PLoS ONE 9 (11): e113350. doi: 10,1371 /journal.pone.0113350

Editor: Klaus Brusgaard, Odense University hospital, Tanska

vastaanotettu: 12 kesäkuu 2014; Hyväksytty 22 lokakuuta 2014; Julkaistu: 20 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Naser et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä työ oli rahoitaa tutkimusta ”K-ras, p53, EGFR ja HER2-geenin poikkeamat peräsuolen syöpä” päässä Deanship tieteellisen tutkimuksen, University of Dammam, Saudi-Arabia (avustus # 2011003). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ilmoittavat, että ei kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

syövän kehittymiseen (karsinogeneesin) on monivaiheinen prosessi, jonka uskotaan johtuvan kertyminen geneettisiä muutoksia yhdessä solussa käyttöiän aikana yksilön. Geenien lukumäärän havaittu liittyvän erilaisia ​​syöpiä kasvaa nopeasti. Yleisimmin käytössä geenit kuuluvat RAS geeniperheen, joista kaksi (Harvey- H) ja (Kirsten-K) on ensimmäinen tunnistetaan olevan homologinen virus muuttamassa geenejä, kun taas kolmas (NRA) tunnistettiin ihmisen neuroblastooma . RAS geenituote on monomeerinen kalvoon paikallinen G-proteiinia 21 kd, joka toimii molekyylipainon kytkin yhdistää reseptori ja ei-reseptori-tyrosiinikinaasin aktivaation loppupään soluliman tai ydin- tapahtumia. Jokainen nisäkässolun sisältää vähintään kolmen erillisen RAS esikasvaintekijät koodaus läheistä sukua, mutta erillisiä proteiineja. RAS geenejä voidaan aktivoida eri pistemutaatioiden mukaan lukien ne, jotka vaikuttavat kodonien 12, 13, 61, tai 113-117. Signaalitransduktion ras-proteiinien hydrolysoidaan GTP, ja aktivoivat mutaatiot inhiboivat tätä prosessia, lukiten proteiini ”on” signalointi konformaatioon [1]. Aktivoivat mutaatiot näissä RAS proteiineja seurauksena konstitutiivisen signalointi ja edistää näin solujen lisääntymistä, ja estämällä apoptoosin.

onkogeeninen KRAS mutaatiot ovat yleisiä lähes kaikissa syövän tyyppejä, mikä KRAS yksi useimmin mutatoitunut geenejä ihmisen syövissä [ ,,,0],2]. RAS onkogeenien yhdessä p53 kasvaimeen estävä geeni, ovat geenit kaikkein johdonmukaisesti havaittu olevan mutatoitunut kolorektaalisyövässä [3] – [4], jossa epiteelisoluissa colorectum etenemistä pieni adenooma suurista adenooma, ja lopulta tulee adenokarsinooma [3].

Useat tutkimukset ovat raportoineet taajuus KRAS geenimutaatioita peräsuolen syöpä. Suurin sarja oli ”RASCAL” tutkimus 2721 peräsuolen syöpä tapauksista ilmoittivat esiintyvyys 37,7% [5]. Vertailukelpoinen taajuudet raportoitu jälkeen [6] – [8].

Tarkoituksena Tämän artikkelin tarkoituksena on ilmoittaa seitsemän uusia KRAS mutaatioita ja avaa oven edelleen KRAS testaus on suuri määrä potilaita, jotta voidaan arvioida yleisyys ja tutkia tarkka ennustetekijöiden ja ennustava merkitys löysi mutaatiot sekä niiden mahdollinen rooli kolorektaalisyövän karsinogeneesissä. Romaani mutaatiot löydettiin kun jälkikäteen opiskelun yleisyyttä ja rakenteessa KRAS mutaatioiden syöpäkudoksen saatu 56 Saudi satunnaista peräsuolen syövän potilaiden itäinen maakunta, ja korreloivia nämä kliinisiä piirteitä, ja p53, EGFR (epidermaalinen kasvutekijä) ja HER2 ( ihmisen orvaskeden kasvutekijän reseptori 2) proteiinin ilmentyminen, ja EGFR geeni mutaatiostatuksesta riippumatta. Se ei ollut meidän aikomusta tutkia kaikkia mahdollisia KRAS-mutaatioita, joita voi löytyä peräsuolen syöpä, joten me vain kohdennettu mutaatiot, jotka ovat yleisesti mukana tämän taudin. Löytämään uusia mutaatioita tuli sattumalta suorittaessaan tutkimuksessa. Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen tutkimus, jossa mallia KRAS geenimutaatioita Saudi peräsuolen syöpäpotilailla.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Tutkimus hyväksyttiin pysyvässä Research Ethics eläviin Creatures (SCRELC), joka on IRB meidän laitoksen (hyväksyntä numero: IRB-2014-01-324). Se ei ollut mahdollista saada kirjallinen suostumus osallistujilta, koska suurin osa potilaista menetettiin seurata. Tästä asiasta keskusteltiin komitean kanssa, joka oli samaa mieltä, sopusoinnussa ”suuntaviivojen Ethical Research Practice” [9], suostumusta ei tarvita niin retrospektiivinen tutkimus, kun tieto hyödynnetään tekijät oli jo yleisön saatavilla ja tekivät ei paljasta potilaan identiteetti. Lisäksi tutkimus ole vaaraa osallistujille.

Viisikymmentäkuusi satunnaisia ​​kolorektaalisyöpää tapausta Saudi potilasta noudetaan arkistosta patologian osaston King Fahdin sairaalan yliopiston. Tapaukset valittiin sattumanvaraisesti perustuu saatavuuteen kliiniset tiedot ja edustava parafiini kudosblokeista riittää suorittaa vaaditut menettelyt, samoin kuin negatiivinen suvussa peräsuolen syövän. Aikataulu kattoi oli 11 vuotta (1998-2008).

Kliiniset ja patologisten tietojen

Kliiniset ja patologisten tietojen kuten histologinen tyyppi, laatu ja vaihe syöpä kerättiin potilaiden kirjaa . Kliiniset ja patologiset tiedot luokiteltiin käyttäen WHO: n kriteerien [10].

immunohistokemiallinen värjäys

immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin EGFR, HER2 ja p53 4 pm paksu parafiinileikkeillä leikattu lohkojen peräsuolen karsinomatooseja kudosta. Värjäytyminen suoritettiin Ventana Benchmark automatisoitu immunostainer mukaan valmistajan ohjeiden (Ventana Medical Systems Inc., Strasbourg). Lähteet ja laimennoksia primaaristen vasta-aineiden tutkimuksessa käytetyt on esitetty taulukossa S1. Immunovärjättiin leikkeet tutkittiin valomikroskoopilla ja arvioitiin manuaalisesti kaksi patologia. Ehdottomasti kalvo ja /tai sytoplasmista värjäytymistä oli tarpeen asia niin EGFR tai HER-2 /neu positiivinen, kun taas tumavärjäystä vähintään 10%: n syöpäsolujen tarvittiin p53 positiivisuus (kuva S1).

Perimän DNA: n uutto

Viisi kahdeksan 10 pm paksu formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut syöpäkudoksen leikkeitä käytetään erottamaan genomista DNA: ta. Osiot poistettiin parafiini kahdesti 5 minuutin ajan ksyleenissä, peräkkäin niihin lisätään 100, 96 ja 70% etanolia, 30 sekuntia kummallakin, värjättiin hematoksyliinillä 30 sekunnin ajan, huuhdeltiin vedellä ja inkuboitiin yön yli 1 M NaSCN 37 ° C: ssa poistamaan rajat linkkejä. Objektilasit huuhdeltiin kahdesti 10 minuutin ajan 1 x PBS-liuoksessa huoneenlämpötilassa, ja täysin kuivattiin ilmassa. Kuten kokenut patologi, syöpäkudoksen kaavittiin lasilevyllä pinta leikkausveitsellä, jotta saadaan vähintään 70% kasvainsoluja ja siirrettiin sitten 2,0 ml: n mikro- sentrifugiputkiin. Genominen DNA uutettiin sitten käyttämällä WaxFree DNA Kit (TrimGen, Maryland) täytäntöön standardin kuvanneet valmistajalle inkuboimalla yön yli vaiheessa 14 protokollan. Uutettu genomi-DNA kvantifioitiin Epok spektrofotometrillä ja analysoitiin 0,8% agaroosigeelielektroforeesilla visualisoida DNA kokojakauma.

Niille potilaille, jotka esillä uusia KRAS eksonin 4 mutaatioita, myös uutettu genomi-DNA noncancerous peräsuolen kudokseen, kuten on kuvattu edellä. Noncancerous kudos saatiin kasvaimen vapaa resektiota marginaali kolektomian näyte samasta potilaasta.

PCR-monistus KRAS eksonin 4

Sekvensointi sovellettu havaita KRAS eksonin 4 mutaatioita sarjat havaitseminen A146T – joka on eksonin 4 mutaatio raportoitu yleisesti mukana peräsuolen syöpä [11] – [12] – ei ollut kaupallisesti saatavilla. Sisäkkäinen PCR lähestymistapa samanlainen kuin hyväksymien Fadhil, et al [13] toteutettiin monistamaan ja suorittaa sulavan analyysi eksoni 4 KRAS-geenin, jotta voidaan tarkistaa onnistuneen PCR-reaktioissa ja spesifisyys. Ensimmäinen PCR kierros tehtiin lopullisessa tilavuudessa 25 ui. Kukin reaktio sisälsi 1 x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix, 0,5 × Q-ratkaisu, 2 alukeparia (taulukko 1), joka kattaa kuormittajat KRAS eksonissa 4 0,3 uM lopullinen pitoisuus kutakin aluketta ja 10 ng templaatti-DNA. PCR suoritettiin käyttäen ABI: n Veriti Thermal Cycler (Life Technologies), 15 minuutin ajan 95 ° C: ssa, 40 sykliä kutakin: 30 sekuntia 94 ° C: ssa, 90 sekuntia 55 ° C: ssa ja 90 sekuntia 72 ° C: ssa, minkä jälkeen 10 minuutin ajan 72 ° C: ssa. Kun oli lisätty 2 ui (5 x) täyteväriä, 10 pl kutakin monistettu näyte elektroforeesilla 2% TBE-agaroosi- etidiumbromidilla-värjätyn geelin ja visiualized kanssa GelDoc järjestelmän Biorad.

korkean resoluution sulamiskäyräanalyysi (HRM) suoritettiin käyttäen sisäkkäisiä PCR-reaktio lopputilavuudessa 15 ui, joka sisälsi 1 x HRM Master Mix (Qiagen) ja 1-alukeparia, joka on spesifinen eksonin 4 (taulukko 1), jossa kutakin aluketta 0,7 uM lopullinen konsentraatio . Malli koostui 1,5 ui 1:100 laimentaminen ensimmäisen kierroksen PCR-reaktiossa. Perättäiset PCR-reaktio suoritettiin kuvatulla tavalla käyttöohjeessa HRM Type-se Kit (Qiagen).

HRM käytetään arvioimaan dissosiaatiota (sulaminen) ominaisuudet kaksijuosteisen DNA: n (dsDNA). Emäsparin koostumus ja GC-pitoisuuden vaikutus sulaa käyttäytymistä eri dsDNA fragmenttien. Aikana HRM, dsDNA altistuu vähitellen yhä lämpötilassa, kun läsnä on fluoresoivaa väriainetta (esim. EvaGreen). Fluoresoiva väri fluoresoi vain, kun sidottu dsDNA. Fluoresenssia seurataan siirtymistä dsDNA yksijuosteiseen DNA (ssDNA), joka pienenee dsDNA sulaa. Piirtämistä fluoresenssin muutoksia sen jälkeen, kun spesifisten DNA-fragmenttien PCR: n aikana johtaa yhden piikit, jotka vastaavat tiettyjä amplikoneja, [14].

DNA: n sekvensointi

Kun HRM, onnistunut ja erityisiä PCR-tuotteet, joka esittää yhden sulamishuipun olivat sarake puhdistettiin käyttämällä QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. PCR-tuotteet eluoitiin 30 ui eluointipuskuria ja laimennettiin 1:10 veden kanssa. Laimennettu PCR-tuotteita käytettiin sitten templaattina syklisekvensointireagenssipakkausta kautta Big Dye Terminator v1.1 Kit (Applied Biosystems). Kaksisuuntainen sekvensointi (eli eteen- ja taaksepäin) suoritettiin käyttäen syklisekvensointireagenssipakkausta reaktio (10 ui lopullisessa tilavuudessa), joka koostuu 1 x terminaattorin esiseosta, 1 x sekvensointi puskuria, 0,4 uM joko M13-F tai M13-R-alukkeita (taulukko 1) ja 4 ui laimennettua mallin. Reaktiot ajettiin Veriti (Life Technologies) mukaisesti seuraavalla tavalla: Yksi sykli 95 ° C: ssa 15 minuuttia; 30 sykliä 95 ° C 10 sekunnin ajan, 55 ° C 5 sekunnin ajan, 72 ° C: ssa 4 minuutin ajan. Sekvenssointireaktiot puhdistettiin ABI: n BigDye Xterminator Purification Kit (Life Technologies) ja ladattiin 3500 Genetic Analyzer (Life Technologies). Sekvensointitiedot analysoitiin Sekvensointianalyysin v5.4 ja SeqScape v2.7 ohjelmistot (Life Technologies).

Siirtyvät päättyminen määritykset (STA) B

STA perustuu alukepidennysmenetelmää menetelmiä, joissa 3 oligonukleotidien (2 monistamista ja 1 mutaation havaitsemiseen) käytetään havaitsemaan tietyn mutaation. Kuitenkin, STA käyttää sisällyttämällä useita leimattuja nukleotideja havaitsemiseen alukkeen verrattuna sisällyttäminen yhden leimatun nukleotidin muihin alukepidennysmenetelmää perustuvat menetelmät. Havaitseminen aluke pariutuu yhden emäksen ennen kohdepaikan ja pidennetään sitten vasta kun kohdepaikan on mutatoitunut. Laajentaminen tunnistus pohjamaali useita leimattuja nukleotideja tehostaa signaalia ja lisää PCR-fragmentti pituus mahdollistaa mutaation syrjintä villin tyypin kautta huippu väri ja palakooltaan jälkeen kapillaarielektroforeesijärjestelmiä [15].

Käytimme Mutector II Mutation Detection Kit (TrimGen, Maryland) tunnistaa mutaatioita kodoneissa 12, 13 ja 61 KRAS-geeni, jotka ovat KRAS mutaatioita raportoitu useimmiten aiheuttavat peräsuolen syöpä [11] – [12], samoin kuin spesifisiä mutaatioita EGFR geenin ominaisuus paikoissa eksonien 18-21, mukaan lukien tietyt pistemutaatioita, deleetioita ja insertioita joka tunnistaa potilaat, jotka todennäköisimmin vastaavat kohdennettua keuhkosyöpä hoito, kuten tyrosiinikinaasin estäjät erlotinibin ja gefitinibi. Mutector II Mutation Detection Kit toteuttaa STA tekniikkaa samanaikaisesti havaitsemiseksi ja erilaistumista mutaatioiden esiintyvien samassa kohteessa. Mutector II Mutation Detection Kit GP05-CM tunnistaa ja erottaa kaikki 12 mutaatiot tapahtuvat kodoneissa 12 ja 13, kun taas Mutector II Mutation Detection Kit GP06 on suunniteltu 5 mutaatiot esiintyvät kodonissa 61. Mutector II Mutation Detection Kit GP07-02 tunnistaa mutaatioita ominaisuus paikoissa eksonien 18-21 EGFR-geenin. STA teknologia parantaa merkittävästi herkkyyttä. Se havaitsee jopa 1% somaattiset mutaatiot verrattuna 15-20% kautta Sangerin sekvensoinnilla [15]. Lyhyesti, 50 ng gDNA PCR-monistettiin käyttämällä reagensseja, edellyttäen kautta kuvattuja PCR-olosuhteita, joita valmistaja. PCR-tuotteet puhdistetaan, ja mutaatioita kodoneissa 12, 13, ja 61 rikastettiin erikseen mutaatio erityisiä primer extension reaktio. Näytteet, jotka sisälsivät rikastettua mutaatioita puhdistettiin ylimäärästä fluoresenssiväriaineet, laimennettu 5-10 kertaa vedellä. Kolme mikrolitraa laimennettua primer extension tuotteet sekoitettiin latauspuskuria annetaan sarjasta ja fragmentti mitoitettu kautta kapillaarielektroforeesijärjestelmiä ABI: n 3500 Genetic Analyzer (Life Technologies). Kapillaarielektroforeesijärjestelmiä käyttöolosuhteet ja väline asennusohjelma tiedonkeruun selitetään yksityiskohtaisesti sisällä Mutector II Mutaatio Kit käyttöohje.

toiminnallinen ennustaminen ja molekyylimallinnuksesta uusien KRAS mutaatioiden

toiminnallinen vaikutus ei -synonymous (proteiinien rakenteeseen muuttavaa) eksonista 4 mutaatioita arvioitiin käyttäen POLYPHEN-2 (polymorfismi fenotyyppaus v2) [16] ja SEULOA (lajittelu intoleranssista maasta suvaitsevainen työkaluja) [17]. Käytimme myös mutaatio arvioijan [18] ennustaa toiminnallisia vaikutuksia mutaatioiden perustuu evoluution säilyttämiseen altistunutta aminohappo proteiinihomologit. Lisäksi molekyylimallinnusta levitettiin ennustaa toiminnallisia vaikutuksia romaanin mutaatioiden havaittu. K-ras-proteiini rakenteen mallintamiseen käytettyjen saatiin Protein Data Bank (PDB ID: 3gft). Mallinnus mutaatiot tehtiin ja visualisoitiin PyMOL [19] – [20]. PyMOL näyttää tiedot kaikista steerisen häiriön välillä mutatoitu aminohappo- ja muut aminohapon sivuketjut ja muodon kanssa ainakin steerinen häiriö on valittu käsin. Mutantti sivuketjut mallinnettiin asemiin proteiinin avulla rotameerien alhaisimman ristiriitaisia ​​Van der Waalsin säteiden ja kokoonpanon kanssa vähiten steerisen häiriöitä muiden aminohapposivuketjujen. Villityypin ja mutantti-proteiinin rakenne asetettiin päällekkäin korostaa ennustetut konformaatiomuutoksia aiheuttamat kunkin mutaation.

Tilastollinen analyysi

Data-analyysi suoritettiin SPSS for Windows version 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Tulokset olivat ristiintaulukoida tutkia suhteita muuttujien. Tilastollinen analyysi kategorisen muuttujia suoritettiin käyttäen χ neliön testi yhdistymis- ja Fisherin testiä tarvittaessa. Kun kaksi jatkuvaa riippumatonta muuttujaa tutkittiin, t-testi ja varianssianalyysi käytettiin. P-arvo on alle 0,05 pidetään merkittävänä kaikissa tilastollisissa analyyseissä.

Tulokset

Novel KRAS mutaatioita

KRAS geenimutaatioita havaittiin syöpäkudoksessa 24 ulos 56 tutkituista tapauksista (42.85%). Näistä 11 (19,64%) oli eksonin 4 mutaatioita paikallinen kodonien välillä 134 ja 150, kun taas 13 (23,21%) oli mutaatio eksonin 2, joka vaikuttaa kodonit 12 ja 13. Mutaatiot ei havaittu kodonien 61 eksonin 3. jakautuminen mutaatioiden meidän kohortti on esitetty taulukossa S2.

11 tapauksia eksonin 4 aberraatioita kanna 8 erilaista mutaatiota (taulukko 2), joista yksi oli aiemmin raportoitu (p.Ala146Thr, missensemutaatio) ja 7 olivat romaanin paljastamat COSMIC tietokannan tutustuttavissa 19/09/2014. Me vahvistanut kaikki uusi sekvenssi vaihtelut havaittu omassa kohortin sekvensoimalla vastakkaisen juosteen. Kaikki näytteet osoittivat identtisen sekvenssimuuntelun vastakkaisen lohkon. Heikko signaali näytteestä 33 (kuvio 1) voi johtua alentaa kasvainkudoksen sisältöä; toinen (eteenpäin) säikeen osoitti myös heikon signaalin sekvenssin vaihtelun (c.404G A) samoin. Kuitenkin sekvensoimalla noncancerous kudosta potilaan osoittanut mitään signaalia lainkaan vaihtelua c.404G A, joka ilmoittaa, että signaali näytteessä on yli detektioraja sekvensointi protokollaa. Yhtä uusista mutaatioista (G138G) havaittiin kolmella potilaalla ja toinen (Q150X), havaittiin kahdella muulla potilaalla. Neljä seitsemän mutaatioiden olivat missensemutaatioita muuttamalla aminohapposekvenssiä proteiinin (A134V, R135K, E143K ja R149G), kun taas kaksi mutaatio oli samaa (G138G ja K147K) ja yksi, joka on nonsense katkaisemalla mutaatio (Q150X). Missense ja nonsense eksoni 4 mutaatioita havaittiin seitsemällä potilaalla (12,5% kokonaismäärästä). Kuvio 1 on elektroferogrammi varten KRAS eksonin 4 nonsense ja missensemutaatioita, että katkaistu tai muuttanut KRAS-proteiinin aminohapposekvenssi, vastaavasti. Näytteet 32 ​​ja 45 sisälsivät myös toinen mutaatio (p.Gly12Asp) kodonissa 12 eksonin 2, joka käy ilmi STA analyysi, joka oli usein havaittu peräsuolen syöpäpotilailla (kuva 2). Uuden eksonin 4 KRAS mutaatioita havaittiin olevan somaattisten, koska osat noncancerous peräsuolen kudosten potilailla, joiden kanna ne mutaatiot, osoittivat villityypin sekvenssi (kuvio 1).

Kaikki kuvattu mutaatiot vahvistettiin kautta sekvensoimalla eteenpäin nauha. Näytteen numero ja mutaatio nimikkeistön mukaan kuorma-autojen ohjeiden korostuvat päällekkäin mutaation. Nuolet sijainnin emäsparin muutoksen.

Pohjalevy on näytteen 32 osoittaa toinen punainen huippu (GGT GAT) ja kolmas musta huippu (villityyppi).

toiminnallinen vaikutus kuin synonyymi mutaatioiden KRAS-proteiini määritettiin käyttämällä bioinformatiikan työkaluja ja tulokset on esitetty taulukossa 3. esimerkiksi E143K ja Q150X mutaatioiden ennustetaan olevan haitallisia ja suuri vaikutus proteiinin taas R135K ennustetaan suvaita tai on neutraali vaikutus proteiinin. Lisäksi käytettiin molekyylimallinnuksen arvioida toiminnallista vaikutusta näiden uusien KRAS mutaatioiden ja tulokset on esitetty kuviossa 3. molekyylimallitus tiedot istuvuus ennustuksen POLYPHEN-2 ja SIFT, sekä säilyttäminen (taulukko 3). Esimerkiksi R135K mutaatio ennustetaan olevan hyvänlaatuisia ja mallinnus osoitti myös hieman ennustettu vaikutus proteiinien rakenteeseen. Loput mutaatiot ennustetaan aiheuttavan merkittäviä muutoksia proteiinin rakenteessa linjassa ennustetun vahingollista vaikutusta POLYPHEN-2.

Villityypin (WT) KRAS esitetään sinisellä ja mutantti proteiinit näkyvät keltaisina . Sivuketjut aminohappojen näkyvät vihreinä WT jäämien ja punainen mutantti jäämiä. a) WT K-RAS osoittavat sivuketjun A134 (vihreä). b) päällekkäisyys WT ja mutanttien A134V KRAS osoittavat ennustetun konformaatiomuutoksia aiheuttamia A134V mutaatio (huomaa muutokset kierteen ja beta-levyn). c) päällekkäisyys WT ja mutanttien R135K KRAS osoittavat ennustetun konformaatiomuutoksia aiheuttamia R135K mutaatio (huomaa muutoksia helix ja silmukka ketjut), mutta ei vaikuta GTP sitova tasku. d) päällekkäisyys WT ja mutanttien E143K KRAS josta esitetään ennustettu konformaatiomuutoksia aiheuttamia E143K mutaatio (huomaa muutokset silmukan lähellä GTP sitova tasku). e) päällekkäisyys WT ja mutanttien T144I KRAS josta esitetään ennustettu konformaatiomuutoksia aiheuttamia T144I mutaatio (huomaa muutokset GTP sitova tasku ja muutokset suunta sitoutuneen GTP, vihreä on paino- ja punainen on mutantti). f) päällekkäisyys WT ja mutanttien R149G KRAS josta esitetään ennustettu konformaatiomuutoksia aiheuttamia R149G mutaatio (huomaa muutoksia helix ja silmukka ketjut lähellä GTP sitova tasku). g) päällekkäisyys WT ja mutanttien Q150X KRAS josta esitetään ennustettu konformaatiomuutoksia aiheuttamia Q150X mutaatio (huomaa muutokset silmukan ketju).

Pistemutaatiot määrittämän EGFR mutaatio havaitseminen pakki eksonit 18, 20 ja 21 EGFR-geenin ei havaittu missään 56 tutkituista tapauksista. InDel mutaatiot eksonit 19 ja 20 ei myöskään havaittu.

Tärkein kliininen, patologinen ja immunohistokemiallinen löydökset raportoiduista tapauksista on esitetty taulukossa 4. Taulukoissa 5 ja 6 esittävät esiintyvyys naissukupuolen tapauksissa, joissa uudella KRAS mutaatioita verrattuna tapauksiin muihin KRAS mutaatioiden ja KRAS-mutaatio negatiivisia tapauksia (70%, 42,8% ja 43,75%, tässä järjestyksessä). Ne osoittavat myös pienempi esiintyvyys imusolmuke etäpesäke ja p53 ilmentymistä, vaikka erot eivät ole tilastollisesti merkittäviä (p-arvo on välillä 0,078 ja 1,0). Emme löytäneet EGFR tai HER2-proteiinin ilmentymisen tai EGFR geenimutaatioita tahansa 10 tapausta. Ei myöskään ollut merkitsevää eroa kolmen ryhmän osalta potilaan ikä, ja kasvaimen koko, syvyys ja laatu.

Kolme viidestä potilaasta kätkeminen haitalliset mutaatiot olivat kehittyneempiä tauti lisääntynyt kasvaimen syvyyteen ja imusolmuke etäpesäke (tapaukset 32, 45 ja 51), kun taas kaksi oli paikallinen sairaus (tapaukset 41 ja 48).

kaksi tapausta samanaikaisessa eksonin 2 mutaatio (tapaukset 32 ​​ja 45) osoitti suurempaa kasvaimen koon ja syvyys verrattuna useimpiin muihin tapauksissa uusia mutaatioita ja oli myös imusolmuke etäpesäke.

keskustelu

aktivointi KRAS onkogeenin on liitetty peräsuolen syövän synnyn, on mutatoitunut in 30-40% adenokarsinoomien [5] – [8], esiintyvyyden verrattavissa niihin, esillä olevassa tutkimuksessa (42.85%). MRNA transkriptio KRAS-geenin koostuu 5765 emäksiä koodaavat 188 aminohappoa. Eksonit 1, 2, 3, 4, ja 5 sisältävät 181, 122, 179, 160, ja 5123 emäkset, vastaavasti [21]. Valtaosa somaattiset mutaatiot kodoneissa 12 ja 13 (joka sijaitsee eksonissa 2). Muita harvemmin mutaatioita esiintyy eksonissa 3 (kodonit 59/61) ja eksonin 4 (kodonit 117/146) [22] – [23]. Noin kolmannes kolorektaalisyövissä kanna mutaatiota G12 ja G13 kodonit taas eksoni 4 mutaatiot kodonissa 117 ja 146 havaittiin vain korkeintaan 5,5% kasvaimista [24]. Tutkimuksemme osoitti paljon pienempi esiintyvyys eksonin 2 mutaatiota (23,21%) ja paljon suurempi esiintyvyys eksonin 4 mutaatioista (19,64%) ja eksonin 4 mutaatiot lokalisoitu välillä kodonien 134 ja 150 sijasta mukana kodonien 117 ja 146.

eksoni 4 KRAS mutaatiot aliarvioitu, koska kaikki ponnistelut kliinisten tutkimusten keskittyi eksonin 2 (kodonit 12 ja 13) ja eksonin 3 (kodonissa 61) mutaatioita [22] – [25]. Kaikki seitsemän romaani KRAS mutaatioita raportoitu olevassa artikkelissa esiintyi eksonissa 4 ja lokalisoitu välillä kodonien 134 ja 150. Siten ehdotamme myös kodonien 134-150 hotspot rutiini KRAS mutaatioanalyysiin kolorektaalisyövässä potilaille, eikä niinkään keskity vain Kodoneissa 117 ja 146. Havaitsimme missense ja nonsense eksonin 4 mutaatiota 12,5% tapauksista, joka on korkeampi kuin mitä oli aiemmin raportoitu, joka oli 10%, mutta myös eksoni 3 ja kansallisten sääntelyviranomaisten lisäksi eksonia 4 mutaatiota [24]. Kaikki uudet mutaatiot todettiin somaattisten koska kaikki osat noncancerous peräsuolen kudoksen 10 tapausta, että kanna mutaatiot osoitti villityypin sekvenssin.

toiminnallinen vaikutus uusien ei-synonyymi mutaatioiden KRAS proteiini arvioidaan käyttämällä bioinformatiikan työkaluja ja molekyylimallinnuksesta (taulukot 2 3, kuvio 3). R135K mutaatio johti korvaaminen Arg varten vastaavasti veloittaa Lys, joka on ennustettu aiheuttaa vain vähän muutoksia vuorovaikutus vierekkäisten tähteiden. Bioinformatiikan työkaluja osoitti, että R135K mutaatio on ennustettu olevan neutraali vaikutus proteiiniin. Vastaavasti, molekyylimallinnuksen osoitti pienen muutoksen proteiinin aiheuttama rakenteen tämän mutaation (kuvio 3). Sen sijaan E143K mutaatio on ennustettu olevan haitallinen vaikutus proteiinin bioinformatiikan työkaluja (taulukko 3) ja molekyylimallinnuksella (kuvio 3). Tämä mutaatio johti vaihdosta negatiivisesti varautuneen Glu positiivisesti varautuneet Lys (taulukko 2), joka voi aiheuttaa suuria muutoksia vuorovaikutuksesta viereisen aminohappotähteen. Kuvio 3 osoittaa, että E143K mutaatio aiheutti merkittäviä muutoksia rakenteeseen KRAS proteiinin varsinkin silmukan lähellä GTP sitova tasku. R149G mutaatio on ennustettu olevan neutraaleja, mutta molekyylimallitus osoitti, että tämä mutaatio aiheutti muutoksia heliksin ja silmukka ketjut lähellä GTP: n sitoutumista taskussa. Tämä on todennäköisesti johtuu muutoksista välisen vuorovaikutuksen aminohappotähteiden aiheuttama vaihdosta positiivisesti varautuneen Arg ei-polaarinen Gly (taulukko 2). Lisäksi tämä mutaatio sijaitsee lähellä konservoituneen SAK motiivi ja tuoreessa tutkimuksessa kävi ilmi, että lähellä mutaatio (K147E) johtaa itsestään aktivoiva RAS proteiini, joka voi toimia itsenäisesti ylävirran signaalit ja näytteille pienempi affiniteetti RAF-kinaasin [26]. Q150X mutaation ennenaikainen lopetuskodoni ja ennustetaan vaikuttavan vakauteen mRNA kautta nonsense välittämää rappeutuminen mikä vähentää ilmentymistä katkaistun proteiinin. Parhaan tietomme mukaan Q150X mutaatio havaitaan esillä olevassa tutkimuksessa on toinen KRAS lyhennetty mutaatio raportoidaan kolorektaalisyövässä kirjallisuudessa. KRAS-mutaatio (CAG TAG) määritetään ennenaikainen opastinta kodonissa 22 (Gln22Stop) on aiemmin todettu potilaalla metastasoitunutta peräsuolen syöpää Palmirotta, et al [27]. BRAF ja p53-geenien ei todettu muutettava ja mikrosatelliittien epävakaus ei ollut läsnä. Potilas, kuitenkin, havaittiin olevan vastetta anti-EGFR-hoitoa. Kiinnostavaa meidän kaksi potilasta kätkeminen lyhennetty mutaatio oli EGFR negatiivisia IHC. Heillä ei myöskään ollut EGFR geenimutaatioita. Useissa prekliinisissä [28] ja kliiniset [29] ovat osoittaneet, että esiintyminen KRAS mutaatioiden peräsuolen syöpä on itsenäinen ennustava parametri EGFR täsmähoitoihin vastus. Lopuksi, vaikka samaa uusi eksoni 4 mutaatioita on raportoitu esillä olevassa tutkimuksessa (mukaan lukien G138G mutaatio, joka havaittiin kolmella potilaalla) ei muuttanut aminohappoa koostumus, ne voivat silti olla merkitystä tuumorigeneesissä. On yhä enemmän todisteita siitä, että synonyymi mutaatiot (usein virheellisesti kutsutaan ”hiljainen”) voi vaikuttaa transkriptioon, liittämiseen, mRNA kuljetuksen ja kääntämisen, joista mikä tahansa voi muuttaa fenotyyppiä, tekee synonyymi mutaatio kuin hiljainen [30].

Havaitsimme yhtä uusista mutaatioista kolmessa tapauksessa (G138G) ja toinen kaksi tapausta (Q150X). Meidän otoskoko on melko pieni tekemään frekvenssianalyysiä ja verrattuna suurempiin julkaistuihin tutkimuksiin. Kuitenkin se, että nämä uudet mutaatiot havaittiin 5/56 tapauksissa osoittaa, että lisätutkimuksia on tehtävä.

EGFR yli ilmaistu monenlaisia ​​syöpiä, erityisesti peräsuolen syöpä, ja näyttää heijastavan aggressiivisempia histologisia ja kliinisiä käyttäytymismalleja [31]. On myös osoitettu, että p53-proteiinin yli ilmentyminen voi auttaa mahdollisesti ennustamaan metastaattinen levinnyt imusolmukkeisiin kolorektaalisyövässä [32]. Tällaisen tiedon perusteella, alhainen esiintyvyys imusolmuke etäpesäke ja p53 ilmentymistä meidän potilailla kätkeminen romaanin mutaatioita yhdistettynä ilman EGFR ja HER2-proteiinin ilmentymistä ja EGFR geenimutaatioita voi yleensä viittaavat heikompilaatuisen väylän peräsuolen syövän kehityksen perustana potilaat, jotka ovat todennäköisesti myös vastustuskykyisiä anti-EGFR ja anti-HER2-hoidon. Tämä keinottelu on sopusoinnussa havainto, että mutaatiot eksonin 4 KRAS ennustavat suotuisampaa kliininen tulos, jos potilaalla on peräsuolen syöpä [24]. Ironisesti, neljä seitsemästä uusien eksoni 4 mutaatioita havaittu esillä olevassa tutkimuksessa ennustetaan olevan vahingollisia KRAS-proteiinin, joka käy ilmi molekyylimallinnus.